JPH02124093A - Ｄｎａ分子 - Google Patents

Ｄｎａ分子

Info

Publication number
JPH02124093A
JPH02124093A JP63277205A JP27720588A JPH02124093A JP H02124093 A JPH02124093 A JP H02124093A JP 63277205 A JP63277205 A JP 63277205A JP 27720588 A JP27720588 A JP 27720588A JP H02124093 A JPH02124093 A JP H02124093A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
gene
dna molecule
protein
fmdh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP63277205A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3072993B2 (ja
Inventor
Cornelius Hollenberg
コルネリウス　ホレンベルグ
Zbigniew Janowicz
ズビグニエウ　ヤノウィクツ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dynavax GmbH
Original Assignee
Rhein Biotech GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to DE3789866T priority Critical patent/DE3789866T2/de
Priority to EP87110417A priority patent/EP0299108B1/en
Priority to ES87110417T priority patent/ES2056799T3/es
Priority to AT87110417T priority patent/ATE105858T1/de
Priority to AU24434/88A priority patent/AU2443488A/en
Application filed by Rhein Biotech GmbH filed Critical Rhein Biotech GmbH
Priority to JP63277205A priority patent/JP3072993B2/ja
Publication of JPH02124093A publication Critical patent/JPH02124093A/ja
Priority to US07/844,885 priority patent/US5389525A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP3072993B2 publication Critical patent/JP3072993B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/02—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a cytochrome as acceptor (1.2.2)
    • C12Y102/02001—Formate dehydrogenase (cytochrome) (1.2.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 するＤＮＡ分子およびその使用 記　　　　述 最近１０年間に、唯一の炭素源およびエネルギー源とし
てメタノールを利用できる幾つかの酵母株が単離された
。最近までの研究はその酵素レベルに限られていで、主
に二つの種、即ち＋１８ｎｓ（！ｎ１ＪＩａ　ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａとＣａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉに関
するしのであった。
酵素的Ｃ１究によると、メタノール栄養の酵母において
は、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ＞、ホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナ−１２（ＦＭＤ）およびホルメートデ
ビドロゲナーピ（ＦＭＤＨ）によって、それぞれホルム
アルデヒドおよびホルメートを経てＣＯ２に酸化される
。最初の酸化段階で発生するＨ２Ｏ２はカタラーゼによ
り分解される。Ｃ１化合物はキシルロース−５−（Ｐ）
Ｊ３よびホルムアルデヒドのトランスケタラーゼ反応に
より同化され、少者は異化好路から１１れる。この反応
はジヒドロキシアヒドンシンターゼ（ＤＨＡＳ）により
触媒される。
メタノール栄養酵母のメタノールによる発白は全体的タ
ンパクｆｆ組成の変化を伴なう。新しく合成された３種
類の主要なタンパク質と約５種類の少量のタンパクＶｔ
がある。更に、メタノールによる培養は巨大なベロキシ
ソームの出現を伴なう。
これらのオルガネラはメタノール代謝に関与する重要な
酵素、即らＭＯＸ、ＤＨＡＳおよびカタラーゼ（１）の
若干をもっている。他の二つのメタノール酵素ＦＭＤと
ＦＭＤＨは細胞質タンパク質である。メタノール培養細
胞における酵素ＦＭＤＨ，ＭＯＸ、およびＤＨＡＳは全
細胞タンパク質の４０％までを構成する。このメタノー
ル利用経路は高度に画分化されていて、これらの反応の
累積は非常に複雑である。
メタノール異化酵素は、グル」−ス責化産物抑制／脱抑
制機構により調節される（２）。メタノールは発現レベ
ルをファクター２〜３だけ増加させるもう一つの、ＸＩ
効果をもつ。Ｈ１ρｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいては、異
化Ｄ　ＨＡ　Ｓ　ｌ！ｉ？素はこの一船釣調面スキーム
に従うが、限られた酷のブドウ糖で培養する間に、説抑
制、即ちまた別の後転写機構がこの調節で一つの役割を
演じる。
最近、ベロキシソームＷ９素をコード化する三つの遺伝
子がＬ匹打旦且加およびＰｉｃｈｉａ　ｐＲ３ｔｏｒｌ
ｓからクローン化され、Ｉｌ、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　
（３）およびＬ眩廷虹追（４）から得られたＭＯＸ遺伝
子およびｕ、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　（５）から得られ
たＤＨＡＳをコード化するＤＡＳＥｆｆ伝子のヌク転子
ヂド配り１１を解析したところ、ベロキシソーム中への
ＭＯＸおよびＤ　Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｓの輸送に対して開裂し
うる信号の配列は必要でないことが分かった。
若干のメタノール遺伝子のプロモーターは非常に効果的
であり、その調節の仕方は工業的応用に都合よい。外来
タンパク質の発現を増進でき、厳重な制御下に置ける。
このようにしてメタノール栄養酵母により産生きれた大
半のタンパク質（ＭＯＸ、ＤＨＡＳ）はベロキシソーム
に貯えられる。この機構を理解すれば酵母中の外来タン
パク質の安定性に関する幾つかの問題の解決に役立つで
あろう。
工業的バイオテクノロジーの分野においては、人聞の特
に望まれるタンパク質を厳重な管理下で生産できる微生
物学的：Ｊ！４節システムに対する要望がある。生産さ
れるタンパク質の量を制御するために遺伝子工学システ
ムで使用できるプロモーター／ターミネータ−系は既に
入手できるが、生物学的系においては、最も効果的なシ
ステムを選ぶことができるようにより多くのシステムを
用意するのが右利であるということが分かったので、更
