JPH08500083A - ミエリン塩基性タンパク質のペプチドフラグメントを用いたｔ‐細胞増殖の抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトミエリン塩基性タンパク質のぺプチドに関するものであり、特にヒトミエリン塩基性タンパク質の免疫優性エビトープを含むアミノ酸配列に関するものである。本発明はまたヒトミエリン塩基性タンパク質ぺプチドがつかさどる自己免疫を抑制する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ミエリン塩基性タンパク質のペプチドフラグメントを用いたＴ-細胞増殖の抑制 本発明は、米国に係属中の一部継続出願であり、以下の対応ＰＣＴ出願を適用 可能である： （ａ）１９９０年３月３０日に出願された出願番号０７／５０２，５５９の係 属中の米国出願の一部継続出願である１９９２年４月９日に出願された出願番号 ０７／８８５，３１８号 （ｂ）１９９２年２月２８日に出願された出願番号０７／８４３，７５２号。発明の分野 本発明は、Ｔ-細胞に媒介された、またはＴ-細胞依存性の自己免疫応答の抑制 のための組成物及び方法に関する。より詳しくは、本発明はミエリン塩基性タン パク質（ＭＢＰ）のペプチドフラグメント及びその類似体からなる組成物、及び 、ミエリン塩基性タンパク質に特異的なヒトＴ-細胞の増殖をアネルギー化また は停止させる、または、そのようなＴ-細胞の活性抑制を引き起こすために、そ のペプチド及び組成物を用いる方法に関する。本発明のペプチドは、ミエリン塩 基性タンパク質反応性のＣＤ４⁺Ｔ-細胞の同定にも有用である。発明の背景 本節における議論は、本発明に対する「従来技術」とされる著作の議論に限ら れない。従って、本発明者の利害関係に対するいかなる承認や宣誓も、この議論 を理由として含まれることはない。 多発性硬化症（ＭＳ）は、ヒト中枢神経系の白質の臨床的炎症性疾患であり、 自己免疫性の病因であると考えられている。その病因にかかわらず、ＭＳは、神 経組織の自己免疫攻撃に結び付いている。例えば、その疾患は、ブロミネント（ prominent）Ｔ-細胞及びマクロファージが、神経組織（例えば、脳、末梢神経、 または関連した細胞タイプ）中への浸潤、脱髄及び神経病理学的機能障害によっ て特徴づけられる。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、ＭＳの大多数の動 物モデル、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における誘発試薬としての役 割、 と同様にヒト疾患のポスト−バイラル（post-viral）脳脊髄炎におけるその役割 のために、本発明者とその共同研究者及び他の者によって、疾患の自己抗原とし て広く研究されている。さらに、本発明者およびその共同研究者らは、”バイス タンダー（bystander）抗原”としてのＭＢＰを研究した（上述の、出願番号８ ４３，７５２号）。 ＭＳの病原に関する主要な仮説では、ＣＮＳの白質中のミエリン塩基性タンパ ク質と反応性のＴ-細胞が炎症性過程を開始する。他の仮説では、プロテオリビ ドタンパク質（ＰＬＰ）と反応性のＴ-細胞が炎症性過程を開始する。ミエリン 塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的な活性化されたＴ-細胞が、ＭＳ患者から 単離されるという証明（Allegretta，M.et al.,Science，247：778,1990）は、 さらに、その疾患の病原に、ＭＢＰ−反応性Ｔ-細胞が含まれることを暗示する 。本発明者らの研究は、炎症過程の開始に引き続く、その疾患の病理にも、ＭＢ Ｐ−反応性Ｔ-細胞が含まれることを示した。（以下でさらに詳細に述べるよう に、本発明者らは、健康人もまた、しばしばＭＢＰ−特異的Ｔ-細胞を有してい るが、ＭＳ患者と異なり、健康人からのＭＢＰ−特異的Ｔ-細胞は活性化されて いないということを証明した。） ＭＳの現在の治療は、単に緩和するだけであり、患者の免疫応答を抑制するた めに非−特異的形態で作用する薬剤の投与を含んでいる。そのような薬剤の例は 、シクロホスファミド、イムラン（アザチオプリン）、シクロスポリンＡである 。プレドニソン及びメチルプレドニソンのようなステロイド化合物もまた多くの 例で採用される。これらの薬剤は、ＭＳに対して限られた効力しか持たない。そ のような薬剤は、それらの毒性により、また、長期的な使用において”全身の（ global）”免疫抑制を誘発する、即ち、それらが、病原微生物に対する通常の保 護的免疫応答をダウンレキュレート（downregurate）し、それにより、感染の危 険性を増すという事実によって使用を制限される。さらに、長期間に渡って全身 の免疫抑制された患者は、ある悪性の発展の危険性が増大する。 生起している免疫過程のさらに詳細は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ ）、ＭＳの第１の動物モデルについて知られている。ＥＡＥは、適当なアジュバ ント中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）での免疫化によって、またはＣＤ ４⁺、ＭＢＰ-反応性Ｔ-細胞の注入を通した獲得転移によって、小型哺乳類に容 易に誘発されうる。（Alvord Jr， E.C.らeds．in Experimental Allergic Enc ephalomyeritis： Auseful model for Multiple Sclerosis，A.R.Liss,N.Y., 1 984；Makhtarian，D.E.ら Nature 305: 356, 1984； Ben-Nun,A.ら J.Immuno l . 129:303,1982）。マウス及びラットの両方においてＥＡＥを誘発するＴ-細 胞は、起脳炎細胞と名付けるが、ＭＢＰの免疫優性（immunodominant）領域に対 応するペプチドを特異的に認識する。これらの領域のＴ-細胞に対する提示（pre sentation）は、抗原−提示細胞（ＡＰＣｓ）の表面で、独自の主要組織適合性 抗原系（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を伴って生ずる。ＭＢＰの免疫優性領域、即ち ＣＤ４⁺タイプのＴ-細胞反応性のＭＢＰによって最も頻繁に認識されるタンパク 質の一部は、宿主哺乳類の種及び、ＭＢＰのアミノ酸配列が非常に高い種間相同 性を示すという事実にもかかわらず、ＭＢＰの種類によっても異なる。例えば、 本発明者及び共同研究者が発見したように、ヒトにおけるヒトＭＢＰの免疫優性 エピトープ（epitope）は、アミノ酸８４−１０２からなるヒトＭＢＰ分子のサ ブ配列に含まれる。他の免疫優性エビトープが、アミノ酸１４３−１６８からな るヒトＭＳ分子のサブ配列に見いだせる。これは、ＭＳに感染した個人から単離 したヒトＴ-細胞の特異性によって証明される（関連特許出願、出願番号５０２ ，５５９及び後述の実施例１）。マウスＭＢＰの免疫優性領域は、マウスに投与 したときアミノ酸１−９であり（ZamvilらNature 324: 258,1986）、ラットの免 疫優性領域は、ラットに投与したときアミノ酸６６−８８である（BurnsらJ.Exp .Med.169:27,1989）。一方、ラットにおけるモルモットＭＢＰのイムノトミナン ト領域は、残基７５−８４に位置している（Hashim,G. Myerin：化学と生物学， Alan R.Liss,N.Y.1980）。 ＥＡＥ系においてなされた研究に基づいて、一般的な自己免疫性疾患、特にＭ Ｓの治療に対して、他の治療法が発達した。１９８７年６月２４日に出願された 米国特許出願、出願番号６５，７９４（現在は取り下げられた）、及び１９８８ 年６月２４日に出願された同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１３ ９であって、現在は各国段階の米国出願番号０７／４６０，８５２、及びその一 部継続出願である米国出願番号０７／５９６，９３６とは、全ミエリン塩基性タ ンパク質の経口または経腸投与によれば、疾患−誘発性及び非誘発性フラグメン ト及びそれらの類似体と同様に、急性の単相性ＥＡＥの抑制において有効であり 、同様に投与したとき、ＭＳ徴候を抑制するのに有効である。 以下の、同時係属の共同で譲渡した特許出願もまた興味深い：１９８９年１２ 月２０日に出願された米国特許出願第４５４，８０６号は、自己抗原、前記自己 抗原の疾患−誘発性フラグメントおよびそれらの類似体のエアロゾル（aerosol ）投与が、ＭＳのようなＴ-細胞媒介自己抗原疾患を治療するために有効な治療 法であることを開示している。 ”自己抗原の経口投与による自己免疫性疾患のダウンレギュレーシヨンの促進 ”という名称で、１９９０年３月２０日に出願された米国特許出願第０７／４８ ７，７３２号は、自己抗原、疾患−誘発性フラグメント及びそれらの類似体の経 口投与とともに相乗剤（促進剤）を使用することが、Ｔ-細胞媒介自己免疫性疾 患の治療に効果的であることを開示している。 米国特許出願第０７／８４３，７５２号は、経口または吸入によるバイスタン ダー抗原の投与により、自己免疫疾患を治療するための方法及び組成物を開示し ている。バイスタンダー抗原は、組織−特異的抗原であり、免疫攻撃の場所に存 在し、経口投与されたとき、攻撃を受けている組織において逆に免疫攻撃を抑制 するＴ-サプレッサー細胞を生成する。バイスタンダー抗原は、自己抗原である 必要はなく、それ自体が免疫攻撃の標的である必要はない。（実際、（経口投与 で抑制を引き起こす）免疫優性エビトープは、攻撃を受けている組織における同 じ抗原の他の部分または他の抗原の部分に対して向けられた免疫攻撃の抑制にお いてバイスタンダー抗原として振る舞うが、自己抗原の免疫抑制エビトープは、 それらの免疫優性エビトープとは異なるという証拠がある。）しかし、バイスタ ンダー抗原は、（ａ）攻撃を受けている組織に特異的であり、（ｂ）経口投与で Ｔ-サプレッサー細胞の引き出し能力を持たねばならない。 Ｔ-細胞レセプターは、２本の異なったタンパク質物質の鎖からなる。あるＴ −細胞レセプター（ＴＣＲｓ）は、Ｖ−ベータ（ＶＢ）鎖とＶ−アルファ（ＶＡ ）鎖からなり、ＭＢＰを認識することが知られている。ＳＪＬ／ＰＬマウスにお いて、これらのレセプターを有する起脳炎（即ち、マウスに投与したとき疾患を 誘 発する）Ｔ-細胞は、ＭＨＣ分子から提示され（Zamvil, S.S.ら，Nature 324:25 8,1986）、マウス遺伝子Ｈ−２でエンコードされたＮ−末端マウスＭＢＰペプチ ド（残基１−９）を認識する。ＭＨＣに関連して提示されるこのペプチドを認識 するＴ-細胞レセプターの大多数は、マウスＴＣＲ遺伝子ＶＢ８．２及びＶＡ２ またはＶＡ４によりエンコードされる。ルイスラット（Lewis Rat）において、 マウスＶＢ８．２及びＴＣＲＶＡ２遺伝子と相同なＴＣＲ遺伝子セグメント（se gment）が、ルイスラットＭＨＣを背景とするＭＢＰ残基６８−８８を認識する 起脳炎Ｔ-細胞に見いだされた（BUrns,F.R.ら，J.Exp.Med.169:27,1989）。 ＶＢ８．２−特異性モノクローナル抗体（即ち、対応遺伝子により発現される生 成物ＶＢ８．２を認識する抗体）のマウスへの投与は、ネズミのＥＡＥの治療に 効果的であることが示された。特にＴＣＲＶＢ８．２アミノ酸配列に対応するペ プチドによる免疫化は、ルイスラットのＥＡＥを改善する（Vanderbark, A.A.ら ,Nature 341:541-544,1989;Howell,H.D.ら，Science:246.668;1989）。 しかし、免疫優性領域のように振る舞う（ＭＢＰのような）自己抗原の領域は、 種特異的である。これまでのところ、ヒトにおいて、ＭＢＰの免疫優性領域を認 識するＴ-細胞間での、ＴＣＲＶ−遺伝子におけるコモン（common）Ｖ−遺伝子 の利用法が存在するか、また、これらの免疫優性領域がＭＳ患者において積極的 に同定されるかどうかは決定されていない。 現在、多重投与量及び少量の、起脳炎免疫優性エピトープを含む全抗原の経口 投与がこのタイプの活性抑制を引き起こすことが見いだされている。一方、全自 己抗原（または起脳炎免疫優性エビトープを含むそれらのフラグメントのひとつ またはそれ以上）のｉ．ｖ．投与もまた、自己抗原のエピトープを認識する免疫 攻撃Ｔ-細胞以外の抑制を引き起こす。後者のタイプの抑制は、クローナル・ア ネルギーの機構を通して進行すると考えられているが、１回の投与及び、起脳炎 エビトープ、特に免疫優性エピトープを含む多量の抗原を、特にプロテアーゼ阻 害剤とともに経口投与したときにも観察される。 ＭＳに対する自己抗原であると考えられるタンパク質であるヒトＭＢＰについ て、本発明者らは広範に試験し、ＭＳ患者から単離された多くのＭＢＰ−特異的 免疫攻撃（ＣＤ４⁺）Ｔ-細胞によって認識されるエピトープを含むタンパク質の フラグメントを明らかにした。免疫優性エピトープからなるそのようなフラグメ ントは、ＭＳにかかった患者への投与の候補者のようであり、自己免疫応答の抑 制、特に神経組織への自己免疫攻撃に応答性するＭＢＰ-反応性Ｔ-細胞の機能の 抑制を終点とする。その最後に、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳類 に対するペプチドフラグメントの経口投与のみならず、そのようなフラグメント の経腸投与も考慮する。 従って、本発明の目的は、免疫抑制試薬、特にヒトＭＢＰのフラグメント、そ して、これらのフラグメントをヒトＴ-細胞機能の抑制に使用する方法を提供す ることにある。 本発明の他の目的は、ヒトへの経口及び／またはｉ．ｖ．投与に有効なヒトＭ ＢＰのこれらのフラグメントからなる組成物及び製薬製剤、そして、そのような 製剤の使用方法を提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、ヒトＴ-細胞の特異性を決定するのに使用できる 試薬として、免疫優性エピトープを含むＭＢＰのペプチドフラグメントを提供す ることにある。 本発明のさらなる目的は、ＭＢＰ−反応性Ｔ-細胞をアネルギー化したり、そ のようなＴ-細胞の活性抑制を起こす化合物及び組成物を提供することにあり、 後者は、ＭＢＰ-反応性Ｔ-細胞の増殖の抑制という例示で証明される。 本発明の、これら及び他の目的は、当業者にとって、本明細書、図面、請求の 範囲に照らして明らかになる。図面の簡単な説明 図１は、ＭＳ患者（左側パネル）及び健康な対照（右側パネル）から単離した 、異なるヒトＭＢＰペプチドフラグメントと特異的に反応するＭＢＰ反応性Ｔ- 細胞の頻度を示す棒グラフである。 図２Ａ及び２Ｂは、ＭＢＰで経口トラライズ（tolerize）された動物からの脾 臓細胞の転移による（ＭＢＰ-特異的起脳炎Ｔ-細胞のｉ．ｐ．接種によって誘発 された）ＥＡＥの抑制のグラフ的表示である。 図３は、ＭＢＰ給餌動物からのＣＤ４⁺−欠如またはＣＤ８⁺−欠如のＴ-細胞 の同時転移により獲得転移されたＥＡＥの抑制を示す。 図４は、ＭＢＰ給餌動物からの種々のＴ-細胞サブセットのＣＤ４⁺Ｔ-細胞を 伴う同時転移によるＥＡＥ誘発（もしあったら）に対する保護の程度に関連した ＤＨＴ応答の棒グラフである。 図５は、ＭＢＰ-給餌マウスからの種々のＴ-細胞サブセットを注入されたマウ スのＣＮＳ（即ち、実質及び髄膜）から単離された炎症性のフォシ（foci）の平 均数を表現する定性的組織学分析の棒グラフである。 図６Ａは、ＭＢＰの静脈内（ＩＶ）投与によって積極的に誘発されたＥＡＥの 抑制を示す。図６Ｂは、ＭＢＰのＩＶ投与の獲得転移されたＥＡＥに対する影響 、及び、それらを起脳炎ＭＢＰ列を伴う無垢の動物への同時投与したとき、ＩＶ −トラライズされた動物の脾臓が抑制を与えない可能性を示す。 図７は、異なるＭＢＰペプチドの経口（Ａ）またはＩＶ（Ｂ）投与に引き続く ＥＡＥ抑制の変化を表す棒グラフである。 図８は、ヒトＭＢＰの免疫優性エピトープ領域（ヒトＭＢＰアミノ酸残基番号 ８４−１０２）に基づいて構成された種々のペプチドの、ヒトＭＢＰ-反応性Ｔ- 細胞クローンの増殖を刺激する能力のグラフ的表現である。 パネルＡ：ひとつまたはそれ以上のＮ-末端アミノ酸のオミッティング（omittin g）効果。 パネルＢ：ひとつまたはそれ以上のＣ−末端アミノ酸のオミッティング効果。 図９は、１５−メル（mer）（ヒトＭＢＰアミノ酸残基番号８５−９９）の、 ４つの異なるヒトＴ-細胞クローンの増殖を刺激する能力を、ＭＢＰペプチド８ ４−１０２及び８６−９７の、そのような増殖を刺激する能力との比較において 示すグラフである。 図１０は、８５−９９及び８８−１０４ヒトＭＢＰペプチドに接触したＴＣＲ ／ＭＨＣを示すチャート（chart）、及び、この相互作用に対して提出されたモ チーフ（motif）である。 図１１は、本発明のヒト８５−９９ＭＢＰペプチドによるＴ-細胞クローンの 増殖の誘発を、元のままのＭＢＰタンパク質によるこれらのクローンにおいて誘 発された増殖との比較において示すチャートである。 図１２は、５人のＭＳ患者から生成され、ＭＢＰ残基８４−１０２反応性の、 １８Ｔ-細胞列からのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を示すオートラジオグラフである。 図１３は、ＴＣＲＶＢ及びＪＢ遺伝子のＭＢＰ-反応性Ｔ-細胞列の、ＭＳ患者 の末梢血液から生成されたＭＢＰ反応性Ｔ-細胞列に対する使用のサザンブロッ ト分析のオートラジオグラフである。 図１４は、ＭＳ患者及び対照から単離されたＴ-細胞の、これらの患者がある ＭＣＨ抗原を持っているかどうかに関連したヒトＭＢＰポリペプチドの異なる領 域に対する反応性を示す一連の棒グラフである。 図１５．事前にフリーペプチド抗原で刺激したＴ-細胞は、抗原性刺激に対し て非応答性である。Ｔ-細胞クローンＯｂ．１Ａ１２．８は、ＭＢＰペプチド８ ４−１０２で、または８４−１０２でパルスされたＤＲ２＋Ｂ細胞列（９０１０ ）もしくはＬ細胞トランスフエクタントで、３７℃で２時間直接刺激され、増殖 を検定された。１回の刺激のウェル（well）中のペプチドの最終濃度を示した。 パネルＡに見られるように、３つ全ての刺激物は、等価なＴ-細胞増殖をもたら した。