JPH0840928A - 活性な凝固促進物質を含有する血液凝固障害の治療のための安定な組成物 - Google Patents
活性な凝固促進物質を含有する血液凝固障害の治療のための安定な組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血液凝固障害の治療のための安定な組成物お
よびその組成物の製造方法を提供する。 【構成】 脂質小胞中および／または脂質小胞上に結合
し、静脈内投与に適している活性凝固促進物質を含む血
液凝固障害の予防または治療のための安定な組成物およ
びその製造方法。
よびその組成物の製造方法を提供する。 【構成】 脂質小胞中および／または脂質小胞上に結合
し、静脈内投与に適している活性凝固促進物質を含む血
液凝固障害の予防または治療のための安定な組成物およ
びその製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、活性な凝固促進物質、
例えば活性化凝固因子と所望により他のタンパク質、を
含有する血液凝固障害（疾患）の予防及び治療のための
安定な組成物に関する。
例えば活性化凝固因子と所望により他のタンパク質、を
含有する血液凝固障害（疾患）の予防及び治療のための
安定な組成物に関する。
【０００２】
【従来技術】血液の凝固障害は、例えば、凝固成分の欠
乏により凝固時間が標準値から外れるような場合に起き
る。この障害は先天的であり得るが、病的状態で後天的
に発症し得る。血友病Ａは最も頻繁に起きる先天的な凝
固障害である。血友病Ａの患者は因子ＶIIIの不足によ
り、頻繁に出血を起こし易く、これは因子ＶIII（第ＶI
II因子）濃縮物で治療可能である。しかしながら、患者
の約１５％では因子ＶIII中和抗体（いわゆるインヒビ
ター）の発生により因子ＶIII濃縮物による治療が殆ん
ど不可能となっている。血友病Ａインヒビター患者の治
療のために、凝固因子類の複合混合物が証明された。活
性化プロトロンビン複合体ＦＥＩＢＡ（登録商標、Ｉmm
uno）は「因子ＶIIIインヒビター迂回活性（factor eig
ht inhibitor bypassing activity）を有する。因子ＶI
II濃縮物の代わりに、凝固因子Ｘａとリン脂質との混合
物により血友病Ａを治療する試みがなされた。米国特許
第４，６１０，８８０には、因子Ｘａとリン脂質小胞の
混合物による血友病犬の治療が記載されている。この混
合物は不安定であり、そのような訳で、使用直前に新た
に因子Ｘａ含有溶液とリン脂質小胞懸濁液とを混合しな
ければならなかった。止血は達成されるが血栓症は起き
ないように、混合比を選択しなければならないと強調さ
れている。
乏により凝固時間が標準値から外れるような場合に起き
る。この障害は先天的であり得るが、病的状態で後天的
に発症し得る。血友病Ａは最も頻繁に起きる先天的な凝
固障害である。血友病Ａの患者は因子ＶIIIの不足によ
り、頻繁に出血を起こし易く、これは因子ＶIII（第ＶI
II因子）濃縮物で治療可能である。しかしながら、患者
の約１５％では因子ＶIII中和抗体（いわゆるインヒビ
ター）の発生により因子ＶIII濃縮物による治療が殆ん
ど不可能となっている。血友病Ａインヒビター患者の治
療のために、凝固因子類の複合混合物が証明された。活
性化プロトロンビン複合体ＦＥＩＢＡ（登録商標、Ｉmm
uno）は「因子ＶIIIインヒビター迂回活性（factor eig
ht inhibitor bypassing activity）を有する。因子ＶI
II濃縮物の代わりに、凝固因子Ｘａとリン脂質との混合
物により血友病Ａを治療する試みがなされた。米国特許
第４，６１０，８８０には、因子Ｘａとリン脂質小胞の
混合物による血友病犬の治療が記載されている。この混
合物は不安定であり、そのような訳で、使用直前に新た
に因子Ｘａ含有溶液とリン脂質小胞懸濁液とを混合しな
ければならなかった。止血は達成されるが血栓症は起き
ないように、混合比を選択しなければならないと強調さ
れている。
【０００３】リン脂質小胞を因子Ｘａと併用すると血栓
症の危険性が増大することは、うっ血兎を用いるインビ
ボ試験から既知であり（Blood, 59、 401ー407 (198
2)）、因子Ｘａと合成リン脂質（ホスファチジルコリン
ホスファチジルセリン脂質小胞、ＰＣＰＳ小胞）とを一
緒に試験した時に、因子Ｘａの血餅形成の増大が記載さ
れている。プロトロンビン複合体濃縮物の投与後の血栓
症の危険性も、凝固活性リン脂質と活性化凝固因子との
併用に帰することができる。凝固因子ＶIIIとＩＸとを
リポソームに組み入れることは既知である（米国特許第
４，３４８，３８４）。これを用いて血友病Ａ又はＢの
治療に経口又は経腸的に投与される組成物が得られる。
ここに、リポソームの大きさは１μmであり、因子ＶIII
又はＩＸを未成熟消化から防止している。これら組成物
は静脈内に存在しないので、これらの投与による血栓症
の危険性は無い。活性化凝固因子が保存に不安定である
ことは既知である。可能な限り安定なベータ因子Ｘａ組
成物を得る方法が知られている（Thrombosis Research
22, 213-220 (1981)）。この方法によれば、ベータ因子
Ｘａは０.０３Ｍイミダゾール緩衝液中、ｐＨ７.２にお
いて、５０％グリセロール中に冷蔵保存される。しかし
ながら、この方法を４℃で用いても、不活性フラグメン
トへの変換が起きる。同様の方法で、グリセロール−水
混合物中での因子Ｘａの安定化における不安定さが記載
されている（J.B iol. Chem., 248, 7729-7741 (197
3)。
症の危険性が増大することは、うっ血兎を用いるインビ
ボ試験から既知であり（Blood, 59、 401ー407 (198
2)）、因子Ｘａと合成リン脂質（ホスファチジルコリン
ホスファチジルセリン脂質小胞、ＰＣＰＳ小胞）とを一
緒に試験した時に、因子Ｘａの血餅形成の増大が記載さ
れている。プロトロンビン複合体濃縮物の投与後の血栓
症の危険性も、凝固活性リン脂質と活性化凝固因子との
併用に帰することができる。凝固因子ＶIIIとＩＸとを
リポソームに組み入れることは既知である（米国特許第
４，３４８，３８４）。これを用いて血友病Ａ又はＢの
治療に経口又は経腸的に投与される組成物が得られる。
ここに、リポソームの大きさは１μmであり、因子ＶIII
又はＩＸを未成熟消化から防止している。これら組成物
は静脈内に存在しないので、これらの投与による血栓症
の危険性は無い。活性化凝固因子が保存に不安定である
ことは既知である。可能な限り安定なベータ因子Ｘａ組
成物を得る方法が知られている（Thrombosis Research
22, 213-220 (1981)）。この方法によれば、ベータ因子
Ｘａは０.０３Ｍイミダゾール緩衝液中、ｐＨ７.２にお
いて、５０％グリセロール中に冷蔵保存される。しかし
ながら、この方法を４℃で用いても、不活性フラグメン
トへの変換が起きる。同様の方法で、グリセロール−水
混合物中での因子Ｘａの安定化における不安定さが記載
されている（J.B iol. Chem., 248, 7729-7741 (197
3)。
【０００４】
【発明が解決すべき課題】本発明は、血液凝固障害の治
療のための安定な組成物であって、活性な凝固促進物質
を単独で、または凝固因子及び／又は補助因子又は繊維
素溶解因子と一緒に含有する組成物を利用（入手）可能
にすることを目的とするものである。「活性な凝固促進
物質」という語句は、予備的な活性化なしに凝固促進活
性を示す物質と定義される。例えば、全活性化凝固因子
及び補助因子を選択することができる。本発明はまた、
血液凝固障害の治療のための安定な組成物であって、活
性な凝固促進物質を含有し、潜在的に存在するウイルス
の不活化処理がされた組成物を利用可能にすることを目
的とするものである。
療のための安定な組成物であって、活性な凝固促進物質
を単独で、または凝固因子及び／又は補助因子又は繊維
素溶解因子と一緒に含有する組成物を利用（入手）可能
にすることを目的とするものである。「活性な凝固促進
物質」という語句は、予備的な活性化なしに凝固促進活
性を示す物質と定義される。例えば、全活性化凝固因子
及び補助因子を選択することができる。本発明はまた、
血液凝固障害の治療のための安定な組成物であって、活
性な凝固促進物質を含有し、潜在的に存在するウイルス
の不活化処理がされた組成物を利用可能にすることを目
的とするものである。
【０００５】
【課題を解決るために手段】上記の課題は、本発明の、
適当な活性凝固促進物質と小胞形のリン脂質とを含有す
る安定な組成物により解決された。活性化された凝固因
子の安定性は、因子Ｘaのような活性化凝固因子を小胞
形のリン脂質上に会合（即ち脂質小胞内又は上への結合
を介し）により予想外に増大されることが証明された。
それを用いて、溶液又は凍結形、及び／又は凍結乾燥形
での極めて良好な保存安定性が達成された。又、活性化
凝固因子が例えば凍結乾燥やウイルス不活化処理等の物
理的な不活化からも保護されていることが証明できる。
活性化された凝固因子のインビボ活性は維持されてお
り、このことも、組成物の安定性の目安である。
適当な活性凝固促進物質と小胞形のリン脂質とを含有す
る安定な組成物により解決された。活性化された凝固因
子の安定性は、因子Ｘaのような活性化凝固因子を小胞
形のリン脂質上に会合（即ち脂質小胞内又は上への結合
を介し）により予想外に増大されることが証明された。
それを用いて、溶液又は凍結形、及び／又は凍結乾燥形
での極めて良好な保存安定性が達成された。又、活性化
凝固因子が例えば凍結乾燥やウイルス不活化処理等の物
理的な不活化からも保護されていることが証明できる。
活性化された凝固因子のインビボ活性は維持されてお
り、このことも、組成物の安定性の目安である。
【０００６】本発明の組成物は、非緩衝化溶液中、通常
の安定剤の不在下での凍結乾燥及び再構成などの測定に
おいて、活性凝固促進物質の活性が４０％以上、好まし
くは５０％以上保持されている場合、そして／又は通常
の安定剤の不在下、組成物の水溶液中、２２℃で２０時
間の保存後、活性な凝固促進物質の活性が４０％以上、
好ましくは５０％、最も好ましくは６０％以上保持され
ている場合、安定であると考えられる。本発明の組成物
のインビボ注入後にも達成された極めて高い安定性から
断定されるように、本発明組成物は血液凝固障害の治療
に極めて好適である。
の安定剤の不在下での凍結乾燥及び再構成などの測定に
おいて、活性凝固促進物質の活性が４０％以上、好まし