に調１ωシステムを入手するための強い要望が依然とし
て存在する。現在のシステムは、とりわけ帳重なＦＡＩ
ｌｉ５と高い有糸分裂安定性とが要求される場合に、決
して効率が良いとは言えない。
従って、本発明の目的は、より効果的で、かつ非常に容
易に制御できる調節システムを提供することにある。
本発明の利点は、ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ
Ｈ）活性をもつタンパク質に対する構造遺伝子および制
御領域をコード化するＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子を
提供することによって得られる。
基礎的研究およびメタノール利用の生物工学的な面につ
いてもつと広範囲の研究を開始するために、細胞質のメ
タノール鍵酵素Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｉ−１をコード化する遺伝
子をクローン化した。この長さ１０２Ｏｂｐｌ伝子転子
列とその調節領域をクローン化した。ＦＭＤＨはブドウ
糖安化産物抑制／脱抑制／メタノール誘導機構により、
転写レベルで調節される。
本発明に係るＤＮＡ分子は、外来タンパク質の発現を増
進することができ、そして厳重な制（社）下に置くこと
ができるという上記の特徴がらみて生物工学産業におい
て極めて有用である。
野生型Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｉ−１タンパク質の遺伝暗号を指定
する配シ１１を有するＤＮＡ分子は、この分野で公知の
組換えＤＮＡテクノロジーの技術により、改善された生
物工学的特徴を示すタンパク質をコード化するように修
飾できる。この紺換えＤＮＡアクノロジー技術の修飾は
、構造遺伝子そしてまた制御領域のプロモーターの遺伝
情報を指定する配列のところで実施できる。このため、
有用タンパク質の非常に重要な過剰生産とｍ重な制御の
１」的で、幾つかの特徴が得られる。
本発明ＤＮＡ分子の特に好ましい一員体例を第５図に示
す。
本発明に係るＦＭＤ）−１調節配列の使用例は、前記Ｄ
ＮＡ配列とＳ、　ｃａｓｔｅ　ｌ　ｌ　ｉ　ｉから得ら
れるＢ型訂炎ウィルス５ｌ−８２−３抗原およびＢ型引
炎ウィルスＳ抗原α−アミラーゼおよびＳ、ｃａｓｔｅ
からｉｑられるグルコアミラーゼあるいはＳａＣＣＩｌ
ａｒｏｍｙＣｅＳ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから１４られ
るインベルターゼとの結合である。
本発明ＤＮＡ分子は分泌信号の遺伝情報をＩＦ７定する
ＤＮＡ配列と組合わせることができ、そしてこれら信号
の例として１ｌａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｔ
＋ａ膜転座信号、なるべくはペロキシソーム　タンパク
質、メタノールオキシダーゼおよびジヒドロ４ニシア廿
トンシンターゼ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｌｃｅｓ　ｃａｓ
ｔｅｌｌｉ　　ａアミラーゼおよびグルコアミラーゼ信
号、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　　ａ−因子およびインベルターゼ信号が挙げ
られる。
Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｉ−１活性をもつタンパク質に対する構造
遺伝子および制御領域の遺伝情報を指定するＤＮＡ分子
の調製物は天然ＤＮＡおよび（または）ＣＤＮＡおよび
（または）化学的に合成されたＤＮＡから１ｑられる。
調節領域および（また◆よ）ＦＭＤＨタンパク質に対す
る構造遺伝子の遺伝情報を指定する本発明ＤＮＡ配列を
含む組換えベクターを調製でき、前述した史に他のＤＮ
Ａ配列と組合わけることかできる。発現系にＤＮＡ配列
を移す目的のための組換えベクターが一般にこの分野で
使用されていて、適宜選択できる。例えば、λ　ｃｈａ
ｒｏｎ　４　Ａファージは前述したＤＮＡ分子を有する
ことができる。
望む遺伝子の発現に適した微生物は、また組換え１つＮ
△テクノ１］ジーに適合する公知の微イト物から選ぶこ
とができる。しかし、ｉ　１ｉｉａ　１＋１１１の外来
タンパク質に耐えうる微生物が好ましい。
最も好ましい微生物はＣａｎｄｉｄａ、　Ｈａｎｓｃｎ
ｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ属である。
ここに述べた微生物は、本発明ＤＮＡ分−ｆを微生物の
染色体中に組込むか、またはエピソームベクターを介し
て外来染色体ＤＮＡ分子上に本発明ＤＮＡ分子を保持す
ることにより望む物質をつくり出すことができる。
本発明ＤＮＡ分子に結合させた外来遺伝子によってコー
ド化され、形″？ｆ転換された微生物によりつくられる
タンパク質は、この分野で公知の方法で前記微生物を培
養し、これまたこの分野で標準的な知識となっている方
法でタンパク質を回収することにより得られる。
ここで本発明を下記の明細事項と図面により一層詳しく
説明する。これら図面は次のようである。
第１図：　Ｓ　Ｄ　Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動
によるタンパク質１１１製抽出物および容器内翻訳生成
物の分析。
レーン７〜９はＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅで染色し
たゲル：タンパク質相製抽出物はそ れぞれ誘導、説抑制、および非誘導の 細胞から得た。レーン１０は精製 ＦＭＤＨ，レーン１〜３は、それぞれ 誘導、非誘導細胞から単離された ｍＲＮ△およびＦ　Ｍ　Ｄ　Ｈｍ　ＲＮ　Ａ種で畠゛化
した分別ｍ　ＲＮ△の３５ｓ標識した１ｎ　ＶｉｔｒＯ
翻訳生成物。レーン４はレーン１からの翻訳生成物の免
役沈降。
レーン５はハイブリッド選択ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳。し〜
ン６はレーン５がらの翻 訳生成物の免疫沈降。
第２図：　Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｉ−１遺伝子を包含するＤＮＡ
所片の制限地図。矢印は転写の方向を示１．１第３図：
Ｓ１−マツピング； レーンＭ１，１．２．３，４．Ｍ２ ａ、ｂ、ｃ、ｄ、アルカリ性アガロー スゲル上での分離。レーン５、Ｍ３は ６？６ポリアクリルアミドゲル／８Ｎ尿素上での分離。
レーン１，２は、遺（ム子を包含する４、ｌｋｂ　　Ｅ
ｃｏＲＩ／ト１ｉｎｄＩ［１１１ｉ片（２）の全保護（
１）。
レーン３．４は３′−末端標識１．４ ｋｂ　　ＢａｍＨｒ／ｌ−ｌ　ｉ　ｎｄｍ’：）う’ｌ
；）ントの保護。３は保護バンド。４は １．４ｋｂ完全バンド。レーン５は１ｋｂＢａｍＨＩ／
Ｐｓ　ｔ　Ｉ３片をＢａｍ＋−１１部位で単一椋識を用
いて保護。レーンａ、ｂ、ｃ、ｄは、それぞれ誘 導、脱抑制（１％グリセリン）、３％ グルコースの固定相および３％グル］ スＩｇ養の対数中期から１１ｉ離された口＋ＲＮΔ調製
物により、遺伝子部分を含む３′−末端標識したＤＮＡ
フラグ メン［−の保護。
１４図：配列化の戦法−概略表示。
遺伝子を含むＤＮＡフラグメン１へを ＢａＬ３１消化に付し、生じたフラ グメントをＭ　１３および（または） ｐＵＣ型ベクターにリブローン化する。
これらフラグメントをＳａｎｇｃｒｒ人により、また疑
わしい場合にはＨａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ法により
順番に配列した。
第５ａ図：　Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｉ！遺伝子およびその５′３
′制御領域のヌクレオチド配列。
第５ｂ図：　ＦＭＤＨ遺伝子およびその５′３′制御作
域のヌクレオチド配列。
第５Ｃ図：　ＦＭＤＨ道伝了およびその５′３′制御領