７日後、Ｔ-細胞は洗浄され、８４−１０２（５μｇ／ｍｌ）または８４ −１０２でパルスされたＢ細胞もしくはＬ細胞（１００μｇ／ｍｌ）に対する応 答が再検定された。パネルＢに示したように、最初に高濃度の８４−１０２で刺 激されたＴ-細胞は、いかなる第２の抗原性刺激に対しても非応答性であった。 図１６．Ｔ-細胞の非応答性は、Ｂ細胞の添加では防ぐことができない。Ｔ-細 胞クローンＯｂ．１Ａ１２．８は、第１の刺激として、単独、またはＭＨＣクラ スＩＩ適合性（９０１０）または非適合性（９００９）の照射され形質転換され た表示した数のＢ細胞を添加した８４−１０２の存在下のいずれかで、７日間第 １の刺激の培養をされた。次に、洗浄され、ＭＢＰ８４−１０２ペプチド（５μ ｇ／ｍｌ）またはｒＩＬ−２（１０³ｕ／ｍｌ）のいずれかの増殖が検定された 。 ペブチドなしで成長したＴ-細胞（丸印）は、第２の抗原性刺激に対して十分に 増殖することができるが、ペプチドとともに成長したもの（四角印）は、Ｂ細胞 添加に関わらず非応答性であった。ＩＬ−２の増殖は、すべての細胞集団におい て等価であった。 図１７．Ｔ-細胞アネルギーの反応速度論。Ｔ-細胞クローンＯｂ．１Ａ１２． ８は、５μｇ／ｍｌの８４−１０２中で０から１６８時間培養され、洗浄され、 ８４−１０２またはＩＬ−２の増殖が検定された。誤差表示は、３倍培地からの ＣＰＭの標準誤差を表している。２つの一致するが分離された実験からのデータ が、全ての時間に対してプールされた。 図１８．アネルギー化されたＴ-細胞は、ＣＤ３の発現を継続する。Ｔ-細胞ク ローンＯｂ．１Ａ１２．８は、５μｇ／ｍｌの８４−１０２存在下または非存在 下で４日間培養され、洗浄され、細胞表面表現型及び増殖的応答の両方が検定さ れた。細胞は、標準ＭＡｂＭｓＩｇ−ＦＩＴＣまたはＯＫＴ３ＦＩＴＣに３０分 間（コールター(coulter)）で３０分着色した。４℃で２回洗浄し、１％ホルマ リン中で固定し、フローサイトメトリーで検定した。同じ第１の培地からのＴ- 細胞は、８４−１０２またはｒＩＬ−２存在または非存在でパルスされたＢ細胞 （９０１０）の増殖に対して検定された。 図１９．種々の刺激物によるアネルギー化されたＴ-細胞の活性化。８４−１ ０２存在下または非存在下で７日間培養されたＴ-細胞クローンＯｂ１Ａ１２． ８は、洗浄され、αＣＤ３＋ＰＭＡ、Ｔ１ｌ₂＋Ｔｌ１₃、ＰＭＡ＋イオノンマイ シン（iononmysin）、及びｒＩＬ−２の対数滴定に対する増殖が検定された。各 試薬の最終濃度または腹水希釈液をｘ−軸に取った。ＰＭＡ濃度は、αＣＤ３ま たはイオノンマイシンの濃度の下に挙げた。 図２０．アネルギー化されたＴ-細胞は、抗原性刺激に対して［Ｃａ⁺²］ｉを 放出する能力を阻害された。Ｏｂ．１Ａ１２．８は、±５μｇ／ｍｌ８４−１０ ２で７日間培養され、洗浄され、［Ｃａ⁺²］ｉの分析のために２μｇ／ｍｌのＩ ｎｄｏ−１で負荷された。＋１００μｇ／ｍｌの８４−１０２でパルスされたイ オノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、αＣＤ３（１／３０腹水希釈液）、または Ｂ細胞（９０１０）による第２の刺激が、矢印で示した時点でフローサイトメー ターに添加された。ＡＰＣ刺激のために、細胞はフローサイトメーターから取り 出され、１分間遠心分離された。（実線で示した）。各試料のパーセント応答は 、ベースラインより上の細胞の％を表している（刺激後引く刺激前）。 図２１．アネルギー化されたＴ-細胞によるシトキンの生成。 Ａ．Ｔ-細胞クローンＯｂ．１Ａ１２．８は、８４−１０２存在下または非存在 下で、２日間培養され、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ＋１μｇ／ｍｌのイオノマイシ ン、または５μｇ／ｍｌの８４−１０２±１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下また は非存在下で、３７℃で４時間刺激された。全細胞ＲＮＡは、ノザン分析のＲＮ Ａゾル（RNAzol）Ｂ法により抽出された。括弧は、それぞれがシトキン特異的プ ローブに加えて、β−アクチン制御プローブでハイブリッド化された同一の試料 の２つの異なるノザンブロットを表している。ｍＲＮＡ結合のおよその寸法が挙 げられている。 Ｂ．Ｏｂ１Ａ１２．８は、±８４−１０２で２日間培養され、洗浄され、８４− １０２または、ポジティブな対照としてｒＩＬ−２で刺激された。第２の培養後 ２０時間に上澄み液が回収され、ＨＴ−２細胞の培地で１：３に希釈された。Ｈ Ｔ−２細胞の増殖は、８４−１０２で刺激されたアネルギー化されていないＴ- 細胞の上澄み液にＩＬ−２が存在し、それはｒＩＬ−２のポジティブな対照で最 大であることを示している。発明の概要 ひとつの態様において、本発明は、ヒトＭＢＰのフラグメントであるペプチド からなる免疫抑制試薬に向けられている。本発明の実施態様は、ペプチド及びそ れらのペプチドからなる製薬組成物を含んでいる。 本発明は、前記ペプチドを、ミエリン塩基性タンパク質及びそれを含む組織に 対する免疫応答の抑制のため、及び／または、ヒトＭＢＰの免疫優性エビトープ を認識するＴ-細胞の抑制のために使用する方法にも向けられている。これらの 方法は、本発明によるぺプチドのひとつまたはそれ以上の経口および／または経 腸投与を含み、タンパク質及びそれを含む組織に対する免疫応答の抑制をもたら す。 本発明には、アミノ酸配列ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲからなるヒトＭＢ Ｐのフラグメントも含まれる。 さらなる態様にあっては、本発明は、ＭＢＰの前記フラタメントのひとつまた はそれ以上からなる製薬組成物に向けられている。 本発明のさらなる態様は、ヒトＴ-細胞機能の抑制、及びＣＤ４⁺ＭＢＰ-反応 性ヒトＴ-細胞の同定におけるヒトＭＢＰのフラグメントの使用方法を含む。発明の詳細な説明 本明細書で挙げられている特許出願、特許、及び出版物は、その全体が参考文 献としてこの明細書に取り入れられている。不一致がある場合は、定義を含めた この開示が優先する。 ここで用いられる”抑制（suppression）”は、その細胞を通常刺激する因子 に対する応答におけるＴ-細胞の増殖の、計測可能で再現性のある減少を含む。 しかし、本発明は、有害なＴ-細胞の増殖、即ち自己免疫攻撃を促進するＴ-細胞 （自己抗原に特異的なＣＤ４⁺Ｔ-細胞、例えばＭＢＰ）の増殖の抑制にのみ関す ることを強調すべきである。確かに、本発明の重要な態様は、限られた方法によ って抑制を引き起こす能力であり、以下で議論するように、自己抗原に特異的な 有害なＴ-細胞の抑制は、投与されたＭＢＰのフラグメント及び／または投与方 法の選択の結果である。 有害なＴ-細胞の増殖の抑制は、間接的にも測定できる。即ち、ＭＳに見られ る神経組織に対する損傷のような、免疫攻撃Ｔ-細胞増殖が直接的あるいは間接 的に引き起こす疾患の徴候の緩和、またはＭＳ患者が被るＭＳの攻撃の数や厳し さの減少を通して見られる。神経組織に対する損傷は、例えば、磁気共鳴イメー ジング（magnetic resonance imaging）（ＭＲＩ）によって検査でき、損傷の数 及び厳しさの測定を、それらの中に見ることができる。ＭＳ攻撃数または厳しさ の減少は、例えば患者の臨床評価によって検査することができる。ＭＲＩ及び臨 床評価は、この分野ではよく知られている。 ”自己抗原（autoantigen）”という用語は、異常な状態にある哺乳類に通常 見いだされる物質であり、その哺乳類のリンパ球または抗体によって、けっして ”自己”とは認識されず、免疫調節系によって外来物質であるとして攻撃される 物質と定義する。即ち、自己抗原とは、自己免疫破壊を受ける抗原である。元の 抗原に特異的な抗体または（ＣＤ４⁺タイプの）同等（even）Ｔ-細胞が単に存在 するだけでは、それは自己抗原として確立されない。ＭＢＰ及びＰＬＰ（プロテ オリピドタンパク質）は、ＭＳにおける自己抗原の例である。 （ＭＢＰのような）自己抗原の”免疫優性エピトープ”は、感応性哺乳類のＴ -細胞の大多数（絶対多数である必要はない）を含むがそれに限られない十分な 数のＴ-細胞によって認識される抗原決定因子を意味し、その感応性哺乳類が病 気の哺乳類でもあるとき、抗原に対してそのようなＴ-細胞が、免疫応答を開始 または開始を助ける。（この議論から、”感応性の”哺乳類が病気になった哺乳 類である必要がないということは明かである。） 自己抗原の”免疫優性領域”または”免疫優性ドメイン”は、免疫優性エピト ープを含む自己抗原のアミノ酸配列の領域と定義する。ＭＢＰまたは他の自己抗 原の免疫優性エピトープ（及び領域）の構造（及び／またはＭＢＰまたは他の自 己抗原分子の配置）は、宿主に依存して変化する、よって宿主特異的である。本 発明者らは、免疫優性エピトープが宿主特異的である理由は、それらが（約８か ら約１５のアミノ酸の長さのペプチド断片に含まれると考えられる）モチーフか らなり、それが宿主の主要な主要組織適合抗原系に結合することであるという証 拠を挙げた。このモチーフは異なる種間で変化し（ＭＨＣも同様に変化し）、同 じ種の要員の間でも多形態性を示す。 ＭＢＰのフラグメントの”類似体（analog）”という用語は、ＭＢＰのフラグ メントに構造的に関連し、ＭＢＰフラグメントと同様の生物学的活性を有する化 合物を含む。この定義でいう生物学的活性とは、ＭＢＰフラグメントを投与した 際のＴ-細胞媒介またはＴ-細胞依存性の自己免疫応答を抑制する能力、または自 己免疫攻撃の原因となるか、あるいはそれに貢献するＴ-細胞の増殖を抑制する 能力、もしくは、ＭＢＰの免疫優性エピトープを認識するＴ-細胞によって認識 される能力をいう。フラグメントＭＢＰ８４−１０２の類似体の例は、フラグメ ントＭＢＰ８４−１０２ｔｙｒであり、アミノ酸１０２がチロシンに変わってい る。図８からわかるように、この変化はＭＢＰフラグメントのＭＢＰ-反応性Ｔ- 細胞列の増殖を刺激する能力に、全くあるいはわずかにしか影響を与えない。さ らに、アミノ酸配列は、本フラグメントは比較的小さな寸法であるので、フラグ メントの溶解性または薬理反応速度に影響を与えないと予想される。”類似体” は、同程度に同じ活性を発揮する必要はないことは特記すべきである。即ち、” 類似体”は、元の抗原の実際のフラグメントと同様に有効な抑制剤である必要は ない。 関連したヒトＭＢＰエピトープの他の類似体が、これらの類似体の、ＭＨＣと 結合したり、関連するＴ-細胞レセプターによって認識されたりする能力（両者 はインビトロで試験できる）に基づいて構成される。 ここで用いる”Ｔ-細胞”または”Ｔ-リンパ球”は、造血（即ち血液を造る） 組織に位置したステム細胞から導かれた免疫系細胞と定義する。Ｔ-細胞には３ つの広いカテゴリー：ヘルパー、サプレッサー、及び細胞毒がある。Ｔ-細胞は 、ＣＤ４抗原（そのときＣＤ４⁺Ｔ-細胞と称される）またはＣＤ８抗原（この場 合ＣＤ８⁺Ｔ-細胞と称される）のどちらかを、その細胞表面で発現させる。周辺 （circulating）Ｔ-細胞によるＣＤ４またはＣＤ８の発現は、そのＴ-細胞の機 能及び特異性に相関している。ＣＤ４⁺である”ヘルパーＴ-細胞”は、抗原及び クラスＩＩＭＨＣ分子を認識し、ヘルパーまたは調節機能を果たす。”細胞毒” 及び”サプレッサー”Ｔ-細胞（ＣＤ８⁺である）は、抗原及びクラスＩＭＨＣ分 子を認識し、細胞毒及び抑制機能を果たす。 ”積極的な抑制（active suppression）”は免疫機能の抑制であり、その抑制 が、免疫細胞、特に調節（サプレッサー）Ｔ-細胞の付加による誘発の結果であ る。”クローナルアネルギー（clonal anergy）”は、非応答性及びさらに特別 には、これらの細胞が通常は特異的で、通常は増殖するような抗原の提示に対す る非応答性の状態にある免疫細胞、特に免疫攻撃Ｔ-細胞における誘発による免 疫機能の抑制である。La Salle, J.ら，J.Exp.Med.,176：177−186，1992年7月 。アネルギー化されたＴ-細胞は、それらが”ターン・オフ（turn off）”され たと見られるものを除いた全ての点において平常であることを示す。それらは、 インターロイキン-２（ＩＬ-２）の添加なしでは活性化されず、それらが認識す る抗原の提示に際して増殖しない。ＩＬ-２が加えられると、細胞は脱アネルギ ー化（de-anergized）となり、抗原の提示に際して増殖を始める。 ここで用いる”治療（treatment）”は、ＭＳの徴候を持つ自己免疫疾患（ま たはそれらの臨床的徴候の発現）を防御する予防治療と、治癒的治療、即ち、Ｍ Ｓの徴候を呈する疾患のオンセット（onset）後の、ひとつまたはそれ以上の徴 候の抑制あるいは測定可能な緩和とを含むことを意味する。 ”レセプター誘導ペプチド（receputor-derived peptide）”は、ここで、Ｔ- 細胞レセプターまたはその類似体のＶＢ１７及び／またはＶＢ１２と同様に（弱 毒 化されたＶＢ１７−またはＶＢ１２−を含むＴ-細胞のような）他の試薬のアミ ノ酸配列を有する（または含まれる）ペプチドであって、それがＭＳの徴候を有 する疾患に罹った哺乳類に投与されたとき、そのような徴候のひとつまたはそれ 以上を抑制するものと定義する。（本発明の活性ペプチドの最短配列長さは、約 ２０アミノ酸である。活性が保持されている限り、特に長さの最大値はない。例 えば、ＴＣＲまたは同等全Ｔ-細胞が使用できる。） ”ＭＨＣ”または”主要組織適合抗原系”は、活性化されたＴ-細胞、マクロ ファージ及び他の免疫系細胞の表面に存在する哺乳類細胞表面タンパク質の一連 の複合体と定義する。ＭＨＣは、組織適合性（または移植）抗原の提示において 、及び従来の（外来の）抗原に対する免疫応答の調節において、多くの免疫性の 態様における中心的役割を演ずる。ＭＨＣタンパク質分子には、クラスＩ及びク ラスＩＩの２つのタイプが存在する。ヒトＭＨＣ遺伝子は、ヒト染色体６に位置 し、マウスＭＨＣ遺伝子は、マウス染色体１７上のＨ−２遺伝子座に位置する。 ”クラスＩＩＭＨＣ分子”は、ＭＨＣの一部を形成する膜糖タンパク質である 。クラスＩＩＭＨＣ分子は、Ｂ−細胞、マクロファージ、脳アストログリア、表 皮ランケルハンス細胞、樹木状細胞、胸腺上皮及びヘルパ−Ｔ-細胞を含む免疫 系の細胞に主に見いだされる。クラスＩＩＭＨＣ分子は、組織移植片拒絶、抗体 生成移植片対宿主反応の刺激の間の免疫応答の調節、及び他の現象の間での”自 己”（または自己由来）の認識に含まれる。以下の明細書では、ＭＨＣは”クラ スＩＩＭＨＣ”と交換可能に用いられる。そのＭＨＣ遺伝子は、”ＭＨＣ遺伝子 ”と称される。Ｔ-細胞は、それが単核食細胞（マクロファージ、単球）、ラン ケルハンス細胞またはろ胞樹木状細胞のような、当初は処理（消化物）を吸収し 、それらの細胞表面に（それらのＭＨＣに応じて）タンパク質の抗原フラグメン トを提示する抗体提示細胞（ＡＰＣｓ）に出会ったときに免疫応答を開始する。 ＣＤ４⁺Ｔ-細胞は、クラスＩＩＭＨＣ分子を発現するＡＰＣｓによってタンパク 質が処理され、そのペプチドフラグメントが提示されたとき、抗原分子を排他的 に認識する。”Ｔ-細胞レセプター（T-cell receptor）”または”ＴＣＲ”は、 ここで、Ｔ-細胞表面に存在する抗原認識レセプターと定義する、従って、ＴＣ Ｒは、免疫系を抗原として認識、そして提示、する分子に結合するレセプターで ある（そ の分子は外来または自己由来で、後者である場合は自己免疫疾患である）。Ｔ- 細胞の大多数は、１本のアルファ（Ａ）と１本のベータ（Ｂ）鎖を含むジスルフ ィド結合したへテロダイマータンパク質からなるＴＣＲを発現するが、Ｔ-細胞 の少数は、２本の異なる鎖（ガンマ及びデルタ）を発現する。ＴＣＲは、ＡとＢ 鎖からなり、その各々は、可変または不変の領域からなる。（Tilinghast, J.P. ら，Science 233: 879, 1986； Concannon,P.ら， Proc.Natl.Acad. Sci.USA8 3: 6589,1986: Kimura,N.ら，J.Exp.Med.164: 739, 1986: Toyonaga,B.ら，Pro c.Natl.Acad.Sci.USA 82: 8624, 1985.）。その可変領域は、”可変”、”相違 ”、及び”結合”セグメントからなる。それら可変、相違、及び結合セグメント 間の接合点は、Ｔ-細胞による抗原認識の部位であると仮定される。Ho,H.Z.ら， Immunogenetics,1982,15: 509-517; Olerup,O．ら，Tissue Antigens, 1987,30 :135-138; Opelz,G.ら，Tissue Antigens, 1977,9：54-58; Danska,J．S．ら，J .Exp.Med., 1990,172: 27-33；Kempkis,B．ら，J.Immunol., 1991，147:2467-24 73; Sellins， K.S.ら，J.Immunol., 1992,149:2323-2327を参照。 Ｔ-細胞の抗原の認識は、Ｔ-細胞レセプター（ＴＣＲ）、ＡＰＣのＭＨＣ分子 、及びＡＰＣによってクラスＩＩＭＨＣ分子の３次元構造の裂け目またはポケッ トを通して処理されたぺプチドの間の３分子間相互作用を反映している。（Bjor kman, P.J.ら，1987,Nature,329:506と329:512）。ＡＰＣ表面に最も頻繁に提示 され、Ｔ-細胞によって認識されるタンパク質の部分は、免疫優性エビトープで ある。 動物モデル（ＥＡＥ）において、動物ＶＢ８．２配列の部分からなるＴ-細胞 レセプターは、疾患の治療に使用され、疾患-誘発性Ｔ-細胞を除去することによ り作用すると見られる。特に、動物モデルにおいて、マウス及びラットのＶＢ８ ．２の露出した（表面）部分に相当するＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅ ｒ−Ｓｅｒ及びＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇという配列か らなるぺプチドは、（マウス及びラットにおいて）ヘルパ−Ｔ-細胞を除去する ことにより自己免疫疾患と戦うことが確認された。 本発明者らは、ヒト宿主においてヒトＭＢＰの免疫優性エピトープを含むヒト ＭＢＰの２つの領域を同定した。これらの領域は、ヒトＭＢＰアミノ酸配列の２ つの異なる部分に固有のものである（各々残基番号８２−１０４及び１４３−１ ６８）。