JPH08501203A - 生理活性物質を連続的に適用するための包帯 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、成長因子のような創傷の治癒を促す生理活性細胞産生物（１７）を分泌する細胞（１６）を封入したエンベロープ（１２）を含んでなる。このエンベロープは、さらに、細胞生産物（１７）の通過拡散する底面膜（１５）と、不透過性上面膜（１４）とで構成される。好ましい、包帯（１０）は上記２つの膜の間に挿入されたセパレーター（３０）を有する。本発明は、また、細胞（１６）に遺伝子操作を加える方法、並びに創傷を治療する方法に関する。包帯（１０）は、新鮮で純粋な細胞生産物（１７）を連続的かつ均一に供給する。

Description

【発明の詳細な説明】生理活性物質を連続的に適用するための包帯 発明の分野 本発明は傷に治療用細胞生産物を連続的に供給する包帯に関する。より詳細に は、本発明は、細胞と細胞培養液とを収容するためのチャンバーで細胞生産物透 過性膜を有するチャンバーを有する包帯、当該包帯に有用な遺伝子操作を加えた 細胞、並びにかかる細胞を生産するための方法に関する。発明の背景 哺乳類（動物及び人間）の傷の治療には、歴史的にみて、物理的保護を与えか つ感染をある程度軽減するような単純な受動的包帯が用いられてきた。治療はこ のような単純な包帯からもっと積極的な治療へと進歩しつつある。特に火傷のよ うな重度の傷には、皮膚移植や皮膚片が適用されてきた。皮膚の細胞は徐々に「 生着」して傷口を埋める。 各種の増殖因子を傷に直接投与することによって治癒を促進しようと試みられ ている。Ｂｒｏｗｎ Ｇ．Ｌ．， Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ Ｌ．， Ｊｕｒｋｉ ｅｗｉｃｚ Ｍ．Ｊ．，Ｎａｈｉ Ｆ．， Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｇ．（１９９１） “Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ Ｗｏｕｎｄｓ ｂｙ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ”Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎ ｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．第８８巻１８９−１９４頁；Ｂｒｏｗｎ Ｇ．Ｌ．，Ｎａｎ ｎｅｙ Ｌ．Ｂ．，Ｇｒｉｆｆｅｎ Ｊ．， Ｃｒａｍｅｒ Ａ．Ｂ．，Ｙａｎ ｃｅｙ Ｊ．Ｍ．，Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ Ｌ．，Ｈｏｌｔｚｉｎ Ｌ．，Ｓｃ ｈｕｌｔｚ Ｇ．，Ｊｕｒｋｉｅｗｉｃｚ Ｍ．Ｊ．，Ｌｙｎｃｈ Ｊ．Ｂ．（ １９８９）“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ｂ ｙ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｅｐｉｄｅ ｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ”Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．第３２１ 巻７６−７９頁；ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ Ｐ．，Ｉｗａｔａ Ｋ．Ｋ．“Ｇｒｏｗ ｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ”（１９８９）Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第７巻７９３−７９８頁；Ｐｉｅｒｃｅ Ｇ．Ｆ．， Ｍｕｓｔｏｅ Ｔ．Ａ．，Ａｌｔｒｏｃｋ Ｂ．Ｗ．，Ｄｅｕｅｌ Ｔ．Ｆ．， Ｔｈｏｍａｓｏｎ Ａ．（１９９１）“Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｌａｔｅ ｌｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ”Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第４５巻３１９ −３１６頁；並びにＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｔａｔｏｒｉ，Ｃｌａｒｋ，“ＥＧＦ ａｎｄ ＰＤＧＦ−Ａｌｐｈａ ｉｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ”Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第４５巻３ ４６−３５２頁（１９９１）を参照されたい。増殖因子は創傷及びその周辺部の 組織中の細胞の増殖及び／又は分化を促進する。局所ゲルなどを傷の表面に貼付 することによってこれらの増殖因子を傷に投与することが試みられている。しか し、このような増殖因子含有ゲルには幾つかの欠点がある。これらのゲルに含ま れる増殖因子の量には限りがある。時間が経つと患者自身の組織から産生される 酵素によってゲル及び／又は増殖因子が分解される可能性がある。さらに、増殖 因子の単離及び精製はその生理活性を低下させることがある。 増殖因子を傷に直接滴下する試みもなされているが、この適用方法は連続的な ものではなく、その傷の様々な箇所に増殖因子を一様な量で与えるものでもない 。 さらに、増殖因子は半減期の短いものが多く、傷に投与された増殖因子の量は 時間経過とともに著しく減少する。最後になるが、単離・精製された増殖因子の 価格は極めて高い。 増殖因子を傷に添加すると傷の治癒が促進されることが判明しているにもかか わらず、傷の治療に増殖因子を応用することが広まっていないのは上記のような 欠点があるためである。 したがって、創傷組織に対して直接的に均一量の生理活性増殖因子を連続的に 供給できるような包帯があれば望ましいであろう。