JPH08500730A - 内毒素結合タンパク質の調製のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 形質変換した宿主細胞によって適切な細胞培養培地に分泌される、内毒素結合タンパク質の単離のための方法の改良が開示されている。 その好適な態様において、本発明は、殺菌性／浸透性促進タンパク質やリポ多糖類結合タンパク質のような、組換内毒素結合タンパク質の収率を向上するための手段として、カチオン交換物質の培地への添加を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 『内毒素結合タンパク質の調製のための方法』 本願出願は、1992年５月19日に出願された米国特許出願No．07/885,501の一部 継続出願である。発明の分野 本発明は、一般に、組換法による内毒素結合タンパク質の調製のための改善さ れた手順に関し、具体的には、発酵槽での培養を含む培養において遺伝子的に形 質転換した宿主細胞を用いた、殺菌性／浸透性促進（BPI）タンパク質、リポ多 糖類結合タンパク質（LBP）、高密度リポ多糖類、Limulus抗-ＬＰＳ因子、タキ プレシン、および構造的に関連するタンパク質などの組換内毒素結合タンパク質 の大規模製造のための方法に関する。発明の背景 内毒素あるいはリポ多糖類は、グラム陰性細菌の細胞壁の構成成分であり、急 性細菌感染の発現に関与する。内毒素あるいはリポ多糖類（LPS）の一次形状に 結合する無数のタンパク質が報告されている。かようなLPS−結合タンパク質の 例には、本明細書に参考までに取り入れた、殺菌性／浸透性促進タンパク質（BP Iタンパク質）、リポ多糖類結合タンパク質（LBP）、高密度リポ多糖類およびタ キプレシン〔本明細書に参考までに取り入れたNakamura et al.,J.Biol．Chem., 263: 16709-16713(1988)〕がある。 これらタンパク質のある種は、構造上の重要な相同性を共有している。例えば 、BPIとLBP双方は、LPSの脂質Ａ部分に 結合する各分子の領域である約25kDaの陽荷電したアミノ末端領域を有する。Sch umann et al.,Science,249: 1429-1431(1990)を参照のこと。 膜結合したLPSへのBPIタンパク質の結合は、感受性のグラム陰性細菌のエンベ ロープ透過性を増大させる。Ooi et al.,J.Blol.Chem.,262: 14891 (1987)。BPI タンパク質は、可溶性LPSにも結合し、そして、ヒトBPIタンパク質は、イオン交 換クロマトグラフィーあるいは大腸菌アフィニティークロマトグラフィーを組み 合わせた酸抽出によって、多形核好中球（PMNs）から単離されている。Elsbach et al.,J.Biol.Chem.,254:11000(1979); Welss et al.,Blood,69:652(1987)。ヒ トPMNsから単離したホロBPIタンパク質は、グラム陰性細菌の広範な種に対して 強い殺菌活性を有している。Elsbach et al.,J.Blol.Chem.,254:11000(1979)。 この抗細菌活性は、単離したヒトのホロBPIタンパク質のアミノ末端領域に関連 しているものと思われる。これに対して、単離したヒトのBPIタンパク質のカル ボキシ末端は、わずかに検出可能な抗細菌活性を示したに過ぎなかった。Ooi et al., J.Exp.Med.,174: 649(1991)。 BPIをコードするヒトDNAかクロ−ニングされ、組換えBPIおよびその生物学的 に活性な（例えば、アミノおよびカルボキシ末端）断片の大量生産を許容する、 コードしているタンパク質のアミノ酸配列を解明されている〔本明細書にて参考 までに採り上げたGray et al.,J.Biol.Chem.,264:9505（以下、「Gray」と称す る）および米国特許No.5,198,541を参照〕。従来のタンパク質精製法を利用した 形質変換した細胞の培地から組換えBPIおよびBPI-関連タンパク質を精製するた めの最初の試みは、低収率を招くのみであった。³⁵Ｓ標識したメチオ ニンを用い、成熟BPIタンパク質のアミノ末端の199個のアミノ酸〔以下、「rBPI （1-199）」と称する）を含む組換え生成物を発現する形質変換したチャイニー ズハムスター卵巣（CHO）細胞の細胞培養にて実施されるパルス追跡実験は、組 換えBPI断片が、追跡の3.5〜７時間にて培地から消失していたことを示した。こ の生成物の低収率の根拠を決定するための予備実験にて、タンパク生成物は顕著 な「粘着性」を示し、そして実際のところ、それ自体、（宿主細胞を含む）他の 培地成分、およびプラスチックならびにガラス培養器に接着していた。しかしな がら、タンパク質損失に関する詳細な理由は、未だ明らかにされていない。 BPIタンパク質と同様，LBPは、LPSの脂質Ａ部分に結合する。