くは５０％以上保持されている場合、そして／又は通常
の安定剤の不在下、組成物の水溶液中、２２℃で２０時
間の保存後、活性な凝固促進物質の活性が４０％以上、
好ましくは５０％、最も好ましくは６０％以上保持され
ている場合、安定であると考えられる。本発明の組成物
のインビボ注入後にも達成された極めて高い安定性から
断定されるように、本発明組成物は血液凝固障害の治療
に極めて好適である。
【０００７】タンパク質及び脂質成分で特徴付けられる
その構造に基づき、血小板性凝固活性物質（例えば血小
板中に天然に存在する血液凝固因子）の複合体の単独使
用又はさらなる凝固活性物質及び脂質小胞との併用が、
本発明における血小板代用品として適当であり、それを
用いて活性化血小板の欠乏に関連する血液凝固障害が好
適に予防及び治療できる。１つには本発明の複合体は血
小板の形を模倣し、他の機能的な類似性、例えば、タン
パク溶液中又はカルシウムイオンの存在下での凝固能又
はコラーゲン型の構造タンパク質への吸着等の他の機能
的な類似性が達成されている。従って、本発明の組成物
は血小板の機能を果たし得る。血友病Ａインヒビター血
漿の凝固時間測定のためのインビトロ試験により本発明
組成物の血友病Ａインヒビター患者の治療における有効
性の評価がなされる。有効な組成物は凝固時間を少なく
とも５０％短縮し、好ましくは正常な血漿の凝固時間に
する。
その構造に基づき、血小板性凝固活性物質（例えば血小
板中に天然に存在する血液凝固因子）の複合体の単独使
用又はさらなる凝固活性物質及び脂質小胞との併用が、
本発明における血小板代用品として適当であり、それを
用いて活性化血小板の欠乏に関連する血液凝固障害が好
適に予防及び治療できる。１つには本発明の複合体は血
小板の形を模倣し、他の機能的な類似性、例えば、タン
パク溶液中又はカルシウムイオンの存在下での凝固能又
はコラーゲン型の構造タンパク質への吸着等の他の機能
的な類似性が達成されている。従って、本発明の組成物
は血小板の機能を果たし得る。血友病Ａインヒビター血
漿の凝固時間測定のためのインビトロ試験により本発明
組成物の血友病Ａインヒビター患者の治療における有効
性の評価がなされる。有効な組成物は凝固時間を少なく
とも５０％短縮し、好ましくは正常な血漿の凝固時間に
する。
【０００８】驚くべきことには、凝固因子Ｘａとリン脂
質小胞との会合により、因子ＶIIIインヒビター血漿中
で保存安定性が良く高い半減期を有する組成物が生成で
きることが分かった。本発明の組成物は凍結乾燥して保
存することが好ましい。凍結乾燥組成物は、小胞形構造
の複合体を含有する溶液に再構成され得る。約３−２０
％（ｗ／ｗ）の量の単糖類又は二糖類等の炭水化物を加
えると好都合である。本発明の複合体の安定性は少量の
カルシウムイオンの存在でさらに増大する。凝固因子と
脂質小胞との複合体は、凝固障害の治療のための医薬組
成物中で血餅形成性でないことも証明されている。
質小胞との会合により、因子ＶIIIインヒビター血漿中
で保存安定性が良く高い半減期を有する組成物が生成で
きることが分かった。本発明の組成物は凍結乾燥して保
存することが好ましい。凍結乾燥組成物は、小胞形構造
の複合体を含有する溶液に再構成され得る。約３−２０
％（ｗ／ｗ）の量の単糖類又は二糖類等の炭水化物を加
えると好都合である。本発明の複合体の安定性は少量の
カルシウムイオンの存在でさらに増大する。凝固因子と
脂質小胞との複合体は、凝固障害の治療のための医薬組
成物中で血餅形成性でないことも証明されている。
【０００９】活性成分として、本発明の組成物はビタミ
ンＫ依存性タンパク、例えば、因子ＩＩａ、ＶIIa、Ｉ
Ｘａ及びＸａからなる群から選択される因子、好ましく
はＸａβを含有する。さらに、例えば、因子ＩＩ、ＶI
I、ＩＸ、Ｘ、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プ
ロテインＳ及びプロテインＺ等の他のタンパク質を含有
することができる。因子Ｘａと少なくとも１個の記載さ
れたタンパク質との併用が特に有用であることが示され
た。付加量の因子ＶIII、活性化因子ＶIII、及び／又は
ｖＷＦ、因子Ｖ及び／又は活性化因子Ｖが好都合であ
る。本発明の他の実施態様には、活性化血液凝固因子と
脂質小胞、及びさらには「組織因子」又は「組織因子」
の断片からなる複合体が含まれる。
ンＫ依存性タンパク、例えば、因子ＩＩａ、ＶIIa、Ｉ
Ｘａ及びＸａからなる群から選択される因子、好ましく
はＸａβを含有する。さらに、例えば、因子ＩＩ、ＶI
I、ＩＸ、Ｘ、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プ
ロテインＳ及びプロテインＺ等の他のタンパク質を含有
することができる。因子Ｘａと少なくとも１個の記載さ
れたタンパク質との併用が特に有用であることが示され
た。付加量の因子ＶIII、活性化因子ＶIII、及び／又は
ｖＷＦ、因子Ｖ及び／又は活性化因子Ｖが好都合であ
る。本発明の他の実施態様には、活性化血液凝固因子と
脂質小胞、及びさらには「組織因子」又は「組織因子」
の断片からなる複合体が含まれる。
【００１０】本発明の組成物はアゴニストとアンタゴニ
ストを同時に含有していても良い。活性凝固促進物質の
外に活性凝固促進物質の投与における副作用を緩和又は
回避するためにアンタゴニストを含有させてもよい。複
合体に含有される凝固活性物質は好ましくはヒト由来で
あり血漿画分から単離されるか、組換え起源である。潜
在的な感染性に基づいて、ウイルス又はプリオン等の感
染性物質を不活化するための処理が適当である。物質又
は物質とリン脂質との複合体を熱処理することが勧めら
れる。該処理は例えば、ＥＰ0 159 311に従い、確実に
行える。好ましい実施態様では、ウイルス不活化のため
の処理により感染性物質を含有しない、高純度の因子Ｘ
ａ（少なくとも１００ Ｕ／mgタンパク）とリン脂質小
胞との複合体が得られる。
ストを同時に含有していても良い。活性凝固促進物質の
外に活性凝固促進物質の投与における副作用を緩和又は
回避するためにアンタゴニストを含有させてもよい。複
合体に含有される凝固活性物質は好ましくはヒト由来で
あり血漿画分から単離されるか、組換え起源である。潜
在的な感染性に基づいて、ウイルス又はプリオン等の感
染性物質を不活化するための処理が適当である。物質又
は物質とリン脂質との複合体を熱処理することが勧めら
れる。該処理は例えば、ＥＰ0 159 311に従い、確実に
行える。好ましい実施態様では、ウイルス不活化のため
の処理により感染性物質を含有しない、高純度の因子Ｘ
ａ（少なくとも１００ Ｕ／mgタンパク）とリン脂質小
胞との複合体が得られる。
【００１１】その安定性に基づいて、組成物は何等の追
加なしに、即ち、炭水化物（ショ糖）又はプロテアーゼ
阻害剤（アプロチニン）等の通常用いられる安定剤を添
加せずに、液状組成物として得ることができる。しかし
ながら、該組成物は液体−凍結形又は凍結乾燥形で保存
し得、この場合、多糖類の存在は水の除去に好都合であ
る。本発明によれば、小胞形のリン脂質を脂質小胞とし
て用い得る。リン脂質は合成又は天然起源のいずれでも
よい。化学的に純粋なリン脂質の標準化（評定された）
混合物が有利である。
加なしに、即ち、炭水化物（ショ糖）又はプロテアーゼ
阻害剤（アプロチニン）等の通常用いられる安定剤を添
加せずに、液状組成物として得ることができる。しかし
ながら、該組成物は液体−凍結形又は凍結乾燥形で保存
し得、この場合、多糖類の存在は水の除去に好都合であ
る。本発明によれば、小胞形のリン脂質を脂質小胞とし
て用い得る。リン脂質は合成又は天然起源のいずれでも
よい。化学的に純粋なリン脂質の標準化（評定された）
混合物が有利である。
【００１２】脂質小胞はリン脂質分散物（分散物）の音
波処理（Barenholz et al., Biochemistry 16, 2806-28
10, 1977)、逆相蒸発法（F. Szoka and D. Paphadjopou
los,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198, 197
8)、エタノール注入法（S.Batzri and E.D. Korn, Bioc
hem. Biophys. Acta 298, 1015-1019, 1973）又は透析
による混合ミセルからの界面活性剤の除去（O.Zumbuehl
and H.G. Weder, Biochem. Biophys. Acta 640, 252-2
62, 1981）等の様々な方法で調製できる。さらに、オル
ソンら（Olson et al., Biochem. Biophys. Acta 557,
9-23, 1979）の押し出し法も使用できる。多重ラメラ小
胞の分散物は、好ましくは有機溶媒中の脂質溶液をロー
タリーエバポレーターを用いて蒸発させることにより得
られる脂質フィルムの水和により得ることができる。こ
の分散物を窒素圧を用い、２個の重層ポリカーボナート
フィルターを通して押し出す。
波処理（Barenholz et al., Biochemistry 16, 2806-28
10, 1977)、逆相蒸発法（F. Szoka and D. Paphadjopou
los,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198, 197
8)、エタノール注入法（S.Batzri and E.D. Korn, Bioc
hem. Biophys. Acta 298, 1015-1019, 1973）又は透析
による混合ミセルからの界面活性剤の除去（O.Zumbuehl
and H.G. Weder, Biochem. Biophys. Acta 640, 252-2
62, 1981）等の様々な方法で調製できる。さらに、オル
ソンら（Olson et al., Biochem. Biophys. Acta 557,
9-23, 1979）の押し出し法も使用できる。多重ラメラ小
胞の分散物は、好ましくは有機溶媒中の脂質溶液をロー
タリーエバポレーターを用いて蒸発させることにより得
られる脂質フィルムの水和により得ることができる。こ
の分散物を窒素圧を用い、２個の重層ポリカーボナート
フィルターを通して押し出す。
【００１３】この方法はリン脂質が液体−結晶状態であ
る温度（相転移温度ＴMよりも少なくとも５℃、好まし
くは少なくとも１０℃上）で行うべきである。所望によ
り、押し出しの前に凍結−解凍サイクルを繰り返す（M.