発明の概要 本発明の包帯は、一般に、エンベロープを含んでなるが、このエンベロープは 上側の液体不透過性膜と、当該エンベロープ中の栄養培地中に維持された細胞に 由来する増殖因子やホルモンなどの生理活性物質に対して透過性をもつ下側の膜 とによって画定されている。上記の生理活性物質は好ましくは増殖因子又は成長 ホルモンである。上側の膜と下側の膜の間にセパレーターが置かれていてもよい 。 本発明は、このような包帯の製造方法並びに当該包帯の貼付によって創傷を治 療する方法を提供する。 本発明は、別の態様では、様々な増殖因子を産生するような遺伝子操作を加え た遺伝子、かかる遺伝子の作製方法、当該遺伝子によって形質転換された細胞、 並びにかかる細胞の生産物（発現産物も含む）を提供する。図面の簡単な説明 図１は、上記包帯の封入セパレーター型具体例の断面図である。 図２は、上記包帯の外辺セパレーター型具体例の断面図である。 図３は、追加の膜が複数のセパレーターの間に位置していてしかも包帯によっ て取り囲まれているような具体例の断面図である。 図４は、ゲルと併用した状態での上記包帯の外辺セパレーター型具体例の断面 図である。 図５は、創傷部位の上に貼付した付着式セパレーター付包帯の部分断面図であ り、ゲルの使用についても示してある。 図６は、プラスミドｐＳＶ₂ＮＥＯの概略図である。 図７は、プラスミドλＧＨ２の概略図である。 図８は、プラスミドｐＮＥＯ−ｂＧＨの概略図である。 図９は、プラスミドｐＮＥＯ−ＣＭＶ−ｂＧＨの概略図である。 図１０は、プラスミドｐＥＣＥの概略図である。 図１１は、プラスミドｐＵＣＤＳ３の概略図である。 図１２は、プラスミドｐＵＣＤＳ３−ＳＡＬＩの概略図である。 図１３は、プラスミドｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦの概略図である。 図１４は、プラスミドｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ−ＮＥＯの概略図である。 図１５は、包帯内部に位置する細胞から放出されたウシ成長ホルモンのオート ラジオグラフィーである。発明の詳細な説明 本発明は、新鮮な生理活性分子（例えば増殖因子や成長ホルモンなど）を直接 創傷に、持続的に放出され連続的かつ均等に、適用するための新規包帯を提供す る。 図１に示す通り、包帯１０は、液体に対して不透過性の上面膜１４と透過性の 底面膜１５を有するエンベロープ１２；チャンバー５６；細胞生産物１７を産生 する細胞１６；及び上記チャンバー内部５６に含まれる細胞栄養培地１８を含ん でなる。 新鮮な生理活性をもつ細胞生産物１７は底面膜１５を通って傷口に拡散する。細 胞１６は細胞生産物を連続的に産生するので、傷は上記生産物を連続して受け取 ることになる。包帯１０は、人間を含めた哺乳類の創傷の治癒速度を増大させる ことができる。包帯の使用 創傷の治癒速度は、１種類の包帯から供給されるたった１種類の増殖因子によ って高まる。したがって、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミ ング増殖因子（ＴＧＦ）又は上皮増殖因子（ＥＧＦ）のいずれか１種類での治療 によって創傷の治癒速度が高まる。ただし、様々な増殖因子を創傷の治療に好ま しくは逐次的に併用すると治癒速度はさらに高まる。 好ましくは、例えば、３種類の異なる包帯の中の３種類の異なる細胞種から産 生された３種類の異なる増殖因子によって創傷を治療する。例えば、最初の包帯 はＰＤＧＦ産生細胞を収容しているのが好ましく、そのＰＤＧＦが免疫反応の引 き金となってマクロファージの浸出及び血管形成を促進する。その後、およそ２ 〜３日後に、最初の包帯を取り外して、ＴＧＦ−βを産生する細胞を収容した第 二の包帯を付ける。ＴＧＦ−βは患者自身の繊維芽細胞（皮膚下層の組織の基盤 となる細胞）の増殖及び／又は分化を誘起して、創傷部位におけるコラーゲン繊 維の産生を増加させる。およそ２〜３日後に、第二の包帯を取り外して、上皮増 殖因子を産生する細胞を収容した第三の包帯を貼付する。上皮増殖因子は患者自 身の表皮細胞の増殖を促して傷口をふさぐ。 別法として、１種類の包帯を使用することもでき、注射器を用いて包帯から細 胞を取り除いて別の種類の細胞を注入してもよいし、或いは複数の細胞生産物（ 増殖因子など）を同時に放出するように包帯を設計してもよい。 本発明の包帯は様々な創傷、例えば、褥瘡、火傷、擦過傷、さらにはもっと深 い傷に使用することができる。さらに、この包帯は乾癬のような皮膚病の治療に も使用することができる。また、この包帯は皮膚移植の治癒を促したり、傷口に 当てた培養角化細胞（ケラチノサイト）の「生着」を促したりするのに用いるこ ともできる。 この包帯は、生物への細胞生産物のデリバリーシステム（送達システム）を提 供 するために用いることもできる。エンベロープ 包帯のエンベロープ、すなわち外側部分は細胞１６及び栄養培地１８を取り囲 んで封入する。エンベロープの大きさ（これによって包帯の大きさが決まる）は 創傷の大きさによって決定される。エンベロープは一枚の材料で作成することも できるが、好ましくはエンベロープは別個の上面膜１４と底面膜１５で構成され る。上面膜 上面膜１４は液体不透過性で好ましくは疎水性の材料でできている。上面膜は エンベロープの内容物に対して不透過性でなければならず、好ましくはウイルス や細菌などの生物の包帯への侵入を阻止する。また、上面膜は酸素や二酸化炭素 のような気体に対する透過性をもたないことが好ましい。様々な高分子材料を使 用することができ、例えばポリプロピレンやポリエチレンのような液体不透過性 で免疫反応や炎症を引き起こさないものを用いることができる。 好ましくは、上面膜は、ヘキスト・セラニーズ社（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｃｅｌａ ｎｅｓｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）から「セルガード（Ｃｅｌｇａｒｄ）５５５０）」 の商品名で入手可能なもののような材料でできている。セルガード５５５０は均 一な不織ポリプロピレン繊維布とセルガード２５００（ポリエチレンフィルム） で構成されている。セルガード５５５０は細孔の大きさが０．０７５×０．２５ ミクロン（直径）、多孔度４５％、水分透過速度が２４時間当り４６０ｇ／ｍ² のものである。