JPH08500837A - Ｍａｇｅ−３遺伝子から誘導されてｈｌａ−ａ１により提示される単離されたノナペプチドおよびそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＭＡＧＥ−３遺伝子によりコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導されるノナペプチドに関する。このノナペプチドは、ＨＬＡ分子であるＨＬＡ−Ａ１により提示される。その結果得られる複合体を細胞傷害性Ｔ細胞により同定する。そのような評価を診断または治療に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＡＧＥ−３遺伝子から誘導されてＨＬＡ−Ａ１により提示される単離されたノ ナペプチドおよびそれらの用途 本出願は、１９９２年８月３１日出願の同時係属出願第０７／９３８，３３４ 号、および１９９３年３月２６日出願の同第０８／０３７，２３０号の一部継続 出願である。発明の分野 本発明は、免疫遺伝学およびペプチド化学に関する。詳細には本発明は、免疫 原として、またＨＬＡ−Ａ１分子の標的として有用であることを含め、種々の点 で有用なノナペプチドに関する。とりわけ本発明は、ＭＡＧＥ−３遺伝子により コードされている腫瘍拒絶抗原(tumor rejection antigen)前駆体から誘導され 、ヒト白血球抗原であるＨＬＡ−Ａ１により提示される、いわゆる「腫瘍拒絶抗 原」に関する。背景と従来技術 宿主有機体による癌細胞の認識または認識欠如に関する研究は、多くの異なっ た観点で続けられてきた。該分野を理解するということは、基礎免疫学および腫 瘍学の両方を幾分理解することであろうと考えられる。 マウス腫瘍に関する初期の研究により、同系動物に移植した場合、そのマウス 腫瘍が腫瘍細胞の拒絶を導く分子を呈すことがわかった。これらの分子は、受容 動物においてＴ細胞により「認識」され、移植細胞の溶解と共に細胞傷害性Ｔ細 胞応答を引き起こす。この証拠は、インビトロにおいてメチルコラントレンとい ったような化学発癌物質により誘発される腫瘍を用いることで初めて得られた。 腫瘍により発現されてＴ細胞応答を誘起する抗原は、腫瘍毎に異なることが分か った。化学発癌物質による腫瘍の誘発と細胞表面抗原の相違に関する一般的教示 に ついては、Ｐrehnら，Ｊ.Ｎatl.Ｃanc.Ｉnst.１８：７６９−７７８（１９５７ ）；Ｋleinら，Ｃancer Ｒes.２０：１５６１−１５７２（１９６０）；Ｇross, Ｃancer Ｒes.３：３２６−３３３（１９４３）；Ｂasombrio，Ｃancer Ｒes.３ ０：２４５８−２４６２（１９７０）を参照。このクラスの抗原は、「腫瘍特異 的移植抗原」または「ＴＳＴＡｓ」として知られるようになった。化学発癌物質 により誘発されてそのような抗原提示が観察された後に、インビトロにおいて紫 外線照射により腫瘍が誘発される場合にも同様の結果が得られた［Ｋripke，Ｊ. Natl.Ｃanc.Ｉnst.５３：３３３−１３３６（１９７４）を参照］。 上記腫瘍タイプの場合にＴ細胞媒介性の免疫応答が観察されたのに対し、自然 発生腫瘍は一般に非免疫原性であると考えられた。従って、自然発生腫瘍には、 腫瘍ができている患者の腫瘍に対して応答を引き起こす抗原は存在しないと確信 された［Ｈewittら，Ｂrit.Ｊ.Ｃancer ３３：２４１−２５９（１９７６）を参 照］。 一連のtum^-抗原を提示するセルラインは、ＢoonらのＪ.Ｅxp.Ｍed.１５２：１ １８４−１１９３（１９８０）［この開示は引用によって包含される］で記載さ れているように、マウス腫瘍細胞またはセルラインの突然変異誘発により得られ る免疫原性変異体である。詳述すると、tum^-抗原は、同系マウスにおいて免疫応 答を起こさず、また腫瘍を形成する腫瘍細胞（すなわち、「tum⁺」細胞）を突然 変異することにより得られる。これらのtum⁺細胞を突然変異すると、それらは同 系マウスにより拒絶されて、腫瘍を形成しなくなる（すなわち、「tum^-」）［Ｂ oonら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７４：２７２（１９７７）を参照］［ この開示は引用によって包含される］。この現象を起こす多くの腫瘍タイプが示 されている［例えば、Ｆrostら，Ｃancer Ｒes.４３：１２５（１９８３）を参 照］。 tum^-変異体は、免疫拒絶反応を開始させるので、進行性腫瘍を形成しないよう に思われる。この仮説を支持する証拠には、腫瘍の「tum^-」変異体、すなわち通 常は腫瘍を形成しない変異体が、亜致死性照射により免疫系が抑制されたマウス において腫瘍を形成できること［Ｖan Ｐelら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳ Ａ ７６：５２８２−５２８５（１９７９）；およびtum^-細胞である肥満細胞腫 Ｐ８１５を腹腔内注射すると、１２〜１５日間指数的に増殖した後、リンパ球お よびマクロファージが流入する中、僅か数日で排除されるという観察［Ｕyttenh oveら，Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１５２：１１７５−１１８３（１９８０）］が包含される 。さらなる証拠には、免疫抑制量の放射線を与えても、マウスが、同じtum^-変異 体に対する再刺激に耐えるのを可能とする免疫記憶を、その後の細胞の再刺激に よって獲得するという観察が包含される［Ｂoonら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ ＳＡ ７４：２７２−２７５（１９７７）；Ｖan Ｐelら，上記；Ｕyttenhoveら ，上記］。 