JPH08500041A - インビトロの角膜同等モデル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、組織培養システムを用いて製造された眼の角膜部分の器官同等物に関する。角膜同等物を構築する方法は、インビボでの眼の角膜と同様の構造を生じる。角膜同等物は眼のインビトロモデルであり、インビボでの移植若しくは植込み用にまたはインビトロで化合物をスクリーニングするのに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 インビトロの角膜同等モデル発明の分野 本発明は、組織培養システムの分野に関し且つ眼の角膜の器官同等物、すなわ ち角膜同等モデルに関する。角膜同等モデルを構築する組織培養法は、インビト ロでの眼の角膜と同様の構築物を生じる。角膜同等物は眼のインビトロモデルで あり、インビトロでの移植若しくは植込み用にまたはインビトロで化合物をスク リーニングするのに用いることができる。 発明の背景 組織培養技術は、組織および器官同等物を開発するのにうまく用いられている 。これらの技術の基本は、生細胞、栄養素および培養条件の適切な組合せによっ て機能的組織および器官に改造されることができるコラーゲンマトリックス構造 を必要とする。組織同等物は、いずれも本明細書中に参考として包含されている 米国特許第４，４８５，０９６号明細書；同第４，４８５，０９７号明細書；同 第４，５３９，７１６号明細書；同第４，５４６，５００号明細書；同第４，６ ０４，３４６号明細書；および同第４，８３７，３７９号明細書を含む多数の特 許において広範囲に記載されてきた。組織同等物の一つの成功した用途は、実際 のヒトの皮膚と同様の形態学を有する生育皮膚同等物である。生皮膚同等物は２ 種類の層から成り、上部は、コラーゲンマトリックス中のヒト皮膚線維芽細胞の より厚い下方層を覆つている、分化し且つ重層されたヒト表皮角膜実質細胞から 成る。べル（Ｂｅｌｌ）ら、「再形成皮膚の処方（Ｒｅｃｉｐｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ Ｓｋｉｎ）」、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ，１１３：１１３〜１１９（ １９９１）。 研究は、角膜の上皮および内皮細胞の培養に関して行なわれた。シー（Ｘｉｅ ）ら、「ウサギ角膜細胞の簡単な短期組織培養技術（Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｃｏｒｎｅａｌ ｃｅｌｌｓ）」、Ｉｎ Ｖｉｔ ｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉ ｏｌｏｇｙ ，２５：２０〜２２（１９８９）およびシモンズ （Ｓｉｍｍｏｎｓ）ら、「組織培養における角膜上皮創傷閉鎖。眼刺激のインビ トロモデル（Ｃｏｒｎｅａｌ Ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｃｌｏｓｕｒｅ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａｎ ｉｎ ｖｉｔ ｒｏ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｏｃｕｌａｒ Ｉｒｒｉｔａｎｃｙ）」、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ， ８８：１３〜２３（１９８７）。眼の角膜のインビトロ器官同等物の開発は、多 数の種類の製品および原料に関する潜在的なインビボの眼および皮膚刺激の正確 且つ安価な非動物予測モデルとして役立つインビトロ毒性検定における使用が特 に関心をよんでいる。 発明の概要 本発明は、眼の角膜の器官同等物に関する。本発明による角膜同等物の構築は 、角膜中の３種類の異なる細胞層、すなわち、外層である重層偏平上皮；中心層 であるコラーゲン線維；および内層である角膜内皮とも称する単層偏平上皮の組 織培養による生産を必要とする。角膜同等物を構築する方法は、インビボでの眼 の角膜と同様の構造を生じる。 本発明は、部分的には、インビボでの角膜透明性のためだけでなく、改良され た形態学、生化学的および生理学的マーカーの発現、細胞の広がり、マトリック スに対する上皮付着並びにインビボでの上皮被覆の均一性のために内皮層の包含 が必要とされるという発見に基いている。内皮は、角膜同等物における基底膜の 生長を促す。内皮の影響によってインビトロでの高水準の上皮分化を達成すると いう結果は意外であった。 この発見に基いて、他の組織および器官同等物における内皮の使用も、基底膜 の生長を促すということが発見された。したがって、本発明は、更に、コラーゲ ンまたは上皮細胞を用いるこのような組織および器官同等物構築における内皮細 胞の使用に関する。 図面の説明 図１は、内皮細胞層を用いておよび用いることなく形成された角膜同等物のフ ォトミクログラフＡおよびＢを示す。三細胞角膜構築物のフォトミクログラフＡ は、湿潤界面において１４日後に得られた。正常ウサギ上皮（ＥＰ）は、約７層 の細胞から成る。多層の形質転換されたマウス内皮層（ＥＮ）の存在のために、 正常ウサギ基質線維芽細胞（ＦＩＢ）は過増殖性ではない。これは上皮付着を可 能にし且つ線維芽細胞皮膚の生長を排除する。内皮層を用いない（Ｂ）上皮は、 付着が不十分であり、厚みおよび組織化が異なる。倍率＝１６０Ｘ 図２は、液内、湿潤界面および乾燥界面で培養後の角膜同等物のフォトミクロ グラフＡ、ＢおよびＣを示す。フォトミクログラフは、異なる環境条件下におい て培養された角膜同等物の組織学的外観を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン で染色された柔軟な切片は、異なる培養環境を用いて得られた異なる形態学を示 す。上皮細胞を液内培養において格子上で１４日間増殖させた場合（Ａ）、その 結果は、最小限に組織された厚みのある上皮である。この上皮は、更に、上皮細 胞の一様でない広がりゆえに厚みが異なる。