後述の実施例１に示したように、本発明者らは、ヒトＭＢＰアミノ酸残 基番号８４−１０２を、ＭＳに罹った患者から単離した周辺Ｔ-細胞の大多数に より認識されるヒトＭＢＰのひとつの免疫優性ドメインと同定した。さらなる実 験は、このドメインの免疫優性エピトープは、さらにヒトＭＢＰアミノ酸番号８ ５−９９に位置していることを決定した。これらのデータは、実施例３で提供し た。（実施例３のデータからの推論により、前述のヒト宿主免疫優性エピトープ が存する動物ヒトＭＢＰフラグメントは、いくつかのＴ-細胞クローンでフラグ メント８７−９８であることがわかる。しかし、８４−１０２と反応性の全ての Ｔ-細胞クローンは、フラグメント８５−９９を認識する）。ＭＢＰフラグメン ト１４３−１６８の同様の実験は、その免疫優性エピトープの正確な位置の決定 を容易に導く。 ＭＳ、ＥＡＥの動物モデルを含む実験は、ラットにおけるモルモットＭＢＰ及 びウシＭＢＰの対応する免疫優性エピトープを含むタンパク質フラグメントは、 疾患にかかった動物に経口投与されたとき、疾患の徴候の抑制に有効であること を示した（関連特許出願番号０７／５９６，９３６及び後述の実施例２）、しか し、いくつかの非誘発性フラグメントは、誘発性フラグメントより強力な抑制剤 である。さらに、この経口による抑制は、ＣＤ８⁺サプレッサーＴ-細胞の誘発に 依存していることが示された（Linderら，J.of Immunol.142： 748, 1989）。 動物においてＭＢＰの起脳炎フラグメントを用いたいくつかの実験が、他者によ って行われた。例えば以下を参照：Swierkosz,J.E., 1977,J.Immunol. 119：150 1-1506; Su, X-Mら， 1991,J.Neuroimmunol.34：181-190（ｉ．ｖ．マウスにお いて起脳炎であると決定されたＭＢＰフラグメントは、牌臓細胞と結合し、獲得 転移されたＥＡＥを緩相する）、Ａｖ ｒｉｌｉｏｎｉｓ，Ｋ．ら，１９９１， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，３５： ２０１−２１０（ｉ． ｖ．モルモ ットに投与されたとき起脳炎であることが小されているリポソーム結合したヒト ＭＢＰペプチドフラグメントのモルモッ卜における、同じフラクメントて誘発さ れたＥＡＥの抑制のための使用、及び、フリーペプチドの同じ目的でのｉ．ｐ． 及びｓ．ｃ．の使用））。 従って、本発明のぺプチドは、そのようなぺプチドを含む特異的な免疫抑制の 合成の設計において有益に使用され、翻って、それは有害なＴ-細胞の増殖の抑 制に有効である。例えば、ヒトＭＢＰ-特異的ＣＤ４⁺Ｔ-−細胞においてアネル ギーを誘発するか、または脱髄に特異的なＴ-サプレッサー細胞を誘発すること が示されているヒトＭＢＰの配列からなるぺプチドは、そのような目的で構成し 、使用することができる。例えば、後述の実施例１及び２を参照。さらに、実施 例２で報告された結果は、トラライジング試薬の投与の方法及び計画は、自己免 疫反応の抑制をもたらす機構に影響を与えることを示している。従って、ヒトに おいてヒトＭＢＰの免疫優性エビトープを取り入れたぺプチドフラグメントは、 インビトロでのＭＢＰ-反応性ＣＤ４⁺ヒトＴ-細胞の増殖の阻害に有効であり、 ヒトにおいてｉ．ｖ．経路を通して投与されたとき、同じ機構によって有効であ ると予想される。同じエピトープペプチドは、ヒトに経口投与されたとき、ヒト 神経組織の免疫攻撃の抑制を有効に誘発すると予想される。本発明者らは、（前 述の２つの免疫優性エピトープ領域を含む）全ＭＢＰは、ＭＢＰが少量および複 数回投与により経口投与されたとき、サプレッサーＴ-細胞を引き出すことを通 した抑制（積極的な抑制）を誘発することを示す証拠を有している。同じ抗原が 経口投与されても、大量で１回の投与であれば、アネルギーを通した抑制を誘発 するだろう。最後に、抑制の両方の機構は、上で同定した２つの極端な例の間の ＭＢＰからの経口投与計画を調整することにより誘起される。 理論的に裏付けされていないが、ＭＢＰの免疫優性フラグメントの経口または 経腸投与により、サプレッサーＴ-細胞が、翻って、神経組織（即ち、脳、脊髄 、末梢神経、または関連した細胞タイプ）の免疫攻撃に寄与するＴ-細胞の抑制 を引き出されるようになると考えられる。ＭＳに罹った患者において見られる疾 患を構成する神経組織の損傷は、そのような自己免疫攻撃の直接の結果と考えら れる。このトラライズ機構は、免疫攻撃下の組織近傍におけるＴ-細胞の免疫反 応性の抑制を起こす調整（サプレッサー）Ｔ-細胞の積極的な誘発を含んでいる ので、それは、積極的な抑制の一例である。 本発明者らは、これらのサプレッサーＴが特異的であるような抗原が見られる 身体の箇所を標的としている寛容抗原特異的サプレッサーＴ-細胞の誘引によっ て、活性の抑制が起きるという多数の実験証拠を蓄積してきた。この箇所は、自 己免疫攻撃を受けている組織を含む。ひとたびこれらがこの抗原に遭遇すると、 サプレッサーＴは、非特異的免疫抑制因子ＴＧＦ−βおよびインターロイキン− ４（ＩＬ−４）のような、自己免疫攻撃を含む自己免疫反応を抑制する抑制シト キニンを分泌する。（第８４３７５２号の関連特許参照） 対照的に、免疫優性エピトープを取込むＭＢＰフラグメントの静脈投与（ある いは皮下、あるいは腹腔内投与）は、クローンアネルギーとして知られる別の機 構を経て免疫抑制を引起こすと信じられている。クローンアネルギー、あるいは Ｔ-細胞の非反応性の原因は、適切な相互促進因子がない状態で、抗体が生じる ことである。Jenkins,M.K. PNAS,84:5409-5413,1987．含まれる因子が厳密に同 等かは、明記されていないが、可溶性シトキニン（例えば、Ｂ−７、ＥＤＣＩ、 および適切な細胞内のカルシウム濃度）には触れている。しかし、より最近の証 拠は、相互促進因子がないことよりはむしろ、いわゆる“貞のシグナル”が、ア ネルギーの原因であることを示唆している。しかし、これらのシグナルは、未だ その性質を明らかにされていない。ラサール，ジェー．エム． （LaSalle J.M. ）他，J.Exp.Med.,１７６：１７７−１８６，６月号，１９９２参照。Ｔ-細胞ク ローンを誘導して増殖させるよりはむしろ、相互促進因子のないＡＰＣｓによる 抗原の発生（および／または負のシグナルの存在下で）によって、Ｔ-細胞はＩ Ｌ−２の原因でありつづける一方で、サブ配列抗原促進の原因ではなくなり、し たがってアネルギー化されたと評される（Jenkinsら， Proc. Natl. Acad. Sci 84 :5409,1987；Muellerら，Ann. Rev. Immunol.7：４５５，１９８９；Schwartz ら，Science 248：１３４９，１９９０）。したがって、ＭＢＰのような、ある 自己抗原に対して特異的な自己免疫反応促進クローンは、もはやその抗原に反応 して増殖せず、自己免疫疾患症状の原因である組織損害を引起こす免疫攻撃反応 を減少するが、このような神経組織損害が、ＭＳ中で観測された。 クローンアネルギーによる抑制は、寛容化された動物から寛容化されていない 動物に、後者の動物において免疫機能の抑制を引起こすために転移されたサプレ ッサーＴ-細胞の能力の有無を試験する養子移入実験によって、活性の抑制と区 別することができる（以下の実験においてそのように区別された）。Ｔ-細胞転 移は、抑制機構が活性であれば、すなわち、サプレッサーＴ-細胞の誘引を含ん でいれば抑制を引起こし、抑制機構が非活性であれば、すなわちクローンアネル ギーが含まれていれば起こらない。実験例２において報告された結果は、免疫抑 制の各機構が含まれる例を図示し、また、抑制機構は以下の一つまたはそれ以上 によることを示している：（i）寛容誘導するために投与されるサブスタンス（ 例えば、ＭＢＰの免疫優性エピトープ的フラグメントは、経口的経路を経る活性 抑制および非経口的経路を経るエネルギーを誘導する）：（ii）寛容抗原の投与 の経路（例えば、攻撃Ｔ-細胞によって認識されるエピトープのみがi.v.経路を 経てアネルギーを誘導する）：（iii）投与の量と頻度（例えば、経口的に投与 されたＭＢＰは、少量を多様な容量にて与えられた際には、活性の抑制を、経口 的に多量を単一の容量にて与えられた際には、非活性の抑制を誘引する）。 データは、ＭＢＰの起脳炎性および非起脳炎性フラグメントのいずれもが、経 口的に投与された際に活性の抑制を誘発することができるが、これらの非起脳炎 性フラグメントは、活性の抑制を経てのみ、また、経口の経路を経て投与された 場合にのみはたらく免疫抑制エピトープを取込むものである。起脳炎性フラグメ ント（免疫優性エピトープを取込む）もまた、単一の用量にて大量に投与されれ ば、経口の経路を経てアネルギーを誘発することができる。 これらの結果は、寛容化作因および寛容化剤としてのＭＢＰに基づく方法の設 計に、重要な区分を有する。したがって、望ましい免疫抑制の種類によって、特 定のフラグメントと同様に特定の投与方法を用いることができる。例えば、一つ かそれ以上の疾患繁殖エピトープ的ペプチドを、i.v.あるいはs.c．あるいはi.p .経路を経て用いることが望ましく、同時に一つかそれ以上の免疫抑制エピトー プ的ぺプチドを、経口の経路を経て用いることが望ましい。 投与経路の組み合わせを含む寛容化方法および／またはプロトコールおよび／ または自己抗原フラグメントが最も効果的であると判明することも予想される。 当業者には理解されるであろうが、フラグメントおよびフラグメントの組み合わ せ（あるいはフラグメントと全抗原との組み台わせ）の有効性およびＭＢＰフラ グメントの投与方法（あるいは方法の組み合わせ）の有効性は、治療を受ける被 験者の年齢、性別、体重、体調および疾患状況と、他のフラグメントあるいは治 療が同時に使用されるか否かによって異なる。その結果、用いられたフラグメン トおよび投与方法は、相当にこれらの因子に基づいて決定されなければならず、 実験によって一件毎の根拠に基づいて決定される必要がある。しかし、このよう な決定には、定例の実験以上のことは必要でなく、実施例および指針をここに包 含した。 実施例１にて同定されたように、本発明に用いるヒトＭＢＰの配列に基づくペ プチドは、よく知られた固相法を用いて合成することができる（Merrifield, R. B.）Fed. Proc. Soc. Ex. Biol., 21：４１２，１９６２およびJ. Am. Chem.SO c. 85：２１４９，１９６３;R.Mitchell A.R.ら，J. Am. Chem. Soc. 98:７３５ ７，１９７６；Tam,J.ら，J. Am. Chem. Soc. 105：６４４２，１９８３）が、 好ましくは市販のペプチド合成装置を用い（Applied Biosystem社製），フォス ターシティー，ＣＡ製造のものなど）、製造業社の使用説明書に従う。あるいは また、このようなペプチドは、現在では当業界で広く知られるところの、ＤＮＡ 組替え技術によっても合成することができる（Maniatisら，分子クロ−ニンク゛ ：実験の手引，Cold Spring Harbor研究所，ＮＹ，１９８２，pp.５１−５４お よびpp.４１２−３０参照）例えば、これらのペプチドは、望ましい種より分離 されたＭＢＰの望ましいフラグメントを暗号化するＤＮＡ配列の、発現ベクトル への取込みおよび、個別に望ましいペプチドを発現するであろう適当な真核また は原核の宿主へのこのようなベクトルの導入の後に、ＤＮＡ発現の産物として得 られるか、あるいは融合ペプチドまたは蛋白質の部分として得られ、このものか ら広く知られた技術を用いて分離することができる。 ペプチド類似体は、以下に開示される通り、上述の合成あるいは組替え技術お よび例えばler,E.B.,実験的医学および生物学の進歩 21：２５９−２８１，１９ ７８．の方法によって、ヒトのＭＢＰ遺伝子により暗号化された既知のアミノ酸 配列を用いて設計することができる。例えば、ＭＢＰの望ましいフラグメントの 、厳密なアミノ酸配列に基づいてはいるが異なる配列を有するペプチドは、上述 の技術を用いて化学的に合成することができる。このようなペプチドは、例えば 実施例１にて述べられている、この特定のヒトＭＢＰの免疫優性エビトープのア ミノ酸８７−１０２中のより精密な位置を同定するための操作あるいは、例 ４にて述べられている、Ｔ細胞レセプターおよびＭＨＣに対する効果を、試験す ることができる。個体より収集され、分離された末梢ＭＢＰ特異的サプレッサー Ｔ-細胞をペプチドにさらし、それらが増加するか否かを測定することによって 、ＭＢＰ基盤ペプチドの内服による人体での有効性をインビトロに試験すること ができる。その上に、あるいはまた、これらの分離されたサプレッサ−Ｔ-細胞 は、ＭＢＰペプチドにさらした際にＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−４のような 抑制シトキンを遊離するか否かを試験し、測定することができる。（例えば、Ａ ＰＳ’ｓとしての脾臓細胞の使用が必要でないこと以外は、ＰＣＴ ＵＳ９２／ ０１７０５に対応する、同時係属の米国特許出願第８４３７５２号におけるトラ ンスウエル（transwell）システムの利用を参照：ＭＢＰペプチドは、細胞を誘 導するために用いられ、ＴＧＦ−βを遊離させることができる。）ＭＢＰ特異的 Ｔ-サプレッサー細胞は、ＭＢＰにさらされることによって分離され、増殖評価 に引続いてアンチＣＤ８⁺抗体を用いた結合研究を行なった。 本発明は、ヒト、とりわけＭＳに苦しむ被験者の自己免疫攻撃Ｔ-細胞の機能 を抑制するための経口的または非経的使用について薬剤の製剤および投薬量形式 をも提供するものである。ヒトＭＢＰおよび類似体のフラグメントであり、その 一定量が免疫攻撃細胞の増殖抑制に効果的である発明によれば、一般的にこのよ うな投薬量形式は一つまたはそれ以上のペプチドを含んでいる。例えば、本発明 の方法に準じて治療を受けてきた患者におけるＭＢＰ特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞およ び／またはＭＳの１つまたはより多くの兆候の減衰のような、免疫攻撃細胞のイ ンビトロな抑制となる機能の抑制は、本発明の範疇であるとみなされる。何が抑 制および兆候の減衰を構成しているかは、これまでの章を参考のこと。 本発明のＴ-細胞抑制ペプチドは、これらの添加配列が、このようなペプチド の抑制機能をうち負かさない限りにおいては、ＭＢＰ基盤配列を導く、あるいは これに続く、添加的非ＭＢＰ誘導アミノ酸配列をも包囲する。免疫抑制行動に対 するこのような構造の試験は、例えばここに述べるされたアッセイ法の一つまた はそれ以上を用いて簡単に行なうことができる。 本発明の調剤組成物は、任意の成分として、当業界で広く知られる種類の薬用 の媒体、担体、希釈剤、可溶化剤あるいは乳化剤および塩を含むものであってよ い。このような基質の非限定例は、蒸留水中０．５Ｎの食塩水を非経口的に用い 、乳糖を経口的に用いることを含む。 ヒトＭＢＰのフラグメントは、免疫抑制の有効性を増大させる相乗剤とともに 、経口にあるいは吸入によって投与することができる。本発明に用いる相乗剤の 非限定例は、例えば大腸菌（E. coli）の様々なサブタイプ、およびサルモネラ 菌（Salmonella）（LPS,Sigma Chemical Co.），セントルイス，ＭＯ：Difco,デ トロイト，ＭＩ：バイオモルBIOHOL調査研究所，プリマス，ＰＡ）、脂質Ａ（Si gma Chemical Co.,セントルイス， ＭＯ；ＩＣＮ Biochemicals,クリーブラン ド，ＯＨ；Polysciences,Inc.,ウォーリントン，ＰＡ）、およびDeres,K.）らに より開示されたように（Nature, 342:５６１−５６４，１９８９）して得られる トリパーミトイル-Ｓ-グリカリルシステイニル-セリル-セリン（Ｐ₃Ｃ５５）と 共有結合で結合したペプチド、あるいはBraun,V.,Biochim. Biophys.Acta 435： ３３５−３３７，１９７６に開示されたようにしてE. coliより得られる、“ブ ラウンの”リポ蛋白のような免疫調節リポ蛋白、などのようなグラム陰性の細菌 の多様な品種の中の細菌リポ多糖類を含む。ＬＰＳが望ましく、脂質Ａが特に望 ましい。脂質Ａは、全ＬＰＳ分子よりも毒性が弱いために、本発明での使用には 特に望ましい。本発明にＬＰＳを用いるには、グラム陰性の細菌から抽出し、Ga lanesら（Eur. J. Biochem. ９：２４５，１９６９）およびSkelly,R.R.ら（Inf ect. Immun. Biochem.23：２８７，１９７９）の方法を用いて精製することがで きる。 効果的な量の相乗剤、例えばＬＰＳあるいは脂質Ａは、前記哺乳類の体重１kg 毎に、毎日０．１５〜１５mg程度、望ましくは前記哺乳類の体重１kg毎に、毎日 ０．３〜１２mgの広範囲に及ぶＭＢＰフラグメントとともに投与される。 本発明の抑制剤の投与の方法は、経口の形式あるいは非経口の形式あるいはこ れらを組み合わせたものである。経口の投与とは、経口、経腸あるいは胃内の投 与を含むが、経口が望ましい。非経口の投与とは、腹腔内、皮下、皮膚内、およ び最も望ましい静脈内投与を含む。 一般的に、ＭＢＰ基盤ペプチドあるいは類似体は、ヒトの患者に対し、各投与 ごとに約１０μｇ〜 ２０mg、好ましくは約１００μg〜２５０μｇの範囲で、 経口 にて投与される。この量は、一つの投与量形式あるいは多数の投与量形式におい て、パルス投与される。活性抑制を引起こすためには、全てのＭＢＰについて、 毎日５回ずつ１mgの投与量形式が効果的な量の一例である。アネルギーのために は、非経口的な１０〜２０mgが効果的な量の例である。投与の投薬量および頻度 を最適化するために、患者の監視が望ましい。患者への投与の厳密な量および頻 度は、当業界では充分認識されているように、発現の時期と頻度および患者の疾 患の深刻度および患者の体調によって多様となるであろう。このような最適化は 、一件毎の根拠に基づいて行なわれることが望ましい。ここに指針を開示された 免疫抑制に必要な投薬量の最適化は、不要な実験ではない。 本発明の別の好ましい具体化における薬剤の経口製剤または投薬量形式は、本 発明によれば、吸入によっても投与することができ、望ましくはエアロゾルの形 態で用いる。