その後の研究により、自然発生腫瘍が突然変異誘発を受けると、応答を引き起 こす免疫原性変異体が生成されることが分かった。それどころか、これらの変異 体は、元の腫瘍に対する免疫防御応答を誘起することができた［Ｖan Ｐelら， Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１５７：１９９２−２００１（１９８３）を参照］。こうして、 同系拒絶応答の標的である腫瘍において、いわゆる「腫瘍拒絶抗原」の提示を誘 起するのが可能であるということが示された。外来遺伝子を自然発生腫瘍にトラ ンスフェクトした場合にも同様の結果が得られた［このことに関しては、Ｆears onら，Ｃancer Ｒes.４８：１９７５−１９８０（１９８８）を参照］。 腫瘍細胞表面に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞に認識されて、細胞溶解を引き起 こす抗原クラスが認められている。このクラスの抗原を以後、「腫瘍拒絶抗原」 または「ＴＲＡｓ」と称する。ＴＲＡｓは、抗体応答を誘起したり、しなかった りする。これらの抗原が研究されてきた範囲は、インビトロにおいての細胞傷害 性Ｔ細胞による特性付け研究、すなわち、ある特定の細胞傷害性Ｔ細胞（以後、 「ＣＴＬ」と称する）サブセットによる抗原の同定に関する研究である。該サブ セットは、提示された腫瘍拒絶抗原を認識して増殖し、抗原を提示している細胞 を溶解する。特性付け研究では、抗原を発現している細胞を特異的に溶解するＣ ＴＬクローンが同定された［こういつた研究例は、Ｌevyら，Ａdv.Ｃancer Ｒes .２４：１−５９（１９７７）；Ｂoonら，Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１５２：１１８４−１ １９３（１９８０）；Ｂrunnerら，Ｊ.Ｉmmunol.１２４：１６２７−１６３４（ １９ ８０）；Ｍaryanskiら，Ｅur.Ｊ.Ｉmmunol.１２４：１６２７−１６３４（１９ ８０）；Ｍaryanskiら，Ｅur.Ｊ.Ｉmmunol.１２：４０６−４１２（１９８２） ；Ｐalladinoら，Ｃanc.Ｒes.４７：５０７４−５０７９（１９８７）に見い出 すことができる］。こういったタイプの分析は、副組織適合抗原、雌に特異的な Ｈ−Ｙ抗原、および「tum^-」抗原と称し、本明細書中で論じたクラスの抗原等、 ＣＴＬｓにより認識される他のタイプの抗原に必要である。 上記内容の代表的腫瘍は、Ｐ８１５として知られている［ＤeＰlaenら，Ｐroc .Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８５：２２７４−２２７８（１９８８）；Ｓzikora ら，ＥＭＢＯ Ｊ ９：１０４１−１０５０（１９９０）、およびＳibilleら，Ｊ .Ｅxp.Ｍed.１７２：３５−４５（１９９０）を参照］［この開示は引用によっ て包含される］。Ｐ８１５腫瘍は肥満細胞腫であり、ＤＢＡ／２マウスにおいて メチルコラントレンで誘発され、またインビトロにおける腫瘍およびセルライン として培養されている。Ｐ８１５系は、突然変異誘発後、Ｐ９１Ａ［ＤeＰlaen ，上記］、３５Ｂ［Ｓzikora，上記］、およびＰ１９８［Ｓibille，上記］と称 する変異体を含め、多くのtum^-変異体を生成する。腫瘍拒絶抗原とは対照的に（ これが重要な特徴である）、tum^-抗原は、腫瘍細胞が突然変異誘発された後にし か存在しない。腫瘍拒絶抗原は、突然変異誘発することなく特定の腫瘍細胞に存 在する。従って、文献に関し、セルラインは、「Ｐ１」と称する系のようなtum⁺ となって、tum^-変異体の産生を誘起することができる。tum^-表現型は親系の表現 型とは異なるので、tum^-セルラインはそれらの親tum⁺系と比べてＤＮＡが違うで あろうと予想され、この違いは、tum^-細胞における重要な遺伝子の位置を決定す るのに利用することができる。その結果、Ｐ９１Ａ、３５ＢおよびＰ１９８とい ったようなtum^-変異体の遺伝子は、遺伝子のコード領域における点突然変異によ り、それらの正常な対立遺伝子とは違うということが分かった［Ｓzikoraおよび Ｓibille，上記、並びにＬurquinら，Ｃell ５８：２９３−３０３（１９８９） を参照］。このことは、本発明のＴＲＡｓではあてはまらないことが証明されて いる。これらの文献はまた、tum^-抗原から誘導されるペプチドがＬ^d分子に提示 されてＣＴＬsに認識されるということをも実証した。Ｐ９１ＡはＬ^dにより、Ｐ ３５は Ｄ^dにより、またＰ１９８はＫ^dにより提示される。 本願と同じ譲受人に譲渡された、１９９２年５月２２日出願のＰＣＴ出願ＰＣ Ｔ／ＵＳ９２／０４３５４では、ＭＡＧＥ族と称する、一連のヒト腫瘍拒絶抗原 前駆体コード遺伝子を教示している。これらの遺伝子の幾つかはまた、van der ＢruggenらのＳcience ２５４：１６４３（１９９１）でも論じられてもいる 。ＭＡＧＥ族の種々の遺伝子が腫瘍細胞において発現し、そのような腫瘍の診断 用マーカーとして、さらにはまた本明細書中で論じる他の目的のためのマーカー として働き得るということは現在明らかである［Ｔraversariら，Ｉmmunogeneti cs３５：１４５（１９９２）；van der Ｂruggenら，Ｓcience ２５４：１６４ ３（１９９１）もまた参照］。タンパクがプロセッシングされて細胞表面に提示 される機序は、現在かなりよく文献で示されている。