域のヌクレオチド配列。
第６図：細菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子とＦ　Ｍ　Ｄ　
Ｈプロモーターとの融合を含むプラスミド。
第７図：肝炎Ｓ−遺伝子を含むプラスミド；１−ＩＡＲ
８は旧ｐｏ　ｌ　ｙｍｏｒｐｈａ（７）自律的？１Ｎ製
配列：　Ｕ　ＲＡ　３はＳ、ｃｃｒｅｖｉｓｉａｃ’、
１７伝ｆ；ＦＭＤＨはプロを一ター（−９型プロ モーター）。
第８図：ウェスタンプロットはペル第１−シダーゼ／タ
ンパク質Ａ法により染色。この 実験にポリクローン抗体（明確でない）を使用した。
レーンミニメタノールによるＬＲ９培 養 レーンミニ形質転換体ｗ１０　３−遺 伝子 レーンに、１．ｍニゲルコース上で培 養したＳ−遺伝子をもつ形質転換株 （抑制） レーンｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ：メタ ノール上で培養したＳ−遺伝子を６つ 異なった形質転換株 レーンｎ、０：それぞれ５００．４５ ０ｎｇの精製Ｈ８８ＡＱ 第９図：α−アミラーゼ遺伝子を発現するプラスミド；
記号は第７図のものと同じ。
第１０図：メタノール含有培地上での形質転換株の培ｒ
１（誘導）。培地中、および細胞中の（細胞内酵素レベ
ル）酵素活 性（Ｕ／ｄ）を測定した。後者の値は 培地１１Ｒ１に相当するものとして表示した。
第１１図：形質転換株（上の列）から、また対照未形質
転換株ＬＲ９（下の列）から の培地５０μｌを平板上に適用後の輪 光の形成。
株、培地、ベクター Ｉｔ、　ｏｆ　ｎｏｒ　ｈａ　（Ａ　ＴｅＯ２４４３８
）の好熱型、同株型の株を用いた。酵母を文献（３，５
）記載のように最小量のＹＮＢ培地上３７り′Ｃ−発育
させた。メタノール利用系の誘発は、メタノール１％を
含む最小量の培地で培養することにより達成した。グル
コース３％の最小量の培地での培養は系の抑制を起こし
た。
［、ｃｏｌｉ　Ｌ９０；　Ｃ６００ｒｅｃ＾、　ｈｓｄ
Ｈ，ａｒａＢを形質転換に用いた。
Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＨ１０３，ｔｈｉ、　　ｓｔｒ八、
　　ｓｕｐ［、ｅｎｄＡ、　　５ｂｃＢｈｓｄＲ，Ｆ’
　ｔｒａ０３６．　ｐｒｏ八Ｂへ　Ｌａｃｌ、　ＺＨ１
５，およびＥ、Ｃ０１ｉに１１８０２　ｑａｌ、　ｍｅ
ｔ、５ｕｐＥ、をそれぞれファージＭ１３およびλ−ベ
クターｃｈａｒｏｎ　４　Ａに対する宿主として使用し
た。プラスミドＤＮＡおよびＲＦ　　Ｍ１３は規模拡大
したアルカリ性ミニリゼイト法（６）とそれに続＜ｃｓ
ｃｊ２超遠心により単離した。
λ−ベクターＣｈａｒｏｎ　４　Ａおよびｃｈａｒｏｎ
　４組換え体クローンは規模拡大した平板溶菌液法（６
）により単離した。
５０ｋｂより大きい寸法をもつＬ肚旦制」加金ＤＮＡは
前述したように５スフエロプラストから単離した。
Ｃｈａｒｏｎ　４Ｈ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　　Ｄ　Ｎ
　Ａライブラリーは、限定的にＥｃｏＲＩ消化したＨ、
　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＤＮＡを、萌記のように（５）
　　Ｃｈａｒｏｎ　４７−ムで結合することにより構築
した。
Ｌ匣旦Ｕ且加から得られるＰｏ１ｙＡ　　ｍＲＮＡおよ
びｉｎ　ＶｉｔｒＯ無細胞家兎網状赤血球系によるこの
ｍＲＮＡの分析は前述されている（５）。
ｍＲＮＡ標識化　ｍＲＮＡを温和なアルカリ処理（７）
により部分的に分画化し、γ−３２ＰＡ　Ｔ　Ｐ　（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）で５′−末端のところを標識した。
差数的プラークフィルターハイブリッド形成法は（１２
）に記載のように本質的に行なった。組換えファージを
平板１枚当り約３．０ＯＯｐｆｕまで塗布した。各平板
からのプラークを１組の５〜６個のレプリカニトロ−セ
ルロースフィルター（３Ａ　８５　、５ｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒおよび５ｃｈｉｉ　ｌ　ｌ　）にブロッティングし
た。これらフィルターを適当な３２Ｐ−ｍＲＮＡまたは
３２Ｐ−ＤＮＡプローブに、更に１５０Ｌ＋（１／＃Ｉ
ｌ！のｔＲＮＡ、１０ｕ（１／ｄのｐｏｌｙ　Ａ、　　
５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　’　ｓ溶液、５ｕｇ／ｄのｒ
ＲＮＡ　［（５゜６）記載のように単離した１１．ｐｏ
ｌ　ｍｏｒｐｈａから１ｎられる］を含有する５ｘＳＳ
ＰＥ、５０％小ルムアミド中でハイブリッド形成させた
。
Ｓ１マツピング実験は木質的にＦａＶａｒＯＩＯ等（８
〉により記述されたようにして行なった。ＮＥＮからの
８１ヌクレアービは１．０ＯＯＩＪｔ位／ｄの濃度で用
いた。
ハイブリッド選択技術はＢｊｎｃｍａｎ　’６　（９）
により記述されたようにして実行した。手短かに言えば
、組換えサブクローンから得たＤＮＡを５ｃｐｈａｃｒ
ｙＳ−５００のＤＰＴＥ誘導体に共有結合で結合させた
。次に全ｍＲＮＡをＤＮＡ／　Ｓ−５００？トリックス
でハイブリッド形成させた。固定化ＤＮＡと相補的でな
いｍＲＮＡ種を非常に厳重な条件（５，９＞下で洗い去
った。ハイブリッド形成したｍＲＮＡを１００℃の水で
溶出した。ハイブリッド選択されたｍｌでＮＡを次に無
細胞系で翻訳し、この翻訳生成物を前記のように免疫沈
降によって分析した。
配列解析　ＦＭＤＨ遺伝子を包含するＤＮＡ断片のエキ
ソヌクレアーゼＢａ１３１消化からＸ　Ｌｌされた種々
の重複断片を、Ｍ１３ファージｍｐ９ｍｐ　　に、そし
てプラスミドｐｕｃｉ２．ｐｕｃ１３にクローン化した
。これらυブローン化断片を、Ｓａｎｇｅｒ等（１０）
およびＨａｘａｍ−Ｇｉ　Ｉｂｅｒｔ（１１）の方法に
より順番に配列した。
ホルメートデヒドロゲナーゼは他で述べたようにメタノ
ール培養したＨ、　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞から均質
になるまで精製した。ＦＭＤＨに対する変性形抗体を標
準法に従い家兎でつくった。
ＦＭＤＨをコード化するｍＲＮＡ種の同定３％グルコー
ス（リプレッション）あるいは１％メタノール（誘導）
で培養した細胞から！１離した全ｍＲＮＡのｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ１１１訳生成物を５ＯＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析
した。第１図は、誘導（レーン１）、非誘１３（レーン
２）ＩＩＩ胞から得たｍＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏＩｌ
＄１訳生成物、なラヒニＦＭＤＨに対して向けられた特
異的抗体による最初のＦＪＪ製物の免疫沈降物（レーン
４ンの比較を示す。更にまた、１％メタノール、０．５
％グリセリン１０．１％グルコース（脱抑制）、および
３％グルコース培養から得た粗製タンパク質抽出物の電
気泳動像を、精ｌ’ＪＦＭＤＨ（それぞれレーン７．８
．９および１０）の電気泳動移動度と比較した。
得られた結果は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上のＦＭＤＨタンパ
クの位置をはっきり証明しており、かつＦＭＤＨタンパ
ク質およびそのｍＲＮＡがメタノール（誘導）で培養し
たＩｌＩ胞の主要秤であることを示す。二つの他の主要
タンパク質、即ちＭＯＸとＤＨＡＳの位置も示されてい
る。第１図はまた脱抑制条件下でかなりの発現が達成さ
れたこと（レーン８）および３％グルコースがメタノー
ル利用系の酵素を抑制することも指摘している。
上記の結論から、本発明者等は、ショ糖密度勾配遠心に
より、スクリーニングの手順゛Ｃ使用するためにＦＭＤ
Ｈをコード化したｍＲＮＡに富むｍＲＮＡフラクション