ホロ-LBPタンパ ク質は、肝臓から分泌された６０kDaのタンパク質であり、LPSをマクロファージ に誘導する機能を担っていることが報告されている。Ooi et al.,J.Exp.Med.,17 4:649-65(1991)。BPIタンパク質とは異なり、LBPは一般に、LPSによって生じた 炎症反応を増幅する。例えば、LBPは、LPS-誘発した腫瘍壊死因子（TNF）の生成 を剌激する。 本発明での興味ある事項は、タンパク質の単離および精製における交換物質お よび関連物質の使用にある。例えば、Prioret al.,による国際出願の公開公報 No.WO 89/05157は、免疫グロブリンが交換物質に吸着されているクロマトグラフ ィーカラムに細胞の培養培地を通過させることによる、組換え免疫グロブリンの 精製と単離を報告している。そして、免疫グロブリンを、カラムの塩濃度を上げ ることによって溶出した。他の例として、Robins, et al.,による国際出願の公 開公報No.WO 90/08159は、アニオン交換物質の存在下でのインキュベーションに よるタンパク調製物からのDNAの除去を報告して いる。Ann.N.Y.Acad.Scl.,413:313-321 (1983)にてWangは、非イオン性樹脂を用 いて、発酵槽培養物から、標準抗生物質、シクロヘキシミドの生成と単離のため の「ハイブリッド」発酵抽出法の結果を示し、そして、ある樹脂（XAD-4、Rohm and Haas、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）に関して、樹脂から生成物を 回収「できる」程度にまで、樹脂表面に生成物が吸着されることを付言している 。 細菌感染およびその後遺症の調節剤としての、BPIタンパク質およびLBPのよう な内毒素結合タンパク質の有用性がために、細胞培養物からかようなタンパク質 を単離するための改善された方法を、当該分野では要望されている。発明の概要 本発明は、内毒素結合タンパク質、特に、脂質Ａ結合タンパク質の高収率での 単離を促す改善された方法を提供する。 改善された方法は一般に、内毒素結合タンパク質をコードするDNAで遺伝子的 に形質変換された宿主細胞を含む細胞の培養培地に特定のカチオン交換物質を組 み込むことを含む。前記宿主細胞によって細胞の培養培地に分泌されたかような タンパク質は、前記カチオン交換物質に可逆的に結合することができる。そして 、結合したタンパク質を有するカチオン交換物質は、細胞の培養培地から分離さ れる。最後に、所望の内毒素結合タンパク質は、カチオン交換物質から単離され る。 改善された方法は、内毒素結合タンパク質あるいはその断片の発現のためのDN Aで遺伝子的に形質転換した宿主細胞（好ましくは、CHO-K1あるいはCHO-DG44細 胞）を含む細胞の培養培地に特定のカチオン交換物質（好ましくは、Ｓ−セファ ロース粒子）を組み込むことを含む。前記宿主細胞によって細胞の培 養培地に分泌されたタンパク質は、前記カチオン交換物質に可逆的に結合する。 そして、結合したタンパク質を有するカチオン交換物質は、細胞の培養培地から 分離される。最後に、タンパク質は、カチオン交換物質から単離される。 本発明の実施において、目下のところ好ましいカチオン交換物質はＳ−セファ ロースであり、そして、目下のところ好ましい単離手順は、カチオン交換物質を 勾配的あるいは段階的に増加させたイオン強度と連続的に接触することを含む。 本発明の好ましい態様において、殺菌性／浸透性向上タンパク質およびその生 物学的に活性な断片、ならびに、アミノ末端にBPIタンパク質もしくはその生物 学的に活性な断片、そして、カルボキシ末端に免疫グロブリンＨ鎖領域の少なく とも一つの定常領域あるいはその対立遺伝子変異体を含む融合タンパク質のよう なBPI-関連タンパク質、これらに限定する意図はないが、を含む組み換えBPI生 成物の生成のために、改善された方法は適用される。所望のタンパク質は、宿主 細胞の成長ならびにタンパク生成物の分泌に適した培養培地にて成長および維持 される遺伝子的に形質転換した宿主細胞によって分泌される。 本発明の他の態様においても、本発明の改善された方法は、リポ多糖類結合タ ンパク質およびそのアミノ末端断片の単離に適用される。 前述の簡単な要約は、本発明の好ましい態様を示している。 本願発明の他の無数の態様および利点は、当業者であれば、以下の詳細な説明 を考慮することで明らかになるであろう。図面の簡単な説明 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、rBPI(1-199)タンパク質を単離するための 、本願発明の方法および従来のクロマトグラ フィー法を用いた比較実験の結果を示している。 図２は、Ｓ−セファロースからのrBPI(1-99)の段階的溶出の結果を示している 。 図３は、本発明に従って調製した生成物のウェスターンブロット分析の結果を 示している。 