［該分野の開発に関する大 まかな経緯は、Ｂarinaga，「Ｇetting Ｓome´Ｂackbone´：Ｈow ＭＨＣ Ｂi ndsＰeptides」，Ｓcience ２５７：８８０（１９９２）に見い出すことができ る；Ｆremontら，Ｓcience ２５７：９１９（１９９２）；Ｍatsumuraら，Ｓci ence２５７：９２７（１９９２）；Ｌatronら，Ｓcience ２５７：９６４（１ ９９２）もまた参照］。一般的に、これらの文献では、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子に結 合するペプチドとして９個の長さのアミノ酸（「ノナペプチド」）が必要である こと、またノナペプチドの１番目および９番目の残基の重要性を教えている。 遺伝子のＭＡＧＥ族に関する研究により、実際に特定のノナペプチドが腫瘍細 胞の表面に提示され、ノナペプチドの提示には、提示する分子がＨＬＡ−Ａ１で あることを要することが現在明らかにされている。ＭＡＧＥ−１腫瘍拒絶抗原（ 「ＴＲＡ」または「ノナペプチド」と称する）の複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ 「ＣＴＬｓ」と称する）により該抗原を提示している細胞の溶解を引き起こす。 こういった観察は、本明細書中で論じるように、診断および治療の両方に関係が ある。 例えば、本願の親出願である、１９９２年８月３１日出願の米国特許出 願第０７／９３８，３３４号に示されている研究では、種々のＭＡＧＥ遺伝子の 相同領域を、関連のあるノナペプチドをコードするＭＡＧＥ−１遺伝子領域と比 較すると、高い相同性があるということが示された。それどころか、これらの観 察により、全て同じＮ末端およびＣ末端アミノ酸を有する一連のノナペプチドで あるという、本明細書中で開示特許請求する本発明の一態様が導かれた。これら のノナペプチドは、単独での、または担体ペプチドと組み合わせた免疫原として の使用を含め、種々の目的に有用であるとして記載した。ノナペプチドは、抗原 性エピトープを構成するのに十分な大きさであり、それに対して生成される抗体 は、ノナペプチドが単独で存在しても、またはより大きなポリペプチドの一部と して存在するとしても、そのノナペプチドを同定するのに有用であるとして記載 した。 ノナペプチドは、メラノーマのような腫瘍細胞の表面上の種々のＨＬＡサブタ イプを同定するのに有用であると記載した。この能力により、ノナペプチドは、 診断用マーカーおよび治療薬の両方に役立つ。これらの特徴を以下に論じる。 ノナペプチドをコードする核酸配列は本明細書中にも記載している。これらの 核酸配列はまた、腫瘍の有無を診断するプローブとしても有用であると記載した 。 また本出願により、ヒト以外の細胞をヒトＨＬＡ分子をコードする核酸配列で トランスフェクトできる細胞モデルを使用できたということを如何にして見い出 したかをも示した。次いで、その結果得られるトランスフェクタントは、特定の ＨＬＡ分子に関するノナペプチド特異性を試験するのに、またはＭＡＧＥ遺伝子 での別のトランスフェクションを目的として使用することができる。同時トラン スフェクタントは、ＭＡＧＥを基礎とする特定のＴＲＡが特定のＨＬＡ分子によ り提示されるかどうかを決定するのに使用することができた。 本発明は、先の２つの親出願に記載されているぺプチドの１つに関する。とり わけ、ＭＡＧＥ−３によりコードされている腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導される ノナペプチド： Ｇlu Ｖal Ａsp Ｐro Ｉle Ｇly Ｈis Ｌeu Ｔyr は、ヒト白血球抗原であるＨＬＡ−Ａ１により提示されることが現在見い出され ている。この発見とそれらの結果を以下の開示に記載する。図面の簡単な説明 図１は、ＭＡＧＥ−１遺伝子の３００塩基対フラグメントが関連のある腫瘍拒 絶抗原をコードするとして同定された操作の概要を説明している。 図２は、細胞を種々のＭＡＧＥ−１ペプチドと共にインキュベートした細胞溶 解研究を示している。 図３は、ＭＡＧＥ−１ノナペプチドの存在下にＨＬＡ−１遺伝子でトランスフ ェクトされたマウス細胞の溶解と、ＭＡＧＥ−１をコードする配列で同時トラン スフェクトした場合のマウス細胞の溶解とを比較している。 図４は、種々のＭＡＧＥ遺伝子の相同部分から得られるノナペプチドと、これ らのノナペプチドをコードする核酸配列とを比較している。 図５は、種々のセルラインに対してＣＴＬクローン２０／３８を用いるクロミ ウム放出アッセイの結果を示している。 図６は、ＣＴＬクローン２０／３８の抗原特異性を決定するために試みたアッ セイの結果を示している。 図７は、ＴＮＦ放出アッセイをトランスフェクトされた種々の細胞に対して行 う場合に得られた結果を示している。 図８は、本発明のペプチドを用いる細胞溶解アッセイの結果を示している。 配列番号：１−９は、ＭＡＧＥ遺伝子およびこれらをコードする核酸配列から得 られる相同ノナペプチドを示す。好ましい態様の詳細な説明 実施例１ van der ＢruggenらのＳcience ２５４：１６４３（１９９１） ［この開示 は引用によって包含される］に記載されている２.４kbのＢamIIIフラグメントは 、ＭＡＧＥ−１タンパクをコードする遺伝子のエキソン２および３しか含まれて いないことで知られている。このフラグメントは、ＭＺ２−Ｅ抗原の発現をＥ^- 抗原欠損セルライン変異体ＭＺ２−ＭＥＬ.２.２に伝達して、Ｅ⁺ＣＴＬｓによ るトランスフェクタントの細胞溶解を引き起こす。ＤeＰlaenらのＰroc.Natl.Ａ c ad.Ｓci. ＵＳＡ ８５：２２７４（１９８８）、およびＣhomezらのＩmmunogen etics ３５：２４１（１９９０）による先の研究により、発現ベクターの形で トランスフェクトされていなくても、抗原ペプチドをコードする配列を含む小さ な遺伝子フラグメントはそれらの抗原を規則正しく発現することが立証されてい る。