（レーン３）をｔｕｉｔすることができたわけである。
ＦＭＤＨ子のスクリーニング ＣｈａｒＯｎ４ファージにおけるＨ、ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａＤＮＡバンクを、差数的プラークハイブリット形成
法（材料および方法）により、誘導、非誘導細胞から得
た放射性３２Ｐ−標識ｍＲＮＡを用いて、またＦ　Ｍ　
Ｄ　Ｈｍ　ＲＮ　Ａ富化フラクションから得た３２Ｐ−
ｍＲＮＡ（第１図、レーン３）を用イテスクリーニング
した。更にまた、ＭＯＸおよびＤＡＳｍ伝子（転子５＞
をコード化したクローンからの３２Ｐ−ＤＮＡプローブ
でレブリノＪフィルターをハイブリッド形成さヒ“た。
（殻名は他の強誘発性遺転子二つをコード化したクロー
ンを同定しかつ除外するために行なった。望むファージ
を選択し、それらのＤＮＡを更に同定した。
組換えクローンの同定 クローンの最初の同定は、ハイブリッド選択技術、制限
マツピング、および与えられたクローンによりコード化
されたｍＲＮＡの大きさの確定により行なった。
ハイブリッド選択 Ｃｈａｒｏｎ４組換えクローンＪＭから冑だＤＮＡをＤ
ＰＴＥＳ−５００マトリツクスに共有結合で結合させ、
ＪＭクローンと相補的なｍＲＮＡを選び、そのｉｎ　Ｖ
ｉｔｒＯ翻訳生成物を分析した。第１図は、ハイブリッ
ド選択ｍＲＮＡが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳したとき、Ｆ
ＭＤＨペプチド（レーン５）と同じ電気泳動移動度をも
つＬふヱ孟上生成物を与えることを示している。レーン
５からのペプチドを特異的抗体（レーン６）で沈降させ
たとき、ＦＭＤＨの大きさをもつ主要バンドと更に他の
弱いバンドが見られる。非誘導ｍＲＮＡを用いた対照実
験で、ＦＭＤＨ性をもつ検出不可能なｍ　ＲＮΔをこの
技術により選択した。レーン５および６に見られる追加
の弱いバンドの存在は、多分使用したハイブリッド選択
技術の人為構造であろう。
これらデータはクローンＪＭがＦ　Ｍ　Ｄ　Ｈ３！ｌ伝
子を含むことを強く示唆する。
の　　　　　　と クローンＪＭおよびそのサブクローンの制限地図を第２
図に示す。遺伝子を包含するＤＮＡ断片は、３２Ｐ−標
識した誘導ｍＲＮＡでサイーンプロットをハイブリッド
形成させることにより同定した。
クローンＪＭからの８，５ｋｂ　　ＥｃｏＲＩＨ，ｐｏ
ｌ　ｍｏｒ　ｈａ　　ＤＮＡ断片は遺伝子を含む。それ
以上の分析により、遺伝子およびｐＢＲ３２５における
Ｈｉｎｄｌｌ［／ＥｃｏＲＩ　　４．１ｋｂフラグメン
ト上の推定：ＪＡ節領領域サブクローン化した。
＄１マツピング プラスミドｐ３Ｍ１から得られる無放射性Ｈ１ｎｄｌ［
Ｉ／ＥｃｏＲＩ　　４．１ｋｂフラグメントを単離し、
誘導および非誘導ｍＲＮＡでアニールした。ヌクレアー
ゼＳ１の作用に対抗してその同ｌ１ｍＲＮＡにより保護
したＤＮＡの大きさを、アガロース電気泳動、それに続
くリーイーンブロツアイングおよび断片を児えるように
するための適当な３２Ｐ−ＤＮＡによるハイブリッド形
成により分析した。第３図、レーン１は誘導ｍＲＮＡが
長さ１．２ｋｂのＤＮＡ断片を保護することを示してい
る。これは、この遺伝子が約３５−３７．０００ドルト
ンのタンパク質の遺伝情報を指定することを示す。この
分子ａ領域でＦＭＤＨは唯一の強誘導性タンパク質であ
るので、この結果はこの遺伝子の同定を支持する。
遺伝子の３′末端、転写方向、および転写ＦＭＤＨのｍ 遺伝子を含む二つの断片、即ち１．ＯｋｂＢａｍｌ−（
Ｉ／ＰｓｔＩＪｊよび１．４Ｋｇ　ｌ−１ｉｎｄＩＩＩ
／Ｂａｍ１−１１、を単離し、３′末端標識をＢａｍＨ
１部位に導入した。石のく第３図、レーン３〜４）、１
．４ｋｂ　　Ｈｉｎｄｌｌｌ／ＢａｍＨｆ断片上の標識
のみが、アニーリングにより保護され、ｍＲＮＡは左か
ら右への（第２図の矢印）転写の方向を示した。バンド
（レーン４）のこの大きさは、遺伝子の３′末端がＢａ
ｍＨ１部位の右へ８５０ｂｌ）に位置することを示した
。この型の実験はまた種々な条件下で培養した細胞から
単離された全ｐｏｌｙ△＋ｍＲＮＡにおけるＦ　Ｍ　Ｄ
　８ｍＲＮＡ種の檜を大雑把に確立させるために用いた
。遺伝子の一部を含む３２Ｐ−３′末端標識したＤＮＡ
の既知量を種々の開のｍＲＮＡでハイブリッド形成させ
た。ＤＮＡ過剰の条件で、与えられた量のｍＲＮＡによ
りＳｌに対して保護したバンドに存在する放射能は、調
製物中のＦＭＤ）１ｍＲＮＡの量の尺度である。これら
データは、誘導および脱抑制発育条件から得た調製物に
おいて、ＦＭＤＨｍＲＮＡがそれぞれ全ＤｏｌＶＡ　＋
ｍＲＮＡの約７％±１％および３％から４％寄与するこ
とを示している。第３図、レーンａ、ｂ。
ｃ、ｄ、は、ＤＮＡ３ｕ　ｇを１０Ｕｇの全ｐｏｌｙＡ
＋ｍＲＮＡでハイブリッド形成させたＳ１実験から生じ
たＤＮＡバンドの強度の比較を示す。３％グルコース（
リプレッション）培養の対数中期において、僅かに無視
しつる争のＦＭＤＨ転写が見えるのに対して、固定相に
おける同じ培養はその前に相当な吊の転写を示すことも
はっきり見える。
これは脱抑制現象の好例であり、固定相においてグルコ
ースが消費し尽されている。
遺伝子の５′末端 ＢａｍＨＩのところに単一の５′末端標識をもつ１．ｏ
ｄｂ　　ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、Ｓ１マ
ツピングで２５５〜２６５ｂｐにわたる多数のバンドを
生じた（第３図、レーン５）。この値を配列データと比
較でると、転写が最初のＡＴＧから−１２の位置付近で
始まっていることを示した。この主バンドはピリミジン
トラックにより包囲されたｒＡＪでの開始を示す。
ヌクレオチド配列 ＦＭＤＨ遺伝子および包含領域のヌクレオチド配列がＳ
ａｎｇｃｒ　（１０）およびＨａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅ
ｒｔ法（１１）により決定された。順番に配列させるべ
きフラグメントは遺伝子を含むＢａ１３１ＤＮＡで消去
することにより発生させた。第４図は、遺伝子の全領域
を両方向に数回配４１　Ｌ、たことを示す。
疑わしい場合には、Ｍ１３法のデータをＨａｘａａ＋−
Ｇｉｌｂｃｒｔ法により得たデータにより補正した。ヌ
クレオチド配列を第５図に提出する。この遺伝子は１．
０２０個のヌクレオチドの開放読み枠（ＯＲＦ）および
３４０Ｄａのタンパク質に対する］−ドを含む。これら
データから計算したタンパク質分子吊は３５．７００Ｄ
ａであり、これは精製タンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥに
より得た伯とよく一致している。この遺伝子は、１）Ｎ
Ａ配列から誘導される遺伝子のＮ末端を、精製タンパク
質のＮＨ−末端解析により得たデータと比較することに
よりＦＭＤＨとして決定的に同定された。
５　’　−３’末端領域 真核生物の５′−制御：ｌｉ１節領域においては、合Ｒ
’ｌ）得られた配列−３Ａ　（９）ＸＸ１ＡＵＧ４Ｇｘ
６ｐｙが能率的に転写され翻訳される遺伝子に必要であ
ると報告された（１２．１３＞。
Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｈ’；ｒ伝子転子ては、この規則に一３Ａ
ＵＧ＋ＩＡＵＧ＋４ＡＸ＋６Ａの配列が存在する場合に
極く一部従うに過ぎない。最初のＡＴＧは全読み枠でス
トップコドンにより進行される。転写開始時に真核生物
に含まれる配列ＣＴＡＴＡＡＡＴＡは−４０の位置に見
出される。酵母 Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃで転写制御に役割を演じると
仮定される他の特徴はＦＭＤＨに存在しないＣＡＡＣ△
ＡまたはＣＡＣＡＣＡ　（１２）のようである。
今までに研究された酵母の大部分において、遺伝子の３
′末端領域は特徴的な配列を含み、これは何人かの若者
によると、転写の適当な終結にある役割を演じ、ポリア
デニル化信号として動く（１４，１５＞　、　Ｚａｒｅ