図４は、本発明の方法に従って調製したrBPI-Ig融合生成物を示すすウェスタ ーンブロットの結果を示している。 図５は、本発明の方法に従って調製したLBPの単離を示すクーマシー染色した ゲルの結果を示している。発明の詳細な説明 以下の詳細な説明は、動物細胞の培養培地からの、三つの特定の内毒素を結合 したタンパク質の組換え生成、組換えBPI タンパク質（rBPIタンパク質）のアミ ノ末端部分、組換えLBP タンパク質（rLBPタンパク質）のアミノ末端部分、およ びrBPI免疫グロブリン融合タンパク質（rBPI-Ig融合体）に関する本発明の実施 例を示すものである。本発明の実施例を、特定の内毒素結合タンパク質に関して 説明するが、そのタンパク質の一般構造ならびに機能の類似性からして、当業者 であれば、本発明の方法を用いて、いかなる内毒素結合タンパク質を単離しうる のは明らかである。かようなタンパク質には、これに限定されるものではないが 、ポリミキシンＢＮ高密度リポ多糖類、Limulus 抗-LPS因子、およびタキプレ シンが含まれる。より具体的には、実施例１は、細胞の培養培地へのカチオン交 換物質、Ｓ−セフアロースの添加が、rBPIタンパク質の収率を向上することを実 証している。実施例２は、カチオン交換物質の細胞培養物への添加が、rBPIタン パク質の収率を向上せしめる結果を実証する結果をさらに示している。実施例３ は、rBPI 免疫グロブリン融合タンパク質の単離への本発明の方法の応用を示し、また、実 施例４は、LBPの単離におけるカチオン交換物質の使用を実証している。実施例１ 組換えBPI 生成物の単離 本発明の方法を、31残基のシグナル配列および、配列番号：１および２に示し た、最初の199個のアミノ酸をコードするDNAの発現生成物であり、本明細書にて 「rBPI(1-199)」と称する組み換えBPIタンパク質を単離するために用いた。使用 したDNA配列は、前出のGray, et al.,の文献で報告されたBPIをコードするDNA配 列とは、rBPI(1-199)発現生成物の第151位のバリンがGTGによって特定されてい るのに対し、Gray，et al.,の文献ではGTCによって特定されており、また、rBPI （1-199）は、第185位にグルタミン酸（GAGによって特定された）がコードされ ているのに対し、Gray,et al.,の文献ではリジン（AAGによって特定された）が コードされている点で相違している。rBPI(1-199)タンパク質の組換え生成が、 「rBPI-23」と称するタンパク質として、Gazzano-Santoro，et al., Infection and Immunity,60:4754-4761 (1992)にて報告されている。 本実施例で使用した宿主細胞は、内因性の３１残基の分泌シグナル配列によっ て先行したヒトBPIの最初の199個のアミノ末端アミノ酸をコードするDNAを含むD NAベクターで形質転換したCHO-K1細胞であった。所望の発現生成物、rBPI(1-199 )は、宿主細胞による翻訳後分泌処理の過程にて除去されるシグナル配列残基で の最初の199個のアミノ酸残基を含むヒトBPIタンパク質の生物学的に活性な断片 である。 ５％胎児ウシ血清を補充したHamsのF12培地に形質変換したCHO宿主細胞を含む 二つのローラーボトルを調製し、そして、集落が形成されるまで成長させた（約 ３日間）。集落が形成されると、HamsのF12培地を除去し、500mlのHB-CHO血清を 含まない培地（Irvine Scientific社、イルビン、カリフォルニア州）と交換し た。最初のローラーボトルにて、約８ｇ（湿潤重量）の殺菌したＳ−セファロー ス（ファーマシア、速流、＃17-0511-01、アップサラ、スウェーデン）に、３日 間、ローラーボトルの一つに添加した。そして、第一カラムを調製するために、 Ｓ−セファロースを単離した。成長培地とＳ−セファロース樹脂を、ローラーボ トルから除去し、プールし、そして、容器の底にＳ−セファロースが定着するよ うに、少なくとも15分間放置した。樹脂を含まない培地を、傾けて除去し、そし て、細胞を除去すると共にＳ−セファロースが保持されるように、フリットディ スクのような、装置に通して濾過した。培地の除去に続いて、Ｓ−セファロース を、0.1Ｍ塩化ナトリウムを含み、pH 4.0にて、20mMの酢酸ナトリウム／酢酸を 含んだ酢酸緩衝液にて懸濁し、ゆっくりと攪拌し、そして、10分間放置した。緩 衝液を除去し、そして、略サイズの液体クロマトグラフィーカラム（１×10cm、E conocolumn、BioRad社、リッチモンド、カリフォルニア州）に移した。 第二ローラーボトルは、Ｓ−セファロースを用いずに、上述した条件下にて成 長させた細胞を含んでいた。この第二ローラーボトルからの培地を、ローラーボ トルから除去した。CHO細胞を遠心分離によって除去し、清澄化した培地を，，p H 4.0にて、20mMの酢酸ナトリウム／酢酸を含むように調整した。