これらの観察を考慮して、２.４Ｋbのフラグメントより小さなフラグメント で実験を行った。２.４kbのフラグメントをより小さなフラグメントへと切断す るのに、種々の制限酵素を使用した。得られたより小さなフラグメントを、pＴ Ｚ１８Ｒプラスミドベクターにクローンした。エキソン３から取り出した３００ 塩基対フラグメントは、オリゴヌクレオチドＶＤＢ １４： ５´−ＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＡＡＡＧ−３´ およびＣＨＯ ９： ５´−ＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＴ−３´ を用いるポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）増幅により得られた。これらのプ ライマーは、ＭＡＧＥ−１の３００塩基対フラグメントをエキソン１の４２２〜 ７２２位の間で増幅する。このフラグメントを発現ベクター ＰＳＶＫ３にクロ ーンした。その新規構築物をpＳＶtkneoβプラスミドと共に、ＭＺ２.ＭＥＬ２. ２セルラインに同時トランスフェクトした。このことは、４×１０⁶個の細胞とp ＳＶtkneoβ［Ｎicolasら，ＣＳＨ Ｃonf.Ｃell Ｐrolif １０：４６９（１９８ ３）］３ug、およびpＴＺ１８ＲまたはＰＳＶＫ３構築物３０ugを用い、リン酸 カルシウム沈降法［Ｔraversariら，Ｉmmunogenetics ３５：１４５（１９９２ ）； 次いで、得られた該トランスフェクタントを、Ｇ４１８ネオマイシン類似化合物 を含む培地中にて選択した。トランスフェクションしてから１５日後に、抗Ｅ抗 原 ＣＴＬ ８２／３０によるＴＮＦ産生を剌激する能力に関して、耐性細胞を試 験した。このことは、１５００ ＣＴＬ ８２／３０を含有するサンプル１００ul をトランスフェクトされた細胞４×１０⁴個へ加えることにより行った。ＴＮＦ の存在を評価するために、上澄みサンプル（５０ul）を取って、３×１０⁴個の ＷＥＨＩ １６４ クローン１３細胞［Ｅspevikら，Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth.９５： ９９（１９８６）］に加えた。例えば、Ｔraversariらの上記文献に従い、ＭＴ Ｔ比色アッセイを利用して、２４時間後にＷＥＨＩ細胞の死亡率を評価した。 図１に示すように、これらの実験により、ＭＺ２Ｅ抗原の発現を有効に伝達す ることのできる、ＭＡＧＥ−１のエキソン３由来の３００塩基対フラグメントが 同定された。実施例２ ＭＡＧＥ−１遺伝子は、非常に関連のある幾つかの遺伝子族に属する［van de r Ｂruggenら，上記を参照］。先の実験は、ＭＡＧＥ−２およびＭＡＧＥ−３ がＭＺ２−Ｅ抗原の発現を指令しないことを示した。明らかに３００塩基対フラ グメントが発現を指令するので、ＭＡＧＥ−２およびＭＡＧＥ−３遺伝子の相同 部分は３００塩基対フラグメントに匹敵していた。違いは明らかであり、Ａther tonらのＪ.Ｃhem.Ｓoc.１：５３８（１９８１）に従って、一時的にＮ−末端を 保護するＦ−mocを用い、１５アミノ酸ペプチドを幾つか合成した。そのペプチ ドをＣ−１８逆相ＨＰＬＣにより精製し、アミノ酸分析により特徴付けた。 ペプチドが得られたら、ＢoonらのＪ.Ｅxp.Ｍed.１５２：１１８４（１９８０ ）のクロミウム放出法を利用する細胞溶解アッセイでペプチドを試験した。簡単 に言えば、９４ウエルのマイクロプレートにおいて、種々の濃度のペプチドを用 い、１０００個の⁵¹Ｃr標識化Ｅ^-標的細胞を３７℃で３０分間インキュベートし た。 等容量のＣＴＬ（ＣＴＬの数は標的細胞の数の５倍である）を含むサンプルを 加えた（セルライン８２／３０）。４時間後にクロミウム放出を測定した。抗Ｅ ＣＴＬｓにより細胞溶解するＥ^-細胞の感作が、ＭＡＧＥ−１の巨大な読み取り 枠の１５８−１７２コドンに対応するペプチドで観察された。より短いペプチド を調製し、有効な細胞溶解が、ペプチド： Ｇlu Ａla Ａsp Ｐro Ｔhr Ｇly Ｈis Ｓer Ｔyr で観察された。 図２に示す結果により、結合したり、細胞溶解を起こすには、１番目および９ 番目のアミノ酸が重要であったということが実証される。このことは、ＭＨＣ− １分子が一般にノナペプチドにより結合することを述べている先の報告［Ｒotzs chkeら，Ｎature ３４８：２５２（１９９０）］に一致する。図２はまた、最 大細胞溶解値の半分が５nＭのペプチド濃度で得られたということをも示してい る。実施例３ どんな分子が関連のあるＭＡＧＥ−１抗原を提示したかを決定するために実験 を行った。このことを行うためには、ＧirdlestoneのＮucl.Ａcids.Ｒes.１８： ６７０１（１９９０）で教示されている、ＨＬＡ−Ａ１遺伝子をマウスセルライ ンであるＰ１.ＨＴＲにトランスフェクトした。このセルラインは、マウス肥満 細胞腫セルライン Ｐ８１５の非常にトランスフェクトされ易い変異体である。 その結果得られ、「Ｐ１.ＨＴＲ.Ａ１」と称するトランスフェクタントを、先に 論じたノナペプチドの存在下、同じ細胞溶解アッセイを利用してインキュベート した。対照もまた使用した。 図３は、このセルラインが細胞溶解されたことを示しており、ヒト以外の細胞 を用いて細胞溶解ペプチドをスクリーニングするためのモデルが開発されたこと を示す。 本明細書中に記載していない実験ではあるが、ＣＯＳ細胞でも同様の結果が得 られた。 またさらなる実験も行ったが、この実験では、Ｐ１.ＨＴＲ Ａ１セルラインを ＭＡＧＥ−１ｃＤＮＡでトランスフェクトした。