培養物を湿潤界面まで上昇させた場 合、上皮は更に組織されるようになる（Ｂ）。乾燥界面まで上昇させた場合、多 数の角化細胞層によって実証されるように、角質層様層が発生する（Ｃ）。 上段：液内、２００Ｘ 下段左：エアリフト湿潤界面、４００Ｘ 下段右：エアリフト乾燥、２００Ｘ 図３は、異なる環境条件下におけるエノラーゼ分布の免疫蛍光法フォトミクロ グラフＡ〜Ｄを示す。フォトミクログラフは、エノラーゼ染色の変化を示す１４ 日間角膜構築物を示す。エノラーゼは、角膜上皮における増殖性細胞集団のマー カーである。通常、それは縁部分の基底細胞中に存在している（ジースク （Ｚｉｅｓｋｅ）、１９９２年）。完全な上皮は、培養が液内である場合（Ａ） にエノラーゼに関して陽性に染色されて、過増殖状態および特殊化すなわち分化 していないことを示す。培養物を湿潤（Ｂ、Ｃ）かまたは乾燥界面（Ｄ）まで上 昇させた場合、染色は基底上の層においてインビボで観察されるものに一層近く まで減少される。 上段左：液内、２００Ｘ 上段右：エア・リフト湿潤、２００Ｘ 下段左：エア・リフト湿潤、４００Ｘ 下段右：エア・リフト乾燥、２００Ｘ 図４は、異なる環境条件下におけるケラチン３の分布を示す免疫蛍光法フォト ミクログラフＡ〜Ｄである。ケラチン３は、角膜上皮細胞に特異的なマーカーで あり、通常、角膜縁の全基底上細胞層および中心角膜の細胞中に存在する（シャ ーマー（Ｓｈｅｒｍｅｒ）ら、１９８６年）。１４日間液内培養された角膜同等 物は、少量のケラチン３標識を示す（少数の最外表面細胞中においてＡＥ５抗体 を用いて標識された）（Ａ）。培養物を湿潤かまたは乾燥界面まで上昇させた場 合（Ｂ、Ｃ、Ｄ）、染色は強く、そしてここではインビボの正常角膜縁の場合と 同様に全基底上層中に存在する。 上段左：液内、２００Ｘ 上段右：エア・リフト湿潤、２００Ｘ 下段左：エア・リフト湿潤、２００Ｘ 下段右：エア・リフト乾燥、左の相、２００Ｘ 図５は、内皮細胞層を用いるおよび用いない、エノラーゼ、ケラチン３および ビンクリン分布の相違を示す免疫蛍光法フォトミクログラフＡ〜Ｄである。湿潤 界面において１４日間後の内皮層含有角膜同等物は、α−エノラーゼ（Ａ）（ジ ースクら、１９９２年）およびケラチン３（抗体ＡＥ５で標識された（シャーマ ーら、１９８６年））（Ｄ）の染色の適当な分布を示す。内皮層を用いることな く湿潤界面にあった試料中のビンクリンの過剰生産は（Ｂ）、内皮層を有する試 料中の小さな斑点の染色まで減少させる（Ｃ）。倍率＝２００Ｘ 上段：湿潤エアリフトおよび内皮層；αエノラーゼ 中段左：湿潤エアリフト：ビンクリン 中段右：湿潤エアリフトおよび内皮層；ビンクリン 下段：湿潤エアリフトおよび内皮層：ＡＥ５ 図６は、内皮細胞層を用いるおよび用いない角膜同等物中のラミニンおよびＶ ＩＩ型の分布を示す角膜同等物の免疫蛍光法フォトミクログラフＡ〜Ｆを示す。 内皮層を用いることなく湿潤界面で１４日後の角膜構築物は、少量のラミニン（ Ａ）およびＶＩＩ型コラーゲン（Ｂ）を示す。内皮層が構築物中に組込まれてい る場合（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ラミニン（Ｃ）およびＶＩＩ型コラーゲン（Ｄ、Ｅ 、Ｆ）は、基質−上皮結合部において途ぎれない線で示される。 上段左：エア・リフト湿潤、ラミニン、４００Ｘ 上段右：エア・リフト湿潤、ＶＩＩ型、４００Ｘ 中段左：エアリフト湿潤および内皮、ラミニン、１００Ｘ 中段右：エアリフト湿潤および内皮、ＶＩＩ型、１００Ｘ 下段左：エアリフト湿潤および内皮、ＶＩＩ型、２００Ｘ 下段右：エアリフト湿潤および内皮、ＶＩＩ型、４００Ｘ 図７〜１０は、角膜構築物の透過型電子顕微鏡写真である。透過型電子顕微鏡 写真用に、内皮、基質および上皮細胞層を含む角膜同等物を、０．１Ｍカコジル 酸ナトリウム、ｐＨ７．４中、２．０％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタ ルアルデヒド、１％アクロレインおよび１％硝酸ランタンの溶液中において１週 間ＭＡ／Ｌ後で４時間固定した。試料を（０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中）１ ％ＯｓＯ₄中で固定後、２％酢酸ウラニル（水性）で一括して染色した。試料を エタノール中で脱水し且つエポキシ樹脂中に埋封した。 図７は、湿潤界面で培養後に異常な鱗状分化が実証されなかったことを示す透 過型電子顕微鏡写真である。構築物上皮は，柱状基底層および形態学的に分化が 実証されない重層基底上細胞を有した。横棒＝２μｍ。 図８は、三層の角膜同等物における基底層の形成を示す透過型電子顕微鏡写真 である。基底層は、多数の半接着斑（星印）、十分明確な基底膜緻密層（大きい くさび形印）、固着フィラメント（小さいくさび形印）および関係した固着斑（ 矢印）と一緒に基質−上皮結合部において観察された。基底層直下の基質（ＳＭ ）は、ボーマン膜に特有のコラーゲン原線維（白矢印）および短い微細な原線維 （白くさび形印）の混合物から成った。横棒＝０．１μｍ。 図９は、上皮表面上の虫状隆線を示す透過型電子顕微鏡写真である。培養物の 頂端の細胞は、前の表面に沿って虫状隆線を発現した（くさび形印）。横棒＝１ μｍ。 図１０は、強固な結合部の存在を示すランタン処理された三重層角膜同等物の 透過型電子顕微鏡写真である。強固な結合部は、上皮の頂端の層中の細胞間で観 察された（くさび形印）。横棒＝０．１μｍ。 図１１は、角膜同等物と直接接触していない内皮細胞単層の存在下で培養され た角膜同等物のフォトミクログラフである。内皮細胞を有する７日間角膜構築物 は、格子中に組込まれるよりもむしろウェルの底面に支持細胞層として置かれた 。線維芽細胞は、上皮の下で移動し且つ増殖して、上皮を格子から押し出す（矢 印）。倍率＝３２０Ｘ 図１２は、マイトマイシンＣによる処理によって減衰された内皮細胞層と一緒 に形成された角膜同等物のフォトミクログラフである。内皮細胞を含む１４日間 角膜構築物はマイトマイシンＣによって減衰された。内皮細胞（矢印）は分裂を 止めたが、それらは線維芽細胞の化学走性および過増殖を防止することはできな かった。線維芽細胞（くさび形印）は、組織崩壊された上皮を格子から押し出し ている。