培地を、10〜1 5mS/cmの導電率になるまで希釈し、そして、rBPI（1-199）タンパク質の結合を 最大ならしめるために、0.1M塩化 ナトリウムを含む、pH 4.0の20mM酢酸ナトリウム／酢酸（酢酸緩衝液）で平衡化 した第二の従来のＳ−セファロースカラムに適用した。 第一および第二のＳ−セファロースカラム双方を、溶出物のA280吸光度が、0. 1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液のみで洗浄した場合と同様の吸光度になるまで、 0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液で洗浄した。そして、各カラムに結合したタン パク質バンドを、1.0M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液を用いて単一工程にて溶出し た。 双方のカラムからの溶出物を、溶出物からの試料を、PBSの存在下にて、４℃ で、終夜にわたって、イムロン−２平板マルチウェルプレート（Dynetech Labs ）に結合する、ELISA分析に適用した。そして、プレートをPBS中の0.05%Tween-2 0にて洗浄し、0.05%Tween-20を含むPBSによるウサギ抗rBPI（1-199）抗血清の1: 1000希釈液で、室温にて、１時間、インキュベートした。インキュベーション後 、プレートをPBS中の0.05%Tween-20にて再度洗浄し、製造業者の指示に従ってTM B試薬（Pierce社、ロックフォード、イリノイ州）を用いてELISAを行い、EL309 ミクロプレートリーダー（Biotek Instruments社、ウィノースキ、バーモント州 ）を用いて450nmにて測定を行った。 ELISAの結果は、細胞の培養培地から誘導したＳ−セファロースカラムからの 溶出物が、培地を添加したＳ−セファロースカラムからの溶出物と比較して、３ 〜８倍の大きな反応性を呈することを示した。 実施例２は、形質変換したCHO細胞と共にＳ−セファロースを培養することで 、形質変換した細胞によって産生されるrBPI(1-199)タンパク質の収率が増大す る、ことを実証する結果を 提示するものである。実施例２ 単離物あるいはrBPI(1-199)の定量分析 細胞の培養培地にカチオン交換物質を添加した場合に、実施例１のCHO細胞培 養物から得たrBPI(1-199)タンパク質の収率が大きくなることを定量的にさらに 実証するために、以下の溶出試料に関する、染色ゲルおよびウェスターン分析を 行った。 実施例１に記載の1.0M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液による溶出物から得たタン パク質試料を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し た。rBPI(1-199)の試料を、まず0.5M以下の塩化ナトリウムを含むように調整し 、そして、75％の最終濃度になるように氷冷したアセトンを添加することで沈殿 せしめた。得られたタンパク質沈殿物を、10,000rpm以上にて，５〜10分間、遠 心分離することでペレット化した。上清を除去し、そして、pH 6.8で、８Ｍ尿素 、２％SDS、60mM Tris-HClを含むゲル試料緩衝液に沈殿物を懸濁した。懸濁し た試料ならびに適切なタンパク質分子量標準（BioRad社、リッチモンド、カリフ ォルニア州、およびBRL社、ベセスダ、メリーランド州）を、95℃にまで、３〜 ５分間加熱し、そして、均一割合あるいは勾配割合のポリアクリルアミドゲル（ BioRad社）に適用し、ミニプロテインIIゲル電気泳動装置（BioRad社）を用いて 分離した。電気泳動に続いて、ゲルを直接的にクーマシー染色（0.05％クーマシ ー・ブリリアント・ブルー−Ｒ、25％イソプロパノール、10％メタノール、10％ 酢酸）あるいは電気転移に用いた。SDS-PAGEによって分離されたタンパク質を、 適切な前染色した標準タンパク質（BioRad社）によって、ニトロセルロース（BA 85、Schleicher and Schuell、キーン、 ニューハンプシャー州）あるいはPVDF（イモビロン−Ｐ、Millipore社、ベツド フォード、マサチューセッツ州）膜のいずれかに電気転移した。転移を、10％CA PS（シクロヘキシルアミノ-１- プロパン−スルホン酸）、10％メタノール、pH 11.5にて、0.5アンペアーで、20分間行った。得られた染みを、ウサギ抗ヒトBPI （ホロタンパク質）抗血清の1:1000希釈液、および製造業者の指示に沿って、ウ ェスターンライト化学ルミネセンス検出システム（Tropix System社、ベッドフ ォード、マサチューセッツ州）を用いて処理した。0.25％にてゲラチン（BioRad 社）を、Tropix I-Blockの代わりに用い、電気転移後に膜は乾燥させなかった。 