或いは、ゲルマン・サイエンス社（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃ ｅ Ｉｎｃ．，ミシガン州アナーバー）から入手可能な細孔径０．１ミクロンの 疎水性膜である「メトリセル（Ｍｅｔｒｉｃｅｌ，登録商標）ポリプロピレン」 を使用することもできる。 上面膜の厚さは、包帯の内容物を収容するに足るものでなければならないが、 患者が運動できるような柔軟性が担保されるものでなければならない。通常は約 ３ミルから７ミルの厚さで十分である。セルガード５５００の厚さは約３ミルで あり、セルガード２５００の厚さは約１ミルである。 細胞１５が「ＳＣＣ−１３」のような足場依存性の細胞である場合には、それ らの細胞は増殖するための表面を必要とする。通常は、その表面は上面膜１４の 内側表面１９又は底面膜１５の内側表面２０のいずれかである。膜１４及び膜１ ５双方の上 で細胞を増殖させるようにしてもよい。セルガードのような疎水性材料でできた 上面膜１４の内側表面１９の上で細胞１６を増殖させる場合には、その表面は好 ましくはプラズマ処理したものである。酸素又はアンモニアプラズマ処理のよう なプラズマ処理は内側表面にアミノ基や水酸基などの親水基を与える。このよう な親水基が存在すると、その表面に細胞が付着し易くなる。プラズマ処理は、ベ クトン・デイキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ ｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・ パーク）の一事業部であるベクトン・ディキンソン・リサーチ・センター（Ｂｅ ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）で行われる 。プラズマ処理については、セルガードの製造業者であるヘキスト・セラニーズ 社によって規定されている。メトリセル・ポリプロピレンを使用する場合には、 その膜上で足場依存性細胞が増殖できるようにするために同様のプラズマ処理が 必要とされるであろう。 或いは、上面膜１４を疎水性フィルムとその内側表面に付着させた親水性フィ ルムで構成してもよい。このような配置は、所要の疎水性を与えつつ、細胞の付 着できる親水性表面が与えられる。 包帯１０に剛性を与えるために、上面膜１４の外側表面２２に発泡体の層２１ を付着させるのが好ましい。発泡体はセミックス・ライフ・サイエンス社（Ｓｅ ｍｉｘ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，ベンシルヴェニア州フラシエー） から入手可能な独立気泡ポリウレタンフィルムラミネートのような従来の材料で できたものでよく、これには例えばアヴェリー・スペシャルティ・テープ社（Ａ ｖｅｒｙ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｔａｐｅ Ｃｏ．オハイオ州ペインスヴィル） から入手可能な「Ｍｅｄ １１８８ＴＴ」のような接着剤を塗布又はアヴェリー 社から「５３２２Ｐ」の商品名で入手可能な淡褐色スパンレースド（ｓｐｕｎｌ ａｃｅｄ）ポリエステルフィルムを貼付してもよい。好ましくは、美的観点から 発泡体２１は肌色に着色する。底面膜 底面膜１５は、増殖因子や成長ホルモンのような所望の細胞生産物１７に対し て透過性のものでなければならない。好ましくは、底面膜１５は、細胞培養液に 感染する可能性のあるウイルス、細菌などの透過し得ないものである。底面膜１ ５には様々な材料を使用することができるが、セラニーズ社から「セルガード５ ５５０）」の 商品名で入手可能なポリエチレンが好ましい。セルガードは上面膜１４もセルガ ード５５００でできていて、さらに上面膜１４と底面膜１５の周辺部が融合して エンベロープ１２を形成しているような場合の具体例で好ましい。底面膜として 使用する場合、セルガード５５００には、製造業者による「トゥイーン（Ｔｗｅ ｅｎ）８０」や「トゥイーン２０」のような界面活性剤でその細孔２４を「濡ら す」ための特殊な処理によって透過性が付与される。膜１５の細孔２４に過剰の 界面活性剤が存在すると、チャンバー５６内の細胞が若干死滅してしまうことが ある。過剰の界面活性剤を除去するために、底面膜１５を１００％エタノール中 に約１２時間浸漬した後、９０℃の脱イオン水中で約１０分間加熱してもよい。 底面膜１５の細孔径は、細胞生産物１７が底面膜１５を通って拡散できるよう な十分な大きさのものでなければならないが、一方では、それよりも大きな細菌 などの物体の通過を阻止できる程度に小さくなくてはならない。細胞生産物がウ シ成長ホルモンの場合には、細孔は約２２０００ダルトンの分子を通過させるも のでなければならない。細胞生産物が上皮増殖因子の場合には、この膜は約６０ ００ダルトンの分子を通過させるものでなければならない。セルガード５５００ 膜の典型的なタンパク保持率は、アルブミン（分子量６７０００）に対しては２ ９％、γ−グロブリン（分子量１６００００）に対しては４０％、フィブリノー ゲン（分子量３４００００）に対しては９８％である。通常は、増殖因子のよう な所望の細胞生産物は３００００未満の分子量を有しており、セルガード５５０ ０膜の細孔内には保持されない。 好ましくは、底面膜は、ゲルマン・サイエンス社から入手可能な細孔径約０． ２〜約０．４μｍで細胞生産物が透過できる「Ｚ−バインド（Ｚ−Ｂｉｎｄ，登 録商標）」という商品名の修飾親水性ポリスルホンで構成される。別の親水性ポ リスルホン膜は、ミクロン・セパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａ ｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）から「ウルトラセップ（ＵｌｔｒａＳｅｐ）」という商 品名で入手できるものである。もう一つの好適な製品はゲルマン・サイエンス社 から「スポール（Ｓｕｐｏｒ）」という商品名で入手できるものである。スポー ルは約０．１〜約０．８ミクロンの細孔径を有する。スポールも親水性で、細胞 生産物が拡散できる。或いは、底面膜はポリフッ素化ポリエチレン（テフロン（ Ｔｅｆｌｏｎ，登録商標））膜で形成されていてもよく、これはファルマシア・ ミリポア社（Ｐｈａｒａｃｉａ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から「ミリセル （Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）」という商品名で入手可能な細胞外マトリックスタンパ ク質で表面を修飾することができる。 