投与の吸入法は、好ましくは鼻腔を経るものでなく、気管支および 肺粘膜を経るものである。本発明のＭＢＰフラグメントおよび関連化合物は、乾 燥粉末粒子としてあるいは微粒子化してキャリアーガス（例えば空気またはＮ₂ ）中に漂わせた水溶液としてヒトに投与することができる。好ましいエアロゾル 薬剤の製剤は、例えば、生理的に受容される緩衝塩溶液を包含する。 本発明の方法は、薬剤の製剤の吸入による投与で、例えば米国特許第４６２４ ２５１号，１９８６年１１月２５日発行：第３７０３１７３号，１９７２年１１ 月２１日発行：第３５６１４４４号，１９７１年２月９日発行および第４６３５ ６２７号，１９７１年１月１３日発行に述べたもののような噴霧器を用いるエア ロゾルスプレーの方式によるものが含まれている。エアロゾル物質は治療を受け る被験者により吸入される。 本発明を実行する際には、Newman,S.P.のAerosols and the Lung,Clarke,SW． およびDavia,D.編．pp.１９７−２２４，バターワース，ロンドン，イングラン ド，１９８４．に開示されている気圧保持の測定用量吸入器（ＭＤＩ）および乾 燥粉末吸入器のような、エアロゾル移送の他の方式を用いることができる。 ここに開示された種類のエアロゾル移送方式は、フィソンズ（Fisons）コーポ レーション（ベッドフォード，ＭＡ）、シエーリング（Schering）コープ（ケニ ルワース，ＮＪ）およびアメリカンファーモシール（American Phharmoseal）コ ー（バレンシア，ＣＡ）など多数の販売元より入手することができる。 治療にエアロゾル投与を用いた場合、１９８９年１２月２０日出願の同時係属 中の米国特許出願第４５４４８６号に開示されているように、全ＭＢＰを用いて ＥＡＥの処理を行なった際およびコラーゲンを用いてアジュバント関節炎の処理 を行なった際にこの効果が見出されたことから、本発明のＭＢＰのフラグメント は、少量を必要とされるのみであることが期待される。さらには、ＭＢＰのフラ グメントの吸入により誘引される免疫抑制は、経口投与に類似した活性の抑制機 構を経て起こる。Weiner,H.L.らFASEB ４（７）：２１０２、１９９０．本発明 のＭＢＰのフラグメントの、エアロゾル投薬量形式によって投与される量は、哺 乳類の体重１kg毎に、毎日約０．０１５〜約１．５mgであり、哺乳類の休重１kg 毎に、毎日約０．０５〜約１５mgの範囲の相乗剤を任意に含むことができ、単一 の投薬量形式あるいは多数の投薬量形式によって投与することができる。投与さ れる厳密な量は、患者の疾患の状態と深刻さおよび、患者の体調によって様々で ある。 本発明によれば、非経口的な投与に対する投薬量形式は、一人毎、用量毎に、 一般的に約１〜２００mgのペプチドを含有し、望ましくは、約１０mg〜約１００ mgを含有する。経口の製剤に関して上の表に記述した、上記の不活性な任意成分 および正確な量の調製および投与計画は、非経口の製剤のみに付属する。 必要有効量は投薬量単位の複数の投与によって達成され得ることから、各投薬 量形式の、個別の経口的または非経口的用量に含まれる活性成分の単位含有量は 、それ自体でＭＳの治療に効果的な量を構成する必要はないことが認識されるで あろう。 実施例１−３において述べた技術を用いて、本発明の方法の有効性を監視し、 本発明の投与に用いられたフラグメントと方法と同様に疾患抑制剤の投与の量と 頻度とを最適化することができる。 Ｔ細胞は、実施例１−３に述べたように、患者の末梢血液あるいは脳脊髄液よ り分離され、増殖、クローン化される（本発明による治療の前および／または後 ）。抗体（多クローン性または単クローン性）は、本発明のＭＢＰペプチドに向 けて得られ（当業界でよく知られ、用いられている従来法によって）、本発明に よる治療の前および／または後に、患者の末梢血液中にＭＢＰ反応性Ｔ-細胞の 兆候を求めて、またより特異的には活性化ＭＢＰ反応性ＣＤ４⁺Ｔ-細胞の兆候を 求めて検定される。本発明のぺプチドは、実施例１の方法を用いてＭＢＰに対し て反応性のＴ-細胞をもつ個体を同定するにも有用である。 本発明は、これより後に、範囲を限定することなく本発明を説明しようと意図 した特定の実施例について叙述される。実施例１： ヒトＭＢＰの主要自己免疫領域の同定 ＭＢＰは、ヒトの脳組織から抽出され、叙述のように（Chou,F.C.H., J. Biol . Chem. 251：２６７１，１９７６）最大分子量ピーク（１８kD）を用いて、Ｃ Ｍ−５２カラム（製造元：Wattman Biosystems Ltd）メイズトン，ケント， Ｕ ．Ｋ．）上で精製された。ＭＢＰぺプチドは、固相法を用いて合成され、あるい は商業研究所（Biosearch Lab Inc.,サンラフアエル，ＣＡ）より入手され、以 下のように高圧液相クロマトグラフィーによって精製された：調製品を含む各ぺ プチドは、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中にて１mg／mlに調製された 。 その後ＨＰＬＣカラム（レイニン(Rainin)逆相Ｃ４あるいはＣ１８）中で、０． １％ＴＦＡを含有する０〜７０％アセトニトリル勾配を用いて処理された。ピー クは２１４nmにて検出された。使用されたＭＢＰぺプチドフラグメントは、以下 の表１中に列記した。しかし、ヒトＭＢＰの配列は公表されている。それゆえ各 ぺプチドに含まれるアミノ酸残基を設計する数のみが必要である。 クラスＩＩＭＨＣ表現型に対して反応性のヒトのＭＢＰに免疫優性のエピトー プがあるか否か、およびこのような反応性の頻度を試験するために、迅速Ｔ-細 胞クローン化技術が用いられた。総計１５８２４の短期間Ｔ-細胞系列が、５１ 人のヒトの被験者由来の末梢血液分子細胞（ＰＭＮ）を精製済ＭＢＰ（１００μ g）で培養し、３日後に、またその後は３〜４日毎に、インターロイキン−２（ ＩＬ−２；ＡＢＩ社、メリーランド州コロンビア）および２単位の組替えインタ ーロイキン−４（ＩＬ−４；ジェンザイム（Genzyme）社、マサチューセッツ州 ボストン）を添加した。培養１３日目に各系列からのアリコートは、ＭＢＰに対 する反応性について以下の増殖検定法を用いて試験された：Ｔ-細胞クローン（ １×１０⁵細胞／ウエル）が、３つ用意され、適当な刺激物（例えば１００μgの 全ＭＢＰあるいは５％のＩＬ−２）で、９６ウエル平底顕微滴定培地（Coster社 ）中、３７℃、７２時間、湿度９０％、ＣＯ２５％にて同時培養された。細胞は 、２μＣｉ［³Ｈ］ＴｄＲ（２Ｃｉ／mmol、ニューイングランド ニュークリア 社、マサチューセッツ州ボストン）によって培養の終盤の１８時間にパルス標識 された。ＡＰＣｓは、ヒトのＢ細胞が転移したヒトのエプスタインバールウィル ス（細菌はＡＴＣＣより購入可能）あるいは、ヒトのＤＲ₂を移入したマウス細 胞であるＬ細胞（Ｌ細胞は補助No.ATCC-CCLlの下にＡＴＣＣより購入可能であり 、Wu,S.ら，J.Immunol.， １９８７，138：２９５３によってＤＮＡを暗号化す るＤＲ２を用いて、Wilkinson,D.ら，J.Exp.Med.，１９８８，167：１４４２− １４５ ８の方法によって移入することができる。）をパルス標識することによつて調製 された。Ｂ細胞またはＬ細胞は、４０ｐMのＭＢＰあるいはリン脂質蛋白質（Ｐ ＬＰ）の存在下と、非存在下のいずれかの完全培地において、１×１０⁶細胞／ ウェルとして３７℃にて２時間用いられ、続いて４℃にて５００rad.の照射を受 けた。補助ＡＰＣｓなしにＴ-細胞を刺激するためには、２μMのＭＢＰ、ＰＬＰ 、あるいは適当なフラグメントが、培養の期間に細胞に対して直接加えられた： ４８時間、続いてチモーゲン（thymogen）によるパルス標識、その後収集が行な われた。一万のＡＰＣ’ｓが、１０００００のＴ細胞クローンに用いられた。 ＭＢＰあるいはＰＬＰに対して反応性であると示されたＴ細胞系列は、その後 同様の技術を用いて上の表１に示されたようにヒトＭＢＰ配列を包囲する重なり オリゴペプチド２０-mersに対する反応性を試験された。ＭＢＰおよびＰＬＰ反 応性頻度分析は、他の神経疾患の被験者および正常な被験者（全ての年齢および 性別はＭＳ患者と一致）と同様に、限定された、再発−緩和性のＭＳの患者（磁 気共鳴画像診断（ＭＲＩ）および臨床検査によって診断された通り）に対して行 なわれた。結果は以下の表２に示された通りである。 ＭＳの患者は白人種であり、非常に特徴的な再発−緩和性の疾患をもち、２４ カ月以内に少なくとも２度の悪化と、血液引出しの際にはＭＲＩを用いて見られ たように良性の腫瘍を呈した。他の中枢神経型の疾患の被験者は、以下の診断を 受けた：大脳血管性の事故（ｎ＝４）、ＣＮＳ出血を伴う脳の外傷（ｎ＝４）、 転移性（metastatic）脳腫瘍（ｎ＝２）の、いずれかの１−３週間後。ＭＢＰあ るいはＰＬＰに対して反応性であるＴ-細胞系列の総数および生じたＴ-細胞系列 の総数が、表２に示されている（“Ag”は“抗原”を意味する）。加えて、ＭＢ ＰおよびＰＬＰ反応性の系列の頻度は、各被験者について、ＭＢＰ反応性系列の 数を生じた系列の総数で割ることにより計算され、平均値+/-ＳＥＭが与えられ た。ＭＢＰとそのフラグメントに対する反応性よりも低い程度ではあるが、ＰＬ Ｐに対する反応性に関しては同様の結果が得られた。 他の被験者と比較して、ＭＢＰの全てのフラグメントに対して反応性である系 列の頻度が、ＭＳの被験者においてはわずかに高いのではあるが、この増分は、 統計的に注目に値するものではない。しかし、以下に議論するように、ＭＳ患者 由来のＭＢＰ反応性細胞系列の、著しく多数が、それぞれアミノ酸８４−１０２ および１４３−１６８を含むフラグメントに対して反応性であり、したがってこ れらのペプチドおよび対応するＭＢＰのフラグメントが、ＭＳの発達においてＭ ＢＰ活性の免疫優性エピトープを含んでいると確認される。 ＭＳの患者由来の総計３０２の細胞系列は、反復した分析では、拡張して確実 にＭＢＰと反応することができ、１４０（４６．４％）がＭＢＰ残基８４−１０ ２と反応し；ほぼ７０−８０％がＭＢＰ残基８４−１０２あるいは１４３−１６ ８のいずれかと反応した。コントロール群では、総計１００のＭＢＰ反応性Ｔ- 細胞系列の内１１（１１．０％）が、８４−１０２ペプチドを認識し、約３４％ が８４−１０２または１４３−１６８ペプチドのいずれかを認識した。各個別の 被験者について、各々のＭＢＰペプチドと反応した、末梢の血液から得たＴ-細 胞の実際の頻度を計算した。ＭＳの患者およびコントロール被験者に対する平均 値は、表２の最右列に示されている。ＰＬＰの対応する免疫優性ペプチドは、こ こにＭＢＰペプチドについて述べたと同様の方法にて確認することができる。 正常な被験者および他の神経疾患のコントロール由来のＭＢＰペプチド特異細 胞系列の頻度は、事実上全く同様であり、したがって分析に際しては併合された 。選択的にＭＢＰ残基８４−１０２に対して反応性である、ＭＳの被験者由来の Ｔ-細胞系列の平均頻度は、コントロールと比較するとより高かった（図１）。 ＭＳおよびコントロールの被験者が、ＭＢＰ残基１４３−１６８に対して反応性 であるＴ細胞系列の高い頻度を示した一方で、ＭＢＰ残基６１−８２および１２ ４−１４２に対する反応性における、注目に値するもののそれほど強烈でない増 分もまた、ＭＳ患者において観測された。活性化されたＴ-細胞系列を選択する ために、ＩＬ−２が用いられた。ＩＬ−２による第１の刺激の後、このように活 性化された細胞系列はＭＢＰペプチドを認識した。 上述の技術を用いて、これらの発見をより数多くのＭＳ患者に拡張することが なされた。付加的な１３２のＴ-細胞系列（ＭＳ患者由来のもの６３および正常 なコントロール由来のもの８８）が研究され、結果は下記の表３に示された。要 約すれば、これらの結果はＭＢＰアミノ酸残基８４−１０２および１４３−１６ ８を含むペプチドをＭＢＰの免疫優性領域とする結論を支持するものである。 前述の表４の結果は、ＩＬ−２を用いたＭＢＰ特異Ｔ-細胞の一次刺激作用に おいて、付加的なＭＢＰ特異Ｔ-細胞クローンが、（コントロールと比較して） ＭＳ患者には、劇的に高い数値で確認されることを証明している。このことは、 ＭＢＰ反応性Ｔ-細胞クローンは、ＩＬ−２にさらされることによって非活性化 され（おそらくは非アネルギー化され）、続いて、ＭＢＰペプチドに対して反応 性となるであろうことを示唆している。実施例２： 免疫寛容の誘導の機構 本例の実験は、誘導あるいは養子移入された際に、ＭＢＰの異なるフラグメン トを用いてＥＡＥの抑制の有効性を比較し、蛋白質フラグメントの経口のおよび 静脈内の投与とを比較し、疾患の状態の治療を比較するために行なわれた。ＥＡ Ｅの誘導は、ＭＢＰが、宿主を免疫するために用いられ、アジユバントとともに 筋肉内に投与される際に起こり、その一方で、養子移入された疾患は、ＭＢＰ反 応性細胞系列が活性化され、その後動物に注射されるさいに生じる（詳しくは以 下のＥＡＥの誘導の章を参照）。本例では以下の物質および方法を用いた。 動物 ６〜８週齢の雌のルイスラットを、Harlan-Sprague Dawley Inc. （インディアナポリス，ＩＮ）より入手した。動物は、ハーバード大学医学部動 物保護施設に収容され、標準的な実験室の餌および水にリブリュームを加えて飼 育された。動物は実験研究審議会の実験動物の保護に関する委員会の指針（Ｐｕ ｂ．＃ＤＨＥＷ：ＮＩＨ、８５−２５、１９８５年改定版）に従って飼育した。 抗原および試薬 脳の組織由来のモルモットのＭＢＰは、Deiblerらの 修飾法により精製した（Prep. Biochem. ２：１３９，１９７２）。蛋白質含有 量および純度は、ゲル電気泳動およびアミノ酸分析によって検査した。コンカナ バリンＡおよびヒストンは、シグマ（Sigma）（セントルイス，ＭＯ）より入手 した。ぺプチドは、神経疾患のためのセンターであるブリガムアンドウィメンズ （Brigham and Women' s）病院内のペプチド施設にて合成し、ＨＰＬＣによって 精製した。合成されたぺプチドのアミノ酸配列は、２１−４０，ＭＤＨＡＲＨＧ ＦＬＰＲＨＲＤＴＧＩＬＤＳ （ラットに経口にて投与した際の免疫抑制エピト ープ領域）；７１−９０、ＳＬＰＱＫＳＱＲＳＱＤＥＮＰＶＶＨＦ（ラットにお ける免疫優性の起脳炎領域）；１５１−１７０，ＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳ ＲＳ である。 寛容の誘導 経口の寛容あるいは活性の抑制のために、ラットは１mlの ＰＢＳに溶解した１mgのＭＢＰ、あるいはＰＢＳのみを、ゲージ１８のステンレ ス剛動物飼育針（Thomas Scientific，スウェーデスボロ，ＮＪ）を用いた胃の 挿管治療によって与えた。動物は、２、３日間隔で５回、免疫化の２日前を最後 として餌を与えた。静脈内寛容あるいはクローンアネルギーのためには、ラット は、０．１mlのＰＢＳに溶解した０．１mgのＭＢＰあるいはＭＢＰペプチドある いはヒストンか、またはＰＢＳのみを注射した。動物は、目の静脈から２、３日 間隔で５回、免疫化の２日前を最後として注射した。 ＥＡＥの誘導 活発に誘導された疾患のためには、ルイスラットは、左 足の肉趾から、５０μlのＰＢＳ中の２５μmのモルモットのＭＢＰをmg/mlの結 核ミコバクテリア（ディフコ(Difco)製）を含有する同体積の完全フロイントの アジュバンド（ＣＦＡ）中に乳化したものにより免疫化した。ＥＡＥの養子移入 のためには、ＭＢＰ活性細胞系列は、Ben-Nunらの方法（Euro. J. Immunol.11： １９５、１９８２）によって飼育し、ＣＦＡ中のＭＢＰにより免疫化されたラッ トから樹立した。起脳炎細胞は、ＡＰＳｓとして免疫化した動物からとり、放射 線を照射した胸腺細胞を用い、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（２μm/l）を加 えた培養による活性化の後に採集した。細胞は、フィコールハイパーク（ficol hypaque）勾配（Ｈｙｐａｑｕｅ１０７７、シグマ社製）を経て収穫し、移入に 先立ち二度洗浄した。５×１０⁶の起脳性細胞は、０．１mlＰＢＳ中として、放 射線照射した（７５０rad、２４時間、earlier）受容体ラットに、腹腔内から注 射した。モジユレーターおよび起脳性細胞双方の細胞生存可能性は、トリパンブ ルーによって試験し、９０％以上であった。全ての実験において、各実験グルー プから５体の動物を用いた。経口の寛容に引続く保護の養子移入のためのＴ細胞サブセットの精製 リンパ球サブセットの減少は、Cruikshankらの修飾方法（J. Immunol. 138： ３８１７，１９８７）により、磁気ビーズを用いだ負の選択によって果された。 ひ臓細胞は、マウスの抗ラットＣＤ８あるいはＣＤ４単クローン抗体（ＯＸ／８ あるいはＷ３／２５はそれぞれセロテック／ハイオプロタクツ（Serotec/Biopro ducts），インディアナポリス，ＩＮ）の１：１０希薄溶液とともに温置し、３ ０分間氷冷し、二回洗浄し、その後平均直径４．５μm（Ｍ−４５０）であり、 共有結合的にヤギの抗マウスＩｇＧが付着している（ダイナル（Dynal），フォ ートリー，ＮＪ）、未洗浄の磁気粒子に加えた。使用した磁気ビーズの量は、標 的細胞の数を見積もったものの１０倍であると推定された。細胞は、ビーズとと もに、１０％の子牛の胎児の血清を１０mlの丸底試験官（Nunc）に追加した、０ ．５mlのＲＰＭＩ１６４０培地にて３０分間温置した。５分毎に静かに振とうし ながら氷冷した。温置した後、ビーズ／細胞懸濁は５mlの培養液で洗浄し、磁気 粒子濃縮機（ダイナル−ＭＰＣ−１）を２分間用いて強い磁場において、細胞− ｍＡｂ−ビーズ錯体は未標識の細胞から分離した。上清を取除き、この操作を２ 回繰返して非粘性のフラクションを得た。ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺において数が減 少した細胞は、indirect flow cytometoryに証明されたように、＞９５％ＣＤ４⁺ ＣＤ８^-あるいはＣＤ４^-ＣＤ８⁺である。ＭＢＰ飼育の動物およびコントロール の動物由来の脾臓全体の数は、Ｃｏｎ−Ａ（２μg/ml）の存在化で培養した（１ mlの増殖培地中、細胞５×１０⁶）。減少した数は、１mlあたり細胞２．５×１ ０⁶の濃度にて培養した。