処理した膜を、Cronex４フィルム（Dupont社、ウィルミントン、デラウェア州） に曝した。 染色ゲルおよびウェスターン分析の結果を、図１Ａ〜１Ｄに示し、図１Ａおよ び１Ｂそれぞれは、培養培地でインキュベートしたＳ−セファロースビーズから 形成したカラムの、0.1M塩化ナトリウムおよび1.0M塩化ナトリウム溶出物の流過 物(FT)のクーマシー染色およびウェスターンブロット分析の結果を示している。 図１Ａおよび１Ｃ中の矢印は、rBPI(1-199)タンパク生成物の分子量に対応する 領域を示している。rBPI(1-199)タンパクの収率は、細胞成長中にカチオン交換 樹脂，，Ｓ−セファロースが、培養培地に添加した時に、少なくとも10倍以上に なるものと推定される。 後続の実験には、３〜５ローラーボトルから得た20〜40ｇのＳ−セファロース からのrBPI(1-199)の単離が含まれる。 結合した試料を、酢酸緩衝液中の塩化 ナトリウムの濃度を上げることで溶出した。図２に示したように、クーマシーブ ルー染色によって視覚化されたrBPI(1-199)生成物は，Ｓ−セファロースカラム からの、0.8、0.9、1.0および1.5M塩化ナトリウ ム−酢酸緩衝液溶出物中の23kDタンパク質として認められた。0.2〜0.7M塩化ナ トリウム−酢酸緩衝液溶出物中には、rBPI(1-199)タンパク質は、ほとんどある いは全く認められなかった。ウェスターンブロットの結果（図３）は、最も強い 検出可能なrBPI(1-199)タンパク質シグナルが、Ｓ−セファロースカラムの0.8〜 1.0M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液溶出物にて得られたことを示している。 Ｓ−セファロースカラムから1.5M塩化ナトリウム溶出物も、rBPI(1-199)(図２ 、右レーンを参照）として表示したタンパク質も含んでいた。Ｓ−セファロース カラムからの1.5M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液溶出物は、ジチトレイレイトール による処理で約23kDaの単一バンドに変化する、約40kDaおよび66kDaを超える分 子量を有するタンパク質を含んでいた（図２）。変化したタンパク質は、抗BPI 抗血清と交差反応し、正当に処理されたrBPI(1-199)のＮ末端配列を有していた 。約40kDaおよび66kDaを超えるタンパク質は、ジスルフィド結合したrBPI(1-199 )の多量体であると思われる。 上記した結果は、細胞の培養培地へのカチオン交換物質の添加が、rBPI(1-199 )タンパク質の回復を改善する。Ｓ−セファロースの至適濃度を決定するために 、Ｓ−セファロースの1.25〜10ｇの量を、500mlの培養培地を含むローラーボト ルに添加し、CHO細胞を形質変換し、そして、上述したようにしてインキュベー トした。カチオン交換物質を含む培地を、上述したようにしてカラムに注いだ。 0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、次いで0.7M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液で カラムを洗浄し、そして、rBPI(1-199)試料を、1.0M塩化ナトリウム−酢酸緩衝 液で溶出した rBPI(1-199)の収率を、C4逆相HPLCでのクロマトグラフィーによ って決定し、そして、2.5ｇ、5.0 ｇおよび10ｇのＳ−セファロースでは実質的に一定であった。ローラーボトル当 たり1.25ｇのＳ−セファロースしか含んでいないローラーボトルでは、収率は約 ５０％減少していた。 実施例３では、本発明の方法を用いて取得したrBPI融合タンパク質の向上した 収率を実証する結果を示している。実施例３ rBPI-Ig融合タンパク質の単離 本実施例で用いた宿主細胞は、免疫グロブリンＨ鎖の少なくとも一つの定常領 域に融合したBPIタンパク質の最初の199個のアミノ酸をコードするDNAを含むDNA ベクターで形質変換したCHO-DG44細胞である。かような「rBPI融合体」の構築は 、双方共に本明細書に参考として採り入れた、係属中の共有に係る米国特許出願 No．07/885,911、ならびに、係属中の共有に係る出願を終えたばかりの一部継続 出願No. （代理人整理番号27129/31429）にて言及されている。形質変換し たCHO-DG44細胞を、ローラーボトルにて成長させた。 各ローラーボトルについ て、T150フラスコ（ヌクレオシドを有さない50mlのα-MEMと10％の透析した胎児 ウシ血清）に形質転換した細胞を接種し、集落を形成するまで細胞を（約３〜４ 日間）成長させた。そして、細胞をトリプシン処理し、500mlのHam'sF12培地と1 0％の胎児ウシ血清を含む900cm²のローラーボトルに移し、集落を形成するまで 細胞を約３日間成長させた。