倍率＝３２０Ｘ 図１３は、眼球赤道を水平に通過して眼球を上下半分ずつに分割する子午線平 面で切断された眼球の図面（Ａ）である。図（Ｂ）は、ヒト角膜の断面図であり 、５種類の層を示している。（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，ボ リセンコ（Ｂｏｒｙｓｅｎｋｏ）ら、リトル・ブラウン（Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ）出版社、２１６〜２１７頁、１９７９年による図面。） 発明の詳細な説明 眼の最外層は、緻密な無血管結合組織から成る線維膜である。線維膜には２種 類の異なる部分、すなわち、強膜および角膜がある。眼の「白色部分」である強 膜は、線維膜の後部分を形成する。線維膜の前部６分の１は、透明な角膜を形成 するように変化している。（図１３Ａ。） 角膜は、両面が上皮のシートで覆われている。外部シートである重層偏平上皮 は、基質−角膜結合部において眼球結膜と一緒になる。角膜内皮とも称する単層 偏平上皮は、角膜の内面に並んでいる。角膜の中心層は、そのコラーゲン線維の 規則的配列の結果、透明である。基質を上皮層および内皮層から隔てている２種 類の膜、すなわち、ボーマン膜およびデスメ膜がある。（図１３Ｂ。） １．インビトロ角膜モデルの構築 本発明による角膜同等物の構築には、角膜中の３種類の異なる細胞層、すなわ ち、外層である重層偏平上皮；中心層であるコラーゲン線維；および内層である 角膜内皮とも称する単層偏平上皮の組織培養および生産が必要である。角膜同等 物を構築する方法は、インビボでの眼の角膜と同様の構造を生じる。 角膜同等物の好ましい実施態様の以下の説明は、例示するためのものであって 制限するためのものではない。細胞および培養パラメーターは変更することがで き、それはなお本発明の範囲内である。 インビトロの角膜モデルを構築する第一工程において、内皮細胞を細胞培養イ ンサートの膜上に播種する。 細胞培養インサートの壁は、ポリスチレン、ポリカーボネート、樹脂、ポリプ ロピレン（または他の生物適合性プラスチック）から成ることができ、ポリカー ボネートの多孔質膜底面または底部に付着したコラーゲン、セルロース、ガラス 繊維若しくはナイロンから製造された膜などの他の培養適合性多孔質膜があり、 その上で細胞を培養することができる。膜の多孔度は０．２μｍ〜１０μｍであ ることができ、３μｍが好ましい。インサートは、培地が培養物の底面に接近す るように培養皿中に浮遊するかまたは支持される。無細胞性コラーゲン層を細胞 培養膜上に注入し且つ室温でゲル化させる。無細胞性層キャストの量は、用いら れる細胞培養膜に依るが、典型的に、１ｍＬ〜約５ｍＬである。 好ましい方法において、面積が約２ｃｍ²で３μｍの多孔度のポリカーボネー ト膜底面を有するＫ樹脂培養インサートを用いる。無細胞性層１ｍＬをポリカー ボネート膜上に注入し且つゲル化させる。無細胞性コラーゲン層は、０．０５％ 酢酸、８．１％ １０Ｘイーグル最小必須培地、４ｍＭ １−グルタミン、ゲン タマイシン５０μｇ／ｍｌ、重炭酸ナトリウム１．８ｍｇ／ｍｌおよび１０％ダ ルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）１０％ウシ新生児血清（ＮＢＣＳ）中に 酸抽出ウシ鍵コラーゲン６８６μｇを含む。これがいったんゲル化したら、内皮 細胞３ｘ１０⁴個（６．７ｘ１０³個／ｃｍ²）をゲル上に播種する。次に、内皮 層を、１０％ＮＢＣＳ、４ｍＭ １−グルタミンおよびゲンタマイシン５０μｇ ／ｍｌを含むＤＭＥＭ中に３７℃、１０％ＣＯ₂で４日間浸漬する。或いは、無 細胞性コラーゲン層を省略することができ、内皮細胞を多孔質膜上に直接的に播 種する。無細胞性層の使用は、形質転換された内皮細胞を用いて膜の底面の非接 触阻害細胞の過剰増殖を阻害する場合に好ましい。或いは、無細胞性層は、ＩＶ 型コラーゲン、ラミニンまたはヒドロゲルから製造することができる。 内皮層を形成するのに用いられる内皮細胞は、種々の源に由来することができ る。ヒツジ、ウサギおよびマウス由来の角膜内皮細胞が用いられてきた。マウス 内皮細胞をＳＶ４０のラージＴ抗原で形質転換した（ムラガキ （Ｍｕｒａｇａｋｉ）ら、１９９２年）。好ましい細胞種は、形質転換されたマ ウス角膜内皮細胞系または、ヒツジ若しくはウサギ由来の正常角膜内皮細胞であ る。最も好ましいのは、正常ウサギ角膜内皮細胞である。正常内皮細胞は、酵素 によって分離された角膜内皮または角膜の外植片に由来し且つへパリン５０μｇ ／ｍＬおよびヘパリン結合成長因子−１を０．４μｇ／ｍＬ加えることによって 修飾されたＭＳＢＭ培地（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、１９９２年）（Ｍ ＳＢＭＥ）中で連続的に培養される。形質転換された内皮細胞をＤＭＥＭ−１０ ％ＮＢＣＳ中で培養する。 非角膜起原の内皮細胞も、本発明において用いることができる。本発明におい て用いることができる非角膜起原内皮細胞としては、血管およびヒト謄帯静脈の 内皮細胞がある。 内皮細胞は、ＳＶ４０のラージＴ抗原を含む組換え体レトロウイルスで形質転 換することができる（ムラガキら、１９９２年）。形質転換された細胞は、それ らが接触阻害されないために、角膜同等物中で増殖し続け且つ無細胞性層の上部 に小丘を形成する。非形質転換細胞は、基質細胞−コラーゲン層の下にある単層 を形成する。或いは、正常内皮細胞は上記のようにトランスフェクトすることが できるが、熱感受性遺伝子を加えることによってトランスフェクトすることがで きる。これは、低温での連続培養において細胞が増殖することを可能にする。融 合する内皮細胞層の確立後、形質転換遺伝子を失活させるように温度を上昇させ ることができ、細胞がそれらの正常な調節を回復し且つ接触阻害を示して非形質 転換細胞と同様の内皮細胞単層を形成することを可能にする。大部分のぺプチド は（熱ショックタンパク質を例外として）熱感受性であるので、培養温度の上昇 によって失活させることができるぺプチドは広範囲に選択される。