また、底面膜は、例えばゲルマン・サイエンス社から入手可能な「メトリセル （登録商標）」、ミクロン・セパレーション社製の「ミクロクリアー（Ｍｉｃｒ ｏＣｌｅａｒ）」のようなポリカーボネート膜又はミクロン・セパレーションズ 社製の「ポリピュアー（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ）ＰＶＣ」のようなポリ塩化ビニル膜 などを含めた疎水性膜で構成されていてもよい。ミクロクリアーは約０．１μか ら約０．８μの細孔径を有しており、ポリピュアーは約０．８ミクロンの細孔径 を有している。その他の親水性膜には、例えば、ゲルマン・サイエンス社から「 ヴェルサポール（Ｖｅｒｓａｐｏｒ）」の商品名で入手可能な不織ナイロン上の アクリレート共重合体、並びに例えばミクロン・セパレーションズ社から「アセ テートプラス（Ａｃｅｔａｔｅ Ｐｌｕｓ）」の商品名で入手可能な膜のような 酢酸セルロースが含まれる。ヴェルサポールは約０．２〜３μの細孔径を有して おり、アセテートプラスは約０．２２μ〜０．８μの細孔径を有している。疎水 性膜は、その膜の細孔を細胞生産物が通過できるようにするために、最初に親水 性としなければならない。これは、細孔を親水基で裏打ちするための真空下での プラズマ処理、或いはハイポール（Ｈｙｐｏｌ）のような創傷保護材（ドレッシ ング材）で膜を処理することによって達成することができる。 底面膜の厚さは、包帯の内容物を収容するに足るものでなければならないが、 細胞生産物１７が拡散できる程度の薄さのものでなければならない。通常、底面 膜の厚さは０．５ミルから８ミルの範囲である。底面膜は、例えばナイロン布の ような各種材料で補強してもよい。このような補強材は薄い底面膜を支持して底 面膜を壊れ難くする。 好ましくはあるが任意選択的な事項として、コンヴァテック社（Ｃｏｎｖａｔ ｅｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）から「デュオダーム（Ｄｕｏｄｅｒｍ）」の商品名で入 手可能なハイドロコロイドフィルムや、或いはダブリュ・アール・グレース・ア ンド・カンパニ一社（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）製の生分 解性２０００又は３０００系ポリウレタンプレポリマーでできている「ハイポー ルハイドロゲル（Ｈｙｐｏｌ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」の商品名で入手可能な親水 性ハイドロゲルのような、親水性の市販ゲル創傷保護材６０を底面膜１５の底面 ５０に適用してもよい。このようなゲルは、 創傷Ａと包帯１０の間の物理的クッションを与え、傷を水和し、傷からの滲出物 で底面膜１５の細孔２４が閉塞するのを防止するのに役立ち、かつ疎水性の底面 膜を親水性にするという幾つかの機能を果たす。細胞生産物１７はゲル６０を通 して十分に拡散して傷に到達する。 創傷保護材は接着剤付フィルムとして入手可能で底面膜１５の底面５０に直接 貼付することができるし、或いはハイポールハイドロゲルの場合にはハイポール ハイドロゲルを１０％トルエン溶液に溶解してその溶液中にセルガード２５００ のような底面膜１５を浸漬する。底面膜１５が飽和（約１０秒以内に起こる）し たら、底面膜を取り出して乾燥する。次に、水を加えて底面膜１５の細孔内及び 表面に存在するハイポールハイドロゲルと反応させて無色のハイドロゲルとする 。底面膜１５はこのようにして親水性となり、細胞生産物１５が底面膜を通過で きるようになる。他の好適なハイドロゲルには、例えばバード・ホーム・ヘルス ・ディヴィジョン（Ｂａｒｄ Ｈｏｍｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）か ら入手可能な「ヴィジリオン（Ｖｉｇｉｌｉｏｎ）」、スミス・アンド・ネフュ ー社（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｎｅｐｈｅｗ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手可能な「 イントラジット・ゲル（Ｉｎｔｒａｓｉｔｅ Ｇｅｌ）」、フーゲラ社（Ｆｏｕ ｇｅｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手可能な「ゲリパーム（Ｇｅｌｉｐｅｒｍ） 」が含まれる。好適なコロイドには、例えば、コンヴァテック社から入手可能な 「デュオダーム」、ホリスター（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ）社から入手可能な「リス トアー（Ｒｅｓｔｏｒｅ）」、ケンダール（Ｋｅｎｄａｌｌ）社から入手可能な 「コンフィール（Ｃｏｍｆｅｅｌ）」が含まれる。上述の目的を達成できるもの であればその他のハイドロゲル又はハイドロコロイドフィルムも使用することが できる。 上面膜１４及び底面膜１５の縁部は漏れ止めシール２６で接合し、これらの２ つの膜の間に空間すなわちチャンバー５６を与えるようにする。 図１に示す封入セパレーター型具体例では、セパレーター３０は上面膜１４に も底面膜１５にも付着していない。その代わり、上面膜１４及び底面膜１５の縁 部３２と３４をセパレーター３０の範囲よりも広くして、上面膜１４及び底面膜 １５の縁部３２と３４を直接シールする。超音波溶接、ヒートシール、インパル ス、接着剤などの慣用法を用いて漏れ止めシールを与えることができる。ヒート シール が好ましい。上面膜１４及び底面膜１５が共にセルガードでできている場合には 、これら２つの膜をヒートシールすると不透明のものが透明に変わるので、ヒー トシールでもう一つの利点が得られる。セパレーター 任意選択要素ではあるが、セパレーター０を用いるのが好ましい。セパレータ ー３０は包帯１０に剛性と形状を与える。セパレーターは上面膜１４と底面膜１ ５を隔離する。セパレーター３０は、包帯１０が創傷の輪郭に適合できる程度の 柔軟性をもつべきである。また、セパレーター３０は生体適合性のもので、しか も抽出物量の低いものであるべきである。