集落が一旦形成されれば、Ham's F12培地は除去さ れ、500mlの血清を含まないHB-CHO培地（Irvine Scientific社、イルビン、カリ フォルニア州）と交換した。 Dulbeccoの燐酸緩衝化生理食塩水(PBS)でまず洗浄し、120℃で、20分間、オー トクレープしたＳ−セファロースビーズを、 無菌的にローラーボトルに添加した。そして、ビーズと成長培地を除去し、少な くとも15分間静置した細胞を、37℃で、３日間インキュベートした。樹脂を含ま ない培地の塊を除去し、細胞の除去とＳ−セファロースの保持を許容する、フリ ットディスクのような装置に通して濾過した。培地の除去に続いて、Ｓ−セファ ロースを、pH 4.0にて20mM酢酸ナトリウム／酢酸、0.1Ｍ塩化ナトリウムを含む 酢酸緩衝液に懸濁し、ゆっくりと攪拌し、そして、10分間放置した。次に、緩衝 液を除去し、Ｓ−セファロースを、略サイズの液体クロマトグラフィーカラムに 移した。３〜５のローラーボトルから回収したＳ−セファロースの20〜40ｇのプ ールした試料のために、Econocolumn(2.5×10cm、BioRad社、リッチモンド、カ リフォルニア州）を用いた。充填したＳ−セファロースカラムを、溶出物のA280 吸光度が、0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液のみで洗浄した場合と同様になるま で、0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、0.5M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、1.0M 塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、そして、1.5M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液で再度 洗浄した。 培養培地にＳ−セファロースビーズを添加しないことを除き、上述のようにし て、CHO-DG44細胞をさらに調製した。その代わりに、二つの異なるタンパク質Ａ カラムを用いてrBPI融合発現物を精製する試みがなされた。HB-CHO培地（上記参 照）の第一試料を、残りの培地からCHO-DG44細胞を分離するために、0.45μｍフ ィルターに通して濾過した。試料をpH 8.0に調整し、ProSepA（生物処理用）カ ラムに適用した。第二調製物を、AvidGel（生物処理用）カラムに適用した。双 方のカラムの溶出を、pH 5.5の25mMクエン酸緩衝液で行った。いずれのタンパク 質Ａカラムからも、rBPI融合生成物は回復しなかった。還元後のProSepAカラム からも視覚化できる生成物は得られな かった（図４、レーン１）。しかしながら、ProSepAおよびAvidGelカラムを、pH 3.0の100mMクエン酸緩衝液で処理した場合，，rBPI融合タンパク質は、図４の レーン２および３にそれぞれ示したように検出された。図４のレーン４〜６は、 Ｓ−セファロースカラムからの、0.5M、1.0Mおよび1.5M溶出物を示している。Ｓ −セファロースカラムからの溶出物の内、1.5M溶出物は、約100kDの融合二量体 に相当する物質を含んでいた。 実施例４は、LBPをコードするDNAで形質変換した細胞を、カチオン交換樹脂と 共にインキュベートすれば、向上したLBPの収率が得られることを実証する結果 を示している。実施例４ リポ多糖類結合タンパク質の単離 LBPの25kDアミノ末端のために取得したDNA配列を、配列番号：３に示した。そ の配列は、二つの領域において、Schumann et al., Science, 249: 1429-1431 ( 1990)(配列番号:4)に報告された配列と相違する。これら相違点は、129〜132位 および149位のアミノ酸の相違に至っている（148位のアスパラギン残基が、前出 の Schumannの文献ではGATによって、配列番号：３ではGACによってコードされて いる）。公開されたPCT出願93/06228も参照のこと。 本実施例にて使用した宿主細胞は、発現生成物であるLBPの最初の197個のアミ ノ酸をコードするDNAを含むDNAベクターで形質変換されたCHO-DG44細胞である。 形質変換したDG44細胞を、ローラーボトルにて成長させた。各ローラーボトル について、T150フラスコ（ヌクレオシドを有さない50mlのα-MEMと10％の透析し た胎児ウシ血清）に形質転換した細胞を接種し、集落を形成するまで細胞を（約 ３〜４日 間）成長させた。そして、細胞をトリプシン処理し、500mlのHam's F12培地と10 ％の胎児ウシ血清を含む900cm²のローラーボトルに移し、集落を形成するまで細 胞を約３日間成長させた。集落が一旦形成されれば、Ham's FI2培地は除去され 、500mlの血清を含まないHB-CHO培地（Irvine Scientific社、イルビン、カリフ ォルニア州）と交換した。 