J.Hope et al., Biochem. Biophys. Acta 812, 55-65,
1985）。さらに、１つの実施態様が特に好都合であるこ
とが分かった。ここでは、上記概要のごとく、多重ラメ
ラ小胞の分散物を得、凍結乾燥し、水で再構成する。そ
れにより、以後の押し出しを特に容易かつ高脂質濃度
（例えば、１００mg脂質／ml）で行うことができる。
る温度（相転移温度ＴMよりも少なくとも５℃、好まし
くは少なくとも１０℃上）で行うべきである。所望によ
り、押し出しの前に凍結−解凍サイクルを繰り返す（M.
J.Hope et al., Biochem. Biophys. Acta 812, 55-65,
1985）。さらに、１つの実施態様が特に好都合であるこ
とが分かった。ここでは、上記概要のごとく、多重ラメ
ラ小胞の分散物を得、凍結乾燥し、水で再構成する。そ
れにより、以後の押し出しを特に容易かつ高脂質濃度
（例えば、１００mg脂質／ml）で行うことができる。
【００１４】本発明の複合体を製造するためには、小胞
分散物とタンパク質、好ましくは凝固因子Ｘａとを混合
した後、上記凍結乾燥工程を行う。再構成後、本発明の
複合体をさらに押し出すことができる。さらに、本発明
の複合体の可能な製造方法として、成分を界面活性剤
（tenside）の存在下で混合し、次いで、例えば透析に
より界面活性剤を除去する。タンパク溶液による脂質フ
ィルムの直接の水和も特に好都合であり、ここで、所望
により凍結乾燥及び再構成を行うことにより、押し出し
がより容易になる。最後の変法として、所望により、余
分の凍結乾燥工程無しで済ませることができる。調製し
た小胞とタンパク質とを荷電した粒子の存在下、又はタ
ンパク質を脂質小胞の中又は上に組み込ませるような条
件下（濃度、疎水性タンパク質の選択等）で直接混合す
ることも考えられる。
分散物とタンパク質、好ましくは凝固因子Ｘａとを混合
した後、上記凍結乾燥工程を行う。再構成後、本発明の
複合体をさらに押し出すことができる。さらに、本発明
の複合体の可能な製造方法として、成分を界面活性剤
（tenside）の存在下で混合し、次いで、例えば透析に
より界面活性剤を除去する。タンパク溶液による脂質フ
ィルムの直接の水和も特に好都合であり、ここで、所望
により凍結乾燥及び再構成を行うことにより、押し出し
がより容易になる。最後の変法として、所望により、余
分の凍結乾燥工程無しで済ませることができる。調製し
た小胞とタンパク質とを荷電した粒子の存在下、又はタ
ンパク質を脂質小胞の中又は上に組み込ませるような条
件下（濃度、疎水性タンパク質の選択等）で直接混合す
ることも考えられる。
【００１５】押し出し工程には、直径約３０〜１０００
nmの特定のフィルターを用いることができる。代表的な
脂質小胞の大きさ（動的光散乱法により測定）は３０〜
９００nm、好ましくは１００〜５００nmの範囲である。
生産された複合体の安定性は、カルシウムイオンのよう
な荷電粒子（好ましくは１−１０ｍＭ）が存在すること
で増進される。脂質小胞の中及び上への凝固タンパク質
の結合に基づいて、複合体を自体そのままで精製及び単
離することが可能である。これは、ゲルろ過又は超遠心
で行われる。
nmの特定のフィルターを用いることができる。代表的な
脂質小胞の大きさ（動的光散乱法により測定）は３０〜
９００nm、好ましくは１００〜５００nmの範囲である。
生産された複合体の安定性は、カルシウムイオンのよう
な荷電粒子（好ましくは１−１０ｍＭ）が存在すること
で増進される。脂質小胞の中及び上への凝固タンパク質
の結合に基づいて、複合体を自体そのままで精製及び単
離することが可能である。これは、ゲルろ過又は超遠心
で行われる。
【００１６】負の電荷を示し得るグリセロリン脂質ホス
ファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジル
グリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジ
オリピン）及びホスファチジルエタノールアミンは好適
なリン脂質に含まれ、好ましくは単独、又はホスファチ
ジルコリン及びスフィンゴミエリン等の中性リン脂質と
一緒に用いられ、この場合、カルシウムイオンの添加に
よる結合が好ましい。陰イオン性成分としては、他の脂
質、例えばスルファチドの使用、又はジセチルホスフェ
ート、ホスファチジルメタノール、ホスファチジル−β
−ラクテート及びオレイン酸の使用も可能である。しか
しながら、ホスファチジルコリン又はスフィンゴミエリ
ン等の中性リン脂質を専ら使用することも考えられる。
しかしながら、ポリエチレングリコールの脂質誘導体の
ような化学修飾により得られた物質又はリゾリン脂質又
は糖脂質のクラス由来の物質も使用できる。例えば、ス
テアリルアミン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウ
ムブロミド（ＤＤＡＢ）等の正の電荷を示し得る脂質の
使用、又は１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニ
ウムプロパン（ＴＡＰ）又は１，２−ジアシル−３−ジ
メチルアンモニウムプロパン（ＤＡＰ）型の陽イオン性
脂質の使用も考えられる。
ファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジル
グリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジ
オリピン）及びホスファチジルエタノールアミンは好適
なリン脂質に含まれ、好ましくは単独、又はホスファチ
ジルコリン及びスフィンゴミエリン等の中性リン脂質と
一緒に用いられ、この場合、カルシウムイオンの添加に
よる結合が好ましい。陰イオン性成分としては、他の脂
質、例えばスルファチドの使用、又はジセチルホスフェ
ート、ホスファチジルメタノール、ホスファチジル−β
−ラクテート及びオレイン酸の使用も可能である。しか
しながら、ホスファチジルコリン又はスフィンゴミエリ
ン等の中性リン脂質を専ら使用することも考えられる。
しかしながら、ポリエチレングリコールの脂質誘導体の
ような化学修飾により得られた物質又はリゾリン脂質又
は糖脂質のクラス由来の物質も使用できる。例えば、ス
テアリルアミン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウ
ムブロミド（ＤＤＡＢ）等の正の電荷を示し得る脂質の
使用、又は１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニ
ウムプロパン（ＴＡＰ）又は１，２−ジアシル−３−ジ
メチルアンモニウムプロパン（ＤＡＰ）型の陽イオン性
脂質の使用も考えられる。
【００１７】好ましい実施態様は、例えば、アルキルリ
ン脂質（ＥＰ0 506 704 B1参考）等の抗ウイスル作用を
有する脂質の使用を含む。安定化のためには、付加的な
成分としてリン脂質小胞は８０モル％までのコレステロ
ールを含有することができる。強調される点は、全ての
特定の脂質は単一成分として、所望によりコレステロー
ルを添加して用い得るということである。複合体の形成
のためには、脂質小胞はゲル状又は液体−結晶状である
が、液体−結晶状の系を用いることがより好ましい。本
発明の説明においては、１，２−ジオレオイル−sn−グ
リセロー３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−
オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（例え
ば、ＰＣ／ＰＳ＝８０／２０（w/w））からなる脂質小
胞であり、室温で液体−結晶である脂質小胞を用いる
（実施例１）。しかしながら、不飽和側鎖を有するリン
脂質の使用は酸化により安定性の低下を招き得る。従っ
て、小胞の化学的安定性のためには、ミリスチン酸、パ
ルミチン酸（実施例２及び３）又はステアリン酸等（こ
れらは通常ゲル状態であるが）の脂肪酸基を有する脂質
の使用が好ましい。しかしながら、これら脂質は、コレ
ステロールとの混合物として使用することが特に好都合
であることが分かった。
ン脂質（ＥＰ0 506 704 B1参考）等の抗ウイスル作用を
有する脂質の使用を含む。安定化のためには、付加的な
成分としてリン脂質小胞は８０モル％までのコレステロ
ールを含有することができる。強調される点は、全ての
特定の脂質は単一成分として、所望によりコレステロー
ルを添加して用い得るということである。複合体の形成
のためには、脂質小胞はゲル状又は液体−結晶状である
が、液体−結晶状の系を用いることがより好ましい。本
発明の説明においては、１，２−ジオレオイル−sn−グ
リセロー３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−
オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（例え
ば、ＰＣ／ＰＳ＝８０／２０（w/w））からなる脂質小
胞であり、室温で液体−結晶である脂質小胞を用いる
（実施例１）。しかしながら、不飽和側鎖を有するリン
脂質の使用は酸化により安定性の低下を招き得る。従っ
て、小胞の化学的安定性のためには、ミリスチン酸、パ
ルミチン酸（実施例２及び３）又はステアリン酸等（こ
れらは通常ゲル状態であるが）の脂肪酸基を有する脂質
の使用が好ましい。しかしながら、これら脂質は、コレ
ステロールとの混合物として使用することが特に好都合
であることが分かった。
【００１８】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく
説明する。 リン脂質小胞の生産実施例１ 多重ラメラ小胞の生産 １００ｍｌフラスコ中、１，２−ジオレオニル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホコリン（４０．０ｍｇ）及び１−
パルミトイル−２−オレオニル−ｓｎ−グリセロ−３−
ホスホセリン（１０．０ｍｇ、Ａｖａｎｔｉ極性脂質）
をクロロホルム（５ｍｌ）中に溶解し、減圧下、３０℃
の温度において、ロータリーエバポレーターを補助器具
として用いて蒸発した。溶媒を完全に除去した後、減圧
を３０ｍｂａｒにおいて３０分持続し、その後０．１ｍ
ｂａｒの高減圧にて６時間乾燥した。その後、５ｍｌの
バッファー（２０ｍＭトリス、１５０ｍｌ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．４）を加えてリン脂質フィルムを水和し、室温
において１時間穏やかに振盪した。
説明する。 リン脂質小胞の生産実施例１ 多重ラメラ小胞の生産 １００ｍｌフラスコ中、１，２−ジオレオニル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホコリン（４０．０ｍｇ）及び１−
