【発明の詳細な説明】診断法 背景
本発明はＣＤ４４遺伝子またはＣＤ４４遺伝子の一部の発現を利用して新生物
形成を検査することに関するものである。このような検査には、診断すべき患者
から組織、体液その他の試料を採取し、診断を与え、または既に実施されている
療法を評価ずることか含まれる。特に本発明は、非侵襲的に得られる体液その他
の試料を用いて新生物形成のルーティンスクリーニングを実施するための簡単な
方法を提供することである。
現在腫瘍を診断するための普通の方法は、細胞または薄い組織片を顕微鏡で観
察すること、すなわち極めて有効である場合が多いが、幾つかの重要な制限があ
る方法によるものである。小規模の試料については診断が極めて困難である可能
性があるが、多数の細胞が得られない場合が多く、または患者から多量の試料を
得るのは望ましくないか、もしくは不可能である。５０％にも及ぶ症例において
信頼性のある診断が得られない；それは癌の陽性の証拠がないが、患者が実際に
癌ではないという確信もない場合がありうる。その場合、診断を確立するために
はより侵襲的な検査が要求される。
予後の診断も顕微鏡下に観察した際の細胞の外観に依存する。一般に原発性腫
瘍における細胞が奇異な外観であるほど、それらはのちに転移しやすいが、関連
性は決して絶対的ではない。どれが最も有効な治療法であるかを判定するために
は、転移が起こりやすいか否かをより正確に予想しうることか明らかに有利であ
ろう。
ヒトＣＤ４４遺伝子は種々の大きさの一群の可変性グリコシル化された細胞表
面蛋白質をコードし、その多数の機能はまだ完全には確立されていないが、ＣＤ
４４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により認識されるエピトープを共有する。そ
れは造血細胞および他の多数の細胞タイプ中において発現する標準的部分からな
り、その中へ付加的なエキソンの産物が種々の組み合わせでスプライシングされ
て異なる蛋白質を産生しうることが知られている。これは真核細胞において同一
遺伝子から数種類の、しばしば機能的に無関係の蛋白質を産生するための十分に
認識されたメカニズムであり、選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ
ｓｐｌｉｃｉｎｇ）として知られている。
２種類の共通ＣＤ４４イソ型が現在までに精製され、かつ解明されている（ス
タメンコビック(Stamenkovic)ら，1989)。すなわちｉ）重度にグリコシル化され
た中心３７ｋＤコアからなる９０ｋＤ形、およびｉｉ）近位膜外ドメイン中に挿
入された１３５の余分なアミノ酸を含み、よりいっそう重度にグリコシル化され
た１８０ｋＤ形。免疫−細胞化学的および免疫−沈殿研究により、両者が多数の
異なる細胞および組織内に広く分布することが示された。前者は造血形または標
準形として知られ、循環白血球、骨髄細胞および他の多数の細胞タイプ上に存在
する。他方の上皮性変異型として知られるものは、数種類の上皮細胞タイプ上に
検出される。両者ともホモタイプおよびヘテロタイプの付着性相互作用を仲介す
る受容体として機能し、細胞を相互に、または隣接する細胞外骨格（ｅｘｔｒａ
ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）に付着させる。
少し前に、ｍＡｂヘルメス−３により認識される幾つかのＣＤ４４エピトープ
が末梢リンパ節受容体を構成し、これにより循環リンパ球が末梢リンパ節を認識
し、かつそこを通過するのを可能にするものとし，て同定された。その後この抗
原に対する他のｍＡｂが得られるようになり、スタメンコビック (Stamenkovic)
ら (1989) はそれらのうちの１つを、発現ライブラリーからＣＯＳ細胞中におい
て標準形の分子をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングするために用いた。彼
らはさらにノーザンブロッティングにより、この遺伝子はリンバ球によってのみ
でなく、種々の癌細胞系および代表的な充実性癌の試料によっても発現し、それ
らのうち２種類の結腸癌は正常な結腸上皮より強く発現することを見出した。
バーチ (Birch) ら (1991)は、ヘルメス−３抗体により認識される８０−９０
ｋＤ形のＣＤ４４抗原を強く発現する黒色腫細胞クローンが、それを弱く発現す
るクローンより、ヌードマウスにおいて実質的にいっそう転移性であることを報
告した。サイ (Sy) ら (1991) は、ヌードマウスにおけるヒトリンパ腫細胞の
転移能力が、細胞を標準ＣＤ４４遺伝子でトランスフェクトした後には中程度に
上昇するが、上皮性変異型をコードする構築体によるトランスフェクション後に
は上昇しないと記載している。ガンタート (Gunthert) ら (1991) は、ラットＣ
Ｄ４４抗原に対して形成された新たな抗体により認識されるリンパ球ホーミング
受容体の変異型が、ラット膵臓腺癌細胞の転移挙動に必要であることを示す結果
を得た。この抗体を用いて、彼らは変異型のＣＤ４４に対応するｃＤＮＡ配列を
クローニングし、それがそれまで同定されていないエキソンを含むことを見出し
た。転移性クローンにユニークなこのｃＤＮＡ配列を過剰発現するように設計さ
れた構築体を用いて、同じ細胞系からの非転移性クローンをトランスフェクショ
ンすると、転移性挙動を誘導するように思われた（ガンタート (Gunthert) ら，
1991) 。
これらの所見からみて、種々の組織遣伝学的由来の培養された転移性および非
転移性ヒト腫瘍細胞系がＣＤ４４産物を鑑別的に発現するか否かを知ることが関
心事となった。細胞または組織における遺伝子の発現は、細胞メッセンジャーＲ
ＮＡからｃＤＮＡを作成し、それらの遺伝子産物に対応する部分のｃＤＮＡに優
先的にアニーリングするように選ばれた特異的オリゴヌクレオチドプライマーを
用いて、目的領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させることによって、極め