この同時トランスフェクトされ た細胞を用いて実施例２の細胞溶解アッセイを行うと、それらもまた溶解される ことが見い出された。実施例４ ＭＡＧＥ族に属する種々の遺伝子が相同的であると仮定して、遺伝子の相同領 域内の類似性を同定するために比較を行った。これらの領域を図４に示す。これ らのぺプチドおよびそれらをコードする核酸配列は同一ではないが、かなり高く 相同的であり、とりわけ１番目および９番目の残基はかなりの相同性を示す。実施例５ 本実施例、および以下の実施例６−８は、１９９３年３月２６日出願の同時係 属出願第０８／０３７，２３０号の実施例３７−４０に対応する。 細胞溶解ＣＴＬクローン 「２０／３８」は、ＭＺ２メラノーマ患者の末梢血 液リンパ球から得られた。このクローンは、Ｖan den ＥyndeらのＩnt. Ｊ. Ｃa ncer ４４：６３４−６４０（１９８９）に記載されている［この開示は引用に よって包含される］。ＣＴＬクローンは、ＨerinらのＩnt. Ｊ. Ｃancer ３９： ３９０−３９６（１９８７）に従って単離された［これは引用によって包含され る］。しかし、本明細書中にアッセイを説明する。自己メラノーマ細胞をインビ トロにおいて成長させた後、１０％のＨＥＰＥＳおよび３０％のＦＣＳを加えた ＤＭＥＭ中に１０⁷細胞／mlの割合で再懸濁させ、２００μＣｉ／mlのＮａ（⁵¹ Ｃｒ）Ｏ₄共に３７℃で４５分間インキュベートした。１０mＭのＨＥＰＥＳを加 えたＤＭＥＭで標識細胞を３回洗浄した。次いで、これらを、１０mＭＣのＨＥ ＰＥＳおよび１０％のＦＣＳを加えたＤＭＥＭ中に再懸濁させた後、１０³個の 細胞を含んでいる懸濁液１００μ１を９６ウエルのマイクロプレートに分配した 。ＣＴＬクローンのサンプルを同じ培地１００ulに添加し、アッセイを２回行っ た。プレートを１００×Ｇで４分間遠心分離し、５．５％のＣＯ₂雰囲気下、３ ７℃で４時間インキュベートした。 プレートを再び遠心分離し、上澄み１００ulを集めて計数した。⁵¹Ｃｒ放出パ ーセンテージを以下のようにして計算した： ［式中、ＥＲは観察される実験的な⁵¹Ｃｒ放出であり、ＳＲは１０³個の標識細 胞を培地２００ulのみでインキュベートすることにより測定される自然放出であ り、またＭＲは０．３％のトリトンＸ−１００ １００u1を標的細胞に加えるこ とにより得られる最大放出である］。 高ＣＴＬ活性を示した単核血液サンプルを増加させ、限界希釈法によりクロー ン化し、同じ方法を利用して再びスクリーニングした。 標的細胞Ｋ５６２を試験するために同じ方法を利用した。ＥＢＶ−Ｂ細胞を使 用する場合に変更しなくてはならないことは、ＤＭＥＭ培地を５％のＦＣＳを加 えたハンクス培地で置き換えることだけであった。 これらの実験により、ＣＴＬクローン２０／３８が単離された。 図５は、これらのアッセイの結果を示している。具体的には、ＣＴＬクローン は自己メラノーマセルラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０を細胞溶解したが、ＥＢＶ −Ｂセルライン、繊維芽細胞、Ｋ５６２または非自己メラノーマセルラインＳＫ −ＭＥＬ−２９は細胞溶解しなかったということが分かる。実施例６ ＣＴＬクローンが自己セルラインに特異的であると認められてから、抗原特異 性に関して試験した。このことを行うのに、ＭＺ２患者から得られる抗原欠損変 異体を同じタイプの上記クロミウム放出アッセイで試験した。これらの標的セル ラインは、Ｄ⁺、Ｅ⁺、Ｆ+、Ａ⁺であるＭＺ２−ＭＥＬ ３．０、Ｄ^-であるＭＺ ２−ＭＥＬ．６１、Ｅ^-であるＭＺ２−ＭＥＬ ２．２、およびＦ^-であるＭＺ２ −ＭＥＬ．４であった。ＣＴＬクローン２０／３８の他に、抗Ａ（ＣＴＬ ２８ ／３３６）、抗Ｆ（ＣＴＬ ７６／６）、および抗Ｅ（ＣＴＬ ２２／１３）で あることが知られているクローンを試験した。 これらの結果を図６に示す。ＣＴＬクローン２０／３８は、Ｄ−セルラインで あるＭＺ２−ＭＥＬ．６１を除き、クロミウム放出を起こす全てのセルラインを 細胞溶解したことが分かるので、ＣＴＬクローンが抗Ｄであることが示される。 ＣＴＬクローンによるＴＮＦ放出が、抗原Ｄを提示するメラノーマセルラインの 存在下にのみ観察されるという実験［この実験は本明細書中に包含されていない ］により、この結果を確認した。実施例７ 抗原Ｄが標的分子と同定されてから、抗原Ｄを提示するＨＬＡタイプを決定す る研究を行った。実施例Ａに記載されている実験は、抗原ＤがＭＺ２−ＭＥＬに 提示されることを示したが、このセルラインのＨＬＡ特異性は分かっている［す なわち、Ａ１、Ａ２９、Ｂ３７、Ｂ４４、Ｃw６、Ｃ．c1．１０］。しかし、Ｈ ＬＡ分子であるＡ２９、Ｂ４４およびＣ．c1．１０を欠くＭＺ２−ＭＥＬの変異 体もまた、依然として抗原Ｄを発現することが知られていたので、これらは考慮 すべきものから外すことができた。Ｂ３７を発現するセルラインに関しては何も 見い 出すことができなかったので、研究を行わなかった。 合計して１３個の同種セルライン、即ちＨＬＡ−Ａ１（１３のうち１０）か、 またはＣw６（１３のうち３）のいずれかを発現する１３個のセルラインを試験 した。ＴraversariらのＩmmunogenetics ３５：１４５−１５２（１９９２）［ この開示は引用によって包含される］の方法を利用し、ＣＴＬクローン２０／３ ８によるＴＮＦの放出を剌激する能力に関して、これらのセルラインを試験した 。このアッセイでは、ＷＥＨＩ１６４−１３細胞に対する上澄みの毒性を試験す ることによりＴＮＦ放出を測定する。 このアッセイでは、１５００個のＣＴＬクローン細胞および２５ｕ／mlのＩＬ −２の存在下に、同種セルラインから得られる細胞サンプル（３０００個、１０ ，０００個または３０，０００個の細胞）を培養した。