ｄ　と３１）ａｒａ＋ａｎ　　（１６）　、およびＢｅ
ｎｎｃｔｚｅｎと１ｌａｌｌ　（１７）は、Ｔ−リッチ
。
ＴＡＧ、、、ＴＡＧＴ　（またはＴＡＴＧＴ）。
ＡＴ、、、ＴＴＴまたはＴ、、、ＴＡＡＡＴＡＡ。
、Ａ（またはＧ）、、、Ｔ、、、Ａ、、ＡＴの配列がこ
れらの役割を果すと仮定した。ＦＭＤＨ遺伝子において
は、これら合意の得られた配列との類似性が滅多に見ら
れない。若干の可能性ある信号を探したところ成る繰り
返し配列が見出された。ＴＴＧＧＡとＴＡＧＧの配列は
二回繰り返す。
動物のポリアゾニレ−ジョン信号と同様のＡＡＡＴＡＴ
ＡＡはＯＲＦの末端から３０ｂｐ下流に位置する。
例　　１ ＦＭＤＨ５’上流領域の機能領域を調べることができる
ようにするため、この領域の一連の？ｒ８１人物を単離
した。先ず、描造遺伝子を伴わないプロモーターを得る
ため、１　、４ｋｂ　　Ｂ　ａｒｎｌ−Ｉ　Ｉ断片を含
むｐＵＣ型プラプラスミド適当な点で線形化した後にＢ
ａＪ３１エキソヌクレアーぜ処理に付した。開始時に、
最初のＡＴＧから−５の位置に消去をもつプロモーター
断片に注意を集中した。
この断片はｒ−５プロモーター」と呼ばれる。また「−
９」消去プロモーターも若干の実験に使用した。
「−５プロモーター」を細菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子
（ＢＡａ）の開放読み枠に融合させた。
この遺伝子を、酵母プロモーター制御下で外米タンパク
質の発現を研究するための非常に適当なモデルとして研
究字で用いた。
β−ラクタマーゼの信号配列【よ得られた構成に存在し
なかったので、酵母タンパク質抽出物の酵素活性の測定
が可能になった。融合させたＤＮＡ断片を、ｔｌ、　ｏ
ｆ　ｍｏｒ　ｈａの自律的に？！製する配列（ＨＡＲ８
１）を含むプラスミド（第６図）および旧ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈａの形質転換に対しマーカーとしてｈ　＜　Ｓ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　Ｕ　ｒ　ａ　３遺伝子にクロ
ーン化した。Ｈ，ｐｏｌｙｍｏｒ　ｈａ形質転換でつく
り出されるβラクタマーゼの（１）を、酵素試験および
免疫試験により測定した。表１は種々な培地（異なる炭
素源）で培養した細胞内の、ＦＭＤＨプロモーター制御
下でのβ−ラクタマーゼの合成を示す。
表１は、１ＩｉｌｌｌｔされたＦＭＤＨプロモーターが
抑制／ｌ１ｆ２抑制／誘導機構によって適当にか゛つ厳
重に制御されることを示す。合成されたタンパク質ポの
品定から、本発明系が外来タンパク質の非常に効率的な
転写および翻訳により特徴づけられることが分かる。対
照実験においては、β−ラクタマーゼが２−ｕｍプラス
ミド（コピー数５０／ＩＩ胞）上張りｓ、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　　ｐｉ）Ｃ（ｐｕｒｙｖａｔデカルボキシカ
ーゼ）プロモーターの制御下に Ｓ、ＣｅｒｅＶｉＳｉａｅで発現された。得られた値は
Ｈ，ｐＯｌｙｆｆｌＯｒｐｈａの場合よりファクター５
〜６だけ低かった。
クローン 表１　β−ラクタマーゼの産生 酵素試験　　　　　　　　　　　　　免疫試験（Ｕ／ｍ
ｙタンパク質）　　　　　（全細胞タンパク質の％）ｒ
４５ ７０　　　１００００　　２８０００　　　−　　　　
６−８　　　　１Ｏ−１２ＧＬＩＩ−３％グルコース上
での培養（抑制）ＧＬＩＣ−１％グリセリン上での培養
（肌抑制）Ｍｅｔ−ＯＨ−１％メタノール上での培！（
Ｍ導）すべての場合、対数後期からの細胞を測定のため
に採取した。融合を含むプラスミドはコピー数５０〜６
０／細胞を有した。
例　　２ ＦＭＤＨプロモーターの制御下のＢ型肝炎表面抗原（Ｈ
８８Ａｙ）をコードする遺伝子の発現１　　肝炎タンパ
ク質を発現するプラスミドの構築 Ｂ５す■炎１．２ｋｂ　ＤＮＡ断片は長い５２−３１Ｓ
−タンパク質（ｐｒｅｓ）をコード化していて、これを
処理後（Ｂ２−３１部分の除去）Ｓ−タンパク質に変換
する。ウィルス外被は両方のタンパク質からなる。
本発明者等の発現実験のために、本発明者等は１．２ｋ
ｂｌｌｆＦ片ならびにＳ−タンパク質だけをコード化し
たこのＤＮＡの短い部分を使用した。後者はまた抗原の
擬ウィルス粒子を形成ケることができる。
本弁明者等は肝炎Ｓ−遺伝子を本発明者等の一般性ある
ベクターに挿入した。第１図およびスキーム１に示した
ように、このベクターは自律的複製配列（＋−ＩＡＲ３
）、選択的マーカーとしてＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅか
らｑられるＵＲＡ３ｍ伝子、お転子Ｉｔ、　ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈａプロモーターそれに続く短いリンカ−を含む
。Ｓ−遺伝子の後に、本発明者等は転写ターミネータ−
機能を示すＨ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＭＯＸ遺伝子から
誘導されたＤＮＡ断ハを置いた。
第７図はＳ−遺伝子を含む構成を示す、。
２、　１１．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換および＋
１　Ｓ　Ｉ３△９を発現するクローンのスクリーニング ＋＋、ｐｏｌｔ７ｍｏｒｐｈａ　　ＵＲＡ３ｇ異株ＬＲ
９を上記プラスミドで形質転換した。次にこの酵母形質
転換体をポリクローン抗体を用いてｌ−Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａ
　Ｑの発現について直ちにスクリーニングした。免疫ス
クリニングとして本発明者等はウェスタンブロッティン
グ（ペルオキシダーゼ−タンパクＭＡまたはセンシテイ
ビテイ　　Ｊ　ａ　善−タンパク質Ａ）を用いた。この
スクリーニング手順は、 ρｏｌｙｍｏｒｐｈａ粗製抽出物タンパク質を含む血清
の強い交差反応性により相当に妨げられた。しかし、本
発明者等は発現した抗原を示すことができた。
第８図は、メタノール上ぐ培養した肝炎の遺伝子で形質
転換したＩＩｌ胞からのウェスタンブロッティングタン
パク質抽出物を示し、またＳ−タンパク質の期待した分
子間を有するもう一つの抗原バンドを示す。グルコース
上で培養した形質転換体から得た対照抽出物（Ｆ　Ｍ　
Ｄ　Ｉ−１ブ０モーターの抑制）はこのバンドを有しな
い。第８図に示した結果は、ＦＭＤＩ−（−９プロモー
ター、即ち最初のＡＴＧから−９の位置までプロモータ
ー機能を包含するＤＮＡ断片を消去することにより誘導
されたプロモーターを含む形質転換体から来ている１゜
本発明者等はまた、本発明者等の形質転換体でつくり出
されたＳｌ−ヌクレアーゼマツピングｍ　ＲＮ　Ａを試
験することによって６分析した。これらの結果は、形質
転換体が沢山のＳ−遺伝ｆｍＲＮＡ種をつくり出してい
ること、および転写が抑制／脱抑制／誘導機構により厳
しく制御されていることをボす。
上記結果は、形質転換された細胞から誘導されたタンパ
ク質抽出物の陽性ＲＩＡ試験により確証が与えられた。
この試験で、自然のままのＳ−タンパク質に対して方向
づけられた七ツクローン抗体を用いた。
例　　３ ＦＭＤＩ−１プロモーター制御下で旧ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａにおけるＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｃａｓｔ
ｅｌｌｉから得られるα〜アミラーゼの発現と分泌。
■、ρｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいて分泌タンパク質を発
現する可能性を調べるために、本発明者等は酵母ｓ、　
ｃａｓｔｅ　＋　＋　１１から得られるα−アミラーゼ
遺伝子を選んだ。この遺伝子は５６ｋｄタンパク質をコ