PBSでまず洗浄し、120℃で、20分間、オートクレープしたＳ−セファロースビ ーズを、無菌的にローラーボトルに添加した。そして、ビーズと成長培地を除去 し、少なくとも15分間静置した細胞を、37℃で、３日問インキュベートした。 樹脂を含まない培地の塊を除去し、細胞の除去とＳ−セファロースの保持を許容 する、フリットディスクのような装置に通して濾過した。培地の除去に続いて、 Ｓ−セファロースを、pH 4.0にて20mM酢酸ナトリウム／酢酸、0.1M塩化ナトリウ ムを含む酢酸緩衝液に懸濁し、ゆっくりと攪拌し、そして、10分間放置した。次 に、緩衝液を除去し、Ｓ−セファロースを、略サイズの液体クロマトグラフィー カラムに移した。３〜５のローラーボトルから回収したＳ−セファロースの20〜 40ｇのプールした試料のために、Econocolumn（2.5×10cm、BioRad社、リッチモ ンド、カリフォルニア州）を用いた。充填したＳ−セファロースカラムを、溶出 物のA280吸光度が、0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液のみで洗浄した場合と同様 になるまで、0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、0.7M塩化ナトリウム−酢酸緩衝 液、そして、1.0M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液で再度洗浄した。 Ｓ−セファロースビーズが添加された細胞培養物からのrLBPの収率を、上述し た0.7M溶出物（レーン１および３）および1.0M溶出物（レーン２および４）のク ーマシー染色したゲルに関する図５に示した。図に示したように、著量のLBPが1 .0M にて溶出した。Ｓ−セファロースが、細胞培養物からのLBP生成を促進できるこ とは、算出されたそのpl値（6.6）からは予想できないものである。 pHが約7.0 である、先に使用した培養培地にて、LBPが、そのpl値からして、非荷電あるい はわずかに陰荷電を帯びると考えられ、よって、Ｓ−セファロースのようなカチ オン交換樹脂とは反応しないものと思われる。 本発明の実用における様々な修正と変更が、好ましい態様について述べた先の 説明を考慮すれば、当業者であれば容易に想到できるものと思われる。例えば、 本発明に用いたカチオン交換物質を、使用する細胞のタイプと数（すなわち、組 換生成物の生産効率）に従って変更することができる。他の例では、Ｓ−セファ ロース以外のカチオン交換物質〔例えば、Biorex70、およびSP−セファデックス のようなSP（スルホプロピル）型物質ならびにCM−セファデックスおよびCM−セ ファロースのようなCM（カルボキシメチル）型物質〕が、本発明の方法に使用で きるが、Ｓ−セファロースが、取扱易さ、殺菌工程等への適用において最も好ま しい。さらに他の例として、上記実施例では、ローラーボトルでの内毒素結合タ ンパク質の組換生成物について述べたが、本発明の方法は、発酵槽での生成規模 にまで容易に「大規模」化できる。 rBPI(1-199)の生成のための方法における 典型的な発酵条件は、0.05％FBSおよび0.01％Anti-foam（U Carfermアジュバン ト27、ユニオンカーバイド社）、および１％SP−セファロース「大粒ビーズ」（ 100〜300ミクロンの直径、ファーマシア社）が添加されたExCell 301培地（JRHS cientific社）にて成長したプラスミドpING4502〔前出のGazzano et al.,の文献 を参照〕で形質変換したCHO-K1細胞が投入された、600lの稼働体積を有する750l のChemap（ウッドベリー、ニューヨーク州）発酵槽の使用を含む。最後に、 本発明に従って単離した組換内毒素結合したタンパク質の正確な溶出は、包含さ れるタンパク質の厳密な同一性によって変化するものと思われる。その一例とし て、rBPI(1-199)は、0.7M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液での洗浄により、容易に 樹脂ビーズから単離することができる。しかしながら、Theofanet al.,による係 属中の、共有に係る、米国特許出願No.08／013,801に記載されたような、BPIの システイン置換類似体の収率は、0.6M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液での洗浄によ る単離により向上する。従って、本発明の範疇に課すべき限定は、添付の請求の 範囲に記した限定にとどめるべきである。 