て効率的かつ高感度で研究することができる。しかしホフマン (Hofmann) ら (1
991) および本発明者らによるこの方法を用いた研究は、ＣＤ４４の発現はヌー
ドマウスにおけるこれらの培養細胞系の転移能力に対して、または腫瘍形成能に
対してすら、必ずしも規則的かつ信頼性をもって相関してはいないことを示す結
果を与えた。ほぼこの時期に３つの別個のグループ（ホフマン (Hofmann) ら，1
991、スタメンコビック (Stamenkovic) ら，1991、およびジャクソン (Jackson)
ら，1992）が、種々のヒト細胞系においてこの遺伝子により発現することを彼ら
が見出した他のスプライス変異型についての配列データを公表した。本発明
本発明は、乳房および結腸の腫瘍ならびにそれらの転移を伴う患者から得た新
鮮な組織および体液試料におけるＣＤ４４遺伝子の種々の部分の発現を調べる研
究により得た予想外の知見に基づくものである。これらの結果は、ｉ）転移性（
悪性）腫瘍、ｉｉ）非転移性の局所浸潤性腫瘍および良性腫瘍、ならびにｉｉｉ
）正常組織から得た組織間で、ＣＤ４４発現の極めて明瞭な相異を示した。グル
ープｉ）とｉｉ）の区別は療法の判定に重要であり、．グループｉｉ）とｉｉｉ
）の区別は早期診断およびスクリーニングに重要である。
従って本発明は１観点においては、試料中のＣＤ４４遺伝子の発現を分析する
ことを含む、新生物形成の診断方法を提供する。
具体的態様において本発明は、試料中のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）か
らｃＤＮＡを作成し、ＣＤ４４遺伝子またはその一部に対応する部分の相補的Ｄ
ＮＡ（ｃＤＮＡ）を増幅し、この増幅されたｃＤＮＡを検出することを含む、Ｃ
Ｄ４４遺伝子またはその一部の産物につき試料をアッセイする方法において、増
幅されたｃＤＮＡを新生物形成の診断に利用することを特徴とする方法を提供す
る。
新生物形成の診断とは、新生物形成組織の初期検出を意味するか、またはそれ
は転移性腫瘍と非転移性腫瘍とを区別する工程であってもよい。本明細書におい
て用いる“診断”という語に関してはこれに従って解釈すべきである。
本方法は充実性腫瘍、特に悪性腫瘍、たとえば癌の診断に特に適用しうる。ア
ッセイを行う試料は、身体組織または体液のものであり、インビトロで培養され
た細胞のものではないことが好ましい。試料は充実性腫瘍から得た絹織小片、ま
たは細胞の微小注射針吸引液（ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅ，Ｆ
ＮＡ）であっでもよい。あるいはそれは血液もしくは尿もしくは他の体液、頸部
切屑の試料、または非侵襲的に得た試料、たとえば喀痰、尿もしくは便であって
もよい。
上記ｃＤＮＡは１または２以上の標識された特異的オリゴヌクレオチドプロー
ブを用いて検出することができ、これらのプローブは増幅されたｃＤＮＡ配列の
一部にアニーリングしうるように選ばれる。あるいは標識オリゴヌクレオチドプ
ライマーおよび／または標識モノヌクレオチドを用いることができる。放射性標
識を含めて、使用しうる適切な検出可能な多数の標識がある。
添付の図面につき述べる。
図１−５は、以下に報告する種々の実験の結果を示すオートラジオグラフであ
る。
図６は、エキソン、プローブおよびプライマーを示したＣＤ４４遺伝子地図で
ある。エキソンの番号はスクリートン (Screaton) ら (1992) が用いたものに対
応する。
図７は、エキソン６（図６に示したもの）の核酸配列であり、対応するアミノ
酸配列をも示す。
図８は、他の実験の結果を示す１組のオートラジオグラフである。
図６はエキソン６−１４を示したＣＤ４４遺伝子地図である。基本的または標
準的蛋白質を、理論的にはこれら９つの余分なエキソンのいずれか１つ、幾つか
、またはすべてからの転写体の挿入により修飾することができる。エキソン６は
本出願の優先権主張日には未知であり、本発明の他の観点をなす。エキソン６は
腫瘍の場合は過剰発現するが、正常組織では過剰発現せず、エキソン７−９付近
に位置する。エキソン６の配列を図７に示す。それは１２９塩基対を含み、、５
′側は標準的ＣＤ４４配列により、かつ３′側は通常はエキソン７によりフラン
キングされている。
エキソン９−１１とは対照的に、エキソン６（新規に配列決定されたエキソン
）の産物は、正常組織の試料中では稀に検出されるにすぎない。これは、エキソ
ン６が新生物形成の診断に特に重要であろうということを示唆する。
他の観点においては本発明は新規化合物として、図７に示すエキソン６の核酸
配列、その特徴的フラグメント、縮重した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）、および
／または対立遺伝子変異型を表す配列、相同性核酸配列、ならびにこれらの配列
または相同体とハイブリダイズしうるプローブ、プライマーおよび他の試薬を提
供する。これらの化合物および試薬は、すべて上記方法に有用である。
本発明の他の観点には下記のものが含まれる：
−エキソン６に対応する、図７に示すペプチド配列、それの対立遺伝子変異型
およびその二次修飾体、たとえばリン酸化およびグリコシル化生成物、ならびに
その特徴的フラグメント、たとえばそのボリペプチドがインビボで折りたたまれ
た場合にエピトープを構成するフラグメント。
−上記ペプチド配列、それの対立遺伝子変異型およびその二次修飾体、たとえ
ばリン酸化およびグリコシル化生成物、ならびにその特徴的フラグメントに対す
る抗体。それらの抗体は、たとえば放射性核種または殺腫瘍性化合物で標識され
てもよい。
−インビトロ診断のための、上記標識抗体の使用。
−ラジオイメージング（ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ）またはインビボ診断のた
めの、上記放射性標識抗体の使用。
−所望により殺腫瘍性化合物その他で標識された上記抗体の、療法における使
