JPH08500819A - 幹細胞及びリンパ球の貯蔵法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳動物から採取されたリンパ球及び／或いは幹細胞をゼラチンを含む水性培地に懸濁することによって安定化する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 幹細胞及びリンパ球の貯蔵法発明の背景 本発明は幹細胞及びリンパ球を許容しがたい細胞機能の消失を起こさずに貯蔵 する方法に係わる。 幹細胞は多機能性の未分化細胞であり、即ち、これらの細胞は多様な機能的特 性を持つ細胞に分化することが出来る。これらの細胞は完全には分化せず、２つ に分裂する能力を保持する。特に興味深いのは、リンパ球と骨髄細胞に分化する リンパ造血性幹細胞である。リンパ造血性幹細胞には多くの他の細胞のみならず 以下の細胞が含まれる。即ち、a）顆粒球／単球に対するコロニー形成細胞（CFC -GM）、b）赤血球に対するコロニー形成細胞（BFU-E）、c）好酸球に対するコロ ニー形成細胞（CFC-Eo）、d）多型潜在性コロニー形成細胞（CFC-GEMM）、e）Ｂ 細胞及びＴ細胞の前駆細胞を含む未成熟リンパ球の前駆細胞、及び、f）多機能 性前駆細胞である。図１は造血に関与する幹細胞に含まれる種々の細胞を図示す る市場に配布されているチャートである。 幹細胞は移植、例えば、骨髄移植に必須である。典型的な例として、骨髄移植 は、骨髄細胞を採取し、望ましくない細胞及び物質（例、T細胞及び／又は悪性 腫瘍細胞）を除去するために緩衝液で洗浄して、適当な培地（例、ＲＰＭＩ、同 系の血清、及びDMSO）へ懸濁することが含まれる。その結果得られた材料は、直 ちに受容者に注入されるか、或いは将来利用するために凍結保存（０℃より十分 に低い温度で凍結して）される。末梢血の幹細胞もまた骨髄移植に用いられる。 幹細胞は末梢血から白血球搬出法により、以下に述べる類似の操作で得られる。 Civinの米国特許第4,714,680号、第4,965,204号、及び第5,035,9994号には、 正常の成熟したヒトのリンパ球及び骨髄細胞上の抗原に対するものではなく、ヒ トの多機能性リンパ造血性幹細胞上の抗原に対する単クローン性抗体が記載され ている。塚本らの米国特許第5,061,620には、ヒトのリンパ造血性幹細胞、その 分離、特徴決定、及び利用が記載されている。これらの特許は、夫々、本申請に 参考文献として組込まれている。これらの及び他の急速に進歩しつつある技術は 、 骨髄移植及び他の医療操作を、現在、この治療を受けることの出来るよりも遥か に大きな患者人口に対して適用可能にするであろう。 リンパ球系統群には、リンパ球幹細胞から分化した結果出来た細胞（T細胞、B 細胞とプラズマ細胞）ならびにリンパ球幹細胞も含まれる。図１参照。種々の条 件下では、ある種のリンパ球に富み、及び／或いは他の種の細胞の欠損している 細胞母集団を得ることが望ましい。例えば、悪性化した、或いは感染したリンパ 球のある種の母集団を破壊するのが望ましいことがある。代わりに、患者のリン パ球を体外で活性化（例えば、IL-2により）してから患者に再注入することが望 ましいことがある。簡単に述べると、幹細胞或いはリンパ球を体外で処理、及び ／或いは工作して、処理細胞を体内にもどす種々の技法が知られている。最後に 、遠隔地の患者に対して、移植の準備における組織適合性試験をするためリンパ 球を遠隔地に輸送の必要がある可能性があり、輸送の間、貯蔵が必要である。 上述の技法に加えて、リンパ球或いは幹細胞の母集団を選別、または選択的に 濃縮、或いは破壊するための種々の技法が知られている。例えば、他の技法には 、ワシントン州、シアトル市セルプロ社（CellPro,Inc.）