配列表 （1）一般情報 （i）出願人： （A）名称： ゾーマ コーポレイション （B）番地： 2910 セブンス ストリート （C）都市名： バークレイ （D）州名： カリフォルニア （E）国名： 米国 （F）郵便番号： 94710 （ii）発明の名称： 内毒素結合タンパク質の調製のための方法 （iii）配列の数：４ （iv）連絡先住所： （A）名宛人： マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー アン ドボーラン （B）番地： 233サウス ワッカー ドライブ、6300シアーズ タワー （C）都市名： シカゴ （D）州名： イリノイ （E）国名： 米国 （F）郵便番号： 60606-6402 （v）コンピューター読取形式： （A）媒体： フロッピー ディスク （B）コンピューター：IBM PC互換機 （C）操作システム： PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア： パテント イン リリース #1.0、バージョン #1.25 （vi）現出願データ： （A）出願番号： （B）出願日： （C）分類： （vii）先行出願データ： （A）出願番号： US 07/885,501 （B）出願日： 19-5月-1992 （viii）弁護士／弁理士情報： （A）氏名：メイアーズ、トーマス シー （B）登録番号：36,989 （C）参照／事件番号：31405 （ix）通信情報： （A）電話：（312）474-6300 （B）ファックス：（312）474-0448 （C）テレックス：25-3856 （2）配列番号：１の情報 （i）配列特徴： （A）配列の長さ：1813塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：cDNA （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：31..1491 （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：mat peptide （B）存在位置：124..1491 （xi）配列：配列番号：１ （２）配列番号：２の情報 （i）配列特徴： （A）配列の長さ： 487アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号：２ （２）配列番号：３の情報 （i）配列特徴： （A）配列の長さ： 591塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：cDNA （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号： CDS （B）存在位置： 1..591 （xi）配列：配列番号：３ （２）配列番号：４の情報 （i）配列特徴： （A）配列の長さ： 197アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号：４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＫ，ＵＡ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子的に形質転換された宿主細胞が、細胞の成長と維持において適切な培 地で培養され、そして、所望のタンパク質が前記培地に分泌されることを含む、 内毒素結合タンパク質の生成のための方法であって、以下の一連の工程、すなわ ち： カチオン交換物質に内毒素結合タンパク質が可逆的に結合することを許容する 条件下にて、前記培養培地に特定のカチオン交換物質を組み込み； 内毒素結合タンパク質が結合した前記カチオン交換物質を前記培地から分離し ；および 前記カチオン交換物質から、前記内毒素結合タンパク質を単離する、工程を含 む。 ２．前記カチオン交換物質が、Ｓ−セファロースである請求の範囲第１項に記載 の方法。 ３．前記内毒素結合タンパク質が、細菌性リポ多糖類の脂質Ａ領域に結合する請 求の範囲第１項に記載の方法。 ４．前記内毒素結合タンパク質が、殺菌性／浸透性促進タンパク質である請求の 範囲第１項に記載の方法。 ５．前記内毒素結合タンパク質が、リポ多糖類に結合できる殺菌性／浸透性促進 タンパク質のアミノ末端断片である請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．前記内毒素結合タンパク質が、殺菌性／浸透性促進タンパク質と免疫グロブ リンＨ鎖の定常領域を含む融合タンパク質である請求の範囲第１項に記載の方法 。 ７．前記内毒素結合タンパク質が、リポ多糖類結合タンパク質である請求の範囲 第１項に記載の方法。 ８．前記内毒素結合タンパク質が、リポ多糖類に結合できるリポ多糖類結合タン パク質のアミノ末端断片である請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．前記単離工程が、前記カチオン交換物質と、イオン強度を段階的あるいは勾 配的に増大した培地と連続的に接触させる工程を含む請求の範囲第１項に記載の 方法。