パルミトイル−２−オレオニル−ｓｎ−グリセロ−３−
ホスホセリン（１０．０ｍｇ、Ａｖａｎｔｉ極性脂質）
をクロロホルム（５ｍｌ）中に溶解し、減圧下、３０℃
の温度において、ロータリーエバポレーターを補助器具
として用いて蒸発した。溶媒を完全に除去した後、減圧
を３０ｍｂａｒにおいて３０分持続し、その後０．１ｍ
ｂａｒの高減圧にて６時間乾燥した。その後、５ｍｌの
バッファー（２０ｍＭトリス、１５０ｍｌ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．４）を加えてリン脂質フィルムを水和し、室温
において１時間穏やかに振盪した。
【００１９】実施例２ 実施例１により多重ラメラ小胞分散物を形成後、これを
Ｎ2圧下に２層の１００ｎｍポリカルボネートフィルタ
ー（１０ｍｌセルモバレル エクストルーダー、Ｌｉｐ
ｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｉｎｃ．、バンクー
バー、カナダ）を通して１０回押し出した。この方法で
製造された小胞の粒子サイズの測定を動的光散乱（Ｍａ
ｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ４）の補助器具を用
いて行うと、平均直径約１００ｎｍであった。
Ｎ2圧下に２層の１００ｎｍポリカルボネートフィルタ
ー（１０ｍｌセルモバレル エクストルーダー、Ｌｉｐ
ｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｉｎｃ．、バンクー
バー、カナダ）を通して１０回押し出した。この方法で
製造された小胞の粒子サイズの測定を動的光散乱（Ｍａ
ｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ４）の補助器具を用
いて行うと、平均直径約１００ｎｍであった。
【００２０】実施例３ クロロホルム／メタノール混合物（２：１、ｖ／ｖ）
（５ｍｌ）中の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン（Ｎａｔｔｅｒｍａｎ リン酸脂
質 ＧｍｂＨ）（３５．０ｍｇ）及び１，２−ジミリス
トイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホセリン（Ａｖａｎ
ｔｉ 極性脂質）（１５．０ｍｇ）から、実施例１に記
載の様にリン脂質フィルムを製造した。バッファー５ｍ
ｌ（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
４）を加えた後、５０℃においてロータリーエバポレー
ターを用いてこのフィルムを水和し、５０℃にて実施例
２に記載の様に押し出した。
（５ｍｌ）中の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン（Ｎａｔｔｅｒｍａｎ リン酸脂
質 ＧｍｂＨ）（３５．０ｍｇ）及び１，２−ジミリス
トイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホセリン（Ａｖａｎ
ｔｉ 極性脂質）（１５．０ｍｇ）から、実施例１に記
載の様にリン脂質フィルムを製造した。バッファー５ｍ
ｌ（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
４）を加えた後、５０℃においてロータリーエバポレー
ターを用いてこのフィルムを水和し、５０℃にて実施例
２に記載の様に押し出した。
【００２１】実施例４ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリン（Ｎａｔｔｅｒｍａｎ リン脂質 ＧｍｂＨ）
（３５．０ｍｇ）及び１，２−ジミリストイル−ｓｎ−
グレセロ−３−ホスホセリン（Ａｖａｎｔｉ 極性脂
質）（１５．０ｍｇ）の混合物から、実施例３に記載の
様にリン脂質小胞を製造した。フィルムの水和及び押し
出しはまた５０℃にて実施した。
コリン（Ｎａｔｔｅｒｍａｎ リン脂質 ＧｍｂＨ）
（３５．０ｍｇ）及び１，２−ジミリストイル−ｓｎ−
グレセロ−３−ホスホセリン（Ａｖａｎｔｉ 極性脂
質）（１５．０ｍｇ）の混合物から、実施例３に記載の
様にリン脂質小胞を製造した。フィルムの水和及び押し
出しはまた５０℃にて実施した。
【００２２】実施例５ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（Ｓｉｇｍａ）（４０．０ｍｇ）及び１，２−ジオ
レオイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホグリセロール
（１０．０ｍｇ）又は牛心臓由来のカルディオリピン１
７．５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）の混合物から、リン脂質小胞
を実施例１及び２に記載の様に製造した。
リン（Ｓｉｇｍａ）（４０．０ｍｇ）及び１，２−ジオ
レオイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホグリセロール
（１０．０ｍｇ）又は牛心臓由来のカルディオリピン１
７．５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）の混合物から、リン脂質小胞
を実施例１及び２に記載の様に製造した。
【００２３】実施例６ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（４０．０ｍｇ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ
−グレセロ−３−ホスフェート（１０．０ｍｇ）（Ｓｉ
ｇｍａ）の混合物から、リン脂質小胞を実施例１及び２
に記載の様に製造した。
リン（４０．０ｍｇ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ
−グレセロ−３−ホスフェート（１０．０ｍｇ）（Ｓｉ
ｇｍａ）の混合物から、リン脂質小胞を実施例１及び２
に記載の様に製造した。
【００２４】実施例７ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（３５．０ｍｇ）及び１−パルミトイル−２−オレ
オイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホセリン（Ａｖａｎ
ｔｉ 極性脂質）（１０．０ｍｇ）又は大豆由来のホス
ファチジルイノシートール（５ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ）の
混合物から、リン脂質小胞を実施例１及び２に記載の様
に製造した。
リン（３５．０ｍｇ）及び１−パルミトイル−２−オレ
オイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホセリン（Ａｖａｎ
ｔｉ 極性脂質）（１０．０ｍｇ）又は大豆由来のホス
ファチジルイノシートール（５ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ）の
混合物から、リン脂質小胞を実施例１及び２に記載の様
に製造した。
【００２５】実施例８ 実施例１〜７にて記載されたホスファチジルコリン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジン酸及び／又はホスファチジルイノシトール
の混合物に、コレステロール（５〜８０モル％）（Ｓｉ
ｇｍａ）を加え、各々の実施例に記載の様に押し出し
た。
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジン酸及び／又はホスファチジルイノシトール
の混合物に、コレステロール（５〜８０モル％）（Ｓｉ
ｇｍａ）を加え、各々の実施例に記載の様に押し出し
た。
【００２６】実施例９ リン脂質フィルムを水和後、実施例１−８で調製した分
散物をショック凍結（液体Ｎ2）し、３７℃にて（実施
例２、５−８）及び／又は５０℃（実施例３及び４）に
て溶解した。この工程を４回繰り返した。この方法にて
製造された多重ラメラ小胞を各々の実施例にて記載した
様に押し出した。それから得られた小胞調製物は平均直
径１００ｎｍであった。
散物をショック凍結（液体Ｎ2）し、３７℃にて（実施
例２、５−８）及び／又は５０℃（実施例３及び４）に
て溶解した。この工程を４回繰り返した。この方法にて
製造された多重ラメラ小胞を各々の実施例にて記載した
様に押し出した。それから得られた小胞調製物は平均直
径１００ｎｍであった。
【００２７】実施例１０ 実施例１−９に記載の様に、多重ラメラ小胞をリン脂質
フィルムの水和により製造した。この方法にて得られた
分散物を−８０℃にて凍結し、凍結乾燥した。この凍結
乾燥物を相当する体積のＨ2Ｏを用いて再構築した後、
各々の実施例に記載の様に押し出しを行った。
フィルムの水和により製造した。この方法にて得られた
分散物を−８０℃にて凍結し、凍結乾燥した。この凍結
乾燥物を相当する体積のＨ2Ｏを用いて再構築した後、
各々の実施例に記載の様に押し出しを行った。
【００２８】実施例１１ 実施例１−１０に記載のリン脂質小胞の製造をトリスバ
ッファーの代わりに１５０ｍＭ ＮａＣｌ中にて行っ
た。動的光散乱の補助装置を用いてこの小胞のサイズを
測定すると、バッファー化溶液を用いて製造された小胞
と比較して殆ど同様のサイズ分布であった。
ッファーの代わりに１５０ｍＭ ＮａＣｌ中にて行っ
た。動的光散乱の補助装置を用いてこの小胞のサイズを
測定すると、バッファー化溶液を用いて製造された小胞
と比較して殆ど同様のサイズ分布であった。
【００２９】実施例１２ １，２−ジオレオイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスファチジルコリン １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホコ
リン（Ａｖａｎｔｉ極性脂質）（８．０ｍｇ）、大豆由
来のホスファチジルイノシトール（２．０ｍｇ）（Ｓｉ
ｇｍａ）及びコール酸ナトリウム塩（１０．０ｍｇ、Ｓ
ｉｇｍａ）の混合物を５０ｍｌの丸フラスコに加え、ク
ロロホルム／メタノール混合物（１：１，ｖ／ｖ）（１
０ｍｌ）に溶解した。次に、これを減圧下、２０℃の浴
温度にてロータリィーエバポレーター中にて乾燥するま
で蒸発し、無水アルコール１０ｍｌ中に採り、再度蒸発
した。この方法で製造されたフィルムをバッファー２ｍ
ｌ（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
４）を用いて振盪した。小胞の製造のために、その後、
澄んだ溶液を、４℃にて同じバッファーに対して２４時
間透析した。動的光散乱の補助装置を用いて粒子サイズ
を決定すると平均直径は約７０ｎｍであった。