ード化していて、これはＳ、Ｃａ５ｔｅｌ　Ｉ　ｉ　ｉ
において培地中に全部分泌される。この分泌過程ｔまタ
ンパク質のグリコジル化を伴なう。
本発明者等は、構造遺伝子およびそのターミネータ−を
包含するＥｃｏＲＩｆＩｉ片を、本発明者等の発現プラ
スミド（第９図）中に挿入した。
１１、ρ０Ｉｙ１＋１０ｒｐＨａをこのプラスミドで形
質転換し、その形質転換体を、α−アミラーゼの発現Ｊ
３よび分泌について、デンプン分解試験（デンプン−ヨ
ウ素平板上の輪九形成）または酵素反応速度試験キット
（α−アミラーゼＨｅｒｋＯｔｅＳｔ　Ａ　）を使用し
て試験した。
これらの結果はＦＭＤＨプロモーターの制御下でα−ア
ミラーゼがつくられることをはつきり小している。しか
し、このタンパク質は培地の中に分泌される。第１０図
は対数中期においてタンパク質の約９０％が培地中に分
泌されることをボす。
デンプン−ヨウ素平板試験はこれら結果に確証を与えた
く第１１図）。
これらデータはまた脱抑制条件下で高い発現レベルを（
ｑることが可能なことを示している。この系の特徴は、
バイオテクノロジーの応用面に対してとりわけ非常に貴
１であり重要である。即ち、外来タンパク質の合性が、
インデュリーとしてメタノールを添加しなくても、単に
培地中のグルコースを消費し尽しそして（または）グリ
セリンを添加することにより開始できる。このような容
易な方法で非常に効果的な発現を同時に与えることによ
り取り扱うことができて、バイオテクノロジー産業に応
用できる聞のタンパク質を生成しうる系は以前に提供さ
れたことはなかった。
別の研究で、ＭＯＸおよびＤＡＳのような他のＬ匹ユ肥
旦加プロモーターは脱抑制（ｉ号に対しそれ程強く応答
しないことが示された。ＤＡＳｊ［１４゜ モーターの場合に、脱抑制条件下での発現は後転写制御
により更に減少する。
【図面の簡単な説明】
第１図は粗製タンパク質抽出物およびｉｎ　ＶｉｔｒＯ
闘訳生成物の分析を示し、第２図はＦ　Ｍ　Ｄ　Ｈ遺伝
子を包含するＤＮＡ断片の制限地図を示し、第３図はＳ
ｌ−マツピングを示し、第４図は配列決定の概略を表わ
し、第５ａ図から第５Ｃ図はＦＭＤ）」遺伝子およびそ
の５’、３’制御領域のヌクレオチド配列を示し、第６
図および第７図はそれぞれブうスミドを示し、第８図は
ウェスタンブロッティングタンパク質抽出物を示し、第
９図はα−アミラーゼ遺伝子を発現するプラスミドを示
し、第１０図はメタノール含有ｊＲ地上での形質転換体
の発育を示し、第１１図は輪光の形成を示す。 健−」Ｌ−文−」Ｓ １、　ＤＯｕｌｌｌａ、　Ａ、　Ｌ、、　ｖｅｃｎｈｕ
ｒｓ、　１４．、にＯｎｉｎｇ、　Ｗ［ｖｅｒｓ　　Ｈ
，ａｎｄ　Ｈａｒｄｅｒ　　’ｔ４．　　Ａｒｃｈ　ｏ
ｆＨｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　（１９８５）　　１４５．
２３７゜２、　Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ、Ｒ，、Ｊａｎｏ
ｗｉｃｚ、　ｉ、Ｓｔａｎｉｋｏｗｓｋ８、　　ａｎｄ
　　ｌｌｏｌｌｃｎｂｅｒｇ、　　Ｃ，Ｐ（１９８４）
Ｍｏ１．　　Ｇｅｎ、　　Ｇｅｎｅｔ、　　１９４　４
８９−４９３３、　　　Ｌｅｃｌｅｂｏｅｒ　　＾、Ｈ
，）ｌａａｔ　　Ｊ、　　Ｖｉｓｓｅｒ　　　Ｃ，Ｂｏ
ｓ　　Ｊ、Ｗ。 ＶｅｒｒｌＤＳ、Ｃ，■、、Ｊａｎｏｗｉｃｚ　　Ｚ、
　　Ｅｃｋａｒｔ　　ＨＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ、　　Ｒ
，ａｎｄ　　ｌｌｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｃ，Ｐ（１９８
５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、　　３０
６３゜４、　　Ｅｌｌｉｓ　　Ｓ、Ｂ、　　ｅｔ　　ａ
ｌ、ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｒ　　ａｌｃｏｈ。 ｏｘｉｄａｓｅ　　ａｎｄ　　ｔｗｏ　　ｏｔｈｅｒ　
　Ｉｌｌｅｔｂａｎｏｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　　ｇｅ
ｎｅｓ　Ｉ’ｒｏｍ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　Ｐｉｃｈｉ
ａＰａｓｔｏｒｉｓ、Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃ
ｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５）５：１１
１１−２１ ５、Ｊａｎｏｗｉｃｚ、Ｚ、Ａ、、Ｅｃｋａｒｔ、Ｈ，
Ｒ，Ｄｒｅｗｋｅ　　ＣＲｏｇｇｃｎｋａｍｐ、Ｒ，０
，，１ｌｏｌ　ｌｅｎｂｅｒｇ、Ｃ，Ｐ、、Ｈａａｔ　
　ＪＬｃｄｅｂｏｅｒ、　　Ａ、Ｍ、、Ｖｉｓｓｅｒ、
Ｃ，ａｎｄ　　シａｒｒｉｐｓ、Ｃ。 丁　、　　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、（１９８５）
１３．　３０４３６、Ｗ＋ｌｌｉａｍｓ、Ｂ、Ｇ、ａｎ
ｄ　　Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ、Ｒ、（１９７９）Ｊ、　
ＶｌｒＯｌ、２９　５５５ ７、　　Ｇｏｌｄｂａｃｈ、Ｒ，Ｗ、　　Ｂｏｒｓｔ　
　Ｐ、　　Ｒｏｔｔｅｎ−ｄｅ−Ｂｏｃｒ　　ＪＥ、ａ
ｎｄ　　ｖａｎ　　Ｂｒｕｇｇｅｎ、Ｅ、Ｆ、Ｊｆ１９
７８１Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｅｔ　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ
ｔａ　　５２１゜８゜ ９゜ １０゜ １５゜ Ｆａｖａｒｏｌｏ　　Ｊ、　　丁ｒｅｉｓｍａｎ］、ａ
ｎｄ　　Ｋａｍｅｎ、Ｒ（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５．　７１８Ｂｉｉ
ｎｅＩＩｌａｎｎ、　　Ｈ，、Ｗｃ５ｔｈｏｆｆ、　　
Ｐ、ａｎｄ　ＨｅｒｒｍａｎｎＲ，Ｇ、　（１９８２）
Ｎｕｃ　ｌ　、　Ａｃ　ｉｄ、　Ｉｔｅｓ、　１０．７
１６３−７１７８Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｃｏｕｌｓｏｎ
、Ａ、Ｒ，、Ｂａｒｒｅｌｌ、Ｂ、Ｇ。 Ｓｍ１ｔｈ　　Ａ、Ｊ、Ｈ，ａｎｄ　　Ｒｏｅ　　Ｂ　
　＾（１９８０）Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、　　１４３，
１６１−１７８゜Ｈａｘａｍ　　Ａ、Ｈ，ａｎｄ　　Ｇ
ｉｌｂｅｒｔＭｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（１
９８０）６５，４９９゜Ｖａｎ　Ｄｉｊｋｃｎ、Ｓ、Ｐ
、、　Ｖｅｅｎｈｕｉｓ、Ｈ，ａｎｄ　　Ｈａｒｄｅｒ
Ｈ，（１９８２）Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
３８６，２００−２１６にｏｚａｋ　　Ｈ。 （１９８１１Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、９．　５
２３３−５２５２Ｓａｈｎ　　Ｉｔ。 （１９７７）Ａｄｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｅｎｇ、６．７
７−１０３゜νｅｅｎｈｕｉｓ　　Ｈ，、ｖａｎ　　Ｄ
ｉｊｋｅｎ、Ｊ、Ｐ、　　ａｎｄ　　１ｌａｒｄｅｒ−
６（１９８３）Ａｄｖ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ、２３．２−７６゜Ｚａｒｅｔ　　Ｋ、Ｓ、　
　ａｎｄ　　Ｓｈｅｒｍａｎ　　Ｆ（１９８２）Ｃｅｌ
ｌ　　２８，５６３−５７３゜８ｅｎｎｃｔｚｅｎ ■ ｎｄ ｌａ （１９８２）Ｊ ｈｅｍ