得られたサブセットはモジュレーター細胞として用い られる。 臨床評価 動物は、ＥＡＥの形跡を求めて、目隠し法にて毎日評価され た。ＥＡＥの臨床の厳しさは、以下のように記録された：０、疾患なし；１、尾 に生気なし；２、後脚の麻痺；３、後脚の対麻痺、自制の不能；４、四肢の麻痺 ；５、死亡。疾患の持続時間は、疾患の発症（通常は活性免疫化の後１０日か１ １日、また、疾患の養子移入の後３〜５日）からの、各動物の完全な回復までの 総日数を数えることによって測定した。 遅延性過敏症（ＤＴＨ）検査 ＤＴＨは、ＰＢＳに溶解した２５μgの ＭＢＰを耳に皮下注射することによって検査した。目隠しされた観察者によって 、challengeの前と４８時間後に、カリパス測微計（ミツトヨ製，日本）を用い て、厚さを測定した。実施前と後との耳の厚さの差異は、各動物に対して記録さ れ、その結果は各実験グループ±ＳＥＭについて平均値として表現した。 微細構造 病理変化の微細構造的分析は、ラットにおいて養子移入ＥＡ Ｅを用いて行なった。養子移入の後１５日で脊髄が取除かれ、１０％の中性の緩 衝ホルマリン中に固定した。パラフィン切片を調製し、ラクソール（Luxol）フ ァーストブルーヘマトキシリンおよびエオジンを用い、標準的操作によって染色 した（Sobelら，J. Immunol. 132：２３９３，１９８４）。脊髄組織は、各動物 と柔組織およびミニンジス（meninges）中の切片（２０ci以上のより凝集した炎 症細胞のクラスター ）毎の数多くの炎症中心について同一の方法で標本抽出し、 目隠し法（Sobelら，supra）にて記録した。 統計的分析 臨床のスケールは、記録標本について二末端の（two-tail ed）ウィルコクソン ランクサムテスト（Wilcoxon rank sum test）により分析 し、カイ二乗解析（chi square analysis）を用いてグループ間で疾患の発生率 の比較を行い、方法の比較はスチューデントｔ-検定によって行なった。個々の 実験には、グループごとに動物５体を用いた。結 果 ＭＢＰへの経口の寛容による、養子移入されたＥＡＥの抑制 養子移入 ＥＡＥに対する、先のＭＢＰの経口投与の効果を評価するために、ＭＢＰ飼育の ラットおよびコントロールのラットは、５×１０⁶のＭＢＰ特異的でＣｏｎ−Ａ により促進された起脳炎性系列細胞を、腹腔内から接種した。最後の餌を与えて ２日後にＭＢＰ反応性の細胞を移入した。図２Ａのグラフは、ＭＢＰに対して経 口にて寛容化され、その後ＭＢＰ特異細胞（黒丸）を接種された動物の臨床記録 と、これに相応する同様に接種を受けた未治療の動物の臨床記録である。この表 に示されるように、ＭＢＰの経口投与は養子移入されたＥＡＥに対して何の効果 も及ぼさなかった。本発明者らは、養子移入されたＥＡＥを抑制しようとの経口 の寛容化が失敗に終ったことは、移植された起脳炎性Ｔ細胞が活性化され、敏速 に標的器官に移動することができ、その器官において充分な数の抑制Ｔ-細胞に 先立って免疫攻撃を開始することによると提唱している：リンパ節に移動し；さ らに（iii）は、標的器官（脳）に移動する。したがって、起脳炎性細胞に対す る調節の割合は標的器官に表れ、これらが侵入するタイミングはきわどいようで ある。しかし、経口にて寛容化された動物由来の脾臓細胞が起脳炎性細胞ととも に未治療の受容体に同時転移した際、養子移入されたＥＡＥは抑制され（図２Ｂ ）、既誘引の抑制Ｔ細胞は、たとえこれらが免疫攻撃細胞と同時投与された場合 でもうまく疾患を避け得ることを示唆している。 図２Ｂは、起脳炎性細胞５×１０⁶と、ＭＢＰに対して経口にて寛容化された 動物由来の脾臓細胞１．５×１０⁶を同時に注射した動物の臨床記録を示してい る。同時転移のためには、経口にて寛容化された動物由来の細胞は、起脳炎性細 胞と混合して、注射した（黒丸）。同じく図２Ｂに示したように、起脳炎性細胞 およびモジユレーター細胞が別々に左右の隣接領域に注射した際に類似の保護が か観察され、このことは、保護効果が抑制Ｔ-細胞と攻撃Ｔ-細胞との相互作用に よるものではないことを示唆している。正のコントロール動物の臨床記録は、図 ２Ｂ中に黒四角により示されている。 養子移入されたＥＡＥの抑制は、経口にて寛容化された動物由来のＣＤ８⁺ Ｔ細胞に依存している。 養子移入されたＥＡＥの抑制が、特異Ｔ-細胞サブ セットに依存しているか否かを決定するために、養子移入に先立ってＭＢＰ給餌 動物由来の脾臓細胞がＣＤ４⁺あるいはＣＤ８⁺Ｔ細胞サブセットにおいて消耗さ れ、モジュレーターとして用いられた。図４に示されるように、保護の養子移入 は、ＣＤ４⁺を消耗した脾臓細胞の転移によってではなく、ＣＤ８⁺を消耗した脾 臓細胞の転移によって撤廃された（平均最大記録＝２．３±０．２vs．０．７± ０．２、各々ｐ＜０．０１）。白四角：非選択的脾臓細胞数、黒丸ＣＤ４⁺を消 耗した脾臓細胞、白丸ＣＤ８⁺を消耗した脾臓細胞。 養子移入されたＥＡＥに関連する遅延性過敏症（ＤＴＨ）反応 ＤＴＨ反 応および、経口的な寛容化に続き、活性に誘導されたＥＡＥ抑制の相関関係が見 出された（Millerら，J. Exp. Med. 174：７９１，１９９１;ミラ-他，Proc.Nat l. Acad. Sci. 89：４２１，１９９２）。養子移入されたＥＡＥ中に類似の相関 関係が存在するか否かを決定するために、ＤＴＨ反応を測定した。図４に示すよ うに、傑出したＤＴＨ反応は、養子移入されたＥＡＥに苦しむ動物中で発生し、 ＤＴＨ反応は、ＭＢＰに対して経口にて寛容化された動物由来のスプレノサイト の同時移入によって抑制された。抑制されたＤＴＨ反応は、転移に先立って、Ｃ Ｄ４⁺Ｔ細胞ではなくＣＤ８⁺の消耗によって撤廃された（耳の腫脹率 ＣＤ４⁺ 消耗 vs． ＣＤ８⁺消耗＝０．６±０．１ vs．１．８±０．２、ｐ＜０ ．０１）。 養子移入されたＥＡＥ中のＣＮＳ微細構造における、経口にて寛容化された 動物のＭＢＰ由来の細胞の同時転移の効果 ＭＢＰの経口投与は、活性に誘 導されたＥＡＥにおけるＣＮＳの炎症を抑制する（Higginsら，J. Immunol. 140 ：４４０，１９８８）。それにもかかわらず、臨床疾患を抑制するＥＡＥの免疫 特異的免疫モジユレーター治療が、すべてＣＮＳの炎症に影響を与えるわけでは ない（Offnerら，Science 251：４５０，１９９１）。図５に示されたように、 柔組織とミニンジスとのいずれにおいても、ＭＢＰ給餌の動物由来の細胞が転移 された際に炎症の減少が見られ、経口にて寛容化された動物由来の、ＣＤ８⁺を 消耗したモジュレーターひ臓細胞が転移された場合ではなく、ＣＤ４⁺を消耗し たものである場合に、このような抑制が観察された。特異グループについてのＣ ＮＳ（柔組織およびミニンジス）炎症中心の数値は、以下の通りである：コント ロール＝７６±８．２；ＭＢＰ給餌＝３．８±１．８；ＣＤ４⁺消耗＝２．８± １．０；ＣＤ８⁺消耗＝６５±４；（ｐ＜０．０１、ＭＢＰ給餌およびＣＤ４⁺消 耗 vs．コントロールあるいはＣＤ８⁺消耗） ＭＢＰのIV投与の結果としての、活性に誘導され、養子移入されたＥＡＥの 抑制 図６Ａに示されるように、ＭＢＰの（ＩＶ）静脈内注射は、ＭＢＰを用 いた経口の寛容化による抑制と類似の方法でのＭＢＰ／ＣＦＡを用いた免疫化に よって（平均最大記録＝０．５±０．２、vs．ヒストンを注射されたコントロー ル＝３．０±０．３：ｐ＜０．０１）、明らかに活性に誘導されたＥＡＥを抑制 した。しかし、養子移入されたＥＡＥに対して保護をしなかった（図２Ａ）経口 の寛容化とは対照的に、ＭＢＰのＩＶ注射は、養子移入されたＥＡＥをも抑制し た（平均最大記録＝０．４±０．２、vs．コントロール＝３．２±０．２；ｐ＜ ０．０１）（図６Ｂ）。しかし、経口の寛容化とは異なり、このような細胞が、 ＭＢＰ起脳炎性細胞系列によって同時転移される場合でも、疾患保護はＩＶ寛容 化動物由来の脾臓細胞によって養子移入され得ない（平均最大記録＝２．８±０ ．２、vs．コントロールｐ＝Ｎ．Ｓ．（図６Ｂ）。ＭＢＰペプチドの経口あるいはＩＶ投与の結果としてのＥＡＥの抑制 経口の vs．ＩＶ寛容の機構をさらに研究するため、ＭＢＰの起脳炎性および非 起脳炎性のいずれの領域をも取囲むＭＢＰペプチドを、活性に誘導された疾患に 対する免疫化に先立って経口的および静脈内に投与した。モルモットＭＢＰのＭ ＢＰペプチド７１−９０は、ルイスラットにおいて起脳炎性であった（Swanborg ら，J. Immunol. 114：１９１，１９７５）。図７に示されたように、ＩＶ寛容 化を経るＥＡＥの抑制は、モルモットＭＢＰペプチド２１−４０によってではな く、全ＭＢＰおよび起脳炎性のペプチド７１−９０によってのみ起こった。しか し、２１−４０による経口の寛容化はＥＡＥの抑制に効果的であった。全ＭＢＰ に対して経口的に寛容化されたラットのひ臓細胞からＴＧＦ−βを遊離すると実 験で証明されたことから、モルモットペプチド２１−４０が選択された。Miller ，A．ら，FASEB 6：１６８６，１９９２。コントロールのモルモットＭＢＰペプ チド１３１−１５０は、投与された際、経口でも静脈内でも抑制しなかった。記 録では、ＩＶ経路を経る抑制に加えて、経口で与えられた際には起脳炎性ＭＢＰ ペプチド７１−９０もまた抑制する。この結果は、与えられたＭＢＰの、与えら れた宿主に対する免疫優性領域から誘導されたペプチドは、経口的あるいは静脈 内投与された際にＴ-細胞機能を抑制し得るが、投与の経路およびプロトコール によって異なる機構によって行なうべきである。これらの実験の結果は、経口的 と非経口的（例えば静脈内の）なＭＢＰ投与との間には、ＥＡの抑制機構に根本 的な相違があることを示している。結果は、経口投与された抗原が、活性抑制の 世代を経て優勢に作用し、これに反して非経口投与された抗原は、クローンアネ ルキーを経て作用ことを示唆している。具体的にこの結論を支持するのは、ＩＶ 寛容化された動物由来の脾臓細胞が、養子移入されたＥＡＥを抑制できないこと である。加えて、投与の経路が別々な抑制において、別々のＭＢＰのフラグメン トが多かれ少なかれ効果的であった（例えば、図７参照）。本発見は、本発明の 方法のように抗原制御寛容に基づく免疫抑制法の計画において利用することがで きる。実施例 ３： ＭＢＰ特異的Ｔ-細胞クローンを刺激する重複ペプチドの能力を 評価することによる、ヒトにおけるヒトＭＢＰの免疫支配的なエピトープの決定 のファインチュ−ニング 上記の実施例１で示された細胞増殖活性測定を用いて、ヒトＭＢＰ（すなわち 、アミノ酸８４−１０２の配列）の免疫優性領域を有するペプチドにおけるＴ- 細胞の増殖を刺激する能力を評価し、免疫優性領域のＮ末端とＣ末端が少しずつ 進んで切断されたアミノ酸配列を有する一連のペプチドの能力と比較した。図８ に示すように、（および以下の表５に示すように）試験されたＴ-細胞の系列は 、アミノ酸８５位までＮ末端が切断されたものを用いたときに増殖し、その後、 増殖を活性化する断片の能力において急激な減少があった。 少しずつ進んだＣ末端の切断は速く急激に刺激能力に影響を与え、そこでは、 わずか９９残基までの切断のみが、エピトープの機能に実質的な影響を与えない 。Ｃ末端の切断がない場台、図８に示すように、アミノ酸８５および８６の欠如 もまた、試験されたクローンによって寛容されると思われる。図９において、異 なるペプチドが異なるクローンの増殖に差異を生じるかどうか調べるために、４ つの異なるＴ-細胞のクローンが、全体のＭＢＰ８４−１０２ペプチドと、８５ −９９および８６−９７のペプチドとにさらされた。各々のクローンは、本来、 エピトピックペプチドの存在下で増殖するための異なる能力を持っているが、そ れにもかかわらず、クローンに増殖を引き起こす特有のペプチドの能力は、質的 にはどのクローンでも似通っていた。これらの研究から、アミノ酸８５−９９の 断片は、全てのＴ-細胞クローンにとって、Ｔ-細胞の活性を刺激することができ る最小の免疫支配的な断片を成すと思われる。 以下の表５は、ＭＢＰ（８４−１０２）ペプチド、およびこのペプチドの切断 または修飾されたものの存在下で、ヒトＭＢＰ（８４−１０２）特異的Ｔ-細胞 クローンが増殖するための能力を示している。表中における数字は、Ｔ-細胞ク ローンの最高刺激の５０％を与えるペプチドの濃度（マイクロモルで表示）であ る。Ｔ-細胞クローンの最高刺激は、修飾および切断されていないＭＢＰ（８４ １０２）ペプチドにさらして評価されたものである。太字は、“５０”および“ ＞５０”が、修飾および切断されていないＭＢＰ（８４−１０２）ペプチドと比 較して、刺激による活性が５倍または５倍以上低下したことを意味することを示 している。 最高刺激（参照点：ＭＢＰ（８４−１０２）ペプチド）の５０％を与えるペプ チドの濃度（μＭ）が与えられている。 ＭＢＰ（８４−１０２）ペプチドと比 較して活性における５倍以上の低下。実施例 ４： ＭＢＰ ８５−９９に反応するＴ細胞クローンのアラニンアナロ グペプチドのＴ細胞認識 図１１は、各々のペプチドの、ＭＨＣ（左の列）およびＴ細胞クローン（右の パネル）への結合を示している。ＤＲＢ１*１５０１が導入されたＬ細胞が、オ ートリアクティブ（autoreactive）Ｔ-細胞に、免疫支配的なＭＢＰ（８４−１ ０２）ペプチドを与える。 ＡＰＣは、Ｂ細胞株に対してＭＰＢ（８４−１０２）ペプチド（１００μg／ ｍｌ）で、ＤＲ導入体に対して５０μｇ／ｍｌを用いてパルスされ、5000radで 放射線を照射し、３日間Ｔ-細胞クローンとともに培養し、さらにチミジンパル スを行った。 その結果（固有のペプチドと比較した３Ｈ−チミジンの取り込み(uptake)）は 、黒い長方形（最高刺激の９０％）、斜線付きの灰色（＞最高刺激の５０％）、 明るい灰色（＞最高刺激の１０％）、および白（活性なし）で表されている。そ の結果は、８９８位のＶａｌと９２位のＰｈｅとが、ＭＨＣの結合に関与するこ とを示している。切断されたペプチドのデータは、９５位のイソロイシンもまた ＭＨＣの結合に関与することを示唆する。Ｔ-細胞受容体の接合部は、９０位の Ｈｉｓ、９１位のＰｈｅ、および９３位のＬｙｓが含まれている。 Ｔ細胞クローンＨｙ．２Ｅ１１は、９３位のＬｙｓの位置にＡｒｇを置換する ことに対して寛容であるが、Ｏｂ Ｔ細胞クローンはそうではない。 ＤＲＢ１ １５０１とＤＲＢ５ ０１０１とに対して提案された結合配列が、 図１０に示されている。 上向きの矢印はＤＲ受容体への結合を示し、下向きの矢印はＡＣＰのＭＨＣへ の結合を示している。 一連のアナログペプチドは、使用される８８−９５位で、保守的および反保守 的なアミノ酸の置換体に合成される。 たとえは、マイナス電荷を有するアスパラギン酸は、他のマイナス電荷を有す る残基（グルトミックアシッド(glutomic acid)）で置換され、あるアミノ酸は 電荷を持たない同じ体積のもの（アスパラギニン(asparginine)）で、あるアミ ノ酸は逆の電荷を有するもの（Ｌｙｓ）で、そして最後にａｌａのような小さい アミノ酸で置換されたものである。直前には、６０のペプチドが合成される必要 がある。 予備のデータは、ＭＢＰの１４８−１６２領域が、支配的なエピトープ１４３ −１６８に対する最小のエピトープであることを示唆している。このぺプチドの 中核の領域が、実施例２および３で概説された方法、ＭＢＰペプチド８５−９９ に対するこの実施例４で概説されたものと類似する解析を使用して決定される。 アナログペプチドは、ＤＲ２６-（ＤＲＢ１ １５０１）、ＤＲ２ａ−（ＤＲ Ｂ５ ０１０１）、ＤＲ４、ＤＲ７、およびＤＱ１．１の結合に対して解析され る 。この解析は、どのアミノ酸残基がＭＨＣの結合に関与するか、さらに深く解明 するものである。自然のペプチドの１０倍ほどの結合能を有するアナログペプチ ドは、Ｔ-細胞レセプターの特異性を調べるために使用される。実施例 ５：方法 ＭＢＰは、（Chou,F.C.-H.et al J. Biol. Chem. 251: 2671, 1976）に示され ている通り、ヒトの脳組織から抽出され、最大の分子量のピーク（１８ｋＤ）を 用いたＣＭ−５２カラムで精製された。ＭＢＰペプチドは、固相法で合成され、 商業的研究所（Biosearch Lab Inc.,San Raphael, CA）から得て、高圧液体クロ マトグラフィーによって精製された。使用されたＭＢＰペプチド断片は、以下の 表６に示されている。 Ｔ細胞受容体ＴＣＲ ＶＢ遺伝子のユーセイジは、ＴＣＲ ＶＢプライマーの パネルを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、それに続くササンブロッティング によって決定された。Ｔ-細胞株は、ＭＢＰを用いた二次刺激によって末梢の血 液の単核細胞から確立され、次いで免疫支配的なヒトＭＢＰペプチド（アミノ酸 残基８４−１０２）で刺激され、その免疫支配性は、１３の重複するＭＢＰペプ チドの表６のパネルを使用して、（実施例６に示すような）増殖活性の測定によ って決定された。それらの特定のＭＢＰペプチドを用いた三次刺激に続いて、Ｒ Ｎ Ａが、ＭＢＰ反応性Ｔ-細胞培養ペレット（20、000-50,000個体の細胞）から、グ アニジウム-イソチオシアネート／フエノール-クロロホルムを用いた抽出、およ びキャリア−ｔＲＮＡの存在下でイソプロパノール沈降により抽出された。一本 鎖ｃＤＮＡは、オリゴｄＴとＡＭＶ逆転写酵素（双方ともBathesda Research La boratories, Gaithersburg,MDから商業的に入手）とを用いて合成された。ＰＣ Ｒ（1989年１月２４日に発行された米国特許第4,800,159号；1987年７月２８日 に発行された第4,683195号：および1987年７月２８日に発行された第4,683202号 に開示された複製連鎖反応）増幅は、ＴＣＲ Ｂ鎖のＣＤＲ２領域およびＣＢ（ Ｂ鎖の不変領域）プライマー（表７）に一致する１９のオリゴヌクレオチドのパ ネル（公表されたＴＣＲ ＶＢファミリー --ＶＢ１-２０、表７に対して特異的 な）を用いて行われた（以下に示されているものに従っている、Tilinghast,J.P .ら， Science 223: 879, 1986； Concannon,P.ら， Proc.Natl.Acad. Sci.83 ： 6598, 1986; Kimura,ら，J. Exp. Med. 164: 739, 1986; Toyonaga, B.