発売のセプレイト^TM（ CEPRATE^TM）幹細胞濃縮器、選り分け法、細胞選別（例、蛍光抗体による細胞選 別）、及び磁性ビーズが含まれる。 幹細胞及び／或いはリンパ球を、採取した後（例えば、塚本らの記載の如く） 及び使用する前に、貯蔵する便利で効果的な手段が特に要望されている。発明の開示 本発明は哺乳動物（特にヒト）から得られた幹細胞或いはリンパ球をゼラチン を含む混合水溶液（或いは貯蔵用混合物）に懸濁して安定化する方法を特徴とす る。 好適な実施態様において、当該細胞はこの様な混合物に24時間を越える期間（ 最も好適には36、48、60時間、または72時間でさえも）、凍結点から25℃の間の 温度で懸濁されることが望ましい。修飾液性ゼラチンが好適であるが、未修飾ゼ ラチンもまた使用出来る。いかなる幹細胞或いはリンパ球もこの方法によって貯 蔵可能であるが、前述のリンパ造血性細胞（特に多機能性幹細胞）はとりわけこ の貯蔵法に適している。好適な培地は、ゼラチンの濃度が貯蔵用混合物（当該 細胞を含めて）が40℃以下でゲル化せず、貯蔵の間、幹細胞が存在する様な濃度 のゼラチン（例えば、修飾液性ゼラチンを6-25重量パーセントの濃度）を含む。 好適には、当該混合物は標準の細胞組織増殖培地を含む。以下、好適な適用にお いて述べられる様に、当該混合物はヒト患者への投与に対し製剤学的に許容され るものである。血清使用は任意であり、本発明は実質的に血清を含まず、本質的 に細胞増殖培地、或いは緩衝液、ゼラチン及び貯蔵される細胞だけからなる混合 物で使用されてもよい。しかしながら、血清には利点があり、例えば、任意に10 -75重量パーセントの血清を含む培地を用いて本発明を実行することも可能であ る。懸濁されている当該細胞は、元の標品と比べて、例えば、骨髄或いは白血球 搬出法から希望する細胞の部分母集団を濃縮してもよい。 本発明の特色と利点は、以下の好適な実施態様と特許請求の範囲から明らかに なるであろう。好適な実施態様の記述 本発明の好適実施態様に関する以下の記述は本発明の説明を意図するもので本 発明を制限するものではない。 Ｉ．幹細胞 当業者は、爾後の使用のために適切に貯蔵出来る幹細胞を採取する既知の方法 のあることは承知しているであろう。当該幹細胞は、骨髄または末梢血から得る ことが出来る。幹細胞は既知の技法により、例えば、塚本らの特許、或いはCivi nの特許に開示されている技法、いずれも前に引用され本出願に組込まれている 、を用いて精製することが出来る。他のこの様な技法もまた前に引用されている 。本発明は未修飾の骨髄、或いは白血球搬出法由来の標品の様な混合幹細胞標品 の貯蔵に用いることがで出来る。本発明は、又、未修飾の骨髄、或いは白血球搬 出法由来の標品で、選択幹細胞濃縮、又は、他の細胞濃縮法、例えば、ワシント ン州、シアトル市のセルプロ社（CellPro,Inc.）によるセプレイト^TM（CEPRATE^{T M} ）系の様な免疫親和分別系を用いて濃縮した標品の貯蔵に使用することも出来 る。 前記の討論は、一般的に、リンパ造血性幹細胞、特に、多機能性幹細胞に対す るものであるが、神経幹細胞、上皮幹細胞及びその他を含め他のタイプの幹細胞 も本発明の方法によって貯蔵することが出来る。当業者は、この様な細胞を既知 の技法によって入手することが出来るであろう。 ＩＩ．リンパ球 当業者は、種々のリンパ球を細胞表面上のマーカーに基づいて区別する多数の 単クローン性抗体を知っている。これらの抗体は、前述の免疫学に基づく種々の 細胞選別法に用いて、骨髄或いは白血球搬出法によって得られた細胞母集団を、 特定のリンパ球を得るために選択的に濃縮、又は減少することが出来る。