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）活性を
    有するタンパク質に対する構造遺伝子および制御領域を
    コードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。
  2. （２）野生型ＦＭＤＨタンパク質をコードする特許請求
    の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
  3. （３）組換えＤＮＡテクノロジー技術によつてバイオテ
    クノロジーの特徴を向上させたタンパク質をコードする
    ように修飾された、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ
    分子。
  4. （４）制御領域のプロモーターをコードする特許請求の
    範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
  5. （５）組換えＤＮＡテクノロジー技術によつて制御領域
    の特徴を改善するように修飾された、特許請求の範囲第
    ４項記載のＤＮＡ分子。
  6. （６）第５図に示したヌクレオチド配列をもつ、特許請
    求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
  7. （７）ＦＭＤＨ調節配列の調整の厳重な制御下で遺伝子
    を導くように外来遺伝子をコードするようにＤＮＡ配列
    と組み合わせる、特許請求の範囲第１項から第６項まで
    のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
  8. （８）外来遺伝子は （イ）Ｂ型肝炎ウィルスＳ１−Ｓ２−Ｓ抗原、 （ロ）Ｂ型肝炎ウィルスＳ抗原、 （ハ）Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉ
    ｉから得られるα−アミラーゼ、 （ニ）Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉ
    ｉから得られるグルコアミラーゼ、 （ホ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
    ｅから得られるインベルターゼ、 をコードする特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ分子。
  9. （９）分泌信号の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列と結合
    させる、特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    か１項に記載のＤＮＡ分子。
  10. （１０）分泌信号は、 Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ膜転座信号、
    なるべくはペロキシソームタンパク質メタノールオキシ
    ダーゼおよびジヒドロキシアセトンシンターゼから得ら
    れるちの、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌ
    ｌｉｉα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ信号、ま
    たはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
    α−因子およびインベルターゼ信号である、特許請求の
    範囲第９項記載のＤＮＡ分子。
  11. （１１）天然のＤＮＡおよび（または）ｃＤＮＡおよび
    （または）化学的に合成されたＤＮＡから得られた、特
    許請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１項に記載
    のＤＮＡ分子。
  12. （１２）特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれか
    １項に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体ベクター。
  13. （１３）特許請求の範囲第１２項記載のベクターを含有
    する微生物。
  14. （１４）なるべくはＣａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌ
    ａまたはＰｉｃｈｉａ属の酵母である、特許請求の範囲
    第１３項記載の微生物。
  15. （１５）特許請求の範囲第１項から第１１項までのいず
    れか１項に記載のＤＮＡ−分子を形質転換により取り込
    んだ、特許請求の範囲第１４項記載の微生物。
  16. （１６）ＤＮＡ配列を微生物のゲノム中に組込んだ、あ
    るいは染色体外ＤＮＡ分子として保持した、特許請求の
    範囲第１４項または第１５項記載の微生物。
  17. （１７）高濃度の外来タンパク質に耐える、特許請求の
    範囲第１４項から第１６項のいずれか１項に記載の微生
    物。
  18. （１８）特許請求の範囲第１４項から第１７項のいずれ
    か１項に記載の微生物を培養し、外来物質を回収し、公
    知の方法で精製する、有用物質の製造法。
JP63277205A 1987-07-17 1988-11-01 Ｄｎａ分子 Expired - Lifetime JP3072993B2 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES87110417T ES2056799T3 (es) 1987-07-17 1987-07-17 Moleculas de adn codante para las regiones de control fmdh y gen estructural para una proteina que tiene una actividad de fmdh y su uso.
AT87110417T ATE105858T1 (de) 1987-07-17 1987-07-17 Dna-moleküle, die für fmdh-kontrollabschnitte und strukturgene für ein protein mit fmdh-aktivität kodieren, sowie deren anwendung.
DE3789866T DE3789866T2 (de) 1987-07-17 1987-07-17 DNA-Moleküle, die für FMDH-Kontrollabschnitte und Strukturgene für ein Protein mit FMDH-Aktivität kodieren, sowie deren Anwendung.
EP87110417A EP0299108B1 (en) 1987-07-17 1987-07-17 DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses
AU24434/88A AU2443488A (en) 1987-07-17 1988-10-27 Dna-molecules coding for fmdh control regions and structured gene for a protein having fmdh-activity and their uses
JP63277205A JP3072993B2 (ja) 1987-07-17 1988-11-01 Ｄｎａ分子
US07/844,885 US5389525A (en) 1987-07-17 1992-03-03 DNA-molecules coding for FMDH control regions and structural gene for a protein having FMDH-activity and their use thereof