セパレーター３０は、図１に示す通り 、エンベロープ１２によって完全に取り囲まれていてもよい。これを「封入セパ レーター」型具体例と呼ぶ。上面膜１４と底面膜１５の縁部３２と３４はセパレ ーター３０の範囲よりも広く、上面膜１４と底面膜１５が直接接合できて漏れ止 めシールを与えるようにする。この具体例では、セパレーターはエンベロープ１ ２の中にフィットするような適当な大きさのものでなければならない。セパレー ター３０は図１に示すようにエンベロープ１２内部で浮動状態におかれていても よいし、或いは上面膜１４と底面膜１５の接合に用いられるような慣用法でエン ベロープ１２に接合してもよい。 図２に示す「外辺セパレーター」型具体例では、セパレーター３０は上面膜１ ４及び底面膜１５の縁部３２と３４の間に置かれる。セパレーター３０の上面３ ６及び底面３８の両面に接着剤を塗布し、次に上面膜１４をセパレーター３０の 上面３６に接着し、底面膜１５をセパレーター３０の底面３８に接着する。ダウ ・コーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製の「シラスティック（Ｓｉｌａｓ ｔｉｃ）８９１−タイプＡ」という商品名のポリシロキサン接着剤のような医用 シリコーン接着剤を用いると、セパレーターと膜の間の良好な接着が得られた。 セパレーター３０と膜１４及び１５が同じ材料でできている場合には、膜１４及 び１５とセパレーター３０をヒートシールで融着することができる。また、ダウ ・コーニング社製の商品名「シラスティック−タイプ３５５」のような感圧性医 用シリコーン接着剤を使用することもできる。医用アクリレート系接着剤を使用 することもできる。 外辺セパレーター型具体例では、セパレーター３０は包帯１０の外辺部４０に そって位置し、外界と接触している。セパレーター３０は注射針を入れる部分と して役立ててもよい。例えば、完全に予備形成しておいたエンベロープ１２に細 胞１６を注射することによって包帯１０を組立てるような場合、注射器をセパレ ーター３０を通して挿入し、細胞１６を注入し、注射器を取り外せばよい。その 後、セパレーター材は注射針によってできた穴の周りを封止すべきである。 このように、セパレーター３０を注射針を入れる部分として役立てる場合、セ パレーター材は注射針を取り外した後の穴を封止できるような性質のものでなけ ればならないが、このような材料はこの技術分野では周知であって、例えば、ポ リエチレン、独立気泡ポリエチレン発泡体、ポリプロピレン、ポリウレタン、並 びに好ましいものとして医用シリコーンゴムが含まれる。シリコーンゴムは、針 の周りを密閉できるというその性能の面からだけでなく、その生体適合性の面か らも好ましい。打抜き法（ダイスタンピングともいう）でセパレーターを作成す ることのできる好適な医用シリコーンゴムは、ヴァリシール社（Ｖａｒｉｓｅａ ｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，オハイオ州パークマン）から入手することができる。好適 な独立気泡ポリエチレン発泡体は、アヴェリー社（Ａｖｅｒｙ，オハイオ州ペイ ンスヴィル）から「ＭＥＤ ２１８Ａ」という商品名で市販されている。 外辺セパレーター型具体例では、セパレーター３０の上面３６及び底面３８の 幅は、上面膜１４及び底面膜１５との接着に適した表面積を与えるに足るもので なければならない。セパレーター３０の大きさは通常は包帯１０の大きさが増す につれて大きくなるので、セパレーター３０の上面３６及び底面３８の幅は確定 したものではない。４０〜５０ｍｍの包帯１０には、４ｍｍの上面３６及び底面 ３８が適している。セパレーター３０の高さは、少なくとも約２１ゲージの注射 針が刺し通すことができるような外辺面を与えるに足るものであるべきである。 セパレーター３０は約４ｍｍの高さを有するものが適している。 図３に示す具体例では、セパレーター３０は２つの部材４２及び４４で構成さ れ、その２つの部材の間にフィルム４６が挿入されている。この具体例は、細胞 が足場依存性のものである場合に最も有用である。フィルム４６は細胞１１が付 着及び増殖するのに適した表面を与える。細胞が足場依存性のものである場合、 フィルム４６は親水性のものが好ましい。好適なフィルムには、前述の上面膜又 は底面膜 として使用し得る材料が含まれる。フィルムが栄養培地不透過性の材料でできて いる場合には、培地を循環させるためにフィルム４６に穴を開けてもよいし、或 いは培地がフィルムの周りを循環できるようにセパレーター部材４２及び４４の 位置を設計してもよい。足場依存性細胞の入った包帯に、足場依存性細胞の付着 及び増殖に適した表面を与えるようなフィルムを使用する場合には、上面膜１４ 及び底面膜１５は細胞の付着及び増殖に適した材料でできている必要はない。その他の特色 任意選択事項として、図５に示す通り、包帯１０は、底面膜１５の底面５０に 付着した１又は複数のスペーサー４８を有していてもよい。スペーサーは創傷部 から包帯を持ち上げて、包帯の底面と創傷の間に空間を与える。底面膜１５の底 面５０と創傷の間の空間５２には、創傷保護材を充填してもよい。細胞 様々な天然の細胞又は遺伝子操作を加えた細胞系統を使用することができる。 細胞は、表皮に由来する上皮細胞又は間葉細胞であるのが好ましい。このような 上皮細胞又は間葉細胞が好ましいのは、これらを増殖因子遺伝子その他の遺伝子 でトランスフェクションすると、所望の増殖因子以外の発現産物が創傷組織の細 胞の発現産物に類似しているはずであるからである。 実用的観点からは、無限増殖性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）のものを選ぶのが 望ましい。無限増殖性の細胞系統は、遺伝子操作面及び細胞ストックの維持の面 で都合がよい。ハーバード大学医学部（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃ ｈｏｏｌ）のジェイムス・ラインウォルド（Ｊａｍｅｓ Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ） 博士から入手できる「ＳＳＣ−１３」と名付けられたヒト角化細胞由来の偏平上 皮細胞がん腫を用いて、良好な結果が得られている。