−グリセロ−３−ホスファチジルコリン １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グレセロ−３−ホスホコ
リン（Ａｖａｎｔｉ極性脂質）（８．０ｍｇ）、大豆由
来のホスファチジルイノシトール（２．０ｍｇ）（Ｓｉ
ｇｍａ）及びコール酸ナトリウム塩（１０．０ｍｇ、Ｓ
ｉｇｍａ）の混合物を５０ｍｌの丸フラスコに加え、ク
ロロホルム／メタノール混合物（１：１，ｖ／ｖ）（１
０ｍｌ）に溶解した。次に、これを減圧下、２０℃の浴
温度にてロータリィーエバポレーター中にて乾燥するま
で蒸発し、無水アルコール１０ｍｌ中に採り、再度蒸発
した。この方法で製造されたフィルムをバッファー２ｍ
ｌ（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
４）を用いて振盪した。小胞の製造のために、その後、
澄んだ溶液を、４℃にて同じバッファーに対して２４時
間透析した。動的光散乱の補助装置を用いて粒子サイズ
を決定すると平均直径は約７０ｎｍであった。
【００３０】ショ糖の存在下におけるリン脂質の凍結乾
燥実施例１３ ３−２０％（ｗ／ｖ）の濃度までのショ糖を、実施例１
−１２に対応して製造された小胞に加えた。その後、こ
れを−８０℃にて凍結し、凍結乾燥した。この凍結乾燥
物を再構築した後、動的光散乱の補助装置を用いてサイ
ズを測定すると平均直径は約１００ｎｍであった。負の
染色法を用いた視覚化によるこの溶液の電子顕微鏡試験
によると、サイズ分布は約８０から１３０ｎｍであっ
た。
燥実施例１３ ３−２０％（ｗ／ｖ）の濃度までのショ糖を、実施例１
−１２に対応して製造された小胞に加えた。その後、こ
れを−８０℃にて凍結し、凍結乾燥した。この凍結乾燥
物を再構築した後、動的光散乱の補助装置を用いてサイ
ズを測定すると平均直径は約１００ｎｍであった。負の
染色法を用いた視覚化によるこの溶液の電子顕微鏡試験
によると、サイズ分布は約８０から１３０ｎｍであっ
た。
【００３１】因子Ｘa複合体及びリン脂質小胞の製造実施例１４ 共凍結乾燥 因子Ｘaを以下の様に製造した。Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉ
ｓ法（血漿タンパク質フラクション化法、Ｊ．Ｍ．Ｃｕ
ｒｌｉｎｇ編、１１７頁、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ．、１
９８０）により製造し、ＥＰ ０ １５９ ３１１の方
法により加熱処理したプロトロンビン複合体調製物の溶
液（５０，０００Ｕ因子Ｘ／ｌに相当する）を、ｐＨ
７．０及び室温にて１時間、１２％（ｖ／ｖ）ツイーン
（登録商標）８０の存在下にて処理した。その後、これ
を希釈し、トリソジウム シトレート ジハイドレート
（７．０ｇ／ｌ）と混合し、塩化バリウム溶液（４００
ｍｌ、１Ｍ）を加えることにより、ｐＨ７．０にてプロ
トロンビン複合体のタンパク質を沈澱させた。この沈澱
物を洗浄し、５０ｍＭベンズアミジン ＨＣｌを含む硫
酸アンモニウム溶液（２５％、ｗ／ｖ）中に懸濁した。
非−溶解物を分離し、タンパク質を再度沈澱させるため
に硫酸アンモニウムを用いてこの溶液を８０％飽和させ
た。この沈澱物をバッファーに溶解し、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ及び１ｍＭベンズアミジン ＨＣｌを含む２５ｍ
Ｍトリソジウム シトレート バッファー、ｐＨ６．０
に対してセファデックス（登録商標）−Ｇ２５上におけ
るクロマトグラフィーにて再度バッファー化した。
ｓ法（血漿タンパク質フラクション化法、Ｊ．Ｍ．Ｃｕ
ｒｌｉｎｇ編、１１７頁、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ．、１
９８０）により製造し、ＥＰ ０ １５９ ３１１の方
法により加熱処理したプロトロンビン複合体調製物の溶
液（５０，０００Ｕ因子Ｘ／ｌに相当する）を、ｐＨ
７．０及び室温にて１時間、１２％（ｖ／ｖ）ツイーン
（登録商標）８０の存在下にて処理した。その後、これ
を希釈し、トリソジウム シトレート ジハイドレート
（７．０ｇ／ｌ）と混合し、塩化バリウム溶液（４００
ｍｌ、１Ｍ）を加えることにより、ｐＨ７．０にてプロ
トロンビン複合体のタンパク質を沈澱させた。この沈澱
物を洗浄し、５０ｍＭベンズアミジン ＨＣｌを含む硫
酸アンモニウム溶液（２５％、ｗ／ｖ）中に懸濁した。
非−溶解物を分離し、タンパク質を再度沈澱させるため
に硫酸アンモニウムを用いてこの溶液を８０％飽和させ
た。この沈澱物をバッファーに溶解し、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ及び１ｍＭベンズアミジン ＨＣｌを含む２５ｍ
Ｍトリソジウム シトレート バッファー、ｐＨ６．０
に対してセファデックス（登録商標）−Ｇ２５上におけ
るクロマトグラフィーにて再度バッファー化した。
【００３２】タンパク質含有画分をさらにＤＥＡＥセフ
ァロース（登録商標）速流カラムの方法にてさらに精製
した。くえん酸バッファー（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中
の塩化ナトリウム濃度を増加することにより、他のプロ
トロンビン複合体タンパク質から因子Ｘを分離して溶出
した。得られた画分を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び
２ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス ＨＣｌバ
ッファー（ｐＨ７．４）に対して再度バッファー化し
た。その後、１００Ｕ ＦＸ当たり０．１４ｍｇのＲＶ
Ｖ（ラッセルのくさりへび毒(viper venom)、くさりへ
び由来のプロテアーゼ、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）とこれ
を混合し、室温にて１時間撹拌した。生成した因子Ｘa
を次にベンズアミジン セファロース（登録商標）カラ
ムを用いたクロマトグラフィーにより精製し、硫酸アン
モニウム沈澱により濃縮し、次にその塩を回収するため
にセファデックス（登録商標）−Ｇ２５上でクロマトグ
ラフィーをおこなった。製造された因子Ｘa調製物は少
なくとも１００Ｕ因子Ｘa／ｍｇタンパク質の比活性を
有していた。複合体の製造のために、２．５ｍＭ塩化カ
ルシウムを含む又は不含の実施例１−１２により製造さ
れた小胞調製物を因子Ｘaフラクションに混合した。こ
の溶液を凍結乾燥した。
ァロース（登録商標）速流カラムの方法にてさらに精製
した。くえん酸バッファー（２５ｍＭ、ｐＨ６．０）中
の塩化ナトリウム濃度を増加することにより、他のプロ
トロンビン複合体タンパク質から因子Ｘを分離して溶出
した。得られた画分を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び
２ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス ＨＣｌバ
ッファー（ｐＨ７．４）に対して再度バッファー化し
た。その後、１００Ｕ ＦＸ当たり０．１４ｍｇのＲＶ
Ｖ（ラッセルのくさりへび毒(viper venom)、くさりへ
び由来のプロテアーゼ、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）とこれ
を混合し、室温にて１時間撹拌した。生成した因子Ｘa
を次にベンズアミジン セファロース（登録商標）カラ
ムを用いたクロマトグラフィーにより精製し、硫酸アン
モニウム沈澱により濃縮し、次にその塩を回収するため
にセファデックス（登録商標）−Ｇ２５上でクロマトグ
ラフィーをおこなった。製造された因子Ｘa調製物は少
なくとも１００Ｕ因子Ｘa／ｍｇタンパク質の比活性を
有していた。複合体の製造のために、２．５ｍＭ塩化カ
ルシウムを含む又は不含の実施例１−１２により製造さ
れた小胞調製物を因子Ｘaフラクションに混合した。こ
の溶液を凍結乾燥した。
【００３３】再構築した後、この調製物のＦＥＩＢＡ試
験（試験の記載はＡＴ３５０ ７２６を参照せよ）にお
ける効果を試験した。これと比較するために、非−複合
化因子ＸaのＦＥＩＢ活性を測定した。凍結乾燥の前に
は、両方の場合において、ＦＥＩＢ活性は１７００Ｕ／
ｍｌに達した。凍結乾燥及び再構築後には、因子Ｘa／
ＰＣＰＳ複合体の場合には１６５０Ｕ／ｍｌを取り戻し
た。ＦＥＩＢ活性の損失は、非−複合化因子Ｘaの場合は
もっと大きかった。１２２０Ｕ／ｍｌのみを回収した。
験（試験の記載はＡＴ３５０ ７２６を参照せよ）にお
ける効果を試験した。これと比較するために、非−複合
化因子ＸaのＦＥＩＢ活性を測定した。凍結乾燥の前に
は、両方の場合において、ＦＥＩＢ活性は１７００Ｕ／
ｍｌに達した。凍結乾燥及び再構築後には、因子Ｘa／
ＰＣＰＳ複合体の場合には１６５０Ｕ／ｍｌを取り戻し
た。ＦＥＩＢ活性の損失は、非−複合化因子Ｘaの場合は
もっと大きかった。１２２０Ｕ／ｍｌのみを回収した。
【００３４】実施例１５ 共凍結乾燥物の押し出し １,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリ
ン（４０.０mg）及び１，２−ジオレオイル−sn−グリ
セロ−３−ホスフェート（１０.０mg）の実施例６によ
り製造されたリン脂質調製物（５０ｍｇ）並びに因子Ｘ
a１０００Ｕを含む実施例１４により製造された共凍結
乾燥物を元来の体積の水を用いて処理し、２０℃にて、
２層の４００ｎｍポリカルボネートフィルター（Lipex
Biomembranes,Inc.）を通して２回押し出した。動的光
散乱（Malvern Zetasizer 4）の補助装置を用いて粒子
サイズを測定すると、平均直径は約４５０ｎｍであっ
た。
ン（４０.０mg）及び１，２−ジオレオイル−sn−グリ
セロ−３−ホスフェート（１０.０mg）の実施例６によ
り製造されたリン脂質調製物（５０ｍｇ）並びに因子Ｘ
a１０００Ｕを含む実施例１４により製造された共凍結
乾燥物を元来の体積の水を用いて処理し、２０℃にて、
２層の４００ｎｍポリカルボネートフィルター（Lipex
Biomembranes,Inc.）を通して２回押し出した。動的光
散乱（Malvern Zetasizer 4）の補助装置を用いて粒子
サイズを測定すると、平均直径は約４５０ｎｍであっ
た。
【００３５】実施例１６ 共押し出し 実施例１に記載の様に、フィルムをリン脂質混合物から
製造した。これを、実施例１４からの因子Ｘa含有溶液
を用いて、２．５ｍＭ塩化カルシウムと共に又はこれを
用いずに、水和した。フィルムの水和後、実施例２、９
及び１０の様に実施し、押し出した。これによって、因
子Ｘaはリン脂質小胞と複合体を形成した。その後の凍
結乾燥のために、ショ糖（濃度３−２０％，ｗ／ｖ）を
この方法で製造された複合体に加えた。
製造した。これを、実施例１４からの因子Ｘa含有溶液