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP87110417A EP0299108B1 (en) 1987-07-17 1987-07-17 DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses
AU24434/88A AU2443488A (en) 1987-07-17 1988-10-27 Dna-molecules coding for fmdh control regions and structured gene for a protein having fmdh-activity and their uses
JP63277205A JP3072993B2 (ja) 1987-07-17 1988-11-01 Ｄｎａ分子
US07/844,885 US5389525A (en) 1987-07-17 1992-03-03 DNA-molecules coding for FMDH control regions and structural gene for a protein having FMDH-activity and their use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02124093A true JPH02124093A (ja) 1990-05-11
JP3072993B2 JP3072993B2 (ja) 2000-08-07

Family

ID=27422777

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63277205A Expired - Lifetime JP3072993B2 (ja) 1987-07-17 1988-11-01 Ｄｎａ分子

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5389525A (ja)
EP (1) EP0299108B1 (ja)
JP (1) JP3072993B2 (ja)
AT (1) ATE105858T1 (ja)
AU (1) AU2443488A (ja)
DE (1) DE3789866T2 (ja)
ES (1) ES2056799T3 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015064517A1 (ja) * 2013-10-28 2015-05-07 国立大学法人岐阜大学 ギ酸脱水素酵素とその利用

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL168787B1 (pl) * 1989-08-03 1996-04-30 Smithkline Beecham Biolog Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL
DE69319728T2 (de) 1992-05-23 1999-02-04 Smithkline Beecham Biologicals S.A., Rixensart Kombinierte Impfstoffe, die Hepatitis B oberfläche Antigen und andere Antigenen enthalten
CA2138997C (en) 1992-06-25 2003-06-03 Jean-Paul Prieels Vaccine composition containing adjuvants
WO1994021802A1 (en) * 1993-03-25 1994-09-29 Biosource Genetics Corporation PICHIA PASTORIS ALCOHOL OXIDASE ZZA1 and $i(ZZA2)
US6699704B1 (en) 1994-04-25 2004-03-02 Roche Vitamins Inc. Heat tolerant phytases
US6358722B1 (en) 1994-04-25 2002-03-19 Roche Vitamins, Inc. Heat tolerant phytases
US5712114A (en) * 1995-06-06 1998-01-27 Basf Aktiengesellschaft Compositions for expression of proteins in host cells using a preprocollagen signal sequence
JP3396224B2 (ja) * 1995-09-12 2003-04-14 麒麟麦酒株式会社 カンジダ・ボイジニイのギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター／ターミネーター
WO1997017450A2 (en) * 1995-11-09 1997-05-15 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
US5716808A (en) * 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
US5955349A (en) * 1996-08-26 1999-09-21 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica
US5747328A (en) * 1996-02-28 1998-05-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Microbial system for formaldehyde sensing and remediation
GB9623233D0 (en) 1996-11-07 1997-01-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
CA2231948C (en) 1997-03-25 2010-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified phytases
NZ330940A (en) 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes
EP1659173A1 (en) 1997-10-01 2006-05-24 DSMIP Assets B.V. Protein production process
GB9724627D0 (en) * 1997-11-20 1998-01-21 Genencor Int Bv Gram positive microorganism formate pathway
AU750587B2 (en) 1998-10-16 2002-07-25 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Adjuvant systems and vaccines
US6720174B1 (en) 1999-01-28 2004-04-13 Novozymes A/S Phytases
UA79735C2 (uk) 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
US6645739B2 (en) 2001-07-26 2003-11-11 Phoenix Pharmacologies, Inc. Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same
WO2003054155A2 (en) 2001-12-19 2003-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor
EP2207035B1 (en) 2006-03-14 2013-10-16 Oregon Health and Science University Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection
EA015964B1 (ru) 2006-09-07 2012-01-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина
DK2106447T3 (da) 2007-01-26 2013-06-24 Novozymes As Fremgangsmåde til methanoluafhængig induktion fra methanolinducerbare promotorer i Pichia
WO2008106551A2 (en) 2007-02-28 2008-09-04 The Govt. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. Brachyury polypeptides and methods for use
EA201490303A1 (ru) 2007-05-02 2014-05-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина
WO2009143524A2 (en) 2008-05-23 2009-11-26 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
US9005631B2 (en) 2008-08-04 2015-04-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Membrane proximal region of HIV gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine
WO2010099472A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 The U.S.A. Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Spanx-b polypeptides and their use
US9181306B2 (en) 2009-10-16 2015-11-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine
EP2336152B1 (en) 2009-12-21 2014-08-13 Süd-Chemie IP GmbH & Co. KG Thermostable xylanase for the selective hydrolysis of pentose-containing polysaccharides
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
US9566329B2 (en) 2012-04-06 2017-02-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Live, attenuated rubella vector to express vaccine antigens
ES2752190T3 (es) 2012-09-14 2020-04-03 Us Health Proteína Brachyury, vectores adenovirales que codifican proteína Brachyury y su uso
CN105007936B (zh) 2013-03-08 2018-10-02 扬森疫苗与预防公司 无细胞百日咳疫苗
AU2014260123B2 (en) 2013-04-30 2018-10-11 Donald Danforth Plant Science Center Antifungal plant proteins, peptides, and methods of use
CN103255163B (zh) * 2013-05-15 2016-01-27 北京民海生物科技有限公司 一种ev71病毒样颗粒及其制备方法与应用
EP4137150A1 (en) 2015-08-03 2023-02-22 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Brachyury deletion mutants, non-yeast vectors encoding brachyury deletion mutants, and their use
EP3922726A1 (en) 2020-06-10 2021-12-15 Erber Aktiengesellschaft Truncated promoter for recombinant gene expression

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4876197A (en) * 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US4855231A (en) * 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
GB8600245D0 (en) * 1986-01-07 1986-02-12 Shell Int Research Preparation of 2-arylpropionic acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J BIOL CHEM=1986 *
PROC NATL ACAD SCI USA=1986 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015064517A1 (ja) * 2013-10-28 2015-05-07 国立大学法人岐阜大学 ギ酸脱水素酵素とその利用

Also Published As

Publication number Publication date
DE3789866T2 (de) 1994-09-22
US5389525A (en) 1995-02-14
AU2443488A (en) 1990-05-03
ES2056799T3 (es) 1994-10-16
DE3789866D1 (de) 1994-06-23
EP0299108B1 (en) 1994-05-18
ATE105858T1 (de) 1994-06-15
JP3072993B2 (ja) 2000-08-07
EP0299108A1 (en) 1989-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3072993B2 (ja) Ｄｎａ分子
US5593858A (en) Highly stable recombinant yeasts for the production of recombinant proteins
CA1224735A (en) Cloning system for kluyveromyces species
Sarthy et al. Expression of the Escherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae
Oudshoorn et al. Subunit II of yeast QH2: cytochrome‐c oxidoreductase: Nucleotide sequence of the gene and features of the protein
EP0394538A1 (en) A yeast cell of the genus schwanniomyces
KR930001117B1 (ko) Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법
JPH02476A (ja) 宿主細胞としてのクルイベロミセス
JP2003116525A (ja) 酵母におけるタンパク質の高レベル発現
JPS62208288A (ja) 酵母内でｂ型肝炎ウイルス蛋白を生産する方法
JP2614314B2 (ja) メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびｐｒｅＳ▲下２▼タンパク質の発現
EP0103201A2 (en) Shuttle vector
US4752576A (en) Expression of α-1 antitrypsin in yeast
Zhu et al. Construction of stable laboratory and industrial yeast strains expressing a foreign gene by integrative transformation using a dominant selection system
US5068185A (en) Trains of yeast for the expression of heterologous genes
JPH08500014A (ja) Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）トランスアルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびその使用
JPH08500007A (ja) Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターおよびその使用
Taguchi et al. The cloning and mapping of ADR6, a gene required for sporulation and for expression of the alcohol dehydrogenase II isozyme from Saccharomyces cerevisiae
Boutry et al. Isolation of the structural genes for the alpha and beta subunits of the mitochondrial ATPase from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.
Tikhomirova et al. Transformation of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: cloning and expression of genes
EP0339567A1 (en) Expression of Hepatitis B PreS 2 Protein in Methylotrophic Yeasts
JPH08500008A (ja) Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）リボソームタンパク質ＲＰ２８の遺伝子のプロモーターおよびその使用
KR19980070038A (ko) 한세눌라 폴리모르파 유래의 다중병렬도입형 자기복제서열
DK175647B1 (da) FMDH-protein DNA
CA1339012C (en) Dna-molecules coding for fmdh (formate dehydrogenase) control regions and structured gene for a protein having fmdh-activity and their uses

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090602

Year of fee payment: 9

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090602

Year of fee payment: 9