標準の 方法で処理された末梢血は、混合物［例、バッフィーコート（軟層）］の回収に 用いることが出来、それよりリンパ球の部分母集団が精製される。 ＩＩＩ．貯蔵混合物、或いは構成物 好適な貯蔵混合物には、Babiorの米国特許第4,923,797に記載されている様に 、一般に修飾液性ゼラチンを使用され、これは本出願に引用文献として組込まれ ている。修飾液性ゼラチンは、臨床的に血清代用品、或いは血清増量剤として用 いられており、プラズマゲル（PlasmaGel）、ヘマクセル（Haemaccel）、ロイコ ゲル（Leukogel）、ゼロヒュウジン（Gelofusine）等の種々の商品名で広く入手 出来る。一般に、これらの物質は、部分的に加水分解されたゼラチンで、平均分 子量15,000から40,000ダルトンであり、同濃度のゼラチン溶液よりも低い粘度を 持つ水溶液になっている。ある場合には、これらの物質は、スクシニル化され、 或いは、反応して、例えば、尿素結合を形成したり、又は、架橋されている。市 場で入手出来る物質は、種々の塩類及び他の成分と共に緩衝液中で修飾ゼラチン の溶液の形になっている。本出願に用いられている様な「修飾液性ゼラチン」と いう用語は、さらに反応を受けているにしろ、いないにしろ、部分的に加水分解 されたゼラチン成分自体を指すものである。ある場合には、市場で購入可能の溶 液を使用出来るが、好適には、当該部分的に加水分解されたゼラチンは、市販品 の残余の成分から分離することによって精製される。 好適な混合物は、RMPI或いはイーグルの培地の様な標準の組織細胞培養生育培 地を含む。本発明の混合物に等張性を与えるために通常の緩衝溶液を用いること も可能である。例えば、通常の緩衝液、例えばハンクの均衡塩類溶液である。Ba biorの米国特許4,923,797号に述べられている様に、異項環塩基を貯蔵混合物に 加えることが可能で、任意である。 任意に、血清を当該混合物に加えることも出来る（或いは、血清は元の患者の サンプルから保持していることも出来る）。当該血清は、正常のヒト血清であり 、貯蔵される細胞と同一固体由来、或いは別固体由来であるが、好適には同一固 体由来である。もし血清が使用されると、当該混合物中に存在する血清量は、細 胞を除外した全混合物に基づいて重量で10-75パーセントであり得る。 混合物中の修飾液性ゼラチンの量は、貯蔵される細胞を除外した全混合物に基 づいて 4％から、40℃で当該混合物がゲル化を起こす様な量迄、相当に変動する ことがある。至適結果を得るために必要な量は、当該修飾液性ゼラチンの供給源 によって変動するが、いかなる場合も単純な検査で容易に決定することが出来る 。 所望の細胞タイプに基づき、細胞の生存率を維持するために必要に応じて、細 胞特異的な成長因子を加えるのも随意である。 幹細胞或いはリンパ球は、適当な量で、当該混合物に懸濁することが出来る。 幹細胞或いはリンパ球を含有する混合物の貯蔵の間、25℃迄の高温にも比較的短 時間であれば耐えられるが、 8℃以下の温度に維持することが望ましい。至適貯 蔵生存の間、貯蔵温度は 4℃或いはそれ以下に、しかしながら凍結温度以下では ない温度に維持すべきである。 貯蔵後、幹細胞或いはリンパ球を含む混合物は、加温後、さらに操作を加える ことなく投与することが出来る。又は、幹細胞は、いかなる他の望ましい培地に 当該細胞を懸濁することが出来る様に、洗浄或いは遠心により混合物から分離す ることが出来る。 本発明は血液銀行、研究所、又は他の団体に貯蔵されるべき細胞懸濁との混合 に適したストック溶液を、適切な比率でストック溶液を当該懸濁液と混合するた めの指示書を付けて供給することによって実用化する可能性も考慮されている。 この様なストック溶液は、前述の様に、組織培養培地、或いは他の緩衝液からな り、修飾液性ゼラチンを重量で約 4-8％から、溶液を室温でゲル化を起こす量迄 、好適には重量で20から40％を含む。