ら， Proc. Natl. Acad. Sci. 82： 8624，1985； Kimura,N.ら，Eur.J. Immunol.17： 375,1987）。増幅は、５０μｌの反応に各々のプライマ−１μｇを用いて、３０ サイクル（９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分）行った。増幅産物は、 １％アガロースゲルで分離し、ニトロセルロースに転写し、内部のオリゴヌクレ オチドＴＣＲ−ＣＢプローブでサザンブロットを行った（表７）。プローブは、³² ＰガンマＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Bethesda Research Labs） とを用いて、その比活性が１０⁸cpm/ugになるように標識し、６ｘＳＳＣ／５ｘD enhardt's／０．０５％ピロリン酸／１００ug/mlの変性したＤＮＡ／０．５％Ｓ ＤＳに１８時間３７℃の条件下でハイブリッド形成した。ブロット（blots）は 、６ｘＳＳＣ／７０℃の最終的に厳重に洗浄し、２−１８時間オートラジオグラ フィーを行った。二つ以上のＶＢ断片に陽性なＴ-細胞株は、単一のＭＢＰに反 応するＴ-細胞から導かれたものではないとみなされ、解析から除外した。 配列決定に際して、ｃＤＮＡの増幅は、内部にＰｓｔ Ｉ制限部位を有するリ ーダー断片に特異なＶＢ１７プライマー（表７）を用いて行った。増幅されたＤ ＮＡは、プロテイナーゼＫで処理し、フエノール／クロロホルム抽出し、エタノ ール沈降し、制限エントヌタレアーゼ ＢｇｌIIおよびＰｓｔ Ｉ（商業的に 入手される、例えば、Bethesda Research Lab.,supraから）で切断した。ゲルで 精製したＤＮＡは、Ｍ１３ ｍｐ１８に連結し、一本鎖ＤＮＡは、ジデオキシ法 （Sanger,F.,ら，1977, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 74: 5463）によって配列決 定した。ネガティブコントロール（Negative controls）は、ＲＮＡの試料また はｃＤＮＡの合成および増幅に使用される試薬に起こり得る不純物の混入を調べ る手段に含まれる。使用したＶＢ、ＣＢ、およびＪＢ２．１プライマーの配列は 、以下の表７に示す。 増幅および増幅されていない試料は分けて扱われ、試薬は分注されて、増幅さ れた物質の存在が調べられ、ネガティブコントロールは異なる実験段階（ＲＮＡ の単離、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ増幅）として含まれた。 実施例 ６：ＭＳ患者から単離されたＴ-細胞のＶＢ遺伝子の同定 上述の言及の妥当性を調べるために、二種類の実験が行われた。第一に、ＶＢ ２０を除く表７の全てのプライマーが、末梢血液のＴ-細胞からのｃＤＮＡを増 幅することができた（図１２）。第二に、ＰＣＲ増幅の特異性が、マイトジエン （例えば、フィトヘマグルチニン--“ＰＨＡ”--およびインターロイキン-２） を用いた単一細胞のクローニングによって前もって確立された６９の独立したＴ -細胞クローンにおけるＶＢ遺伝子のユーセイジの解析により調べられた。得ら れた高度のクロ−ニング効果のために、これらのクローンは、末梢血液のＴ-細 胞の間でＶＢ遺伝子のユーセイジの典型的な解析を与えた。これらのＴ-細胞ク ローンの６５／６９（９４．２％）が、ＴＣＲ ＶＢのレパートリーのかなりの 割合がＶＢプライマーによって覆われていることを示していると、ＴＣＲ ＶＢ 遺伝子ユーセイジは決定され得る。これらのうち５８のクローン（８４％）が、 単独のＶＢに陽性であり、７つのクローン（１０．１％）が、おそらく二つの転 移および発現されたＴＣＲ ＶＢ遺伝子の存在のために重複した陽性を示した。 ＴＣＲ ＶＢ遺伝子のユーセイジは、さらに、臨床的に再発性レミティングＭ Ｓと診断された５人の患者から確立された６５のＭＢＰ特異的Ｔ細胞株で解析さ れた。ＭＢＰ反応性Ｔ-細胞株からの典型的なサザンブロットが図１２に示され 、解析された全ての細胞株に対するＶＢ遺伝子のユーセイジが以下の表８に示さ れている。 これらのうち５１の株は、ＭＢＰ残基８４−１０２と反応し、一方１４のＴ- 細胞株がＭＢＰ残基１４３−１６８に特異的であった。ＭＢＰアミノ酸残基８４ −１０２と反応する３１のＭＢＰ Ｔ-細胞株が、ＭＳ患者Ｈｙ（患者１、表８ ）から解析された。これらのうち２３のＴ-細胞株（７４％）は、ＶＢ１７遺伝 子断片を使用することが明らかになり、一方で、他の８つの細胞株はＶＢ２、Ｖ Ｂ７、もしくはＶＢ１４遺伝子断片によって制限された。これらの結果は、ＶＢ Ｉ７が、ＭＢＰ残基８４−１０２と反応するこのＭＳ患者のＴ-細胞株における 一 般的な認識要素であることを支持している。ＶＢ１７のユーセイジは、他の ４人の患者（患者２−５、表８）から調べられた６／２０Ｔ-細胞株の間でもま た発見された。これらの４人の患者の間のＴ-細胞株によって使用された第二の ＴＣＲ ＶＢは、ＭＢＰ残基８４−１０２と反応する７／２０Ｔ-細胞株に見ら れたＶＢ１２であった（表８、図１２）。このＶＢは、マウスやラットで起脳炎 Ｔ-細胞の間で使用される支配的なＴＣＲであるマウスＶＢ８．２に、たまたま 相同性 がある（Burns, F.R. et al., J. EXP.Med. 169: 27,1989）。 ＭＳ患者Ｃｙは、ＤＲ２およびＤＲｗ１１抗原の両方を提示し、そのため、免 疫支配的なＭＢＰ領域（８４−１０２残基）またはＭＢＰ１４３−１６８残基を 認識するＴ-細胞を有していた。このことは、異なるＭＢＰ決定因子と反応する Ｔ-細胞の間で、ＴＣＲ ＶＢのユーセイジを比較するための機会を与えた（図 １２）。ＭＢＰ残基８４−１０２に対して増殖する７つの株のうち、３つはＶＢ １２を発現し、一つはＶＢ１７を発現した（表８）。対照的に、ＭＢＰ残基１４ ３−１６８を認識する６／９Ｔ-細胞株は、ＶＢ１４を使用し、たった一つの株 のみがＴＣＲ ＶＢ１２とＶＢ１７ＴＣＲ遺伝子を使用した（表８）。ＭＢＰ残 基８４−１０２（ＶＢ１２：Ｃｙ．２Ｃ２、Ｃｙ．３Ｆ６）またはＭＢＰ残基１ ４３−１６８（ＶＢ１４：Ｃｙ．１Ｅ６、Ｃｙ．２Ｂ１２、Ｃｙ．２Ｅ２）と反 応する５つのＴ-細胞株のサザンブロット解析は、図１２に示されている。 ＶＢ１２／ＶＢ１３は、定量的なＰＣＲによる算定によれば、正常な末梢血液 Ｔ-細胞の間で相対的に共通であり（約１８％）、ＶＢ１７はかなり少ない頻度 （約３％）である。これと対照的に、ＶＢ１７は、ＭＢＰ残基８４−１０２に反 応するＴ-細胞株の３４／６３（５３．９％）に見られ、一方、それは、正常な 個体の単一細胞のクロ−ニングによって得られた、不規則なマイトジェンによっ て引き起こされたＴ-細胞クローンにおけるＴＣＲ ＶＢ遺伝子の３／３２（９ ．４％）に現れるだけであった（Moretta,A.ら，J. Epp. Med. 157: 743,1983; Hafler,D.A.ら， J. Exp. Med. 167: 1313, 1988）。これらのデータは、ＶＢ１ ７ ＴＣＲが、免疫優性ＭＢＰ８４−１０２領域の認識に選択的に関与すること を示している。 ＰＣＲによって同定されたＴＣＲ遺伝子断片が、ＭＢＰぺプチドの認識に使用 されるＶＢをコードする遺伝子であることを示すために、二つのＶＢ１７陽性Ｔ -細胞株（Ｈｙ．２Ｈ９とＨｙ．２Ｇ５）が限界希釈法によってクローンされた （Moretta, supra.）。ＭＢＰおよびＭＢＰ残基８４−１０２の両方に反応する 、これら二つの細胞株から確立された１１／１１の個々のクローンは、ＶＢ１７ ＋であった。これらのクローンの３つは、ＶＢプライマーの完全なパネルを用い てさらに解析され、他のＶＢ断片には全てが陰性であることがわかった。 患者Ｈｙから得られた４つのＴ-細胞株のＶＢ配列は、公開されたＶＢ１７配 列に１００％相同するものであることがわかった（Kimura, N.ら，Eur.J. Immun ol.17 :375,1987に明かされた）。この配列解析は、特異的なＶＢ断片が確かにこ のアプローチを使用して増幅されることを確証する。ＶＤＪ（多様的結合(diver sity-junctional)）配列の解析は、これらの４つ全てのＴ-細胞が同じ結合ＪＢ ２．１断片を使用し、それらの３／４が同じＶＤＪ配列を有することを示した（ 表７）。どのくらいの頻度でＪＢ２．１遺伝子断片がＶＢ１７＋Ｔ細胞に使用さ れるかを決定するために、ＭＳ患者Ｈｙから得られた２０細胞株のＤＮＡが、Ｃ ＢプライマーまたはＪＢ２．１プライマーと組み合わせたＶＢ１７プライマー結 合体を用いて増幅した（図１３）。これらの株の全ては、ＪＢ２．１遺伝子断片 はもちろんＶＢ１７にも陽性であることがわかった。一方、陰性コントロール（ 全ての細胞株から抽出され、ｃＤＮＡに変換されていないＲＮＡ、および、ｃＤ ＮＡの合成と増幅とに使用された試薬）は、ＰＣＲおよびサザンブロッティング によって陰性であった。これらのデータは、患者Ｈｙから得られた、ＭＢＰ残基 ８４−１０２反応性Ｔ-細胞株における、ＶＢ１７−ＪＢ２．１配列因子に対す る強力な選択性を示している。 ＰＣＲ解析によって同定されたＶＢ１７ ＴＣＲを使用し、かつ、ＭＳ患者Ｆ ｎおよびＮｓから得られたＭＢＰ残基８４−１０２を認識する他の二つのＴ-細 胞株が、配列決定され、ＭＳ患者Ｈｙから得られたＴＣＲ ＶＢの配列と比較さ れた（表８）。ＶＢ１７遺伝子断片配列は、３人の患者から得られたＭＢＰ残基 ８４−１０２に反応するＴ-細胞の間で同様であるが、異なるＪＢ配列因子が発 見された。３つの結果は、異なる個体間で免疫支配的なＭＢＰぺプチドを認識す るＴ細胞における共有されたＶＢ遺伝子ユーセイジを示している。これとは対照 的に、共有されたＪＢ遺伝子断片ユーセイジは、異なる個体間からではなく、同 一の個体から得られたＴ-細胞の間で見つかった。 研究した５人の患者のうちの４人が、病気と関係のあるＤＲ２対立遺伝子に陽 性であったが、患者ＴｗはＨＬＡ-ＤＲ３、ＤＲ４であった。それにも係わらず 、３つのＶＢ１２／ＶＢ１７制限された細胞株は、このＭＳ患者から解析された ４つの株の間に存在し（表８）、共有されたＭＨＣクラスII抗原が、ＭＢＰペプ チ ド８４−１０２を認識することに関して、共有されたＴＣＲ ＶＢ遺伝子ユーセ イジに対して命令とならない可能性があることを示している。実施例 ７： ヒトＭＢＰの主要な免疫支配的領域の同定 急速なＴ-細胞クロ−ニング技術は、クラスIIＭＨＣ表現型と反応するヒトＭ ＢＰにおける免疫支配的エピトープ、および、そのような反応の頻度があるかど うかを確かめるために使用された。１５、８２４の短期培養されたＴ-細胞株の 全体が、精製されたＭＢＰ（上述の実施例５に示すようにして得られた）を用い た末梢血液単核細胞（ＰＭＮ）の培養、および３日後、そしてさらに３−４日ご とにインターロイキン-２（ＩＬ−２）とインターロイキン-４（ＩＬ−４）（Ge nzyme,Boston,MA）を添加することによって、５１の被験者からもたらされた。 培養の１３日に、個々の株の一定量でＭＢＰに対する反応について調べた。ＭＢ Ｐに反応する株は、さらに、上記表６に示されたようなヒトＭＢＰ配列を含む重 複するオリゴペプチド２０マーに対する反応性を調べた。ＭＨＣの制限の実験の ために、ＭＢＰペプチドと反応する株は、最初はＭＢＰによって、次はその株に よって認識される特異的なＭＢＰ断片によって、２回以上のサイクルで刺激した 。患者のサブグループにおいて、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、他の主 要な起脳炎中枢神経系抗原、を認識するＴ-細胞の頻度を調べた。 ＭＢＰおよびＰＬＰの頻度の解析が、他の神経的な疾患を有する被験者および 正常な被験者（全ての年齢および性別はＭＳ患者に対応したものである）はもち ろん、明確な再発性レミティングＭＳ（磁気共鳴像--“ＭＲＩ”--および臨床試 験によって診断された）を保有する患者で実施した。この結果を以下の表８Ａに 示す。 ＭＳを有する患者は、白人で、過去２４ケ月以内に少なくとも２度の悪化症状 があり、よく特徴付られた再発性レミティング症状を有し、磁気共鳴像（ＭＲＩ ）で採血する際の積極的な傷を有していた。他の中枢神経系疾患を有する患者は 、次の症状を有していた：セレブロバスキュラー アクシデント（cerebrovascu lar accident）［４］またはＣＮＳヘモルヘイジ（hemorrhage）を伴った脳トラ ウマ（trauma）［４］から１−３週間後;メタスタティック（metastatic）脳腫 瘍［２］。ＭＢＰまたはＰＬＰと反応するＴ-細胞株の総数、およびもたらされ たＴ-細胞株の総数は、表８Ａに示されている（“Ａｇ”は“抗原”を意味する ）。加えて、ＭＢＰ−およびＰＬＰ-反応性株の頻度が、もたらされた株の総数 に対してＭＢＰ反応性株の数を分けることにより、個々の被験者ことに個別に算 定され、中間値±ＳＥＭが与えられた。 ＭＢＰ反応性株の頻度は、他の患者と比較して、ＭＳを有する患者でわずかに 高くなっているが、このことは統計的に重要ではない。他の神経的な疾患を有す る患者と比較して、ＭＳを有する患者ではＰＬＰに対してより反応性が高かった が、このこともまた統計的に重要であるほどのものではない。 発展させられ、繰り返し行われた解析でＭＢＰと反応することが確信された、 ＭＳを有する患者から得られた総数３０２の細胞株のうち、１４０（４６．４％ ）がＭＢＰ残基８４−１０２に反応した。対照の組では、総数１００のＭＢＰ反 応性Ｔ-細胞株の１１（１１．０％）が、このＭＢＰぺプチドを認識した。個々 の被験者に対する、各々のＭＢＰペプチドと反応する末梢血液から得られたＴ- 細胞の実際の頻度が算定された。ＭＳを有する患者および対照の被験者の平均値 が、表８Ａの右から２番目の列に示されている。 50,000のＴ-細胞株は、50,000のＸ線照射されたＡＰＣ、ＭＮＣ（単核細胞）（ Hafler,D.A.ら，J. Exp. Med.167:1313, 1988）とともに３通に、９６ウェルの ミクロタイタープレートの丸い底に７２時間の間入れ、培養の最後の１８時間に ウエルを［³Ｈ］-チミジンでパルスした。ＡＰＣ ＭＮＣは、単独で培養、また は、合成ＭＢＰぺプチド８４−１０２の１００μｇ／ｍｌ （増殖を促進するペ プチドの最適の濃度であることが決定された）とともにパルス、または、１００ μｇ／ｍｌのＭＢＰとともにパルスした。３通のウェルに対する係数効率（coun ts per minute）（ＣＰＭ）の平均値を表９に示す。ＤＲおよびＤＱｗハプロタ イプが与えられ、ＤＲ２、ＤＲ７、ＤＱｗ１、ＤＱｗ３に陽性である患者（最上 の行）に共通のハプロタイプには、下線を付した。 抗原提供細胞（ＡＰＣ）として、異なる単核細胞（ＭＮＣ）のパネルを使用す るＴ-細胞株の増殖が示されている。被験者Ｈｙから得られたＭＢＰアミノ酸残 基８４−１０２に反応する５つのＴ-細胞株が、オートロガスＸ線照射されたＭ ＮＣを用いた刺激の周期的な繰り返しによって発育せられ、合成ＭＢＰペプチド ８４−１０２でパルスし、ＭＢＰのこの領域の認識に対する調査を行った。 これらの研究のために、ＭＢＰ残基８４−１０２と反応する５つのＴ-細胞株 のパネルが、オートオートロガス（autoautologous）ＡＰＣ ＭＮＣとともに、 上述のように、異なるＭＨＣクラスII遺伝子の産物を認識するモノクローナル抗 体（ｍＡｂｓ）（1:100の終濃度）の存在下でまかれた。（抗体に使用されてい る専門語は、Tenth International Histocompatibility Workshop;それらの特 異性もまた与えられている。）結果は、以下の表１０に示されている。 正常な被験者と他の神経的な疾患のある対照とから得られたペプチド特異的細 胞株の頻度は、ほとんど同一であり、従って解析に組み台わせられた。ＭＢＰ残 基８４−１０２に選択的に反応するＭＳを有する被験者から得られたＴ−細胞株 の頻度の平均は、対照と比較してより高いものであった（図１）。ＭＢＰ残基６ １−８２および１２４−１４２に対する反応において、かなり著しい増加は、Ｍ Ｓ患者においても観察されたが、一方で、ＭＳと対照の被験者の両方が、ＭＢＰ 残基１４３−１６８と反応するＴ−細胞株の高度な頻度を示した。ＤＲ２、ＤＱ ｗ１ハプロタイプは、対照の被験者では非常に稀で、ＭＳを有する患者ではより 共通性がある（表９）。ＤＲ２の表現型と、ＭＢＰ残基８４−１０２に反応する Ｔ−細胞株の割台または頻度の双方との間の結台が観察された（図１４）。 ＭＢＰ残基８４−１０２に対するＴ−細胞の反応性は、ＭＳを有していない被 験者におけるＤＲ２、ＤＱｗ１の発現と関連するかどうかを決定するため、ＤＲ ２、ＤＱｗ１の表現型を有する付加的な６人の正常な被験者を調査した。この結 果を図１４に示す。 ＭＢＰ残基８４−１０２と反応するＴ−細胞株の割台の見地から、ＤＲ２の結 合もまた、対照の間で観察されたが（ＤＲ２＋ 対照、３１．０±１０−．８％ ；ＤＲ２−、１０．１±０．４％）、ＭＢＰのこの領域と反応する株の全体の頻 度は、ＭＳを有する患者のものより少なかった（図１４）。ＤＱｗ１は、ＤＲ１ およびＤＱｗ１０とはもちろん、ＤＲ２と結合が解離した状態にあるが、ぺプチ トとの反応における個々の解析では、ＤＱｗ１表現型との結台は全く示されなか った。 ＤＲｗ１１表現型は、ＭＳを有する被験者より、対照においてより一層共通性 がある（表８Ａ）。ＤＲｗ１１は、ＭＢＰ残基８４−１０２と反応する株の頻度 とではなく、ＭＳを有する患者および対照におけるＭＢＰ残基１４２−１６８に 反応する株の頻度と積極的に結合される（図１３）。ＭＢＰ残基３１−５０に対 する反応、対照の被験者で予め観察されていたこと、は、ＤＲｗ１１と関連付ら れた。他のＭＨＣの結台は観察されなかった。 免疫優性ＭＢＰエピトープと反応するＴ−細胞株の残基に結台するＭＨＣを決 定された。その結果は、以下に表１０に示されている。より明確に、ＭＨＣハプ ロタイプが、免疫優性エビトープと反応するＴ−細胞系内の抗原を提供するため に使用されるかどうかを決定した。 ＭＢＰ残基８４〜１０２と反応する５つのＴ細胞系のモノクローナル抗体阻止 の研究は、ＤＲ分子およびＤＱ分子の両方が制限要素として作用しうることを示 唆した。抗ＤＲ ｍＡｂによって阻止されたクローンの中で、クローン２Ｅ１１ は、ＭＢＰ残基８４〜１０２に反応して、ＤＲ２＋ ＡＰＣのパネルで増殖し、 一方、２Ｃ９および２Ｈ９は、自己由来のＡＰＣでのみ増殖した（表１０）。