この方法での 形質転換は、更に、ヒト角膜内皮細胞などの細胞種を入手し且つ培養するのが難 しい使用法を容易にする。 第二工程において、コラーゲンを角膜実質細胞（基質線維芽細胞）と混合して 、細胞−コラーゲン混合物を達成する。細胞−コラーゲン混合物は、酸抽出ウシ 鍵コラーゲンのμｇ当り約１００個の基質線維芽細胞を有する。線維芽細胞はゲ ルを収縮して約２．５ｃｍ²の隆起区域（メサ）を形成する。 用いることができるコラーゲンは、酸抽出ウシ鍵コラーゲン、酵素抽出ウシ鍵 コラーゲンまたはラット尾コラーゲンである。或いは、コラーゲンは、更に、真 皮から一般的に抽出されるＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの混合物または角膜基 質から抽出されるＩ型、Ｖ型およびＶＩ型の混合物から成ることができる。好ま しくは、ウシ鍵から抽出された精製酸抽出Ｉ型コラーゲンを最初のゲルとして用 いる。器官模式構築物において、基質線維芽細胞は、培養中にそれらがコラーゲ ンマトリックスを変化させると同時に、Ｖ型およびＶＩ型などの更に別のコラー ゲン並びに更に別のＩ型コラーゲンを合成する。上皮細胞は、上皮−基質結合部 におけるＩＶ型およびＶＩＩ型コラーゲンに寄与し、内皮細胞は内皮−基質結合 部におけるＸＩＩ型コラーゲン（ムラガキら、１９９２年）に寄与する。 いずれの啼乳動物基質線維芽細胞もこの細胞層中で用いることができる。強膜 、真皮、鍵または筋膜由来のものなどのいずれの結合組織線維芽細胞も用いるこ とができる。角膜細胞を用いる場合、ウサギまたはヒトの角膜基質由来線維芽細 胞が好ましい。細胞を酵素によって正常角膜基質から分離し、ＤＭＥＭ−１０％ ＮＢＣＳ中で培養し、そして連続的に継代させる。構築物中に取込まれた細胞は ４代目で用いられる。 細胞−コラーゲン混合物である細胞の第二層を製造するために内皮細胞培養物 がいったん用意されたら、融合する内皮層を含む細胞培養インサートから培地を 除去する（典型的に、細胞１．７〜２．５ｘ Ｘ１０ｘ５個／インサート）。細 胞−コラーゲン混合物を移動させ且つ内皮細胞層の表面と接触させる。細胞−コ ラーゲン混合物は、無細胞性層と同比率の材料と一緒に追加の基質線維芽細胞５ ｘ１０⁴個／ｍＬ（キャスト混合物）を含む。この混合物３ｍＬを各細胞培養イ ンサート中にピペットで入れ且つゲル化させる。次に、構築物をＤＭＥＭ−１０ ％ＮＢＣＳ中に浸漬し且つ３７℃、１０％ＣＯ₂で７日間構築させる。 これらの２種類の層は、最終的には角膜モデルの内皮層およびコラーゲン層を 含むものであり、当業者に知られている培養条件下で培養されて、好ましくは、 ダルベッコ−１０％ＮＢＣＳ中に３７℃、１０％ＣＯ₂で７日間浸漬することに よって凝縮されたコラーゲン格子を形成し、凝縮コラーゲン格子を形成する基質 線維芽細胞によるコラーゲンの収縮の結果として生じた中心の隆起区域すなわち 「メサ」を形成する。正常ウサギ基質線維芽細胞を７日間培養するが、培養は、 用いられる種、細胞種および数に応じて更に短いかまたは更に長くてよい（通常 、２〜１０日間）。ＤＭＥＭ １０％ＮＢＣＳは好ましい培地であるが、線維芽 細胞の増殖を一般的に支持するいずれの培地も用いることができる。 第三工程において、凝縮コラーゲン格子がいったん形成されたら、角膜上皮細 胞をコラーゲンの隆起区域上に置く。角膜上皮細胞は種々の啼乳動物源に由来す ることができる。好ましい上皮細胞はウサギまたはヒトの角膜上皮細胞（角膜実 質細胞）であるが、いずれの噛乳動物角膜実質細胞も用いることができる。他の 上皮角膜実質細胞、例えば、眼または表皮の強膜（外側の白色不透明部分）に由 来するものを代用してよいが、角膜実質細胞が好ましい。 培地を、（収縮した基質マトリックスおよび内皮層を含む）培養インサートお よびその周囲から除去する。４世代の正常ウサギ角膜上皮細胞をトリプシン処理 し且つ膜の上部に細胞密度７．２ｘ１０⁴〜１．４ｘ１０⁵個／ｃｍ²で播種する 。次に、構築物を、培地を用いることなく３７℃、１０％ＣＯ₂で４時間インュ ベートして、上皮細胞を付着させる。インキュベーション後、構築物を角膜維持 培地（Ｃｏｒｎｅａｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＣＭＭ）（ ジョンソンら、１９９２年）中に浸漬する。 上皮細胞を、メサが上皮細胞で覆われるまで培養する。上皮被覆の完全さは、 種々の方法によって、例えば、培養物をナイルブルー硫酸塩溶液（リン酸緩衝溶 液中１：１０，０００）で染色することによって確認することができる。 いったんメサが覆われたら、約７日後に、液面が丁度構築物の表面に達して上 皮層を浸漬することなく湿潤界面を維持するのに十分な角膜維持培地（ＣＭＭ） を用いて構築物を新しい培養トレーに無菌的に移す。構築物をＣＭＭと一緒に３ ７℃、１０％ＣＯ₂および６０％を越える湿度でインキュベートし、必要に応じ て、典型的には週に３回培地を交換する。 本明細書中で用いられる「湿潤界面」という用語は、構築物の表面が高湿度で 湿潤しているが、乾燥でも液内でもないように調節される培養環境を意味するた めのものである。培養環境中の水分および湿度の正確な程度は臨界的ではないが 、それは、角化細胞の形成を避けるのに十分な水分および湿度であるべきである 。湿潤界面は、ヒトの眼と同様の水分量を再現する試みとして特徴付けることが できる。 （１）真の空気界面（乾燥）対（２）液内インキュベーション対（３）液内以 外の湿潤インキュベーションでの構築物のインキュベーションの形態学的および 免疫細胞化学的比較は、湿潤または乾燥界面のみが正常の角膜に近い上皮を生じ たことを示した。しかしながら、乾燥界面でのインキュベーションは、角膜上皮 を異常な鱗状（皮膚線）に分化させた。 上皮層および培地の湿潤界面を達成するにはいくつかの変法がある。 上皮層で湿潤界面を達成する変法は、涙液膜を模擬するように脂質／ムチン混 合物を用いる。特殊な涙液膜は、タンパク質−脂質界面活性剤若しくは脂質およ び／またはムチン、グリコサミノグリカン、ヒアルウロン酸または他の水分保持 物質を含む生理的緩衝塩溶液を用いて配合することができる。涙液膜滴をメサの 上部に置いて、上皮と大気との間の湿潤バリヤーを維持する。