その他の「ＳＣＣ」細胞系 統、例えば、ＳＣＣ−４（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ受託番号 ＣＲＬ１６２４）、ＳＣＣ−２５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ 受託番号ＣＲＬ１６２８）及びＳＣＣ−９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ受託番号ＣＲＬ１６２９）なども使用することができる。その他の表層 上皮細胞も使用することができる。 細胞は遺伝子操作を加えて、例えば繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖 因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランス フォーミング 増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン 及びウシ成長ホルモンなど、様々な増殖因子又は成長ホルモンを産生するように することができる。細胞の遺伝子工学 細胞に遺伝子操作を加える上でファージやウイルスのような従来のベクターが 有用である。ただし、患者に腫瘍遺伝子やウイルスが放出される危険性を避ける ために、ウイルス由来の腫瘍遺伝子配列もインタクト（ｉｎｔａｃｔ）なウイル スも全く含んでいないプラスミドベクターが好ましい。 本発明のこの態様に有用なプラスミドは、所望増殖因子の遺伝子が好適なプロ モーター及びターミネーター信号と共に含まれるように合成される。プラスミド は、薬剤耐性を与える遺伝子（例えば抗生物質耐性付与遺伝子）などのマーカー 遺伝子が含まれるように構築するのが好ましい。「Ｇ４１８」と呼ばれるネオマ イシン類似物質に対する耐性を真核生物に与えるｎｏｅｒ遺伝子を用いて良好な 結果が得られている。 細胞は、上記プラスミドでトランスフェクションすることによって遺伝的に改 変することができる。次に抗生物質に暴露して機能的にトランスフェクションさ れた細胞を選択する。選択細胞を増殖させて、さらに所望産物の産生レベルにつ いて特性を調べる。最も高い増殖因子又は成長ホルモン産生レベルを示す細胞を 標準的培養技術で培養を維持する。 培養から細胞の一部又はアリコートを取り出して包帯に使用する。生存可能な 改変細胞の濃度としては約４０００細胞／ｃｍ²〜約７５０００細胞／ｃｍ²もの を使用することができる。約２００００細胞／ｃｍ²濃度が好ましい。膜の表面 積が７ｃｍ²の包帯では、およそ０５×１０⁶±０．１×１０⁶細胞／ｃｍ²の濃度 を用いることができる。 改変細胞は、細胞を包帯に入れる前に照射してもよい。改変細胞は照射によっ て分裂能を失い、それ以降分裂／増殖しなくなる。包帯は、包帯から細胞が漏れ ることのないように設計されるが、包帯が偶発的に避けたり破れたりして改変細 胞が漏れ出た場合でも、照射しておくことによって創傷部での改変細胞の増殖が 防止できる。ただし、照射は、細胞による細胞生産物の産生を妨害しない。 天然に存在し、遺伝子操作を加えていない細胞を使用してもよく、特に、成長 ホルモン又は増殖因子を産生する細胞を使用することができる。培地 改変細胞１６を包帯の耐用期間維持できるような細胞培養培地であればどのよ うな市販培地を使用してもよいが、好適な培地は、ギブコ（Ｂｉｂｃｏ）社／Ｂ ＲＬ社から市販され、カタログ９２（版権１９９１）に記載のダルベッコの改変 イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄ ｉｕｍ）；ギブコ社から市販され、カタログ９２（版権１９９１）に記載のハム （Ｈａｍ）のＦ−１２栄養培地；シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から市販されているケラチノサイト増殖培地（Ｋｅｒ ａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ）；並びにこれらの混合液であ る。好ましい培地はダルベッコ改変イーグル培地であり、それより好ましくない のはケラチノサイト増殖培地である。最も好ましい培地は、ダルベッコ改変イー グル培地とハムのＦ−１２栄養培地の３：１比の混合培地である。 さらに、培地は培地のｐＨを維持するための緩衝剤を含んでいるべきである。 多種多様な市販の緩衝剤を使用することができるが、ギブコ社から市販のＨｅｐ ｅｓ緩衝液が適している。その他の添加成分には、Ｌ−グルタミン（×１００） ，１０ｍｌ／ｌ培地； インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ），１ｍｌ／ｌ培地；ヒド ロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）（１×１０^-5Ｍ），１ｍｌ／ｌ培地；ゲンタマイ シン（１０００×），１ｍｌ／ｌ培地；ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ ０×），１０ｍｌ／ｌ培地； 並びにＮＥ−ＡＡ類（１００×），１０ｍｌ／ｌ 培地が含まれる。通常、１１培地当り１０ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝液を加える。ま た、包帯を人間に使用する場合には、培地はｐＨ変化を示すための呈色指示薬を 含有しないのが好ましい。さらに、細胞培地には、細菌の増殖を抑制するための ペニシリン及び／又はストレプトマイシンのような抗生物質を加えてもよい。 培地は液体培地として述べてきたが、本発明は固形及び／又はゲル化培地をも 包含する。培地は、エンベロープ１２のチャンバー５６に入れたハイポールゲル （Ｈｙｐｏｌｇｅｌ）のようなゲル化材によって維持されていてもよい。包帯の組立て 包帯１０は、所望の具体的態様に応じて、様々な方法によって組立てることが できる。図２の外辺セパレーター具体例を組立てる方法の一つは、上面膜１４の 外辺の内側表面を、接着剤を塗布したセパレーター３０の上面にあてがう。セパ レーターの表面を上向きに置いて、培地１８に懸濁した細胞１６を上面膜１４の 中に入れる。約１×１０⁶個の細胞に対して、１０ｍｌの培地を加える。細胞１ ６を上面膜１４の内側表面１７に付着させた後、底面膜１５の縁部３４を、接着 剤を塗布したセパレーター３０の底面３８に固着させる。