ク ローン１Ａ８および３Ａ１０によるぺプチドの認定は、これらのクローンは抗Ｄ Ｑ ｍＡｂによって部分的に阻止されており、ＤＱｗ１を発現する２つのＡＰＣ 供与体患者のうちのいずれか１つおよび反応体からのＡＰＣに制限された。 ＭＨＣ発現と、免疫優性ＭＢＰエビトープに対するＴ−細胞反応の頻度との関 係をさらに調査するために、ＤＲ２およびＤＲｗ１１表現型の両方を発現する症 状に苦しむ同胞種を有するフアミリーが研究された。 ＤＲ２、ＤＱｗ１；ＤＱｗ１１、ＤＲｗ５２、ＤＱｗ１クラス１１ ＭＨＣ ハプロタイプを発現するＭＳ患者のファミリーメンバーを、ＭＢＰ残基８４〜１ ０２および１４３〜１６８と反応するＴ−細胞の頻度について試験した。 １，７２８個体のＴ−細胞株の総計は、両方の親および４つの同胞種から生じ 、ＭＢＰぺプチド８４〜１０２または１４３〜１６８のいずれかと反応する株（ lines）の数を定量した。 ２８８ウェル（９６ウェル丸底プレート３枚）それぞれの中の２×１０⁵ＭＮ Ｃを、それぞれの試料について上記で概説したように、ＭＢＰ（１０μｇ／ｍｌ ）とともに培養した。１６日目、それぞれのＴ−細胞株を、ＭＢＰ残基８４〜１ ０２および１４３〜１６８に相当する合成ペプチドとの反応性について分析した 。試料毎に生じた、それそれのぺプチド（作用インデックス ＳＩ＞３、デルタ ＣＰＭ＞５００）と反応する株の数を示す。実際の作用インチックスは、およそ ＞２０であった。Ｐ１およびＰ２＝両親；Ｓ１〜Ｓ３＝同胞種である。結果を下 記の表１１に示す。 ＤＲ２＋、ＤＲｗ１１＋患者は、ＭＢＰ残基８４〜１０２および１４３〜１６ ８の両方と反応するＴ−細胞株の頻度が高かった。ＤＲｗ１１＋親は、選択的に ＭＢＰ残基１４３〜１６８を認識し、一方ＤＲ２＋親は選択的にＭＢＰ残基８４ 〜１０２を認識した。しかしながら、ＭＢＰぺプチド反応性株の頻度は、患者の それよりも低いものであった。１つの同胞種はＤＲ２＋であり、選択的にＭＢＰ 残基８４〜１０２を認識した。ＤＲ４、ＤＱｗ３／ＤＲｗ６、ＤＱｗ１を有する 、２つのＨＬＡ同一同胞種のうち、１つはＭＢＰぺプチド８４〜１０２に反応し たのに対して、他方は反応しなかった。ＤＱｗ１はＭＢＰ残基８４〜１０２の認 識を制限しうるが、引き継がれたＴＣＲ多型性のような他のファクターは、ＤＲ ４、ＤＱｗ３／ＤＲｗ６、ＤＱｗ１同胞種の１つにおける、ＭＢＰ自己抗原に対 するＴ−細胞反応性に影響しうる。このファミリー連鎖分析によって、免疫優性 ＭＢＰエビトープの最適な認識は、ＭＳを有する患者においても、またその対照 においても、特異的なクラスＩＩＭＨＣ対立因子を要求することが示唆された。 全体的に、これらの研究は、ＤＲ２を発現する対照試料が、ＤＲ２＋ ＭＳ患者 と比べて同じＭＢＰ決定基を選択的に認識するようにみえるが、それらの血液中 における頻度は、ＭＳを有する患者のそれに比べて少ないことを示している。実施例 ７Ａ： ＶＢ１７ ＴＣＲの配列決定 ６つのクローン化されたＴ−細胞株からの、Ｔ−細胞レセプタ− ＶＢ１７＋ ＰＣＲ生成物は、上述のようにジデオキシ法によって配列決定し、実施例５で、 ＭＢＰ残基８４〜１０２（患者Ｈｙ、Ｆｒ、およびＮｓ）と反応した。ＤＮＡを 、上記実施例５に記載したように、ＶＢ１７リーダー配列およびＴＣＲ ＣＢ領 域について、ＰＣＲプライマーを用いて増幅した。その増幅されたＤＮＡを、Ｍ １３にクローン化し、周知のジデオキシ法（Ｔ−細胞株毎に、３ Ｍ１３ プラ ーク）を用いて配列決定した。その結果を、下記表１２に示す。 上記において、ＭＳ患者Ｈｙから樹立された４つのＴ−細胞株すべてのＶＢ１７ 配列は、公開されているＶＢ１７配列と１００％相同であった、ということが注 意されるべきである。 以下は、アミノ酸に対する３文字コードと１文字コードの一致を示したもので ある。便宜上示す。 アスパラギン酸 （Ａｓｐ，Ｄ） グルタミン酸 （Ｇｌｕ，Ｅ） リジン （Ｌｙｓ，Ｋ） アルギニン （Ａｒｇ，Ｒ） ヒスチジン （Ｈｉｓ，Ｈ） チロシン （ＴｙΓ，Ｙ） システイン （Ｃｙｓ，Ｃ） アスパラギン （Ａｓｎ，Ｎ） グルタミン （Ｇｌｎ，Ｑ） セリン （ｓｅｒ，Ｓ） スレオニン （ＴｈΓ，Ｔ） グリシン （Ｇｌｙ，Ｇ） アラニン （Ａｌａ，Ａ） バリン （Ｖａｌ，Ｖ） ロイシン （Ｌｅｕ，Ｌ） イソロイシン （Ｉｌｅ，Ｉ） メチオニン （Ｍｅｔ，Ｍ） プロリン （ｐｒｏ，Ｐ） フエニルアラニン （ｐｈｅ，Ｆ） トリプトフアン （Ｔｒｐ，Ｗ）実施例８： 以下に示す実施例において、次の材料および方法を用いた： ＭＢＰ反応性Ｔ−細胞クローンの生成。 ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢ Ｐ）反応性Ｔ−細胞およぴクローンは前述のように生成した（５）。Ｔ−細胞ク ロ−ンはＭＢＰ８４〜１０２反応性Ｔ−細胞株から、９６ウェルＶ底マイクロタ イタープレート（Costar,Cambrige,HA）で、μｍ／ｍｌ Ｐ ＨＡ．Ｐ （Well come Diagnostics,Beckenham,UK）および１０⁵照射された異系ＰＢＭＣの存在下 、ＲＰＭＩ １６４０（Whittaker,Walkersville,MD）、１０％のプール化され たヒトのＡＢ血清（ＰＨＳ）（Biocell,Carson City,CA）、４ｍＭのグルタミン （GIBCO,Grand Island,NY）、１０ｍＭ（７）ＨＥＰＥＳ（Whittaker）、１００ μ／ｍｌのぺニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO）、５％のＩＬ−２（ヒト Tstim,Collaborative,Reseach,Bedford,MA）、および１μ／ｍｌのｒＩＬ−４ （Genetics Institute,Cambrige,MA謹呈）からなる培地で、希釈（０．３細胞／ ウェル）を限定することによって生成した。クローンを８〜１２日毎に、９６ウ エル丸底マイウロタイタープレート（Costar）内で１０⁴／ウェルの状態で、４ ０μＭパルスし、照射された自己由来の８４〜１０２ＰＢＭＣとＰＨＡ／異系Ｐ ＢＭＣとを交互に連続して用いて、再度刺激した。ここに示されている実験のた めに、Ｔ−細胞クローンを、長期間の培養からドリフトを予防するために冷凍さ れた同じアリコートによって再度刺激した。９０％ＦＣＳ／．１０％ＤＭＳ中の Ｔ−細胞を液体窒素中で凍結した。 ＭＢＰぺプチド ８４〜１０２。 ＭＢＰぺプチド８４〜１０２は、アミノ酸 配列ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰを、固相法（Bioseach Lab, Inc. ,San Raphael,CA）によって合成し、前述のようにＨＰＬＣにより精製した（５ ）。 細胞株。 前もって樹立されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株９０１０（ＤＲ２ｗ ２、ＤＱＩ）および９００９（ＤＲ２ｗ２、ＤＱ１）を、１０％ＦＣＳ完全培地 で生育し、上記のように凍結し、抗原パルスの前に直ちに解凍した。ＤＲ２ａ（ Idnd gift of R.Sekaly）で移入された、マウスの繊維芽細胞Ｌ細胞株を、ＤＭ ＥＭ（Whittaker）、１０％ＦＣＳ（Whittaker）１．６ｍＭキサンチン（SigmaB iochemicals,St.Louis,MO）、１１０μＭヒポキサンチン（Sigma）、１８μＭマ イコフェノール酸（GIBCO）選択培地中で培養し、上述のように凍結し、抗原パ ルスの前に直ちに解凍した。ＨＴ−２ ムリン ＩＬ−２依存Ｔ−細胞株（ＡＴ ＴＣ）を、５％ ＩＬ−２を有する１０％ ＦＣＳ完全培地中で生育し、最後の 食餌の後２日間のＩＬ−２バイオアッセイに用いた。 ＭＡｂｓ。 これらの研究に用いられるＭＡｂｓは、ＣＤ３特異性ＯＫＴ３ および２ＡＤ２、ＣＤ２特異性Ｔ１１１₂およびＴ１１₃（S. Schlossman謹呈） 、ＨＬＡ−ＤＲ特異性Ｌ２４３、ＨＬＡＤＱ特異性Ｓ３／４（F.Bach謹呈）、Ｈ ＬＡ−ＤＰ特異性Ｂ７／２１（N.Flomenberg謹呈）、ＣＤ２８不活性９．３（J. ledbetter謹呈）、ＣＤ４５ＲＡ不活性２Ｈ４（Schlossman）、ＣＤ４５ＲＯ特 異性ＵＣＨＬ−１（Dakopatts,Glostrup,Denmark）ＬＦＡ−３およびＬＦＡ−１ （T.Springer謹呈）、およびＣＤ２５タック（T.Waldman謹呈）を含む。 増殖検定。 Ｔ−細胞クローン（１０⁵／ウエル）を三重に塗布し、図の凡 例された適切な刺激とともに、７２時間、３７℃、湿度９０％、５％ ＣＯ₂で 、９６ウエル平底マイクロタイタープレート（Costar）中で相互培養し、培養の 最後の１８時間の間、２μＣｉ ［３Ｈ］ＴｄΓ（２ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、New England Nuclear Boston, MA）でパルスした。ＡＰＣは、Ｂ細胞またはＬ細胞を 、１０⁶細胞／ｍｌで、完全培地中、４０μＭのＭＢＰ８４〜１０２の存在下で または存在しない状態で、２時間、３７℃でパルスし、４℃のハンクス（Whitta ker）で２回洗浄した後、４℃で、５０００ｒａｄの照射を行って調製した。補 助ＡＰＣなしで、Ｔ−細胞を刺激するために、２μＭのＭＢＰぺプチド８４〜１ ０２、または１０３μ／ｍｌのｒＩＬ−２（Hoffman LaRoche,Nutley,NJ）を培 養の継続中に細胞に直接加えた。 Ｔ細胞の流体細胞計測分析。 ＭＡｂ腹水をＰＢＳ／２％ＰＨＳ中で１／１ ００に希釈した希釈液を、Ｔ−細胞を１０⁶／ｍｌ、４℃で３０分間コートする のに用いた。細胞を４℃の染色培地で２回洗浄し、１／６０ＦＩＴＣ複台やぎ抗 マウスＩｇ（Tago,Burlimgamie,CA）を用いて、３０分間、４℃で染色した。細 胞を上記のようにして２回洗浄した後、１％のホルムアルデヒド（J.T. BAker C hemical NJ）を用いて固定化した。流体細胞計測分析は、エビックス シー（Ｅ ｐｉｃｓ Ｃ）流体細胞計測（Coulter Electronics, Hialeah, FL）で行った。 Ｂ７−移入。 ５０μｇのＫｐｎＩ線形化Ｂ７−ｐＣＤＭ８構造体を、５μｇ のＰｖｕｌ線形化ＰＯＰ．Ｆとともに、Ｌ−ｔｋ−細胞、またはＤＲ２⁺ Ｌ− ｔｋ−細胞（前もってＤＲ２とともに移入された）に、ＢＲＬエレクトロポレー ターを２５ＯＶおよび１６００ｍＦにセットして用い、エレクトロポレートによ って共移入した。ＰＯＰ．Ｆプラスミドは、ＳＶ４Ｏプロモーターのコントロー ル下で、へルペス単一ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む（２３）。ＤＲ２ −Ｂ７⁺トランスフェクタントを、培地を含むヒポキサンチンーアミノプロテイ ンーチミジン（Sigma）における生育によって選択し、クローン化した。ＤＲ２⁺ Ｂ７⁺トランスフェクタントを、１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩（GIBCO）を 含む、キサンチン／ヒポキサンチン／マイコフエノール酸培地で、選択し、クロ ーン化した。クローン発現細胞表面Ｂ７を、抗−Ｂ７ ｍＡｂを用いて非直接的 な蛍光免疫検定法によって定量されるように、再クローン化した。 ［Ｃａ＋２］ｉの測定。 前記（２２）で述べたように、Ｔ細胞クローン（ ０．２〜１．０×１０⁷／ｍｌ）を、２μｇ／ｍｌのＩｎｄｏ−１（Sigma）とと もに、培養培地に、４５分間、３７℃で負荷した。Ｉｎｄｏ−負荷細胞を、培地 で１／１０に希釈し、ＦＡＣＳ分析の１分前まで４℃に保った。刺激剤ＡＰＣを 、４０μＭの８４〜１０２の存在下、あるいはこれが存在しない状態で、パルス し、２回洗浄し、培地中で、４℃で再度懸濁した。刺激されていないｌｎｄｏ− 負荷Ｔ−細胞を、刺激を加える前の３０秒間に分析した。細胞刺激剤の場台には 、刺激剤ＡＰＣ＋負荷応答体を、３０秒間分析し、それから１５００ｒ．ｐ．ｍ ．で１分間遠心分離して、細胞−細胞接触を樹立し、それから再度懸濁し、反応 について分析した。イオノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Sigma）を、Ｉｎｄ ｏ−１負荷に対する正の対照として用いた。 ノーザン分析法によるシトキンｍＲＮＡの検出。 Ｔ−細胞クローン Ｏｂ ．１Ａ１２．８（１０５／ウェル ９６ウェル丸底マイクロタイタープレート Ｉ１−２／ＩＬ−４補充培地）を、２μＭの８４〜１０２の存在下あるいは存在 しない状態で、４時間培養した。細胞を洗浄し、完全培地中、２×１０⁶／ｍｌ で、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシン、２μＭの８ ４〜１０２、または２μｍの８４〜１０２＋１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡのいずれか の存在下であるは存在しない状態で、３７℃で、４時間、再度懸濁した。全細胞 ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ Ｂ法（TM Cinnna Scientific, Friebdswood, TX）を 用いて抽出した。１０μｇの全細胞ＲＮＡを、１．２％ＳｅａＫｅｍ ＭＥ ア ガロース（FHC Bioproducts,Rockland, ME）および２．２Ｍホルムアルデヒドを 用いたホルムアルデヒドケル電気泳動によって分画した。分画の後、ＲＮＡを、 １ＯＸ ＳＳＣ溶液を用い、一晩の毛管輸送によってＮｙｔｒａｎ膜（Schleich er& Schuell, Keene, NH）にブロットした。膜を減圧オーブン内で、８０℃で２ 時間べイクした。シトキンプローブのハイブリッド形成のために、膜を０．５ｘ ＳＳＣおよび５％ＳＤＳ中で、６５℃で２時間、予備洗浄し、それから５０％ホ ルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１ｘ デンハード溶液、１０ ％デキストラン硫酸塩、および１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ（Sigma）中で 、４２℃で１〜２時間予備ハイブリッド形成した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、および γＩｆｎ（前記参照文２４に記載）のためのプローブを、ランダムプライマーラ ベリング法（Boehringer Mannheim, Mannheim, W. Germany）によつて、＞１０⁸ ｃｐｍ／μｇの特異活性に標識し、新鮮なハイブリッド形成バッフアーに加え た。ハイブリッド形成は、４２℃、２０時間で行った。フィルターを、０．２ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、１０分間、２４℃で２回洗浄し、３０秒間、５０ ℃で２回洗浄した。オートラジオグラフィーを、−７℃で、１〜５日間行った。結果 ぺプチド抗原を用いて予め刺激されたＴ−細胞は抗原に反応しない。 我々 は、ＭＢＰ反応Ｔ細胞クローンは、伝統的なＡＰＣが存在しない状態で、自己由 来のＴ細胞クローン自身のクラスIIＭＨＣ分子に、ぺブチド抗原を存在させるこ とによつて、ぺプチド抗原に反応して増殖するということを以前に示している（ ２２）。そして我々は、抗原のＴ−細胞の提示が、伝統的なＡＰＣに比べて、反 応するＴ細胞クローンにおける、異なるシグナリングを含むかどうか調べた。図 １５に示されるように、第１の増殖定量において、Ｔ−細胞クローン Ｏｂ．１ Ａ１２．８は、パルスされたＤＲ２⁺ Ｂ細胞株またはＤＲ２移入Ｌ細胞と結台 したぺプチドに比べて、培養に直接加えられたＭＢＰぺプチド８４〜１０２に対 して同様に反応した（図１５Ａ）。しかしながら、遊離のＭＢＰ８４〜１０２ぺ プチド抗原によって、もともと刺激を受けたＴ−細胞は、１週間後に定量された 際にいかなる形態であっても、抗原刺激に反応しなかった（図１５Ｂ、白丸）の に対して、第１の培養において、ぺプチドパルスされたＢ細胞あるいはＤＲ２⁺ Ｌ細胞によって刺激されたＴ−細胞は、第２の刺激に正常に反応した（図１５Ｂ 、黒記号）。第２の刺激における無反応の程度は、抗原の濃度、および第１の刺 激で引き起こされる増殖に反比例した。 我々はＭＢＰぺプチドが、２つの異なるＭＢＰぺプチドエビトープに対して反 応する２つの異なる個体からの、５つの異なるＴ−細胞クローンにおける不反応 を引き起こすことを確認した。その特異ぺプチドエビトープのみが、Ｔ−細胞の 不反応を引き起こす（データ示さず）。 相互作用細胞の添加は不反応を逆転させない。 我々は、Ｌ細胞（仮定上、 ヒトの相互作用分子を有さない）が、アネルギーを誘発しないことから、アネル ギーの誘発は、Ｔ−細胞ＡＰＣにおける相互作用シグナルの欠除よりも、負のシ グナルのせいであるとされるべきだと仮定した。しかしながら、最近、Ｌ細胞が ムリンＢ７（G.Freeman,manuscript in preparation）を発現することが見いだ され、ムリンＢ７がヒトのＴ細胞に相互作用することか示されている（２５）。 不反応の誘発における、Ｌ細胞の相互作用効果を直接テストするために、我々は ＤＲ２移入Ｌ細胞を、Ｔ−細胞クローンの培養へ、結合されていないぺプチド抗 原とともに添加した。ヒトＢ７の相互作用分子としての役割を直接テストするた めに、ヒトＢ７の遺伝子をＤＲ２⁺およびＤＲ２−Ｌ細胞へ移入した。表５に示 すように、８４〜１０２中で一週間培養されたＴ−細胞は、ヒトＢ７を発現する またはＢ７およびＤＲ２を共発現するＬ細胞がその培養に加えられた時にも、第 ２ の抗原刺激に反応しなかった。 ぺプチド抗原によって誘発される不反応が、Ｂ７以外の相互作用分子によって 逆転しうるかどうかをテストするために、我々は、抗原の存在化に適切な（９０ １０）または不適切な（９００９）ＨＬＡ−ＤＲのいずれかである、照射された Ｂ７⁺Ｂ細胞を、ＭＢＰ８４〜１０２とともにＴ−細胞クローンの培養に加えた 。 図１６は、どちらのＢ細胞株も、遊離のぺプチドに対するＴ−細胞の反応によっ て引き起こされるアネルギーの誘発を妨げることはできないということを示して いる。