を用いて、２．５ｍＭ塩化カルシウムと共に又はこれを
用いずに、水和した。フィルムの水和後、実施例２、９
及び１０の様に実施し、押し出した。これによって、因
子Ｘaはリン脂質小胞と複合体を形成した。その後の凍
結乾燥のために、ショ糖（濃度３−２０％，ｗ／ｖ）を
この方法で製造された複合体に加えた。
【００３６】活性化されたプロテインＣ、因子Ｘa及び
リン脂質小胞複合体の製造実施例１７ フィルムをリン脂質混合物から実施例１に記載の様に製
造した。１５０ｍＭＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ2を
含む２０ｍＭトリス ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４中
の活性化されたプロテインＣ並びに実施例１４からの因
子Ｘaを含むフラクションを用いて、これを水和した。
１０Ｕ ＦＸa／ｍｌ、１０Ｕ ＡＰＣ／ｍｌ及び１０
ｍｇリン脂質／ｍｌを含む混合物を凍結乾燥した。
リン脂質小胞複合体の製造実施例１７ フィルムをリン脂質混合物から実施例１に記載の様に製
造した。１５０ｍＭＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ2を
含む２０ｍＭトリス ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４中
の活性化されたプロテインＣ並びに実施例１４からの因
子Ｘaを含むフラクションを用いて、これを水和した。
１０Ｕ ＦＸa／ｍｌ、１０Ｕ ＡＰＣ／ｍｌ及び１０
ｍｇリン脂質／ｍｌを含む混合物を凍結乾燥した。
【００３７】因子Ｘa及びＰＣＰＳ小胞複合体の精製実施例１８ 因子Ｘa及びＰＣＰＳ小胞を含む調製物は実施例１４又
は１６に記載の方法により製造し、この場合、ショ糖を
最終濃度５％（ｗ／ｖ）にて因子Ｘaリン脂質調製物に
加えた。調製された溶液が２．４Ｕ因子Ｘa／ｍｌ及び
ＰＣＰＳ小胞（１ｍｇ／ｍｌ）を含む様にこの凍結乾燥
物を水に溶解した。セファロース６ ＨＲ１０／３０；
ファルマシア）を詰めたカラムを、バッファー（１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％アルブミン、０．０１％ツイ
ーン２０、１ｍＭＣａＣｌ2を含む２０ｍＭトリス Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した。ＰＣＰＳ小胞及び因
子Ｘaを含む調製物５００μｌを流速０．４ｍｌ／分に
てこのカラム上のクロマトグラフィーにかけた。溶出流
の２５４ｎｍにおける吸収を測定した。ＰＣＰＳ小胞及
び因子Ｘaを含む排除容積画分を集めた。
は１６に記載の方法により製造し、この場合、ショ糖を
最終濃度５％（ｗ／ｖ）にて因子Ｘaリン脂質調製物に
加えた。調製された溶液が２．４Ｕ因子Ｘa／ｍｌ及び
ＰＣＰＳ小胞（１ｍｇ／ｍｌ）を含む様にこの凍結乾燥
物を水に溶解した。セファロース６ ＨＲ１０／３０；
ファルマシア）を詰めたカラムを、バッファー（１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％アルブミン、０．０１％ツイ
ーン２０、１ｍＭＣａＣｌ2を含む２０ｍＭトリス Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した。ＰＣＰＳ小胞及び因
子Ｘaを含む調製物５００μｌを流速０．４ｍｌ／分に
てこのカラム上のクロマトグラフィーにかけた。溶出流
の２５４ｎｍにおける吸収を測定した。ＰＣＰＳ小胞及
び因子Ｘaを含む排除容積画分を集めた。
【００３８】実施例１９ 実施例１４により製造された凍結乾燥物を、最終の溶液
が因子Ｘa（５Ｕ）及びＰＣＰＳ（５mg/ml）を含む様に
水で再構築した。この溶液（０．５ml）を、ficoll４０
０溶液［３０％（w/v）、１ml、ファルマシア、１５０m
Ｍ塩化ナトリウム溶液中］と混合した。この混合物を超
遠心分離試験管に移し、ficoll溶液（１０％、３ｍｌ）
を重層した。最後にこれをＮaＣl溶液（１５０ml）で重
層し、その後、室温にて、３０分間、１００,０００ｇ
で回転振動して遠心分離した。水溶液よりも低い密度の
精製された因子Ｘa／ＰＣＰＳ複合体を含む層を上清と
して分離した。
が因子Ｘa（５Ｕ）及びＰＣＰＳ（５mg/ml）を含む様に
水で再構築した。この溶液（０．５ml）を、ficoll４０
０溶液［３０％（w/v）、１ml、ファルマシア、１５０m
Ｍ塩化ナトリウム溶液中］と混合した。この混合物を超
遠心分離試験管に移し、ficoll溶液（１０％、３ｍｌ）
を重層した。最後にこれをＮaＣl溶液（１５０ml）で重
層し、その後、室温にて、３０分間、１００,０００ｇ
で回転振動して遠心分離した。水溶液よりも低い密度の
精製された因子Ｘa／ＰＣＰＳ複合体を含む層を上清と
して分離した。
【００３９】実施例２０ 活性化されたプロテインＣ、因子Ｘa及びリン脂質小胞
を含有する複合体を実施例１７により製造した。リン脂
質複合体を水を用いて再構築し、ウルトラフリー−ＭＣ
フィルターユニット上、排除限界１００，０００ダルト
ン（ポリスルホン膜、ミリ孔）、３０分、４０００ｒｐ
ｍの遠心分離によって、出発体積の３分の１にまで濃縮
した。この方法にて得られた残存物質は、活性化された
プロテインＣ、因子Ｘa及びリン脂質小胞の精製された
複合体を含んでいた。
を含有する複合体を実施例１７により製造した。リン脂
質複合体を水を用いて再構築し、ウルトラフリー−ＭＣ
フィルターユニット上、排除限界１００，０００ダルト
ン（ポリスルホン膜、ミリ孔）、３０分、４０００ｒｐ
ｍの遠心分離によって、出発体積の３分の１にまで濃縮
した。この方法にて得られた残存物質は、活性化された
プロテインＣ、因子Ｘa及びリン脂質小胞の精製された
複合体を含んでいた。
【００４０】タンパク質とリン脂質との複合体の安定化実施例２１ 凍結乾燥工程における因子Ｘa／ＰＣＰＳ
小胞複合体の安定性 ＰＣＰＳ小胞を実施例１及び２に記載の様に製造した。
その後、調製物が１５０ｍＭ／ｌ ＮａＣｌ及び５ｍＭ
／ｌ ＣａＣｌ2水溶液中にリン脂質小胞（０．５ｍｌ
／ｍｌ）及び因子Ｘa（４７Ｕ）を含む様に、実施例１
４にて記載した様に製造された因子Ｘaと混合した。こ
の複合体を凍結乾燥した。これと比較するために、因子
Ｘaを同じ濃度であるが、ＰＣＰＳ小胞の無い中で凍結
乾燥した。次にドイツの特許出願Ｐ４３２５８７２.７
に従って、精製水で出発体積に再構築後、凍結乾燥され
た調製物における因子Ｘa活性を測定し、凍結乾燥前の
因子Ｘa量と比較した（表１を参照）。
小胞複合体の安定性 ＰＣＰＳ小胞を実施例１及び２に記載の様に製造した。
その後、調製物が１５０ｍＭ／ｌ ＮａＣｌ及び５ｍＭ
／ｌ ＣａＣｌ2水溶液中にリン脂質小胞（０．５ｍｌ
／ｍｌ）及び因子Ｘa（４７Ｕ）を含む様に、実施例１
４にて記載した様に製造された因子Ｘaと混合した。こ
の複合体を凍結乾燥した。これと比較するために、因子
Ｘaを同じ濃度であるが、ＰＣＰＳ小胞の無い中で凍結
乾燥した。次にドイツの特許出願Ｐ４３２５８７２.７
に従って、精製水で出発体積に再構築後、凍結乾燥され
た調製物における因子Ｘa活性を測定し、凍結乾燥前の
因子Ｘa量と比較した（表１を参照）。
【表１】 因子Ｘa活性（％） 凍結乾燥前 凍結乾燥後 ＰＳＰＳ／ＦＸa−複合体 １００ ５１ 因子Ｘa １００ ２０ 表は小胞のリン脂質が共調製物中の因子Ｘaに対して与
える安定化作用を示している。
える安定化作用を示している。
【００４１】実施例２２ 溶液中での因子Ｘa／ＰＣＰ
Ｓ小胞複合体の安定性 ＰＣＰＳ小胞と因子Ｘaの複合体を実施例２１に記載さ
れるように製造し、凍結乾燥した。再構成後、溶液を２
２℃で２０時間にわたり貯蔵した。続いて、因子Ｘaの
活性を測定した。以下の表は、非複合体化因子Ｘaと比
べてＰＣＰＳ小胞複合体中の因子Ｘaの安定性を示す。
Ｓ小胞複合体の安定性 ＰＣＰＳ小胞と因子Ｘaの複合体を実施例２１に記載さ
れるように製造し、凍結乾燥した。再構成後、溶液を２
２℃で２０時間にわたり貯蔵した。続いて、因子Ｘaの
活性を測定した。以下の表は、非複合体化因子Ｘaと比
べてＰＣＰＳ小胞複合体中の因子Ｘaの安定性を示す。
【表２】
【００４２】実施例２３ 凍結乾燥でのプロテインＣ／
因子Ｘa／ＰＣＰＳ小胞複合体の安定性 プロテインＣ、因子ＸaおよびＰＣＰＳ小胞を含む複合
体を、実施例１７と同様に製造し、凍結乾燥した。組成
物は１５０mＭ ＮaＣlの水性溶液中、０.５mgリン脂質
小胞／ml、１０ＵプロテインＣ／mlおよび４７Ｕ因子Ｘ
a／mlを含有した。これに対する比較のため、ＰＣＰＳ
小胞を用いずに、プロテインＣと因子Ｘaを同一濃度で
凍結乾燥した。次いで蒸留水により初めの容量に再構成
後、凍結組成物中の因子Ｘa活性を実施例２１と同様に
測定し、プロテインＣ活性を色素産生試験（Immunochro
mＰＣ、Immuno）を使用して測定し、凍結前の因子Ｘaと
プロテインＣの各量と比較した（表参照）。
因子Ｘa／ＰＣＰＳ小胞複合体の安定性 プロテインＣ、因子ＸaおよびＰＣＰＳ小胞を含む複合
体を、実施例１７と同様に製造し、凍結乾燥した。組成
物は１５０mＭ ＮaＣlの水性溶液中、０.５mgリン脂質
小胞／ml、１０ＵプロテインＣ／mlおよび４７Ｕ因子Ｘ
a／mlを含有した。これに対する比較のため、ＰＣＰＳ
小胞を用いずに、プロテインＣと因子Ｘaを同一濃度で
凍結乾燥した。次いで蒸留水により初めの容量に再構成
後、凍結組成物中の因子Ｘa活性を実施例２１と同様に
測定し、プロテインＣ活性を色素産生試験（Immunochro
mＰＣ、Immuno）を使用して測定し、凍結前の因子Ｘaと
プロテインＣの各量と比較した（表参照）。
【表３】 表は、複合体でのプロテインＣおよび因子Ｘaに対する
リン脂質小胞の安定効果を示す。
リン脂質小胞の安定効果を示す。
【００４３】実施例２４ 溶液中のプロテインＣ／ＦＸ
a／ＰＣＰＳ小胞の安定性 プロテインＣ、因子ＸaおよびＰＣＰＳ小胞の複合体を
実施例２３に記載と同様に製造し、凍結乾燥した。再構
成後、溶液を２２℃で２０時間にわたって貯蔵した。次
いでプロテインＣおよび因子Ｘaの活性を測定した。以
下の表は、非複合体化因子に比べてＰＣＰＳ小胞複合体
中のプロテインＣと因子Ｘaの安定性の増加を示す。
a／ＰＣＰＳ小胞の安定性 プロテインＣ、因子ＸaおよびＰＣＰＳ小胞の複合体を
実施例２３に記載と同様に製造し、凍結乾燥した。再構
成後、溶液を２２℃で２０時間にわたって貯蔵した。次
いでプロテインＣおよび因子Ｘaの活性を測定した。以
下の表は、非複合体化因子に比べてＰＣＰＳ小胞複合体
中のプロテインＣと因子Ｘaの安定性の増加を示す。
【表４】
【００４４】プロテイン／リン脂質複合体のインビトロ
特性実施例２５ 本発明に係る組成物の効果を試験するため、以下の試験
系を用いた。１００μlのＦVIIIインヒビター血漿（４
５ベテスダ単位／ml）をコアギュロメータ管中、１５０