２４時間後、毒性に関し 、培養物から得られる上澄みをＷＥＨＩ細胞に対して試験した。結果を以下の表 １に示す。 ＣＴＬクローン２０／３８からのＴＮＦ放出を８つのセルラインが剌激するこ とが見い出された。これらのセルラインは全てＨＬＡ−Ａ１であった。Ｃw６を 提示するセルラインはいずれも刺激しなかった。 ＭＡＧＥ発現を決定するために、セルラインをさらにアッセイした。ＴＮＦ放 出を剌激する８つのセルライン全てがＭＡＧＥ−３を発現したが、これに反して ネガティブである２つのＨＬＡ−Ａ１セルラインは発現しなかった。 実施例８ 実施例７で示した結果を考慮して、抗原Ｄが実際にＭＡＧＥ−３から誘導され る腫瘍拒絶抗原であるかどうかを決定するために実験を行った。このことを行う のに、pcＤＮＡ Ｉ／Ａmpへとクローン化されたＨＬＡ−Ａ１の遺伝子１００ng 、および（ａ）pcＤＮＡ Ｉ／Ａmpへとクローン化されたＭＡＧＥ−１のｃＤＮ ＡＮ、（ｂ）pcＤＳＲαへとクローン化されたＭＡＧＥ−２のｃＤＮＡＮまたは （ｃ）pcＤＳＲαへとクローン化されたＭＡＧＥ−３のｃＤＮＡのうちの１つの １００ngでＣＯＳ−７受容細胞をトランスフェクトした。製造元の指示に従って 、トランスフェクトする配列をプラスミドヘ連結させた。１０％のウシ胎児血清 を加えたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が入った組織培養平底マイ クロウエルヘ、ＣＯＳ−７のサンプルを１５，０００細胞／ウエルの割合で播種 した。その細胞を３７℃で一晩インキュベートし、培地を取り除いた後、１０％ のＮｕ血清、４００μｇ／mlのＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭのクロロキ ニン、および上記プラスミドを含むＤＭＥＭ培地３０μｌ／ウエルで置き換えた 。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地を取り除いて、１０％のＤＭ ＳＯを含むＰＢＳ５０μｌで置き換えた。２０分後、この培地を取り除き、１０ ％のＦＣＳを加えたＤＭＥＭ２００μｌで置き換えた。 このようにして培地を変えた後、ＣＯＳ細胞を３７℃で２４時間インキュベー トした。次いで、培地を捨て、２５ｕ／mlのＩＬ−２を加えた１０％のヒト貯蔵 血清を含むアイスコーブ（Ｉscove）培地１００μ１中、１５００個のＣＴＬク ローン細胞２０／３８を添加した。２４時間後に上澄みを取り、Ｔraversariら のＩmmunogenetics ３５：１４５−１５２（１９９２）［この開示は引用によっ て包含される］に記載されているようにして、ＴＮＦ含量をＷＥＨＩ細胞におけ るアッセイで測定した。これらの結果を図７に示す。 ＣＴＬクローンは、ＨＬＡ−Ａ１およびＭＡＧＥ−３でトランスフェクトされ たＣＯＳ−７細胞により強く刺激されたが、他のＭＡＧＥ遺伝子でトランスフェ クトされた細胞によっては剌激されなかったことが分かる。このことから、抗原 Ｄは、ＭＡＧＥ−３遺伝子によりコードされた腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導され る腫瘍拒絶抗原であり、このＴＲＡはＨＬＡ−Ａ１分子により提示されるという 結論に達する。実施例９ 「ＭＡＧＥ−３」遺伝子から誘導されるペプチド： Ｇlu Ｖal Ａsp Ｐro Ｉle Ｇly Ｈis Ｌeu Ｔyr を用いて、さらなる実験を行った。 実施例２でペプチドを調製したときと同じ方法でこのペプチドを調製した。実 施例２に記載したクロミウム放出アッセイもまた利用した。ＭＺ２．ＭＥＬ４３ の抗原Ｄ欠損変異体であるＭＺ２−ＭＥＬ ６１．２セルラインを⁵¹Ｃｒで標識 した後、抗原Ｄ特異的細胞溶解細胞クローンＣＴＬ ２０／３８と、種々の濃度 のペプチドとを用いて試験した。種々の濃度のペプチドと共に、ＭＺ２−ＭＥＬ ６１．２およびＣＴＬ ２０／３８を１．５：１の割合で組み合わせた。その混 合物を４時間インキュベートした後、クロミウム放出を測定した。対照として、 クロミウム標識化ＭＺ２−ＭＥＬ．４３を使用した。 図８に示した結果により、このペプチドは、細胞溶解Ｔ細胞クローンが標的細 胞を認識して溶解することから、確かに腫瘍拒絶抗原として作用することが示さ れる。 先の実施例により、ＭＡＧＥ−３から誘導されるノナペプチドはＨＬＡ−Ａ１ 分子により提示され、またＨＬＡ−Ａ１とノナペプチドとの複合体を提示する細 胞が特異的ＣＴＬ細胞に認識されて溶解されるということが示される。この観察 により、本発明のノナペプチドは治療および診断の両方に使用できるということ が示される。 後者の使用カテゴリーの場合では、例えば、特定のＨＬＡ分子を発現する腫瘍 、または癌細胞自体を同定するためにノナペプチドを使用することができる。癌 細胞を含むサンプルまたは腫瘍細胞をそれに結合するノナペプチドと接触させ、 得られた材料と複合体に特異的なＣＴＬサンプルとを組み合わせる。細胞溶解が 起これば、その腫瘍／癌細胞はＨＬＡ−Ａ１提示体として同定することができる 。 治療的には、ノナペプチドを使用することができる主な方法が２つある。イン ビボにおける治療法では、処置すべき腫瘍にノナペプチドが標的化する態様でノ ナペプチドを投与すればよい。こういったことは、直接注射、時間放出投与、腫 瘍特異的抗体との組み合わせ等により行うことができる。ＨＬＡ−Ａ１分子に結 合すると、ＣＴＬ応答が起こり、腫瘍の細胞溶解が起こる。勿論、そのような治 療法では、腫瘍の細胞溶解を起こすのに十分な量のノナペプチドを投与する。こ の量は、各々の患者、腫瘍のタイプや大きさ等によって様々である。 また「インビトロ」タイプの治療も考えられる。先に示したように、ＨＬＡ− Ａ１分子がＭＡＧＥ−３により誘導されるノナペプチドに結合する場合、もしこ れがペプチド／ＨＬＡ複合体に特異的なＣＴＬｓと接触しているなら、ＣＴＬ増 殖応答が起こる。