前述の他の任意の成分も含まれることがあ る。 別の貯蔵培地はBabiorの米国特許第4,639,373に全般的に記載されている様に ゼラチンを使用し、これは本出願に参考引用して組込まれている。この実施態様 において、使用される緩衝液は前述の如く通常の組織培養培地、或いは無毒の緩 衝液であってよい。ゼラチン含有緩衝液中の当該細胞は、約25℃迄のより高温で も少なくとも12時間は貯蔵可能で満足な結果が得られるが、最善の結果を得るた めには、低温、例えば８℃以下の温度で貯蔵すべきである。 本発明の実施に当っては、いかなる通常の販売源からのゼラチンでも使用でき る。ゼラチン量は、一部、貯蔵の希望期間によって大幅に変動する。 使用量については、貯蔵後のゼラチン除去を容易にするため、混合物が40℃よ り高くない温度でゲルよりも液状である様に十分低くなければならないこと以外 には、何ら重要な上限はない。 血清を使用する場合、それは正常のヒト血清、或いは同一個人の血清でよい。 血清の量は、重量にして全混合物の10％から上は75％迄変動することがある。 ＩＶ．貯蔵細胞の利用 貯蔵後、幹細胞は、存在するいかなるゼラチンも液化するために40℃よりも高 くない温度迄加温する以外はそれ以上の操作を加えることなく輸注することが出 来る。或いは、当該細胞を、貯蔵に用いた緩衝液と同じか、又は別のものであっ ても構わないが、ゼラチン又は血清（もし、いくらかでも存在すれば）緩衝液で 単に洗浄除去し、或いは、ゼラチン含有緩衝液を遠心により除去し、次いで幹細 胞を希望する緩衝液又は培地に再懸濁することにより使用に適する様に再構成す ることが出来る。 請求の範囲は次の通りである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物から得られたリンパ球或いは幹細胞である細胞を安定化する方法 であって、当該細胞を提供し、当該細胞をゼラチンを含む混合水溶液に懸濁する ことからなることを特徴とする方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、さらに当該細胞をゼラチンを含む混合水 溶液に24時間を越える期間維持することからなることを特徴とする方法。 ３．請求項２に記載の方法であって、当該細胞をゼラチン含有の混合水溶液に 、凍結点と25℃との間の温度に、24時間を越える期間貯蔵することを特徴とする 方法。 ４．請求項１に記載の方法であって、当該混合物が修飾液性ゼラチンを含むこ とを特徴とする方法。 ５．請求項１に記載の方法であって、当該混合物が組織培養培地を含むことを 特徴とする方法。 ６．請求項１に記載の方法であって、当該細胞が幹細胞であることを特徴とす る方法。 ７．請求項６に記載の方法であって、当該細胞が多機能性幹細胞であることを 特徴とする方法。 ８．請求項３に記載の方法であって、当該混合物が血清を含むことを特徴とす る方法。 ９．請求項８に記載の方法であって、当該混合物が重量で10-75パーセントの 血清を含むことを特徴とする方法。 １０．請求項１に記載の方法であって、当該ゼラチンが、当該混合物（当該細 胞を含めて）が40℃でゲル化を起こすよりも少ない量で存在することを特徴とす る方法。 １１．請求項１に記載の方法であって、当該ゼラチンが、当該細胞を含む当該 混合物の重量にして少なくとも１パーセントであることを特徴とする方法。 １２．請求項１に記載の方法であって、当該混合物がヒト患者への投与に対し て薬剤学的に許容出来るものであることを特徴とする方法。 １３．請求項１に記載の方法であって、当該細胞が所望の細胞部分母集団を 得るため濃縮され、次いで当該混合水溶液に懸濁されることを特徴とする方法。