通常、次に透過性底面 膜１５が下になるように包帯１０をひっくり返して、培養皿に載せる。約６０分 間平衡化させると、包帯１０はいつでも使用可能な状態となる。 別の方法として、上述の外辺セパレーター具体例について述べた方法を、エン ベロープ１２が完全に組立てられた後で細胞１６を包帯に入れるように変更して 、包帯を組立てることもできる。エンベロープ１２が完全に組立てられた後で、 培地中に懸濁された細胞１６を注射器に入れ、注射針をセパレーター３０の側壁 に刺し込む。その後、注射器の内容物を包帯１０の内部空間３０に注入する。包 帯１０を患者に適用する前に、包帯１０はインキュベーターに入れて平衡化して おく。後者の組立て法は、改変細胞１６を注射器やバイアルのような包帯以外の 容器に入れて医療機関に輸送する場合に用いることができる。改変細胞１６は、 必要とあれば融解した後に、包帯１０に注射すればよい。 図１に示す封入セパレーター型具体例では、上面膜１４及び底面膜１５よりも 少なくとも若干小さい直径又は外辺をもつセパレーター３０を上面膜１４の中に 置く。次いで、適量の細胞１６を加える。細胞１６の入った上面膜１４の上に底 面膜１５を載せる。これら２つの膜１４及び１５の縁部を接着して漏れ止めシー ルを得る。 各種の組立て方法に各種の変更を加えることができる。このような変更は、改 変細胞１６の輸送上の問題やその保存寿命に起因することもある。例えば、改変 細胞１６は封入凍結バイアルに入れて医療機関に送ってもよい。融解後、所望量 の改変細胞１６を取り出して包帯に注入してもよい。或いは、改変細胞を注射器 に入れて凍結し、必要なときに融解して包帯に注入してもよい。包帯の適用 包帯１０を組立てて遺伝的改変細胞１６を適度に平衡化すれば、包帯１０を創 傷 に適用することができる。包帯１０をいったん適所に貼付すれば、包帯は約４〜 ５日までの予測有効耐用期間をもつ。それが経過した時点で、包帯１０を取り外 すか、或いはその寿命を延ばすために包帯１０の中の培地１８を補充する。包帯 １０は、セパレーター側壁３９に刺し込んだ注射針を通して使用済みの培地を吸 引し、セパレーター側壁３９に剌し込んだ注射針を通して新鮮培地を注入して使 用済み培地を置き換えることによって、補充することができる。 ただし、上述の通り、創傷を治療する好ましい方法はひと続きの包帯を逐次適 用することである。この好ましい方法では、包帯は治癒速度に応じて約３〜４日 毎に取り替えられる。実施例１：ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を産出する包帯 包帯の機能を総括的に実証し、かつ１）包帯の中の生細胞によって改変細胞生 産物が産生されて分泌されたこと並びに２）改変細胞生産物が包帯の細孔を通過 して実際の創傷部位に到達できたことを具体的に示すためにウシ成長ホルモン細 胞生産物を設計した。細胞正産物が創傷部位に拡散することを実証するのに創傷 ラットを用いたので、ラット自身の細胞生産物と識別することのできるｂＧＨの ような改変細胞正産物を手にすることが必要であった。 ウシ成長ホルモンを産生する改変細胞を創製するために、ｐＮＥＯ−ＣＭＶ− ｂＧＨをケース・ウェスターン・リサーブ大学（Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒ ｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）微生物分子遺伝学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ）のフリッツ・ロットマン（Ｆｒｉｔｚ Ｒｏｔｔｍａｎ）博士から 入手した。ウシ成長ホルモンをサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及 びウシ成長ホルモンターミネーターと共に保有するこのプラスミドは、以下に概 略する通り合成した。ｐＮＥＯ−ｂＧＨの構築 アンピシリン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＳＶ２ＮＥＯは、アメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，以下ＡＴＣＣと略す，メリーランド州ロックヴ ィル）から入手することができ、その受託番号は３７１４９である。１００ｍｌ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣ１₂，１ｍＭ β−メルカプトエタノール及び１ ００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ ンを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）の標準制限酵素緩衝液 中の各１０単位の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（ニュー・ イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，マサ チューセッツ州ベヴァリー）社から入手）で、３７℃で約２時間、プラスミドｐ ＳＶ２ＮＥＯを同時に消化した。１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動でプラ スミドの主鎖を単離した。およそ３．５ｋｂのバンドを単離してエタノールで沈 殿させた。 ゲノムＤＮＡライブラリーからウシ成長ホルモンゲノムクローンλＧＨ２を単 離する方法は、Ｗｏｙｃｈｋ，Ｃａｍｐｅｒ，Ｌｙｏｎｓ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ， Ｇｏｏｄｗｉｎ ＆ Ｒｏｔｔｍａｎの“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ｇｒｏｗｔ ｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｇｅｎｅ”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：７１ ７９−７２１０（１９８２）に記載されている。約１．８塩基対の完全ｂＧＨ遺 伝子ゲノムクローンを保有しているλＧＨ２を、３７℃の標準制限酵素緩衝液中 で約２時間、約１０単位のＢａｍＨＩと約１０単位のＥｃｏＲＩで消化した。