しかしながら、図１５に示されるように、ぺプチド抗原とともにパルスさ れ、培養の前に洗浄されたＢ細胞ライン９０１０にマッチしたＭＨＣを用いた刺 激は、Ｔ−細胞クローンの不反応を導かなかった。Ｔ細胞クローンはぺプチド抗 原へ照射を行った後の抗原反応性を失うが、ＩＬ−２への反応は未変化であり、 そのことは、不反応性が細胞の死滅に基づくものにされるべきではないことを示 唆している。 アネルギー誘発の反応速度論。 アネルギー誘発の反応速度を定量するため に、ＭＢＰ８４〜１０２ぺプチドおよびＩＬ−２に対する、第２のＴ−細胞反応 を、ぺプチドを用いた２〜１６８時間の第１の刺激の後に検定した。抗原に対す る反応における１０倍より大きい減退が、ＭＢＰ８４〜１０２ぺプチド培養の２ ４時間以内に引き起こされた。そして、その時までに、バックグラウンドの増殖 は（単独で）静止細胞のバックグラウンドに戻った。この不反応性はさらに増強 されて、４日間で、＞１００倍の反応の減退にまでなり、不反応性は実験の期間 中、すなわち７日間維持された（図１７）。 不反応性Ｔ−細胞はＣＤ３の発現へ続く。 ぺプチドアネルギー化Ｔ−細胞 クローンの不反応性は、ＣＤ３／ＴｃＲ細胞表面発現のロスに次くものでありう る。これは、ぺプチド抗原を伴う培養によって不反応性となったＴ−細胞が、ア ネルギー化されていないＴ−細胞クローンと比べて、同様のＣＤ３表面発現を有 するというケースではなかった（図８）。アネルギー化Ｔ−細胞クローンの非抗原性刺激に対する反応 アネルギー化Ｔ−細胞クローンの中でどの活性化経路が欠損しているかをさら に明確化するために、ぺプチド培養によりアネルギー化されたＴ−細胞を、細胞 表面抗原性刺激に似たまたはバイパスする試薬で処理した（図１９）。アネルギ ー化Ｔ細胞はαＣＤ３とＰＭＡまたはＣＤ２分裂促進（mitogenic）ＭＡｂｓＴ １１２とＴ１１３の組み台わせに対する反応で増殖しなかった。これに対して、 アネルギー化Ｔ細胞は、膜貫通伝達（２６）の必要性をバイパスするＰＭＡとイ オノマイシン（ionomycin）の組み合わせには通常に反応し、また別の経路によ り（２７）増殖を刺激するｒＩＬ−２にも通常に反応した。 アネルギー化Ｔ細胞は抗原性刺激後のカルシウムの放出能力が欠損している 。 以前ＭＢＰ反応性Ｔ−細胞クローンが抗原パルス化Ｔ−細胞またはＢ細胞によ り提供されたぺプチドに反応して細胞内の［ＣＡ⁺２］ｉを放出することを示し たように、ぺプチドアネルギー化Ｔ−細胞の反応能力をこのアッセイでテストし た。アネルギー化Ｔ−細胞は、αＣＤ３とクロスリンクするＴＣＲあるいはＢ細 胞で提供されたぺプチド抗原に反応して細胞内［ＣＡ⁺²］ｉを放出を著しく減少 させた（図２０）。これに対して、アネルギー化Ｔ−細胞クローンでのイオノマ イシンに対する反応は、非アネルキー化Ｔ−細胞クローンと同等であった。 アネルギー化Ｔ細胞は抗原反応においてサイトカインを生産することができ ない 。 単独で培養された、あるいは１次培養でＭＢＰぺプチド８４−１０２ で４８時間アネルギー化されたＴ−細胞クローンを、ぺプチド、ぺプチド＋ＰＭ Ａ、またはＰＭＡ＋イオノマイシンとの２次培養で刺激した。４時間後にｍＲＮ Ａを抽出し、ノザンブロッティングにより、ＩＬ−２，ＩＬ−４、とγＩＦＮの 比含量を調べた。アネルギー導入の前に、ＭＢＰ８４−１０２ぺプチドあるいは ＰＭＡ＋イオノマイシンまたはぺプチド＋ＰＭＡの組み台わせに反応して、Ｔ− 細胞クローンＯｂ．１Ａ１２．８はＩＬ−２，ＩＬ−４、およびγＩＦＮのｍＲ ＮＡを台成した。これに対してアネルギー化Ｔ−細胞タローンは、ＭＢＰ８４− １０２ぺプチド単独あるいはＰＭＡとぺプチドの組み台わせに対する反応におい て、ＩＬ−２，ＩＬ−４、とγＩＦＮのｍＲＮＡを合成できなかったが、ＰＭＡ ＋イオノマイシンの刺激に反応して大量のサイトカインｍＲＮＡを台成した（図 ２１Ａ）。ＩＬ−２ｍＲＮＡのノザン解析の結果は、ＨＴ−２細胞を用いたＩＬ −２ハイオアッセイにより確認された（図２１Ｂ）。２次刺激でぺプチド抗原で 活性化されたアネルギー化Ｔ細胞はＩＬ−２を分泌しなかったが、ＨＴ−２細胞 の増殖でみら れたように、非アネルギー化細胞はＩＬ−２を分泌した。 マクロフアージ、Ｂ細胞、樹状突起細胞のような従来のＡＰＣは構成的に、Ｍ ＨＣクラス１１を発現し、ＣＤ⁴⁺Ｔ細胞のタンパク質抗原をプロセスし、提供す ることができる（２８）。活性化後にＭＨＣクラス１１を発現するヒトＴ細胞は 、ぺプチドや分解された抗原を提供することができるが、通常”非従来的”ＡＰ Ｃとしてふるまうことを示唆している抗原全部をプロセスする（２２，２９−３ １）。 ＭＢＰ８４−１０２のＴ細胞提供は、増殖アッセイをもたらすが、ここで我々は ぺプチド抗原に刺激されたＴ細胞が抗原によってもＴｃＲ／ＣＤ３クロスリンキ ングによっても二次刺激で反応しないが、ＩＬ−２ではそうでないことを示す。 さらに長期間継続する抗原非反応性（unresponsiveness）は、非結台型ぺプチド で誘導されるが、Ｂ細胞パルス化ぺプチドやＤＲ２＋Ｌ細胞トランスフエクシヨ ン体では誘導されなかった。このことは、その非反応性は、単に、高用量寛容（ high dose tolerance）のメカニズムで示唆されたような、先の刺激の後の非反 応性抵抗性（refractory）時期によるものではないことを示唆している（９）。 我々は、この非反応性を”アネルギー”という。なせならそのＴ細胞は抗原刺激 に非反応性であるが、残りのＩＬ−２は反応性で、その用語を定義するために確 立されたオリジナルの基準であったからである（８）。 ＴｃＲ／ＣＤ３複台体を通じて２次必須共刺激シグナル（a second essential costimulator signal）なしでシグナルが伝達される、化学的に結台されたＡＰ Ｃあるいは固定化αＣＤ３ ｍＡｂにより、Ｔ細胞寛容がインビトロで誘導され ることができる（６−８）。Ｂ細胞のＢ７と活性化されたマクロフアージと相互 作用しているＴ細胞のＣＤ２８分子は、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激経路の１つ の構成成分であることを示し、Ｂ７共刺激の欠如はアネルキーを起こすかもしれ ないことを仮定する（１４−１６）。しかしなから、ＭＢＰぺプチドの自己Ｔ細 胞提供で誘導されるＴ細胞アネルキーは、共刺激の存在において起こるかもしれ ない。なせならＢ７トランスフェクション体あるいはＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の添 加は、高レベルのＢ７を発現し、非反応性の誘導を防くことができなかつたから である。さらに適当なＭＨＣと振る舞いとフリーの抗原の非存在下で非寛容性Ａ ＰＣとを有し、おそらく培養時にＴ細胞を有するぺプチドの提供のために競合す るＢ細胞は、この非反応性の誘導を克服することができない。これらの結果は、 ぺプチド抗原のＴ細胞提供によるアネルギーの誘導が肯定的共刺激の欠如という よりも、否定的シグナルであることを示唆している。これらの結果は、また、抗 原非反応性のロスを防ぐために、フリーぺプチド抗原の非存在下において、再刺 激化されるべき抗原特異的Ｔ細胞ラインとクローンの生育のための実用的な示唆 を有している。 自己抗原のＴ細胞提供により誘導されるアネルギーのメカニズムを調べた。ア ネルギー化Ｔ細胞は、ＡＰＣまたはαＣＤ３ ｍＡｂクロスリンキングに反応し て著しく［Ｃａ＋^２］ｉの放出能力を減少させた。さらにＰＭＡとイオノマイシ ンの組み台わせでの処理は、サイトキン生産とアネルギー化Ｔ細胞の増殖を回復 させ、ＰＫＣ活性化と［Ｃａ＋^２］ｉ放出後の情報伝達は正常であることを示唆 している。したがって我々のシステムの情報伝達において交互に定義されるアネ ルギー状態は、膜近接で情報伝達欠損が観察されなかったＪｅｎｋｉｎｓとＳｃ ｈｗａｒｔｚによるインヒトロクローンアネルギーに関する研究とは異なる（３ ２，３３）。抗原のＴ細胞提供により誘導されるＴ細胞アネルギーのメカニズム は、周囲に逃げる自己反応性Ｔ細胞が、ＴｃＲに反応して、［Ｃａ＋^２］を放出 できないが、ＰＭＡとイオノマイシンとの組み合わせに反応して増殖することが できるトランスジエニックマウスの研究に似ているように見える（２１）。した がって、少なくとも２つの異なる機能的に定義されたアネルギーが存在するよう である。細胞の情報伝達の経路を制御する多くの異なる分子の１つの変化により 、細胞の形質転換が起こり得るように、Ｔ細胞のアネルギーの現象は、Ｔ細胞活 性化の異なる段階に影響するいくつかの異なるメカニスムにより達成されるかも しれない。 Ｏ’Ｈｅｈｉｒと共同研究者は、ぺプチドまたは超抗原により誘導されるＴ細 胞非反応性は、ぺプチド抗原の添加１６時間後、ＣＤ２５の増加に伴い、ＣＤ３ の表面の発現の減少により特徴づけられ得ることを示した（３４，３５）。我々 はさらに、この初期時点において、緩やかなＣＤ３／ＴＣＲ発現の減少とＣＤ２ ５発現の増加を観察している。これはおそらくＴ細胞活性化によるものであろう （データは示していない）。しかしながら、我々は４日までにアネルギー化Ｔ細 胞は非アネルギー化Ｔ細胞と同等のＣＤ３の表層細胞濃度を示すことを発見した （図１８）。このことはアネルギーは単に細胞表面のＣＤ３／ＴｃＲとして説明 することができないことを示している。 末梢血液から由来するヒトＴ細胞クローンの大半でみたように（２４）、Ｔ細 胞クローンＯｂ．１Ａ１２．８は、分裂促進剤の刺激に反応して、Ｔ_H１とＴ_H２ の両方のサブセットのサイトキンを生産する能力において、Ｔ_ＨＯフエノタイプ を示すようである（３６）。アネルギー化Ｔ細胞は、ＰＭＡの有無に関わらす、 抗原刺激に対する反応として、ＩＬ−２、ＩＬ−４、またはγＩＦＮ ｍＲＮＡ または分泌された定量可能なＩＬ−２を台成することができなかったが、イオノ マイシンとＰＭＡの両方の添加は、サイトキン台成を起こす。これらの結果は、 Ｔ細胞の情報のブロックが、Ｃａ＋^２移動の前におこることを示唆する増殖とＣ Ａ＋^２フラックスデータの両方に一致する。ぺプチド抗原に反応して、Ｔ細胞に よって起こされる否定的シグナルは、これらのアネルギーＴ細胞で変化する実際 の生化学的シグナルのように、まだ定義されているところである。 免疫学上重要な問題は、活性化された自己抗原、反応性Ｔ細胞が炎症反応の間 どのように制御されているかに関するものである。以前の仕事において、我々は Ｔ細胞が高度に精製されたＭＢＰをプロセスしたり、提供することはできないが 、ぺプチド抗原と部分的に分解されたネイティブＭＢＰを提供することができる ことを示した（２２）。このことは、炎症部位（例えば脳の脱髄プラーク）で活 性化されたＴ細胞は、その部位の他のＴ細胞にＭＢＰフラグメントを提供できる かもしれないことを推察させる。ぺプチト抗原のＴ細胞提供が、クローンの非反 応性を引き起こすということは、この寛容のメカニズムが、炎症部位の自己反応 性Ｔ細胞が、破壊された自己組織へクローン拡大するのを防ぐことを発展させた かもしれないことを示唆する。分解されたタンパク質の細胞外高濃度は、自己抗 原の性質であろうが、初期の生体内現位置の（in situ）免疫反応の後の外来抗 原は、低濃度で提供され、従来のＡＰＣにプロセスまたは提供のために取り込ま れるであろう。このようにして、抗原を提供し得るが、プロセスしないＴ細胞に よる不適当な抗原の提供は、分解された自己抗原が利用される炎症部位で反応す るＴ細胞クローンを活性化せずに、アネルギーを起こす。 結論として、我々は、ぺプチド抗原でＴ細胞クローンを前処理することが抗原 非反応性をもたらすというＬａｍｂとＦｅｌｄｍａｎ（１０，１１）の初期の観 察を説明するメカニズムの証拠を提供する。アネルギーは、自己由来Ｔ細胞にぺ プチド抗原を提供することができるヒトＴ細胞で活性化されたＭＨＣクラスIIの 発現に関連づけられる。この相互作用はＴ細胞の初期刺激を引き起こすが、これ らのＴ細胞はぺプチド前処理の２４時間以内に、後の刺激に非反応性にされる。 このアネルギー化Ｔ細胞の情報伝達欠損は、膜近位である。なぜならぺプチド処 理されたＴ細胞クローンは、［Ｃａ＋^２］の放出、サイトキンの生産、抗原刺激 に対する増殖の能力を阻害されるが、ＰＭＡとイオノマイシンの処理に対して、 正常な反応を示すからである。 表１３ アネルギーはＢ７修飾細胞の存在化でおこる。Ｔ−細胞クローンＯｂ． ２Ｆ３は、５μｇ／ｍｌの８４−１０２の存在下あるいは非存在下、１０^４／ウ エルＤＲ２および／またはＢ７感染分子を発現するＬ細胞（５０００ラドで照射 ）添加または非添加で、７日間培養した。ＤＲ２の発現および非発現Ｌ細胞株は Ｂ７でトランスフエクシヨンした。平均蛍光強度はＤＲ２^＋Ｂ^＋ラインで７７， ２（マウスＩｇ−ＰＥ）と２１５．６（Ｂ７−ＰＥ）、ＤＲ２⁻Ｂ７^＋ラインで ５６．８（マウスＩｇ−ＰＥ）と１５８．６（Ｂ７−ＰＥ）であった。１次培養 の後、Ｔ−細胞を洗浄し、８４−１０２に対する増殖のアッセイをおこなった。 明細書実施例８において引用された引用文献リスト Kappler,J.W.,U.D.Staerz, J.White,及びP.C.Marrack. 1988.Self-tolerance el iminates T-cells specific for Mls-modified products of themajor histocom patibility complex.Nature, 332:35. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ， ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 ミラー，アリエール イスラエル国 ハイファ 34 750 アフ ザ シミキン ストリート 24 (72)発明者 アル‐サバー，アーマッド アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02062 ノーウッド ヴィレッジ ロード ウェスト 3403

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸配列が、 i）ヒトミエリン塩基性タンパク質（ｈＭＢＰ）のアミノ酸残基８４−１ ０２； ii）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８５−１０２； iii）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８６−１０２； iv）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８７−１０２； v）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８４−１００； vi）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８４−９９； vii）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８５−９９； viii）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８４−９８； ix）ｈＭＢＰのアミノ酸残基８６−９９； x）残基１０２がチロシンに置換されているｈＭＢＰのアミノ酸残基８４ −１０２； xi）ｈＭＢＰのアミノ酸残基１４３−１６８；及び xii）ｈＭＢＰのアミノ酸残基１４８−１６２ よりなる群から選択されるペプチド。 ２．ヒトＭＢＰの免疫優性エピトープからなり、少なくともヒトＭＢＰのアミノ 酸残基８４−１０２の配列であるアミノ酸配列のペプチド。 ３．ヒトＭＢＰの免疫優性エビトープ領域の全部または一部から本質的に構成さ れるペプチドで、ヒトＭＢＰの免疫優性エピトープを認識するヒトＴ-細胞のイ ンビトロの増殖を刺激する性質を有するペプチド。 ４．少なくともＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰの配列を必須として備 えるアミノ酸配列を有するペプチドで、ヒトＭＢＰの免疫優性エピトープを認識 するヒトＴ-細胞のインピトロの増殖を刺激する性質を有するペプチド。 ５．ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲのアミノ酸配列を必須として備えるペプチ ド。 ６．アミノ酸配列がＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＹである請求の範囲 第３項のペプチド。 ７．多発性硬化症に罹患した哺乳類またはその動物モデルで、静脈を通して上記 哺乳類のミエリン塩基性タンパク質の免疫優性エビトープを含むペプチドの投与 を含む哺乳類のミエリン塩基性タンパク質と反応するＣＤ４⁺Ｔ-細胞の免疫機能 を抑制する方法であって、上記ペプチドは、上記ミエリン塩基性タンパク質の免 疫優性エビトープ領域の全部または一部を必須として備える配列を有し、上記ペ プチドを、上記哺乳類に、上記Ｔ-細胞をアネルギー化するに十分な量投与する ことを特徴とする方法。 ８．多発性硬化症またはその哺乳類のモデルで観察されるタイプの哺乳類の自己 免疫反応を抑制する方法であって、上記哺乳類に上記哺乳類のミエリン塩基性タ ンパク質の免疫優性エビトープを含むペプチドの経口投与を含み、上記ペプチド は上記ミエリン塩基性タンパク質の免疫優性エビトープ領域の全部または一部を 必須として備える配列を有し、上記ペプチドを上記自己免疫反応を抑制するのに 十分な量投与することを特徴とする方法。 ９．経口的に十分量の請求の範囲第１項から第６項のいずれかのペプチドと、薬 理学的に許容される担体または希釈剤を含む薬剤組成物。 10．上記十分量が約１０μｇから約２０ｍｇの範囲である請求の範囲第９項の組 成物。 11．非経口的に十分量の請求の範囲第１項から第６項のいずれかのペプチドと、 薬理学的に許容される担体または希釈剤を含む薬剤組成物。 12．上記十分量が約１から約２００ｍｇの範囲である請求の範囲第１１項の組成 物。 13．上記十分量が上記ペプチドの約１から約２００ｍｇの範囲である請求の範囲 第７項の方法。 14．上記十分量が上記ペプチドの約１０μｇから約２００ｍｇの範囲である請求 の範囲第８項の方法。 15．ｈＭＢＰと反応するＣＤ４⁺ヒトＴ-細胞の増殖を阻害する方法であって、上 記細胞と阻害十分量のクレーム１−６のいずれかのペプチドとを接触させること を備える方法。