用。
これらのペプチド配列またはフラグメントは標準法により、たとえば自動合成
装置を用いて合成することができる。抗体は上記ペプチドを抗原の形で適切な宿
主に投与することにより形成しうる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体
を標準法により調製しうる。
他の観点において本発明は、ＣＤ４４遺伝子のエキソン７−９付近に位置する
エキソンの過剰発現を測定することを特徴とする、新生物形成の免疫学的診断方
法を提供する。好ましくはこのエキソンは図７に示す核酸配列を有する。
腫瘍においてＣＤ４４遺伝子の多数のスプライシングされた変異型が無秩序に
過剰発現することは、特定の組織試料により特定のエキソンが過剰発現する可能
性があるか、またはその可能性がない（または全く発現していない）ことを暗示
する。従っていずれかの単一エキソンにより発現するペプチドに対する抗体を用
いるイムノアッセイは誤った結果を与える可能性がある。従って本発明は、新生
物形成の免疫学的診断のために２以上、好ましくは９つ全部のＣＤ４４エキソン
に対する抗体の混合物を用いることを含む。詳細な記述
本発明の１態様においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡ
の増幅を行う。ＰＣＲについては、ヒトＣＤ４４ ｃＤＮＡに関する配列情報を
利用してプライマーを選ぶことができる。発現しうるＣＤ４４遺伝子のいずれか
の部分に対応するｃＤＮＡを増幅するプライマーを使用しうる。これには挿入エ
キソンを含むか、もしくは含まない標準的部分が包含され、またはそれは１もし
くは２以上のエキソンのみの一部もしくは全部であってもよい。後者の場合、試
薬の浪費がより少なく、かつより良好なシグナルが生じ、また標準配列に対する
プローブを使用しない。
本発明は直接的ＰＣＲの使用に限定されない。たとえば集合した（ｎｅｓｔｅ
ｄ）プライマーの系を使用しうる。当技術分野で知られている他の適切な方法も
適用しうる。
本発明による他の方法においては、増幅されたｃＤＮＡを電気泳動により分離
する。次いでこの分離されたｃＤＮＡにつきブロッティングおよびオ−トラジオ
グフィーを行うことができる。オートラジオグフィーは、電気泳動された増幅産
物をナイロン膜にブロッティングすることにより固定して、32Ｐまたは他の適切
な標識で標識された放射性標識−特異的オリゴヌクレオチドプローブでプロービ
ングすることを伴い、このプローブは増幅されたｃＤＮＡ配列の一部にアニーリ
ングしうるように選ばれる。次いで検出工程は、標識され、分離されたｃＤＮＡ
をＸ線フィルムに露光することを伴う。
以下の実施例において、ヒトＣＤ４４遺伝子の発現が正常組織と対比して種々
の充実性腫瘍において一貫して．、かつ明瞭に増大することが見出された。悪性
（すなわち既に転移性である）腫瘍は、局所浸潤性のものおよび良性のものと、
認められた変化のパターンおよび程度において異なっていた。４６例の腫瘍から
の試料につき研究を行った。そのうち４４例は局所浸潤性または転移性であり、
２例は良性であった。新鮮な外科生検試料から抽出したＲＮＡの逆転写により調
製されたｃＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを採用することにより、ＣＤ４４の発
現の分析を行った。ＣＤ４４遺伝子の特定の部分に特異的にアニーリングするオ
リゴヌクレオチドプライマーを選ぶことにより、これらの結果からみて診断およ
び予後において重要である部分の遺伝子を増幅することが可能である。
ここで見出された変化したＣＤ４４発現と新生物形成との間の強い関連は、必
ずしもこの遺伝子の個々のエキソンのいずれかが新生物形成に際して、または転
移性悪性腫瘍への進行に際してのみ発現されることを意味するわけではない。多
数の研究室で最近得られた証拠（総説に関してはクヌドソン (Knudson) ，1985
、タリン (Tarin) , 1992、ハイレ (Hayle) ら，1992を参照されたい）は、これ
らの病理学的過程は恐らく正常な細胞活動、たとえば細胞の増殖および移動をコ
ードする遺伝子の調節が混乱した結果であろうと指摘している。従っていずれか
の遺伝子または遺伝子の一部が新生物形成または転移をプログラミングするとい
う唯一の機能をもつとは思われない。
本発明の研究においてエキソン１０／１１からの転写体が正常組織に見出され
ることは、転移しうる腫瘍からのＰＣＲ産物において放射性標識プローブＥ４と
ハイブリダイズするバンドの数およびシグナル強度が著しく増大するにもかかわ
らず、このエキソンは転移活性にのみ関与するわけではないことを示す。従って
ＣＤ４４エキソン１０／１１発現が転移挙動をもたらすためには他の支持事象が
要求されると考えられる。それにもかかわらず、このエキソンからの転写体が転
移性腫瘍からの試料中において過剰発現したという所見は、極めて有用な予後の
指示体となることを約束する。
個々のいずれかのエキソンの自然の（突然変異していない）産物が腫瘍細胞中
にのみ存在し、正常な対細胞中には存在しないことが、これ以上の研究により見
出されるとは期待されない。その代わり、本明細書においてＣＤ４４遺伝子座に
つき報告するように、遺伝子の過剰発現および産物の不適切な組み合わせからな
る異常なパターンの遺伝子活性が悪性状態において役割をもつと思われる。これ
らの変化はそれ自体が悪性変換に要求されるのかも知れないし、またはこのよう
な変換を引き起こす他の遺伝的妨害の結果であるかも知れない。たとえそうであ
っても、この問題点を解決せずに観察者がこれらの技術を用いて試料を新生物形
成カテゴリーまたは非−新生物形成カテゴリーに帰属させるのに関連した情報を
得ることはできる。実施例 方法
乳房腫瘍および結腸腫瘍を伴う患者３４人の治療に際して摘出した外科切除検
体から、直径０．５−１ｃｍの新鮮な組織試料を得た。試料を病理検体受付区域
に到着して１０分以内に液体窒素中で瞬間凍結し、使用時まで液体窒素中に保存