mＭ ＮaＣlを含有する１００μl ２０mＭトリスＨＣl緩
衝液、pＨ７.４（ＴＢＳ）と混合し、次いで１００μl
の０.０２５Ｍ塩化カルシウム溶液で再び石灰化した。
分析すべき試料（１００μl）の添加後、直ちに、混合
物の凝固時間を、３７℃でコアギュロメータ（Schnitge
r／Gross）を用いて測定した。示された試験物質中、試
料として純粋なＴＢＳ緩衝液を用いた場合、凝固時間は
８２０秒であった。これに対し、本試験系での正常血漿
の凝固時間は約３５０秒であった。実施例１６によって
生成した組成物を０.８８mＵ 因子Ｘaと０.３μgリン脂
質／mlの濃度で試験した。添加物として、ＡＴ３６８８
８３の方法により調製した０.１Ｕ ＦＥＩＢＡまたは
０.１Ｕ組換え体VIIa因子（Novo nordisk）のいずれか
を試験した。また、実施例１および２の方法によって生
成した０.３μg／mlリン脂質小胞と、実施例１４の方法
に従って製造したＦＥＩＢＡ組成物（０.０１；０.１；
１.０Ｕ／ml）またはＸ因子（０.０１；０.１；１.０Ｕ
／ml）との混合物を試験した。凝固時間に対する試験物
質の影響を以下の表に示す。凝固タンパクおよびリン脂
質の複合体を含む組成物による凝固時間の短縮
特性実施例２５ 本発明に係る組成物の効果を試験するため、以下の試験
系を用いた。１００μlのＦVIIIインヒビター血漿（４
５ベテスダ単位／ml）をコアギュロメータ管中、１５０
mＭ ＮaＣlを含有する１００μl ２０mＭトリスＨＣl緩
衝液、pＨ７.４（ＴＢＳ）と混合し、次いで１００μl
の０.０２５Ｍ塩化カルシウム溶液で再び石灰化した。
分析すべき試料（１００μl）の添加後、直ちに、混合
物の凝固時間を、３７℃でコアギュロメータ（Schnitge
r／Gross）を用いて測定した。示された試験物質中、試
料として純粋なＴＢＳ緩衝液を用いた場合、凝固時間は
８２０秒であった。これに対し、本試験系での正常血漿
の凝固時間は約３５０秒であった。実施例１６によって
生成した組成物を０.８８mＵ 因子Ｘaと０.３μgリン脂
質／mlの濃度で試験した。添加物として、ＡＴ３６８８
８３の方法により調製した０.１Ｕ ＦＥＩＢＡまたは
０.１Ｕ組換え体VIIa因子（Novo nordisk）のいずれか
を試験した。また、実施例１および２の方法によって生
成した０.３μg／mlリン脂質小胞と、実施例１４の方法
に従って製造したＦＥＩＢＡ組成物（０.０１；０.１；
１.０Ｕ／ml）またはＸ因子（０.０１；０.１；１.０Ｕ
／ml）との混合物を試験した。凝固時間に対する試験物
質の影響を以下の表に示す。凝固タンパクおよびリン脂
質の複合体を含む組成物による凝固時間の短縮
【表５】
【００４５】種々の型のリン脂質小胞の生物学的インビ
トロ活性実施例２６ 異なる組成物の種々の型のリン脂質の混合物を含有する
リン脂質小胞を、実施例に記載されるように生成し、因
子Ｘaを含む組成物に調製した。これにより得られるＦ
Ｘaリン脂質小胞複合体を、実施例２５に記載されるよ
うにＦVIIIインヒビター血漿の凝固短縮効果について試
験した。結果（凝固時間）を以下の表に示す。
トロ活性実施例２６ 異なる組成物の種々の型のリン脂質の混合物を含有する
リン脂質小胞を、実施例に記載されるように生成し、因
子Ｘaを含む組成物に調製した。これにより得られるＦ
Ｘaリン脂質小胞複合体を、実施例２５に記載されるよ
うにＦVIIIインヒビター血漿の凝固短縮効果について試
験した。結果（凝固時間）を以下の表に示す。
【表６】
【００４６】
【表７】 凡例 ＤＯＰＣ＝１,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−
ホスホコリン ＰＯＰＳ＝１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グ
リセロ−３−ホスホセリン ＣＨＯＬ＝コレステロール ＣＬＰ＝ジホスファチジルグリセリン（カルジオリピ
ン） ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール ＤＭＰＣ＝１,２−ジミリストイル−sn−グリセロ−３
−ホスホコリン ＤＭＰＳ＝１,２−ジミリストイル−sn−グリセロ−３
−ホスホセリン ＤＰＰＣ＝１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３
−ホスホコリン ＤＯＰＧ＝１,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−
ホスホグリセロール ＤＯＰＡ＝１,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−
リン酸
ホスホコリン ＰＯＰＳ＝１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グ
リセロ−３−ホスホセリン ＣＨＯＬ＝コレステロール ＣＬＰ＝ジホスファチジルグリセリン（カルジオリピ
ン） ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール ＤＭＰＣ＝１,２−ジミリストイル−sn−グリセロ−３
−ホスホコリン ＤＭＰＳ＝１,２−ジミリストイル−sn−グリセロ−３
−ホスホセリン ＤＰＰＣ＝１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３
−ホスホコリン ＤＯＰＧ＝１,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−
ホスホグリセロール ＤＯＰＡ＝１,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−
リン酸
【００４７】実施例２７ VIII因子インヒビター血漿における、２０mＵ 因子Ｘa
および４.９６μgＰＣＰＳ／ml並びに種々のその希釈に
ついて、実施例１４に従って製造した複合体の効果を、
混合直後および３７℃で１時間インキュベーション後、
以下の凝固試験で測定した。２００μlの試料を、コア
ギュロメータ管中、１５０mＭ ＮaＣlを含有する１００
μl ２０mＭトリスＨＣl緩衝液、pＨ７.４（ＴＢＳ）と
混合し、さらに１００μlの０.０２５Ｍ塩化カルシウム
溶液で再石灰化した。本溶液の添加直後、混合物の凝固
時間を３７℃でコアギュロメータ（Schnitger／Gross）
を用いて測定した。ＦVIIIインヒビター血漿（４５ベテ
スタ単位／ml）とＴＢＳ緩衝液の１＋１混合物を示され
た試験物質中、試料として用いた場合、凝固時間は５０
０秒以上であった。比較のため、実施例１４の方法に従
って製造した純粋な因子Ｘaを試験した。結果を以下の
表に要約する。VIII因子インヒビター血漿とのインキュ
ベーション前および後のＸa/ＰＣＰＳおよび因子Ｘaの
凝固時間
および４.９６μgＰＣＰＳ／ml並びに種々のその希釈に
ついて、実施例１４に従って製造した複合体の効果を、
混合直後および３７℃で１時間インキュベーション後、
以下の凝固試験で測定した。２００μlの試料を、コア
ギュロメータ管中、１５０mＭ ＮaＣlを含有する１００
μl ２０mＭトリスＨＣl緩衝液、pＨ７.４（ＴＢＳ）と
混合し、さらに１００μlの０.０２５Ｍ塩化カルシウム
溶液で再石灰化した。本溶液の添加直後、混合物の凝固
時間を３７℃でコアギュロメータ（Schnitger／Gross）
を用いて測定した。ＦVIIIインヒビター血漿（４５ベテ
スタ単位／ml）とＴＢＳ緩衝液の１＋１混合物を示され
た試験物質中、試料として用いた場合、凝固時間は５０
０秒以上であった。比較のため、実施例１４の方法に従
って製造した純粋な因子Ｘaを試験した。結果を以下の
表に要約する。VIII因子インヒビター血漿とのインキュ
ベーション前および後のＸa/ＰＣＰＳおよび因子Ｘaの
凝固時間
【表８】 本発明による因子Ｘa／ＰＣＰＳの複合体は非複合体化
因子Ｘaよりも高い安定性を有する。低濃度において、
因子Ｘa／ＰＣＰＳはまた、VIII因子インヒビター血漿
中１時間のインキュベーション後、凝固時間を短縮する
が、非複合体化因子Ｘaは、その凝固時間短縮活性を既
に失っていた。
因子Ｘaよりも高い安定性を有する。低濃度において、
因子Ｘa／ＰＣＰＳはまた、VIII因子インヒビター血漿
中１時間のインキュベーション後、凝固時間を短縮する
が、非複合体化因子Ｘaは、その凝固時間短縮活性を既
に失っていた。
【００４８】タンパク／リン脂質複合体のインビボ特性実施例２８ ： 血餅（血栓）形成に関する試験 ＡＴ３６８８８３の方法に従って生成したＦＥＩＢＡ調
製物を、ウエスラー−スタシスモデルにおけるＰＣＰＳ
小胞との複合体形および非複合体形でトロンボゲン形成
性について試験した。ＰＣＰＳ小胞は実施例１および２
の方法に従って製造し、その際、１００nmおよび／また
は５０nmの平均サイズの小胞は適当なフィルター選択に
よって得た。４Ｕ ＦＥＩＢＡおよび６０μgＰＣＰＳ
をウサギ体重kg当りで用いた。ＦＥＩＢＡ調製物の血餅
形成性はＰＣＰＳ小胞との複合体形成によっては増加し
なかった。全ての例で、静止モデルでは血栓形成は示さ
なかった（点数＝０−１）。
製物を、ウエスラー−スタシスモデルにおけるＰＣＰＳ
小胞との複合体形および非複合体形でトロンボゲン形成
性について試験した。ＰＣＰＳ小胞は実施例１および２
の方法に従って製造し、その際、１００nmおよび／また
は５０nmの平均サイズの小胞は適当なフィルター選択に
よって得た。４Ｕ ＦＥＩＢＡおよび６０μgＰＣＰＳ
をウサギ体重kg当りで用いた。ＦＥＩＢＡ調製物の血餅
形成性はＰＣＰＳ小胞との複合体形成によっては増加し
なかった。全ての例で、静止モデルでは血栓形成は示さ
なかった（点数＝０−１）。
【００４９】タンパク／リン脂質小胞複合体の熱処理実施例２９ ： 因子Ｘa及びＰＣＰＳ小胞の複合体の熱
処理 実施例１４または１６に従って製造した因子Ｘaおよび
ＰＣＰＳの凍結乾燥物を、ＥＰ１５９,３１１の方法に
従って、６０℃で１０時間、および８０℃で１時間処理
した。再構成溶液の因子Ｘa活性は、熱処理前の活性の
９０％以上であった。動的光散乱法（Malvern Zetasize
rー４）を用いて、小胞構造の保存性を検出できた。
処理 実施例１４または１６に従って製造した因子Ｘaおよび
ＰＣＰＳの凍結乾燥物を、ＥＰ１５９,３１１の方法に
従って、６０℃で１０時間、および８０℃で１時間処理
した。再構成溶液の因子Ｘa活性は、熱処理前の活性の
９０％以上であった。動的光散乱法（Malvern Zetasize
rー４）を用いて、小胞構造の保存性を検出できた。
【００５０】実施例３０ ＦＥＩＢＡおよびＰＣＰＳ小
胞の複合体の熱処理 リン脂質小胞およびＦＥＩＢＡの複合体を、実施例１４
に準じて製造し、凍結乾燥した。再構成後、凍結乾燥物
は、４gクエン酸Ｎa3・２Ｈ2Ｏ／lおよび８gＮaＣl／
l、pＨ７.０の緩衝液中、３０Ｕ ＦＥＩＢＡ／mlと３.