涙液膜は、典型的 に、培地を変更する場合に取替えられる。或いは、涙液膜の１種類またはそれ以 上の成分を培地に対して直接的に加え且つ湿潤面界面で培養中の構築物の表面に 吸上させることができる。 或いは、湿潤界面の維持は、培養物の表面上に水分を吸上し且つ保持すること ができる人工層の使用によって助けることもできる。これは、アガロース、ヒド ロゲルまたはアルギン酸塩から成る薄層の適用によって達成することができる。 もう一つの変法において、湿潤界面は透析膜またはポリマーを用いて達成する ことができ、例えば、メサよりも僅かに大きく切断されたコンタクトレンズ材料 を用いて液体を吸上し且つ保持し、そして水分の損失を防ぐことができる。 ２．他の器官同等物における内皮の使用 内皮層の包含は、改良された形態学、生化学的および生理学的マーカーの発現 、細胞の広がり、マトリックスに対する上皮付着並びにインビボでの上皮被覆の 均一性を促進する。インビトロでの高水準の上皮分化を達成し且つ基底膜形成を 促進する場合の内皮の影響に基く結果を、他の組織同等物インビトロ培養法に応 用した。 コラーゲンを用いる組織または器官同等物の製造において、内皮層上にコラー ゲンを注入する前に、内皮細胞の第一層を上記（１）節に記載したように培養す ることができる。本発明にしたがって変更することができる組織同等物の例とし ては、本明細書中に参考として包含される米国特許第０７／４０８，０５２号明 細書がある。好ましい実施態様において、内皮細胞層を用いて、インビトロ皮膚 同等モデル、例えば、本明細書中に参考として包含される米国特許第４，４８５ ，０９６号明細書に記載されたものを変更して、上皮分化および基底膜形成を促 進する。 ３．角膜同等モデルの使用 ドレイズ眼剌激試験（ドレイズ（Ｄｒａｉｚｅ）ら、１９４４年）は、過去４ ５年間の間、製品の潜在的眼刺激を評価するための基準として役立ってきた。 様々な試験用モデルおよびプロトコルが、眼刺激を評価するためのインビトロ スクリーンとして提案されてきた（ブーマン（Ｂｏｏｍａｎ）ら、１９８８年） 。細胞毒性を評価するための定量化しうる目的の終点と一緒に用いられる細胞培 養物は、インビボのデータセットに対して十分な相関関係を示した（ブルナー（ Ｂｒｕｎｅｒ）ら、１９９１年）。しかしながら、単層培養物中の細胞は、眼な どの複雑な器官において予想される刺激のモデルシステムとしては本来的に限界 がある。典型的に、単層培養物中の細胞は、インビボで刺激を誘導するのに必要 とされるよりもはるかに低い濃度で刺激原に対して感受性である。試験試料は、 培養システムに導入される前に、最初に細胞培地中に溶解させるべきである。こ れは、容量オスモル濃度、ｐＨまたは培地成分への影響による二次毒性をもたら すことがある。更に、試験試料の希釈によって生じた人工物は、毒性を隠し且つ 試料の潜在的剌激の過少評価をもたらすことがある。単層培養物中で得られた表 皮分化の程度は、インビボで観察された分化の程度を不十分にしか模擬しない。 化学的攻撃から眼球組織を保護するのに重要な役割を果たすことが知られている （ホリー（Ｈｏｌｌｙ）ら、１９８５年）、細胞骨格ケラチン網、デスモソーム および強固な結合部を含む角膜上皮の保護バリヤー機能は存在しない。ここで提 案した器官模式モデルは、問題の標的器官をより忠実に模擬するモデルシステム を提供することによって、単層培養物の本来の限界をある程度克服する。更に、 この試験角膜の物理的構造は、インビボでの暴露の態様に近いビヒクル（例えば 、ワセリンおよび鉱油）中の試験試料の局所適用を可能にする。 研究者達は、ヒトの状態に近付くように努力して、動物モデルおよび培養細胞 双方を用いてきた。しかしながら、直接の適用性には広範囲の欠陥がある。動物 の損傷に対する応答は極めて異なることがあり、伝統的細胞培養を用いる分析は 、起こりうるインビボのヒト応答に対する直接的相関関係を単純化しすぎること がある。これらの方法は不可欠であり且つ有用であるが、ヒト器官模式構築物の 使用は、ヒトおよび動物応答間の不一致を排除するのを助け、そして培養された 細胞と複雑な器官との隔たりをうめる。細胞−細胞相互作用および損傷または薬 理物質に対する応答は、調節された器官模式環境において容易に検査することが できる。 器官模式培養法は、更に、従来の移植に対する付属物かまたは代用物としての 移植可能なヒト組織を形成するのに用いることができる。培養された角膜内皮細 胞の使用は、移植材料のしばしば損傷したまたは不適当な内皮の代替物として有 益であることが既に分かっている（インスラー（Ｉｎｓｌｅｒ）およびロペツ（ Ｌｏｐｅｚ）、１９８６年）。培養された角膜上皮の使用も、創傷閉鎖を促進す る場合にある程度有益であることが分かっている（ロート（Ｒｏａｔ）およびト フト（Ｔｈｏｆｔ）、１９８８年）。内皮、基質および上皮を含む器官模式角膜 構築物は、眼の創傷閉鎖および角膜を完全な厚みに修復するのに用いることがで きる。インビトロでは透明ではないが、構築物によって与えられた内皮細胞は、 角膜基質に対する液体輸送を調節し、そして更に基質線維芽細胞を剌激してマト リックスを組織化し且つ角膜透明性に不可欠な適当なコラーゲンおよびグリコサ ミノグリカンを生産し続けることが予想される。インビトロの角膜同等物は、多 かれ少なかれ、細胞外マトリックスまたは基質と一緒に構築されて改造を容易に することができる。創傷閉鎖は、十分に接着した角膜上皮の存在によって維持さ れ、それによって過増殖が制限され且つ基質マトリックスが治癒すると考えられ る。 引用文献 ブーマン（Ｂｏｏｍａｎ）Ｋ．Ａ．、デ・プロスポ（Ｄｅ Ｐｒｏｓｐｏ） Ｊ．、デメトルリアス（Ｄｅｍｅｔｒｕｌｉａｓ）Ｊ．、ドリージヤー （Ｄｒｉｅｄｇｅｒ）Ａ．、グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔ）Ｊ．Ｆ．、グロコ スキ（Ｇｒｏｃｈｏｓｋｉ）Ｇ．、コング（Ｋｏｎｇ）Ｂ．、マコーミック （ＭｃＫｏｒｍｉｃｋ）Ｗ．Ｃ．、ノース・ルート（Ｎｏｒｔｈ−Ｒｏｏｔ） Ｈ．、ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）Ｍ．