した。診断のために切除した組織中にリンパ節転移体および血液由来の転移体が
存在する場合には、それらの一部をも採取した。正常な乳房組織、正常な結腸粘
膜、乳房の腫瘍に隣接する正常なリンパ節、ならびに正常な肝臓をも、外科切除
試料から、および非−新生物形成状態に関して摘出した他の試料から採取した。
正常な末梢血白血球は１０人のボランティアから、また骨髄は３人のボランティ
アから得た。これらの腫瘍およびそれらの臨床段階の組織学的特徴を表１に記載
する。
組織試料からの全細胞ＲＮＡ抽出を、コミジンスキーおよびサッチ（Chomizyn
ski,Sacchi）（1987）が記載する方法に従って実施した。流体試料からの抽出は
インビトロジェンが市販するマイクロファストトラック（Ｍｉｃｒｏｆａｓｔｔ
ｒａｃｋ）キットを用いて行った。ｃＤＮＡ合成およびそれに続くポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）は、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、商標）
予備増幅システム（ＢＲＬライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、英
国ミドルセックス）をこのキット中に供給される緩衝液および試薬と共に用いて
実施された。要約すると、これは鋳型としての試料ＲＮＡおよび市販のヌクレオ
チドトリホスフェートを用いて逆転写酵素により第１鎖ｃＤＮＡを合成する初期
工程を伴う。後続のＰＣＲのために各試料に油を積層し、９４℃に５分間加熱し
て核酸を変性させた；次いで３０サイクルのＰＣＲを下記のサイクルパラメータ
ーにより実施した：９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分。反応混合物中
に鋳型ｃＤＮＡが存在しない陰性対照を各バッチにつきルーティンに試験した。
ヒトＣＤ４４ ｃＤＮＡにつき公表された配列からの情報（ホフマン (Hoffmann
)ら，1991、スタメンコビック (Stamenkovic) ら，1991、ジャクソン (Jackson)
ら，1992）（図６）を利用して本発明者らが作成したプライマーおよびプローブ
の配列は下記のとおりであった：
Ｐ１はその起点が標準ＣＤ４４分子中の挿入部位から３２４ｂｐ上流に位置し
（スタメンコビック (Stamenkovic) ら (1989) が公表した配列中のヌクレオチ
ド７８２と７８３の間）、Ｐ４はこの部位の１５８ｂｐ下流にある。これらのプ
ライマーは、試料が標準ＣＤ４４（いわゆる造血性ＣＤ４４）を発現する場合は
４８２ｂｐのＰＣＲフラグメントを産生し、試料が選択的スプライシングされた
転写体を含む場合は上皮形ＣＤ４４に関する８７８ｂｐを産生する。各ＰＣＲ産
物１０μｌを１．２％アガロースゲル中で電気泳動し、オリゴヌクレオチドプロ
ーブＥ４（＝５′ＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＣ−３′）（図６
参照）とのハイブリダイゼーションのためにハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ+（
アメルシャムＵＫ、英国リトルシャルフォント）ナイロン膜に移した。検出感度
および解像度を向上させるために、ブロッティングおよびオートラジオグラフィ
ーを実施した。プローブをポリヌクレオチドキナーゼの存在下にｙ32Ｐ−ＡＴＰ
で放射性標識した。プレハイブリダイゼーション後に、１０％デキストラン、６
×ＮＥＴ、５×デンハルト液、０．５％ＮＰ４０、および１００μｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡ中で４２℃において一夜、ハイブリダイゼーションを実施した。次い
でフィルターを２回、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、および０．５％ＳＳＣ−−０．
１％ＳＤＳ含有−−中で４２℃において順次１５分ずつ洗浄した。フィルターを
コダックＸ線フィルムに２−１６時間露光した。次いでプローブをストリッピン
グするためにフィルターを０．５％ＳＤＳ中で煮沸し、他の放射性標識プローブ
、すなわちＣＤ４４の標準部分（図６）にアニーリングさせるために本発明者ら
が設計したＰ２（＝５′ＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡ
ＣＡＧＡＣ）と再度ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション、洗浄およ
びオートラジオグラフィーに用いた条件は上記と同じであった。
少数の細胞の検出に関して、この方法の感度の検量を下記により実施した：全
末梢血白血球（ＰＢＬ）を２０ｍｌの全血から、充填赤血球を塩化アンモニウム
緩衝液（細胞溶解用緩衝液５０ｍｌに対し充填細胞１ｍｌ）の添加により溶解し
、次いで１５分後に遠心分離することにより精製した。ＨＴ２９結腸癌細胞の懸
濁液（５０００細胞／ｍｌ）それぞれ０μｌ、１μｌ、１０μｌおよび１００μ
ｌを接種した４本の試験管中に、この白血球ペレットを分配した。次いで全ＲＮ
Ａを抽出し、各試験管から約２０μｇを得た。アリコートの試料当たりそれぞれ
０、１、１０および１００の腫瘍細胞を表す、各試験管から得た４μｇアリコー
トのＲＮＡにつき、前記に従ってｃＤＮＡ合成を行った。これらの試料ならびに
陽性対照（腫瘍細胞のみ）および陰性対照（ＤＮＡなし）につき、図６のエキソ
ン７および１４に特異的にアニーリングさせるために本発明者らが設計したプラ
イマーＤ１およびＤ５を用いて、ＰＣＲを実施した。ＨＴ２９細胞が両エキソン
その他をＰＢＬから容易に区別しうるパターンで発現することは従来の研究から
知られており、本発明者らは増幅すべきセグメントを短縮することによって感度
を高めたいので、オリゴヌクレオチドプライマーＤ１およびＤ５を選んだ。これ