４mgＰＣＰＳ／mlを含有した。本組成物に対応する凍結
乾燥物を、ＥＰ１５９,３１１の方法に従って、６０℃
で１０時間、および８０℃で１時間処理した。熱処理後
の再構成溶液中のＦＥＩＢＡは、動的光散乱法（Malver
n Zetasizer−４）による熱処理前の活性の９０％以上
を示し、小胞構造の保存を検出できた。
胞の複合体の熱処理 リン脂質小胞およびＦＥＩＢＡの複合体を、実施例１４
に準じて製造し、凍結乾燥した。再構成後、凍結乾燥物
は、４gクエン酸Ｎa3・２Ｈ2Ｏ／lおよび８gＮaＣl／
l、pＨ７.０の緩衝液中、３０Ｕ ＦＥＩＢＡ／mlと３.
４mgＰＣＰＳ／mlを含有した。本組成物に対応する凍結
乾燥物を、ＥＰ１５９,３１１の方法に従って、６０℃
で１０時間、および８０℃で１時間処理した。熱処理後
の再構成溶液中のＦＥＩＢＡは、動的光散乱法（Malver
n Zetasizer−４）による熱処理前の活性の９０％以上
を示し、小胞構造の保存を検出できた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユルゲン・ジークマン オーストリア、アー−1210ヴィーン、ゲラ スドルファー・シュトラーセ153／209番 (72)発明者 ペーター・トゥレチェック オーストリア、アー−1190ヴィーン、フー トヴァイデンガッセ41番
Claims (24)
- 【請求項１】 脂質小胞中および／または脂質小胞上に
結合し、静脈内投与に適している活性凝固促進物質を含
有する血液凝固障害の予防または治療のための安定な組
成物。 - 【請求項２】 活性凝固促進物質が活性化凝固因子であ
る、請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 活性化凝固因子がビタミンＫ依存性タン
パクである、請求項２記載の組成物。 - 【請求項４】 活性化凝固因子が因子IIａ、因子VII
ａ、因子IXａおよび因子Ｘａからなる群から選ばれるも
のである、請求項３記載の組成物。 - 【請求項５】 因子Ｘａβが含まれる、請求項４記載の
組成物。 - 【請求項６】 因子II、因子VII、因子IX、因子Ｘ、プ
ロテインＣ、活性化プロテインＣ、プロテインＳおよび
プロテインＺから選ばれるタンパク質がさらに含まれ
る、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項７】 「組織因子」または「組織因子」の断片
がさらに含まれる、請求項１〜６のいずれかに記載の組
成物。 - 【請求項８】 因子VIII、活性化因子VIIIおよび/また
はフォン・ウイルブランド因子がさらに含まれる、請求
項１〜７のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項９】 因子Ｖおよび／または活性化因子Ｖがさ
らに含まれる、請求項１〜８のいずれかに記載の組成
物。 - 【請求項１０】 血小板起因血液凝固障害の治療のため
の、血小板凝集活性物質とのみ、またはさらなる血小板
凝集活性物質と一緒に結合しており、血小板の機能を果
たし得る脂質小胞を含有している請求項１記載の組成
物。 - 【請求項１１】 同時にアゴニストおよびアンタゴニス
トを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項１２】 脂質小胞が、動的光散乱法により測定
して、３０〜９００ｎｍ、好ましくは１００〜５００ｎ
ｍの範囲の大きさである、請求項１〜１１のいずれかに
記載の組成物。 - 【請求項１３】 炭水化物またはプロテアーゼ・インヒ
ビターのような通常の安定剤を含まないものである、請
求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項１４】 組成物が水溶液の形態であり、２２℃
にて２０時間保存後、活性凝固促進物質の活性が４０％
以上残存している、請求項１３記載の組成物。 - 【請求項１５】 液体凍結または凍結乾燥の形態であ
る、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項１６】 活性凝固促進物質が潜在的に存在する
ウイルスの不活化のために処理されたものである、請求
項１〜１５のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項１７】 組成物が潜在的に存在するウイルスの
不活化のために処理されたものである、請求項１〜１５
のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項１８】 組成物が化学的または物理的手段によ
って処理されるものである、請求項１７記載の組成物。 - 【請求項１９】 組成物が熱処理されるものである、請
求項１８記載の組成物。 - 【請求項２０】 活性凝固促進物質が、不活化処理前の
活性に対して、少なくとも９０％の生物学的活性を有し
て含まれている、請求項１６〜１８のいずれかに記載の
組成物。 - 【請求項２１】 凍結乾燥工程が小胞分散物と上記活性
凝固促進物質の混合後に行われるものである、請求項１
記載の組成物の製造方法。 - 【請求項２２】 脂質フィルムの直接水和が上記活性凝
固促進物質の溶液によって行われる、請求項１記載の組
成物の製造方法。 - 【請求項２３】 調製された小胞が荷電粒子の存在下該
活性凝固促進物質と直接混合されるか、または該脂質小
胞中および上記脂質小胞上に上記活性凝固促進物質の取
込みを可能にする条件下で混合される、請求項１記載の
組成物の製造方法。 - 【請求項２４】 該方法がさらに、上記脂質小胞中およ
び／または上記脂質小胞上に結合された上記活性凝固促
進物質にウイルスの不活化のための処理が行われる工程
を含む、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4416180-8 | 1994-05-06 | ||
| DE4416180A DE4416180C2 (de) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | Stabiles Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen und Verfahren zur Herstellung dieses Präparats |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0840928A true JPH0840928A (ja) | 1996-02-13 |
Family
ID=6517576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7109453A Pending JPH0840928A (ja) | 1994-05-06 | 1995-05-08 | 活性な凝固促進物質を含有する血液凝固障害の治療のための安定な組成物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0680763A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0840928A (ja) |
| AT (1) | ATA77095A (ja) |
| CA (1) | CA2148672A1 (ja) |
| DE (1) | DE4416180C2 (ja) |
| FI (1) | FI952170L (ja) |
| NO (1) | NO951762L (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005525424A (ja) * | 2002-05-14 | 2005-08-25 | ユニヴァーシティー オヴ ルイスヴィル リサーチ ファウンデイション インコーポレイテッド | 細胞エネルギーの直接的デリバリー系 |
| JP2009532371A (ja) * | 2006-03-30 | 2009-09-10 | ザ リサーチ ファウンデイション オブ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 低免疫原性および長時間循環性タンパク質−脂質複合体の組成物 |
| JP2018505698A (ja) * | 2015-02-06 | 2018-03-01 | コウシュウ・バイオシール・バイオテック・カンパニー・リミテッドＧｕａｎｇｚｈｏｕ Ｂｉｏｓｅａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． | トロンビンの調製のための方法 |
| JP2019141044A (ja) * | 2019-03-01 | 2019-08-29 | コウシュウ・バイオシール・バイオテック・カンパニー・リミテッドＧｕａｎｇｚｈｏｕ Ｂｉｏｓｅａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． | トロンビンの調製のための方法 |
| EP3868413A4 (en) * | 2018-10-17 | 2022-07-06 | Toray Industries, Inc. | HEMOSTATIC MATERIAL |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4416166C2 (de) * | 1994-05-06 | 1997-11-20 | Immuno Ag | Stabiles Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen |
| DK0796623T3 (da) * | 1996-03-20 | 2005-08-01 | Baxter Ag | Farmaceutisk præparat til behandling af blodkoagulationslidelser |
| AU4709399A (en) * | 1998-06-23 | 2000-01-10 | Victor J. Marder | Phospholipid vesicle-tissue factor complex preparations and methods of making and using same |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4348384A (en) * | 1980-10-17 | 1982-09-07 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for oral administration containing coagulation factor VIII or IX |
| JPS5770814A (en) * | 1980-10-17 | 1982-05-01 | Isamu Horikoshi | Oral preparation of blood clotting eighth factor |
| GB2129685B (en) * | 1982-11-11 | 1985-11-13 | Nat Biolog Standards Board | Anti-haemophilic compositions |
| US4610880A (en) * | 1983-06-27 | 1986-09-09 | Queen's University At Kingston | Composition for controlling hemophilia in mammals |
| US4721618A (en) * | 1983-06-27 | 1988-01-26 | Queen's University At Kingston | Method for controlling bleeding |
| AT389815B (de) * | 1984-03-09 | 1990-02-12 | Immuno Ag | Verfahren zur inaktivierung von vermehrungsfaehigen filtrierbaren krankheitserregern in blutprodukten |
| WO1990003808A1 (en) * | 1988-10-07 | 1990-04-19 | The Liposome Company, Inc. | Heat treating liposomes |
| WO1991002532A2 (en) * | 1989-08-14 | 1991-03-07 | Queen's University At Kingston | Method for stimulating fibrinolytic effect |
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| EP0815852A1 (en) * | 1993-08-06 | 1998-01-07 | Opperbas Holding B.V. | A method for high loading of vesicles with biopolymeric substances |
| DE4416166C2 (de) * | 1994-05-06 | 1997-11-20 | Immuno Ag | Stabiles Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen |
-
1994
- 1994-05-06 DE DE4416180A patent/DE4416180C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-04 CA CA002148672A patent/CA2148672A1/en not_active Abandoned
- 1995-05-05 EP EP95106815A patent/EP0680763A3/en not_active Withdrawn
- 1995-05-05 NO NO951762A patent/NO951762L/no unknown
- 1995-05-05 FI FI952170A patent/FI952170L/fi unknown
- 1995-05-05 AT AT0077095A patent/ATA77095A/de not_active Application Discontinuation
- 1995-05-08 JP JP7109453A patent/JPH0840928A/ja active Pending
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| EP3868413A4 (en) * | 2018-10-17 | 2022-07-06 | Toray Industries, Inc. | HEMOSTATIC MATERIAL |
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