Ｇ．、セドラク（Ｓｅｄｌａｋ）Ｒ．Ｉ．、 「洗浄用製品の眼刺激を推定するインビトロの方法、段階Ｉ、予備評価（Ｉｎｖ ｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｅｙｅ ｉｒｒｉｔａｎｃｙ ｏｆ ｃｌｅａｎｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｐｈａｓｅ Ｉ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）」、Ｊ．Ｔ ｏｘｉｃｅｌ．Ｃｕｔ．＆ Ｏｃｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｏｌ． ７：１７３〜１８ ５（１９８８）。 ドレイズ（Ｄｒａｉｚｅ）Ｊ．Ｈ．、ウッダード（Ｗｏｏｄａｒｄ）Ｇ．、カ ルヴェリー（Ｃａｌｖｅｒｙ）Ｈ．Ｏ．、「皮膚および粘膜に局所適用された物 質の刺激および毒性の実験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙｏ ｆ ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｔｈｅｓ ｋｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）」、Ｊ． ＰＨａｒｍａｃｅｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ． ８２：３７７〜３９０（１９４４）。 ブルーナー（Ｂｒｕｎｅｒ）Ｌ．Ｈ．、カイン（Ｋａｉｎ）Ｄ．Ｊ．、ロバー ツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）Ｄ．Ａ．、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）Ｒ．Ｄ．、「眼の安 全試験の７種類のインビトロ変法の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｏｃｕｌａｒ ｓａｆｅｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）」、Ｆｕｎｄ．Ａｐｐｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． １７：１３６〜１４９（１９９１）。 ホリー（Ｈｏｌｌｙ）Ｆ．Ｊ．、「正常および疾患涙液膜の物理化学 （Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｔｅａｒ ｆｉｌｍ）」、Ｔｒａｎｓ． Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｋ． １０４：３７４〜３８０（１９８５）。 インスラー（Ｉｎｓｌｅｒ）Ｍ．Ｓ．、ロペッ（Ｌｏｐｅｚ）Ｊ．Ｇ．、「培 養されたヒト新生児角膜内皮の移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５（１２）：９６７ 〜７２（１９８６）。 ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）Ｗ．Ｅ．、ミュ−ニア（Ｍｅｕｎｉｅｒ）Ｓ． Ｆ．、ロイ（Ｒｏｙ）Ｃ．Ｊ．およびパレントー（Ｐａｒｅｎｔｅａｕ）Ｎ．Ｌ ．、「正常なヒトケラチノサイトの連続培養、増殖および分化の調節を実験する 明確なシステム（Ｓｅｒｉａｌ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：Ａ Ｄｉｆｉｎｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． ２８Ａ：４２９〜４３５（１９９２ ）。 ムラガキ（Ｍｕｒａｇａｋｉ）Ｙ．、シオタ（Ｓｈｉｏｔａ）Ｃ．、イノウエ （Ｉｎｏｕｅ）Ｍ．、オオシマ（Ｏｏｓｈｉｍａ）Ａ．、オルセン（Ｏｌｓｅｎ ）Ｂ．Ｒ．およびニノミヤ（Ｎｉｎｏｍｉｙａ）Ｙ．、「アルファ−１−ＶＩＩ Ｉコラーゲン遺伝子転写物は短鎖コラーゲンポリペプチドをコードし且つマウス 新生児組織中の種々の上皮、内皮および間葉細胞によって発現される （Ａｌｐｈａ−１−Ｖｌｌｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｅｎｃｏｄｅ ａ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｍｏｕｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ）」、Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７（３）：８９５〜９０２（１９９２）。 ロート（Ｒｏａｔ）Ｍ．Ｉ．、トフト（Ｔｈｏｆｔ）Ｒ．Ａ．、「眼表面上皮 移植（Ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」，Ｉｎｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． Ｃｌｉｎ． ２８（２）：１６９〜１７４（１９８８）。 シャーマー（Ｓｃｈｅｒｍｅｒ）Ａ．、ガルヴィン（Ｇａｌｖｉｎ）Ｓ．およ びサン（Ｓｕｎ）Ｔ．Ｔ．、「インビボおよび培養物中の主要６４Ｋ角膜ケラチ ンの分化に関係した発現は、角膜上皮幹細胞の縁の位置を示唆する （Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ６４Ｋ ｃｏｒｎｅａｌ ｋｅｒａｔｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｌｉｍｂａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎｅａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９（１９８６）。 ジースク（Ｚｉｅｓｋｅ）Ｊ．Ｄ．、ブクソグル（Ｂｕｋｕｓｏｇｌｕ） Ｇ．、ヤンコークカス（Ｙａｎｋａｕｃｋａｓ）Ｍ．Ａ．