らの大部分は上記遺伝子の標準部分にアニーリングされることにより吸収される
ので、これらのプライマーを用いるとこの特定の目的にプライマーＰ１およびＰ
４を用いる問題が回避されることもその理由であった。ＰＣＲサイクルパラメー
ター、ブロッティング、プロービングおよび洗浄の条件は前記と同様であった。
プロービングに用いたオリゴヌクレオチド配列は32Ｐ標識Ｅ４であった。結果の全般的概観
プライマー（Ｐ１およびＰ４）はスプライス産物挿入部位を越えて増幅するの
で、付加的なエキソンドメインからの転写体を含む選択的スプライスされた変異
型のほかに標準分子の介在部分も増幅されることは明らかである。従って標準形
態に対するプローブ（たとえばＰ２）を用いて検出されると考えられる産物の総
数は、この遺伝子座から同定される配列の可能な組み合わせすべてを考慮すると
、大きい。プローブＥ４を用いると、１６のこれらの組み合わせ、すなわちエキ
ソン１１からのＥ４転写体を含むものを、電気泳動により分離された異なる分子
サ
イズのバンドとして視覚化しうる。実際には可能な組み合わせの全範囲がこれら
の結果において検出されたわけではなく、数種類（最高９）の選択的スプライス
変異型が各プローブとハイブリダイズした状態で新生物形成組織中に見られた。
乳房、結腸およびリンパ節からの正常な組織は、実際に幾つかのＥ４含有転写体
（図１および３）を標準分子（図２および４）のほかに発現したが、末梢血リン
パ球（図５）および肝臓（図４）はこの組み合わせのプローブおよびプライマー
で後者のみを検出可能な状態で発現した。詳細を以下に提示する：実施例１ 乳房組織試料
乳房組織試料の研究において得られた結果を図１および２に示す。すべての症
例からの転移性腫瘍沈着物およびそれらの対応する原発性腫瘍は、エキソン１１
からの転写体を含有する数種類の選択的スプライス産物を過剰発現した（図１ａ
）。すべての腫瘍に存在する１５００ｂｐおよび１６５０ｂｐの一致した二重項
と共に、少なくとも８つの分離したバンドがしばしば見られた。正常な乳房組織
および正常なリンパ節はこのプローブにより２つのバンド（１１５０ｂｐおよび
８６０ｂｐ）を形成した。正常な試料には上記の二重項は見られなかった。
結合プローブからのバンドの数およびサイズならびにシグナル強度の差は、検
査したすべての試料において、正常カテゴリーと悪性カテゴリーの間で明瞭であ
った。明瞭な差を見るためにより長期間フィルターをＸ線フィルムに露光する必
要のある試料が時折りあったが、この所見はいずれの症例においても確認された
。
転移の臨床証拠を伴わない局所浸潤性腫瘍からの、および２例の線維腺腫から
の試料も、正常組織と比較してエキソン１０／１１からの転写体を含むスプライ
ス産物を過剰発現したが、これの程度は悪性腫瘍およびそれらの転移体につき得
られた結果と容易に区別された。正常組織に見られるパターンとの区別も容易で
あった（図１ｂ）。しかし１試料は悪性腫瘍と類似の結果を与えた（列１４）（
下記参照）。２例の線維腺腫は非転移性癌からのものと類似のバンドパターンを
示し、乳房の嚢胞性疾患（ｃｙｓｔｉｃ ｄｅｓｅａｓｅ）の症例からの試料は
正常な非−新生物形成乳房組織についてのパターンに類似していた。これが本方
法
による確実な診断の最初の例である。この絹織片は、肉眼による初期検査に際し
ての巨視的外観では良性腫瘍、すなわち線維腺腫からのものであるとして、勤務
病理学者により提供された。次いでそれのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅後に確実に非−
新生物形成であることが解明され、その後の組織鏡検によりこれが確認された。
プローブＥ４を用いた場合に見られた差が有効であって、技術的人工産物では
ないことを確認するために、上記と同一のフィルターをプローブＰ２とハイブリ
ダイズさせた場合に得られた結果を図２に示す。これは、ｉ）検査したすべての
組織が標準型の遺伝子を発現したこと、ｉｉ）エキソン１０／１１からの転写体
を含まない他のエキソンスプライス産物が腫瘍および転移体に存在したこと、な
らびにｉｉｉ）上記の差はこの複合フィルターの種々のパネルおよび列のトラッ
クの装填が不均一だったことによるものではなく、選択的スプライシングによる
ものであることを示す。この実験の条件は、Ｘ線フィルムに対するフィルターの
露光時間（図１については１０時間、これに対し図３については１．５時間）以
外はすべてＥ４とのハイブリダイゼーションの場合と同じであった。実施例２ 結腸試料
結腸癌における所見は乳癌の場合と等しかった。たとえばすべての症例におい
て結腸癌組織はプローブＥ４につき（図３）正常な結腸粘膜その他の正常組織よ
り強く標識された、より大きな分子量のバンドをより多数示した。乳癌の場合と
同様に、プローブＰ２とのハイブリダイゼーションは標準形の分子（図４）と発
現程度の差を示さなかった。実施例３ 本方法の感度の検量
既知数のＨＴ２９結腸癌細胞を接種した末梢血白血珠のＰＣＲ産物のオートラ
ジオグラムの検査は、白血球１０7個の試料中に腫瘍細胞１０個の水準に減少す
るまで、腫瘍細胞に特徴的な付加的バンドの存在を示した。アッセイの条件を微
細に調整することにより、１０ｍｌの血液中に１個の腫瘍細胞を検出することが
可能であると考えられる。
上記のシリーズにおいて、新生物形成組織の試料はすべてＣＤ４４遺伝子の選
択的スプライス産物の過剰発現を示し、非−新生物形成組織からの試料はいずれ
もそれらを示さなかった。従って正常な試料および新生物由来の試料とＣＤ４４
発現パターンとの間には完全な対応があった。一例においては、現時点では転移
の臨床証拠を伴わない患者（患者Ｂ１６、図１Ａの列１４）から摘出した腫瘍が
、転移の可能性を示す発現のパターンをもつことが見出された。現在はこれが偽
陽性の結果であるか、または差し迫った転移の徴候であるかを知ることはできな
い。この患者は現在、追跡病院で観察されている。実施例４