ＣＴＬｓはインビボにおける腫瘍細胞溶解物質であることから 、その結果得られる膨張化集団を患者に投与することができる。ＣＴＬｓは、患 者自身の血液または他のＣＴＬｓ源を用いることにより、もしくはあらかじめ確 定されているペプチド特異的ＣＴＬのサンプルを接触させることにより膨張化す ることができる。このことに関し、ＣＴＬ２０／３８に注目すると、上記治療は 時にその開発方法として有用であった。 本明細書中に記載したタイプの治療法は、特にメラノーマに対して有用である 。サンプル分析により、コーカサス人全人口の２６％がＨＬＡ−Ａ１対立遺伝子 を発現することが示されている。従って、少なくとも２６％のコーカサスのメラ ノーマ人口を、本ペプチドを用いる治療法の潜在的対象人とみなすことができる 。その患者はまた、表面に提示されるＨＬＡ−Ａ１とノナペプチドとの複合体を 含む増殖細胞を用いて処置することもできる。 示したような核酸配列は種々の方法で使用することができる。ＭＡＧＥ遺伝子 は腫瘍において発現することから、その核酸配列は、腫瘍細胞を同定するための プローブとして使用することができる。このことは、標識化ハイブリッド形成プ ローブ、ＰＣＲＮまたは当業界で知られている種々の核酸プローブに基づくアッ セイにより行うことができる。 本明細書中に記載したヒト以外のセルラインの開発により、本明細書中に記載 した本発明の幾つかの特徴を行うためのユニークな方法が示される。例えば、実 施例により、ＣＴＬｓはＨＬＡとノナペプチドとの複合体を認識するが、複合体 を提示する細胞のタイプは区別しないらしいということが示される。従って、Ｃ ＴＬｓを作成するために、ヒトのサンプルにおけるそれらの有無を同定するため に、単離された本発明のヒト以外のセルラインを使用することができる。 上述のように、本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ１遺伝子、およびノナペプチドをコ ードする配列の両方でトランスフェクトされた、単離されたヒト以外のセルライ ンをも包含する。本発明は、遺伝子をコードする１つのＨＬＡおよび１つのＭＡ ＧＥペプチドでのトランスフェクションに制限されず、それどころか、本発明は 、一つ以上のＨＬＡ遺伝子および一つ以上のＭＡＧＥ抗原をコードする配列を含 有し得るポリトランスフェクトされた細胞を包含する。ＭＡＧＥ−１により誘導 されたノナペプチドおよびＭＡＧＥ−３により誘導されたノナペプチドの両方が 共通のＨＬＡ分子により提示されるという知見が得られれば、上記の主張が支持 される。表面におけるＨＬＡおよびペプチドの適切な対の発現が、選択された特 異的ＣＴＬの同定、または治療に関連のあるＣＴＬ増殖の発生のいずれかを導く ので、そのような細胞は万能エフェクター細胞としてみなすことができる。同時 トランスフェクトまたはポリトランスフェクトされた細胞は、当業界で周知であ る適当なアジュバントと組み合わせると、ワクチンとして働き得る。メラノーマ および乳癌のような種々の癌病態の処置は、これらのトランスフェクタントを用 いて行うことができる。 使用した用語および表現は、説明のための用語として使用するものであって、 制限するためのものではなく、示し、かつ記載した特徴またはそれらの一部に属 する幾つかの同義語を除外する用語および表現の使用を意図するものではなく、 本発明の範囲内で種々の変更態様が可能であることが認められている。 配列表 （１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： ルドヴィグ・インスティテュート・フォー・ キャンサー・リサーチ （ii） 発明の名称 ：ＭＡＧＥ−３遺伝子から誘導されてＨＬＡ−Ａ１に より提示される単離されたノナペプチドおよびそれら の用途 （iii） 配列の数 ：９ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 名宛人 ： フェルフェ・アンド・リンチ （Ｂ） 通り ： サード・アベニュー ８０５番 （Ｃ） 市 ： ニューヨーク・シティ （Ｄ） 州 ：ニューヨーク （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ：１００２２ （ｖ） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ディスケット、５．２５インチ、３６０kb記憶 （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＣ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＰＣ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： ０８／０７３，１０３ （Ｂ） 出願日 ： １９９３年 ６月 ７日 （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： ０７／９３８，３３４ （Ｂ） 出願日 ： １９９２年 ８月３１日 （Ａ） 出願番号 ．０８／０３７，２３０ （Ｂ） 出願日 ： １９９３年 ３月２６日 （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： ハンソン、ノルマン・ディー （Ｂ） 登録番号 ：３０，９４６ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ＬＵＤ ２９３．１ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： （２１２）６８８−９２００ （Ｂ） ファックス番号 （２１２） ８３８−３８８４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−１ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号１： （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−２ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号２： （２） 配列番号３の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−２１ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号３： （２） 配列番号４の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−３ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号４： （２） 配列番号５の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−４ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号５： （２） 配列番号６の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−４１ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号６： （２） 配列番号７の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−５ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号７： （２） 配列番号８の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−５１ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号８： （２） 配列番号９の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： ゲノムＤＮＡ （ix） 特徴 ： （Ａ） 名称／略語 ： ＭＡＧＥ−６ ノナペプチドをコードする配列 （xi） 配列 ： 配列番号９：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ 9284−4Ｃ Ｔ 9284−4Ｃ 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ０８／０３７，２３０ (32)優先日 1993年３月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＦＩ， ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＷ，ＮＯ，Ｐ Ｌ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ (72)発明者 ファン・デァ・ブリューゲン、ピエール ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル、 ユー・シー・エル 7459、アベニュー・ヒ ポクレイト 74番 (72)発明者 デ・プラエン、エチエンヌ ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル、 ユー・シー・エル 7459、アベニュー・ヒ ポクレイト 74番 (72)発明者 リルキン、クリストフ ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル、 ユー・シー・エル 7459、アベニュー・ヒ ポクレイト 74番 (72)発明者 トラヴェルサリー、カティア イタリア国 アイ―ミラノ、セスト・エ ス・ジョバンニ 20099番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸配列： Ｇlu Ｖal Ａsp Ｐro Ｉle Ｇly Ｈis Ｌeu Ｔyr を有する、単離されたノナペプチド。 ２．請求項１に記載のノナペプチドをコードする、単離された核酸分子。 ３．ＨＬＡ−Ａ１サブタイプにより特徴付けられる癌病態を患っている患者の 処置方法であって、該ＨＬＡ−Ａ１サブタイプを有する癌細胞に対し、有効な細 胞傷害性Ｔ細胞反応を引き起こすのに十分な量の、請求項１に記載の単離された ノナペプチドを該患者に投与することから成る処置方法。 ４．請求項２に記載の核酸分子でトランスフェクトされた、単離されたヒト以 外のセルライン。 ５．マウスセルラインである、請求項４に記載のセルライン。 ６．ＣＯＳセルラインである、請求項４に記載のセルライン。 ７．癌病態を患っている疑いのある該患者から得られるサンプルを、 （ａ）ノナペプチド： Ｇlu Ｖal Ａsp Ｐro Ｉle Ｇly Ｈis Ｌeu Ｔyr または （ｂ）ＨＬＡ−Ａ１分子と該ノナペプチドとの複合体 に特異的に結合する物質と接触させ、該病態の指標として結合性を測定すること から成る、癌病態の決定方法。 ８．癌病態を処置するのに有用なワクチンであって、請求項１に記載の単離さ れたノナペプチドと、製薬的に許容し得るアジュバントとを含むワクチン。 ９．請求項１に記載のノナペプチドと特異的に結合する、単離された抗体。 １０．モノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。