、「角膜上皮幹細胞の 可能なマーカーの特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ． ３３：１４３〜１５２（１９９２）。 本発明を以下の実施例によって更に例証するが、いずれにせよ、それを制限と とるべきできはない。 実施例 実施例１：角膜同等物の構築において用いられた角膜維持培地（ＣＭＭ）は、 以下の成分を有した。 カルシウム不含ダルベッコ修飾イーグル培地：ハム（Ｈａｍ′ｓ）Ｆ−１２を ３：１ ヒドロコルチゾン１．１μＭ インスリン５μｇ／ｍｌ トランスフェリン５μｇ／ｍｌ ２０ｐＭトリヨードチロシン １０−４Ｍエタノールアミン １０−４Ｍ Ｏ−ホスホリル一エタノールアミン １ｍＭ塩化ストロンチウム ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ ４ｍＭ １−グルタミン ９０μＭアデニン ３Ｘ１０−６Ｍ セレン １．８ｍＭ塩化カルシウム ０．３％ＮＢＣＳ 実施例２：二つの重要な特徴である内皮細胞層および湿潤界面を用いるモデル は、以下のように行なわれた。 連続的に継代されたマウス角膜内皮細胞系または正常ウサギ角膜内皮細胞をト リプシン処理し、細胞培養インサート（例えば、コスタール（Ｃｏｓｔａｒ）ト ランスウェル）の膜上に、ＤＭＥＭ１０％ウシ新生児血清または血清不含培地（ ＭＳＢＭＥ）中において細胞３Ｘ１０⁴個／インサートで播種し、そして３７℃ 、１０％ＣＯ²で４日間インキュベートした。 ウシＩ型酸抽出コラーゲンの混合物（０．５％酢酸中０．９〜１．２ｍｇ／ｍ ｌ）を、重炭酸ナトリウム、１０％ウシ新生児血清および２０ｍＭ １−グルタ ミンを含む１０Ｘ濃ＭＥＭを用いて４℃で中和した。冷中和コラーゲン混合物を 、連続的に継代されたウサギ角膜実質細胞（基質細胞）浮遊液と混合して、最終 細胞濃度を角膜実質細胞５Ｘ１０⁴個／ｍｌとした。 培地を内皮細胞培養物から除去し、そして細胞−コラーゲン混合物３ｍｌを内 皮細胞層の表面上にピペットで移した。次に、コラーゲンゲルを加温して細胞性 コラーゲンゲルを生成した。角膜実質細胞によってゲルを収縮させて、内皮層を 下にして約７日間で中心の隆起区域すなわち「メサ」を有する凝縮コラーゲン格 子を形成した。 ７日目に、連続的に継代された角膜上皮細胞をトリプシン処理し且つメサ上に 細胞濃度１．８Ｘ１０⁵個／メサで置いた。構築物を給湿インキュベーター中に おいて３７℃、１０％ＣＯ₂で４時間インキュベートしてコラーゲンマトリック スに細胞を付着させた。次に、構築物を角膜維持培地（ＣＭＭ）１３ｍｌ中の液 内でインキュベートした。培地を週に３回交換した。 上皮形成後７日目に、一つの試料をナイルブルー硫酸塩溶液（リン酸緩衝溶液 中１：１０，０００）で染色して上皮被覆の完全さを検査した。 メサが１００％覆われたならば、培地１１ｍｌと、培養インサートを支持し且 つ半月形成を防止するための２個の綿パッドが入っている新しいトレーに構築物 を無菌的に移した。培地１１ｍｌで、液面は構築物のちょうど表面に達した（こ の時点での厚みは１ｍｍまたはそれ未満であった）。これは、浸漬されることな く湿潤界面を維持した。次に、各回に培地９ｍｌ（綿パッドが残りの２ｍｌを保 持した）を交換する３回／週の培地交換を行ないながら、構築物を上記のように インキュベートした。 実施例３：角膜分化の環境の影響。 上皮形成された角膜構築物をＣＭＭ中で１週間培養した後、それらを浸漬した ままにしておくか、乾燥空気−液体界面まで綿パッド上に引上げるかまたは、上 皮表面を浸漬させないが湿分を与えるのに十分な培地と一緒に綿パッド上に引上 げた。乾燥界面は、細胞培養インサー卜をその支持体から取出し、そしてそれを 、綿パッドにちょうど達するのに十分な培地が入っている培養ウェル、深ウェル トレーまたは皿中に浮遊した２個の綿パッドの上に置くことによって達成された 。培地を綿パッドによって培養物の底面まで吸上させた。湿潤界面は、パッドの 周囲の培地容量を増加させて液面をメサ（構築物の中心の隆起区域）の肩まで上 昇させたことを除いて同様に達成された。典型的に、２個の綿パッドを有する深 ウェル培養トレー中において、培地９ｍＬで乾燥界面が達成され、そして培地１ １ｍＬで湿潤界面を達成する。培地は、メサの上部の上皮表面を浸漬することな くメサの表面に自然に吸上した。 真の空気界面（乾燥）対液内インキュベーション対湿潤インキュベーションで の構築物のインキュベーションの形態学的および免疫細胞化学的比較は、湿潤ま たは乾燥界面のみが、ビンクリンおよびα−エノラーゼの分布が正常の角膜縁に 近い上皮を生じたことを示した。しかしながら、乾燥界面での培養は、角膜上皮 を異常な鱗状（皮膚線）に分化させた。 実施例４：内皮細胞層の包含。 内皮細胞層の包含は、構築物を更に再現性で且つ製造可能にする。それは、マ トリックス上の角膜上皮の成長を改良し、上皮層の物理的付着を改良し（内皮不 含では分離できないマトリックスから容易に分離可能）、そしてコラーゲン表面 中および上の角膜実質細胞過増殖を排除した（内皮不含では、基質角膜実質細胞 は過増殖性を示し、そして上皮の化学走性であると考えられるものによって格子 から引出された後、格子表面の上皮細胞と競合した）。 実施例５：内皮細胞層包含の効果。 内皮細胞層の包含は、更に、一層優れた器官模式特性を有する構築物を生じた 。内皮層含有および不含の湿潤構築物を比較する免疫化学実験は、固着性フィラ メントの成分であるＶＩＩ型コラーゲンおよび基底膜の成分であるラミニンの増 大した発現を示した。（基底ラミニンおよび細胞マトリックス相互作用は、角膜 創傷閉鎖を研究する場合の重要な成分であり；これらの成分の欠失は、角膜構築 物の有用性を低下させると考えられる。）三層構築物は、更に、α−エノラーゼ のなお一層顕著な縁様局在（角膜上皮の基底層に限定される）を示した。 実施例６：角膜同等物の超微細構造的分化。 三細胞構築物の形態学的分化は、組織された基底層の存在、異常な鱗状分化の 不存在および上皮表面上に特有の虫状隆線の存在を示した。 実施例７：内皮細胞層と基質格子との直接的接触は、最適効果に不可欠である 。 形質転換されたマウス角膜内皮細胞を、６ウェル組織培養皿（細胞６．