本発明者らは、本発明者らの知見に従って下記のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを設計し、合成した：−
標準部分につき（スタメンコビック (Stamenkovic)，1989）
エキソンにつき（ホフマン(Hofmann)，1991）。Ｅ１およびＥ２はエキソン６上
にある。
直径０．５−１ｃｍの新鮮な組織試料を外科切除検体から、または剖検に際し
て得た。この研究に用いた試料はすべて、診断用試料を採取したのちに残る、他
の場合には廃棄されていた組織残屑から得られた。試料を病理検体受付区域に到
着して１０分以内に液体窒素中で瞬間凍結し、使用時まで液体窒素中に保存した
。
ｃＤＮＡはウイルス逆転写酵素により５μｇの全細胞ＲＮＡを鋳型として用いて
合成され、次いでプライマーＰ１およびＰ４を用いてＰＣＲ処理された。ＰＣＲ
増幅、電気泳動およびハイブリダイゼーションは標準条件下で実施された。
ＰＣＲ産物を放射性標識Ｅ２またはＥ４とハイブリダイズさせた場合、癌由来
のすべての試料が数種類のスプライス変異型を過剰発現したが、各プローブにつ
き見られたバンドパターンは異なっていた。従ってエキソン６産物に対するオリ
ゴヌクレオチドプローブは、新生物形成試料を非−新生物形成試料と区別する際
に極めて有効である。ただし少なくとも固形組織からの試料についてはＥ４より
著しく感受性が高いわけではないが、散在性の転移細胞または樹立した転移の由
来する器官を検出するのには恐らく有用であろう。次いで正常組織を含めてすべ
ての試料がＣＤ４４の標準部分を産生することを示すために、同一フィルターを
ストリッピングし、Ｐ２プローブとハイブリダイズさぜた。これによりＥ２およ
びＥ４でプロービングした正常試料と腫瘍試料につき得られた結果の間に見られ
た差がＰＣＲ産物の不均一な装填によるものではないことが確認された。総合的
な結果を表３に示す。これはこれらの変化が高範囲の一般的な癌に見られること
を指示する。
本発明者らは、骨格筋の悪性腫瘍を幾つか検査し、骨肉腫において同様な多重
スプライス変異型の著しい過剰発現のパターンを認めた。実施例５ 臨床採取した尿試料のＰＣＲアッセイによる癌の診断
各人から自然排泄した尿約５０ｍｌを得て、可能な限り速やかに研究室へ輸送
した。９０人の患者からの検体を検査した：４４は生検で証明された膀胱癌を伴
う患者からのもの、４６は膀胱の非−新生物形成性炎症（膀胱炎）を伴う患者お
よび正常なボランティアからのもの。十分に撹拌したのち、各１ｍｌの尿試料を
取り出し、細胞学的検査を行った。試料中の細胞の生存性を判定するために、他
の１ｍｌの尿をフルオレセインジアセテート−臭化エチジウム染色により検査し
た。残りの尿を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを使用時ま
で−７０℃に保持した。オリゴｄＴセルロース錠剤（インビトロジェン）を用い
てｍＲＮＡ抽出を行った。ｃＤＮＡはＡＭＶ逆転写酵素（インビトロジェン）を
用いて合成された。完成したｃＤＮＡ溶液を２本の試験管に等分した。一方は本
発明者らが診断に有用であることを見出した特定のｃＤＮＡ転写体を増幅するた
めのＥ１およびＥ５によるＰＣＲ用であり、他方は内部対照としての標準形のＣ
Ｄ４４（全スプライス変異型を含むもの、または含まないもの）を増幅するため
のＰ１およびＰ４によるＰＣＲ用である。
次いで３５サイクルのＰＣＲを実施した。サイクル条件は：９５℃で１分間、
５５℃で１分間、７２℃で２分間であった。すべての試料につき’ホットスター
ト（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）’法を採用した。結果を図８に示す。
等容量のＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲルの各列に装填し、臭化エチジ
ウムで染色した。尿中の細胞がエキソン６−エキソン１４のすべてのエキソンを
発現するはずのものであれば、現在のＰＣＲプロトコルによればプライマーＥ１
およびＥ４を用いて７３５ｂｐバンドが生成すると予想された。ＰＣＲがプライ
マーＥ１およびＥ５を用いて実施された場合、正常な尿または非−新生物形成性
膀胱炎を伴う患者の尿からのｃＤＮＡを含むトラック（１−８列）にはバンドが
ないが、膀胱癌を伴う患者からの尿試料（９−１６列）にはすべて明瞭な７３５
ｂｐのバンドが見られる（上方パネル）。
標準形のＣＤ４４を表す４８２ｂｐバンドは、ＰＣＲがＰ１およびＰ４を用い
て実施された場合、すべての例にほとんど等しく得られた（下方パネル）。これ
は、膀胱癌を伴う患者からの尿と対照からのものとの間の診断上重要な相異は、
トラックの不均一な装填によってではなく、ＣＤ４４遺伝子の選択的スプライシ
ングによって生じたものであることを示す。１−４列：正常な尿。５−８列：膀
胱炎の尿。９−１６列：膀胱癌を伴う患者１−８からのもの。
全体的結果において、この７３５ｂｐのバンドは正常な尿検体７例中７例およ
び膀胱炎に感染した尿検体９例中９例に全く存在しなかった；すなわち偽陽性０
％である。同様に膀胱癌を伴う患者からの尿試料１９例中１４例（７４％）が陽
性の結果を示した（すなわち偽陰性２６％）。偽陰性試料の場合、フルオレセイ
ン−ｄアセテート−臭化エチジウム染色により示されるように、生存癌細胞が不
足していた。実施例６
１２人の患者からの便を本明細書に記載した方法でアッセイした。結腸直腸癌
を伴う患者９人からの試料のうち５例は陽性の結果を与えた。正常な患者３人か
らの試料のうち３例すべてが陰性の結果を与えた。予備処理していない、細菌に
満ちた試料から得たこれらの様子は、実行可能な診断アッセイ法を容易に開発し
うるであろうという信念を肋成する。
この方法で腫瘍細胞を検出するための本発明者らによる他の経験において、下
記の所見はその診断能を調べる他の人々にとって有用であろう。認識すべき主な
考慮点は、結果の信頼性および再現性は試料から得られるｍＲＮＡの品質および
これらの技術を実施する際の配慮に著しく依存するということである。主な要件
は、確実に高品質のｍＲＮＡをルーティンに得ることにより、かつＰＣＲ増幅工
程の監視のために反応毎に内部標準品を用いることにより、偽陰性の結果を排除
することである。偽陽性は、さほど頻度が高くないことを前提として著しい問題
ではない。それらは同一または他の試料についてのレプリカアッセイにより、か
つ他の臨床データを参照して、認識しうるからである。
本発明者らは、腫瘍細胞を含有する少量の臨床試料において異常なＣＤ４４遺
伝子活性のルーティンＲＴ−ＰＣＲ検出を保証するために必要な方法を探査した
。
組織試料をアリコートに分割し、その半分を直ちに液体窒素中で凍結させ、その
残りを周囲温度に放置した場合、ＣＤ４４スプライス変異型の検出能が経時的に
、また検出取り扱い様式によって、どのように低下するかを示すことができる。
切除後、半時間以内にｍＲＮＡ抽出処理がなされた新鮮な試料は極めて信頼性の
ある結果を与え、新鮮な組織を周囲温度に放置した場合はその後の数時間にわた
って徐々に品質が低下する。試料をまず瞬間凍結した場合、解凍後直ちにＲＮＡ
を抽出した際に得られた結果は満足すべきものであるが、１５分以内から始まっ
て極めて急速に低下し、大きい方の変異型転写体が最初に喪失し、最終的には標
準形ですら喪失する。瞬間凍結した細胞および組織の試料を−７０℃に保存した
場合、４週間後には解凍後直ちにｍＲＮＡを抽出したとしても結果は低下すると
いうことも認められた。従って凍結に際して捕獲された細胞から放出されるリボ
ヌクレアーゼによるＲＮＡ分解は、より遅い速度ではあるがこの温度においてす
ら継続していると思われる。さらに予想されるように、ＲＮＡ抽出のために採取
した試料が壊死または線維症の領域からのものである場合、生存性腫瘍組織につ
き見られた典型的な結果は得られない。従って信頼性のあるデータを得るために
は、試料の選択および検体の処理に際して共に配慮を要する。
このことからみて、新鮮な試料を凍結するか、またはｍＲＮＡ抽出のために処
理するまで、２４時間を越えて保持しないこと；かつ解凍試料をｍＲＮＡ抽出の
ために処理するまで、２時間を越えて保持しないことが好ましい。
本明細書に記載する診断法は、１日以内に、恐らく数時間以内に実施すること
ができ、かつ自動化することができる。本方法の採用により種々の試料につきあ
らゆる種類の癌を検出することが証明され、血液および尿試料についても証明さ
れた。従って本発明者らはこれを癌のスクリーニングおよび診断のための実用的
方法として提供する。原則としてこれは癌の検出および予防プログラムに幅広い
一般的用途をもち、従って疫学および公衆衛生において有用である。その感度、
特異性および簡易性の適明な利用は、癌の初期診断のみでなく、身体の疾病の程
度の評価、治療効果の判定、および腫瘍再発の早期検出をも高める。図面の説明
：
略号：Ｎ＝正常、Ｔ＝原発性腫瘍、Ｍ＝転移図１
Ｅ４でプロービングした乳房組織試料からのＰＣＲ産物のオートラジオグラム
（Ｘ線フィルムを試料フィルターに１０時間露光）。パネルＡ：転移を伴う悪性
原発性乳癌。トラック１、２および３：患者Ｂ１；トラック４、５および６：患
者Ｂ２；トラック７、８および９：患者Ｂ３；トラック１０および１１：患者Ｂ
４；トラック１２および１３：患者Ｂ５。正常な乳房組織と比較して、原発性乳
癌およびそれらの転移沈着物は数種類のスプライス変異型を過剰発現することが
認められる。１５００ｂｐおよび１６５０ｂｐの二重項（矢印）がトラック５に
最も良く見える点に注目されたい。これはすべての腫瘍および転移体に存在する
が、他のトラックにおいてはこの露光時間ではかぶりを生じている。これは正常
な試料においてはいずれも、より長い露光時間（２３時間）ですら検出されない
。パネルＢ：転移の臨床証拠を伴わない乳癌。トラック１４−２０は患者Ｂ１５
−２１からのものである。これらの腫瘍はすべて数種類の変異型を過剰発現する
が、トラック１６（患者Ｂ１７）以外はバンドがより少なく、かつシグナル強度
がより低い−本文参照。１５００／１６５０ｂｐ二重項（矢印）は、この露光時
間ではトラック１５、１６および１８において容易に認められ、より長期間露光
すると腫瘍を含む他のトラックすべてにおいて検出可能となった。しかしこの図
は、より強いシグナルを示すトラックのかぶりを避けるために短い露光時間のみ
を示す。パネルＣ：乳房の線維腺腫および線維嚢胞性疾患。良性腫瘍試料（試料
Ｂ２２および２３）を含むトラック２１および２２は、トラック２３（試料Ｂ２
４）の非−新生物形成試料（線維性嚢胞疾患）より多く発現する。図２
Ｐ２でプロービングした乳房組織試料からのＰＣＲ産物のオートラジオグラム
（Ｘ線フィルムを試料フィルターに１．５時間露光）。この結果は、図１で用い
たものと同一フィルターを、ストリッピングによる先のプローブの除去後に再プ
ロービングすることにより得られた。この場合、下記のことが認められる：ｉ）
図１で見られた相異はトラックの不均一な装填によるものではない、ｉｉ）標準
形の分子の発現は他のいずれの変異型のものより量的に多い、ｉｉｉ）標準形は
検査したすベての組織において発現する、およびｉｖ）腫瘍においてはエキソン
３転写体を含まない他の変異型も存在し、過剰発現する。１５００／１６５０ｂ
ｐ二重項はパネルＡの腫瘍においては認められるが、パネルＢおよびＣにおいて
検出可能であるためにはより長期間の露光を必要とした。図３
Ｅ４でプロービングした結腸組織試料からのＰＣＲ産物のオートラジオグラム
（写真フィルムを試料フィルターに１０時間露光）。トラック１、２および３：
患者Ｃ１；トラック４、５および６：患者Ｃ２；トラック７、８および９：患者
Ｃ３；トラック１０および１１：患者Ｃ４；トラック１２および１３：患者Ｃ５
；トラック１４：正常な肝臓試料。この写真は図１の説明に記載したものと同じ
特色を示し、これらの所見が結腸癌にも適用されることを示す。１５００／１６
５０ｂｐ二重項（矢印）は、数個のトラック（２および８−１２）に容易に認め