７ｘ１ ０³個／ｃｍ²）中のＤＭＥＭ−１０％ＮＢＣＳ中に入れ、そして融合するよう に増殖させた。非収縮基質格子を含む細胞培養インサートをウェル中に入れて、 内皮層からの状態調節培地が格子を湿らすようにし、同時にそれを７日間収縮さ せた。７日目に、基質構築物は通常通り上皮形成され、そして内皮細胞層の存在 下で７日間培養された。試料を組織学によって分析した。結果は、組織崩壊され た上皮および線維芽細胞の化学走性に関する実施例３と同様であった。基質層と の直接接触から隔てられた培養皿の底面に内皮細胞を置くことでは、望ましい結 果が達成されなかった。 実施例８：内皮細胞のマイトマイシンＣによる減衰は、角膜同等物におけるそ れらの効果を阻害する。 形質転換されたマウス内皮細胞は、増殖の接触阻害を示さないので、結果とし て、それらは増殖し続けて、基質格子の下に細胞の多層および小丘を形成する。 基質格子を形成する前に、細胞をマイトマイシンＣで減衰させる試みで実験を行 なった。 形質転換されたマウス内皮細胞を、細胞培養インサートのポリカーボネート膜 上に直接的に播種し、そして融合するように増殖させた。基質層を注入する前に 、マイトマイシンＣを２μｇ／ｍｌかまたは４μｇ／ｍｌ含む培地中において内 皮細胞を３７℃、１０％ＣＯ₂で１時間または２時間インキュベートした。内皮 細胞をＤＭＥＭ−１０％ＮＢＣＳで２回洗浄し、そして基質層を上部にピペット で移した。マイトマイシンＣ処理は内皮細胞の過増殖を防止し且つ上皮の生長を 促したが、しかしながら、それらは線維芽細胞の化学走性を防止することはでき なかった。マウス内皮細胞をマイトマイシンＣで減衰させてマウス内皮細胞が更 に分裂するのを妨げること（おそらくはそれらのＳＶ４０形質転換のために接触 阻害されない）は、内皮層の効果を低減した。 実施例９：角膜同等物における機能的遮断性の発現。 機能的に強固な結合部の存在を、フルオレセイン透過性検定を用いて実証した 。透過性バリヤーは、以下に示されたように、時間に関して改良された。更に、 湿潤界面による培養物の提供が、透過性バリヤーを改良したことは明らかであっ た。更に、透過性バリヤーは、異なる系統の細胞を用いることによって改良する ことができる。２種類の系統のウサギ角膜上皮間の相違を以下に示す。 細胞培養インサート中の角膜構築物を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）２ｍ ｌとカルシウムおよびマグネシウムが入っている６ウェル皿に入れた。ポリカー ボネート環をメサの上部に置き、そして滲出を防止するようにシリコーングリー スのビーズで密封した。この暴露表面積は０．７８５ｃｍ²であった。ナトリウ ムフルオレセイン滴５０μｌ（ＨＢＳＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）を角膜上皮の上部 の環中にピペットで入れ、そして箔で覆って室温で３０分間インキュベートした 。ウェル中のＨＢＳＳ中のフルオレセインの吸光度を分光光度計で４９０ｎｍで 測定した。典型的な結果を以下に示す。湿潤培養物はフルオレセイン透過性に対 して一層大きな耐性を示し、強固な結合部の発現を示唆した。透過性は、上皮細 胞系の性質（外観、増殖特性によって判断される）に応じて変化することが分か つた。 前述の発明は、理解を明確にするための図解および実施例によってある程度詳 細に記載されたが、特許請求の範囲に記載の範囲内でいくつかの変更および修正 を行なうことができることは当業者に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パレントー，ナンシー・エル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02146, ブルックリン，ベル・ヴィスタ・ロード 12 (72)発明者 メイソン，ヴァレリー・エス アメリカ合衆国マサチューセッツ州01460, リトルトン，オールド・ピッカード・レー ン 28 (72)発明者 オルセン，ビョルン・アール アメリカ合衆国マサチューセッツ州02186, ミルトン，ヴォース・ヒル・ロード48

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 角膜同等物であって、 （ａ）内皮細胞層； （ｂ）基質細胞を播種したコラーゲン層；および （ｃ）上皮細胞層 を含む上記角膜同等物。 ２． 前記細胞層の内皮細胞が、ＳＶ４０のラージＴ抗原によって形質転換さ れている請求項１に記載の角膜同等物。 ３． 前記細胞層の内皮細胞が、熱感受性遺伝子によって形質転換されている 請求項１に記載の角膜同等物。 ４． 前記上皮層が、角膜上皮細胞から成る請求項１に記載の角膜同等物。 ５． 角膜同等物を製造する方法であって、 （ａ）内皮細胞を培養して内皮細胞層を形成し； （ｂ）コラーゲンおよび基質細胞を培養して細胞−コラーゲン混合物を達成し ； （ｃ）該細胞−コラーゲン混合物を内皮細胞層の表面と接触させ； （ｄ）該二層を培養して、コラーゲン層が隆起した中心区域を形成するように し； （ｅ）上皮細胞を細胞−コラーゲン層の表面と接触させ； （ｆ）該上皮細胞を、コラーゲン層が上皮細胞によって覆われるまで培養し； そして （ｇ）該上皮細胞を、湿潤面界面を達成する条件下で連続培養して角膜同等物 を形成することを含む上記方法。 ６． 前記細胞層の内皮細胞が、ＳＶ４０のラージＴ抗原によって形質転換さ れている請求項５に記載の方法。 ７． 前記細胞層の内皮細胞が、熱感受性遺伝子によって形質転換されている 請求項５に記載の方法。 ８． 前記上皮層が、角膜上皮細胞から成る請求項５に記載の方法。 ９． 試験物質の効果を検査する方法であって、 （ａ）角膜同等物を試験物質に対して暴露し；そして （ｂ）該試験物質の角膜同等物に対する効果を決定することを含む上記方法。 １０．インビボでの角膜同等物の移植法であって、 （ａ）インビトロで請求項１の角膜同等物を培養し；そして （ｂ）インビボで角膜同等物を移植することを含む上記方法。 １１．コラーゲン層を有する組織同等物であって、その改良が、該コラーゲン 層と接触している内皮細胞層を含むことである上記組織同等物。