られ、トラック３、５、６および１３の対応する位置におけるかすかなシグナル
は、より長期間露光すると、より強くなった。しかしトラック１、４、７または
１４（正常組織）においてはこの付近に何も現れなかった。図４
Ｐ２でプロービングした結腸組織試料からのＰＣＲ産物のオートラジオグラム
（写真フィルムを試料フィルターに１．５時間露光）。これはトラック装填が等
しいこと、および図２に示した他の点が結腸癌に適用されることを確認する。正
常な肝臓が標準形のＣＤ４４を発現することに注目されたい。図５
Ｅ４でプロービングした正常な末梢血白血球、ＰＢＬ（３人の異なる者）およ
び他の正常な組織のＰＣＲ産物のオートラジオグラム（パネルＡ：写真フィルム
を試料フィルターに８時間露光）およびＰ２でプロービングしたもの（パネルＢ
：写真フィルムを試料フィルターに５時間露光）。トラック６は乳癌（患者Ｂ１
）からのＰＣＲ産物を陽性対照として含む。プライマーおよびプローブのこの組
み
合わせで、白血球は標準形のＣＬ４４分子を発現するが、検出可能なスプライス
変異型を発現しないことが分かる。トラック４および５の試料は下記のように新
生物形成の臨床証拠を伴わない個体からのものであった：トラック４、細菌性心
内膜炎で死亡した婦人の身体から剖検に際して得た乳戻組織：トラック５、腸捻
転のため切除した結腸。
参考文献
１．スタメンコビック、アミオット、ペサンド、シード
(Stamenkovic,Amiot M, Pesando J. M, Seed B.)
リンパ節ホーミングに関与するリンパ球分子は軟骨連結蛋白質族の１員である。
Cell 1989; 56: 1057-062.
２．バーチ、ミッチェル、ハート (Birch M, Mitchell S, Hart I.R.)
高水準および低水準のＣＤ４４を発現するヒト黒色腫細胞変異型の単離および解
明。 Cancer Res. 1991; 51: 6660-6667.
３．グンタート、ホフマン、ルディー、レーべル、ゾラー、ハウプマン、マズク
、ウェンゼル、ポンタ、ヘルリッヒ
（Gunthert U, Hofmann Ｍ, Rudy W, Reber S,Zoller M, HauBmann, Matzku S,
Wenzel A, Ponta H,Herrlich P.)
糖蛋白質ＣＤ４４の新変異型がラット癌細胞に転移能力を付与する。
Cell 1991; 65: 13-24.
４．サイ、ガオ、スタメンコビック(Sy M S, Guo Y-J, Stamenkovic I.)
２種類のＣＤ４４イソ型がインビボで腫瘍の増殖に及ぼす異なる作用。
J. Exp. Med 1991; 174: 859-866.
５．ホフマン、ルディー、ゾラー、トルク、ポンタ、ヘルリッヒ、グンタート
(Hofmann M, Rudy W, Zoller M, Tolg C, Ponta H,Herrlich P, Gunthert U.)
ＣＤ４４スプライス変異型がラットにおいて転移挙動を付与する：相同配列がヒ
ト腫瘍細胞系において発現される。
Cancer Res. 1991; 51: 5292-5297.
６．スタメンコビック、アルフォ、アミオット、シード
(Stamenkovic I, Aruffo A, Amiot M, Seed B.)
造血形と上皮形のＣＤ４４は、ヒアルロン酸保有細胞に対する異なる付着能力を
もつ異なるポリペプチドである。
EMBO J. 1991; 10: 343-348.
７．ジャクソン、バックレイ、ベル(Jackson D. G, Buckley J, Bell J. I.)
細胞外ドメイン内の単一部位への挿入により形成されたヒトリンパ球ホーミング
受容体ＣＤ４４の多数の変異型。
J. Biol. Chem. 1992; 267: 4732-4739.
８．コムジンスキー、サッチ (Chomzynski P, Sacchi N.)
酸性グアニジニウム チオシアンテート−フェノール−クロロホルム抽出による
ＲＮＡ単離のための１工程法。
Anal Biochem. 1987; 162: 156.
９．クヌドソン (Knudson A. G.)
遺伝性癌、癌遺伝子および癌抑制遺伝子。
Cancer Res. 1985; 45: 1437-43.
１０．タリン (Tarin D.) 腫瘍の転移。
OxfordTextbook of Pathology 1992; （監修者：オドマッギー、ライト
、アイザックソン(J O'DMcGee, N. A. Wright, P. G. Isaacson)）オックスフォ
ード・ユニバーシティー・プレス、オックスフォード、ｐ.607-633。
１１．ハイレ、ダーリン、テイラー、タリン
(Hayle A. J, Darling D. L, Taylor A. R, Tarin D)
転移性腫瘍細胞系からの全ゲノムＤＮＡを用いる転移能力のトランスフェクショ
ン。Differentiation,1993,印刷中。
１２．スクリートン、ベル、ジャクソン、コーネリス、ゲルス、およびベル
(Screaton G. R., Bell M. V., Jackson D. G.,Cornelis F. B., Gerth U., and
Bell J. I.)
リンパ球ホーミング受容体ＣＤ４４をコードするＤＮＡのゲノム構造が、少なく
とも１２の選択的スプライシングされたエキソンを示す。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 889, p 12160-4,
1992年12月、免疫学。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ
Ｇ０１Ｎ 27/447
33/53 Ｄ 8310−2Ｊ
33/534 8310−2Ｊ
33/574 Ｚ 8310−2Ｊ
(31)優先権主張番号 ９２ ２６ １６５．０
(32)優先日 1992年12月16日
(33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