約 １．８塩基対（ｋｂ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩｂＧＨ遺伝子断片を１％アガロ ースゲル上でのゲル電気泳動で単離して、エタノールで沈殿させた。 次いで、約１．８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ ｂＧＨ遺伝子断片とＢａｍ ＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＳＶ２ＮＥＯとを１：１モル比で混合し、ニュー・イン グランド・バイオラブズ社から入手したＴ４ ＤＮＡリガーゼ約２単位を加えて １５℃で約２０時間かけて連結した。 連結体を大腸菌ＮＭ５２２株（ＡＴＣＣから入手可能，受託番号４７０００） にトランスフェクションさせた。ただし、どんな大腸菌株を用いてもよかった。 トランスフェクションは慣用法で実施し、菌体を０．１Ｍ ＣａＣｌ₂にさらし てＯＤ₆₆₀が０．６となるまで増殖させた菌体を１００μｌ分取した。この菌体 を上記連結体と４℃で３０分間インキュベートした後、３７℃に約２分間暖めた 。この混合物を、次に５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天平板に移して 、３７℃で一晩増殖させた。このプラスミドはアンピシリン耐性付与遺伝子を保 有しているので、このプラスミドを取り込んだ大腸菌はアンピシリン存在下で生 存してコロニーを形成する。しかる後に、コロニーを「ＬＢ培地」として知られ る３ｍｌの増殖培地（その成分は、 Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ著の“Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８２） 第４４０頁，コールドスプリングハーバープレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）発行 ，に記載）に移し、３７℃で６時間振盪培養した。細菌は集密になるまで増殖さ せた。 上記１．８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ ｂＧＨ遺伝子断片がプラスミドｐ ＳＶ２ＮＥＯのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結されていることを検証するた めに、プラスミドを単離して制限マッピングした。プラスミドの単離は、１．５ ｍｌの培地を分取して、Ｅｃｋｅｒｔの“Ｎｅｗ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｒ ａｐｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ”，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．５１，２４ ７−２５４（１９８７）に記載の「ｍｉｎｉｐｒｅｐ」法を利用して行った。プ ラスミドを３７℃で２時間ＢａｍＨＩと大腸菌で同時に消化した。プラスミド断 片を１％アガロースゲル上で電気泳動した。１．８ｋｂのｂＧＨ遺伝子断片及び 約３．５ｋｂのプラスミド主鎖の存在から、プラスミドが適切に構築されている ことが確認できた。プラスミドｐＮＥＯ−ｂＧＨを図８に示す。ｐＮＥＯ−ＣＭＶ−ｂＧＨの構築 標準制限酵素緩衝液中においてプラスミドｐＮＥＯ−ｂＧＨを３７℃で約２時 間約１０単位のＢａｍＨＩで消化した後、その混合液に約２単位のアルカリホス ファターゼを加えて皿に２時間室温でインキュベートした。次いで、１％アガロ ースゲル上で電気泳動して５．３ｋｂのプラスミドを単離してエタノールで沈殿 させた。 別個の反応において、サイトメガロウイルスゲノムから、標準制限酵素緩衝液 中にて３７℃で約２時間約１０単位の制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ（ニュ ー・イングランド・バイオラブズ社から入手）で消化することによって、ＣＭＶ プロモーターを保有する０．７５ｋｂ断片を単離した。その他の起源のＣＭＶプ ロモーターも使用することができる。１％アガロースゲル上での電気泳動によっ て約０．７５ｋｂのＣＭＶプロモーター断片を単離してエタノールで沈殿させた 。このＣＭＶプロモーター断片を上記のＢａｍＨＩ消化して脱リン酸化しておい たｐＮＥＯ−ｂＧＨ断片と１：１のモル比で混ぜ合わせて、約２単位のＴ４ Ｄ ＮＡリガーゼの存在下で １５℃で約２０時間連結した。 この連結体を、上記と同様に、大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションさ せ、ＣＭＶプロモーター断片を保有するアンピシリン耐性クローンを単離した。 このプラスミドをｐＮＥＯ−ＣＭＶ−ｂＧＨと名付けた。ＣＭＶ断片がプラスミ ドｐＮＥＯ−ｂＧＨに連結されていて、ＣＭＶプロモーター断片がｂＧＨ遺伝子 に対して正しく配向していることを検証するために、上記と同様にプラスミドを 単離した。プラスミドｐＮＥＯ−ＣＭＶ−ｂＧＨを制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩ及びＰｓｔＩで同時に消化し、プラスミド断片を１％アガロースゲル上で電 気泳動した。約０．５９ｋｂの断片と約０．２９ｋｂの断片の存在から、プロモ ーターが正しく配向していることが確認できた。図９に示す通り、プラスミドｐ ＮＥＯ−ＣＭＶ−ｂＧＨは全ｂＧＨ遺伝子の上流にＣＭＶプロモーターを保有し ており、ＣＭＶプロモーターによってｂＧＨ遺伝子の転写が調節される。ｐＮＥ Ｏ−ＣＭＶ−ｂＧＨは、また、ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０転写ターミネー ターの調節下に置かれたネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする転 写単位を別個に含んでいる。 このプラスミドは（したがって、このプラスミドでトランスフェクションされ た細胞も）、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０ターミネ ーターの部分を除いてはウイルス由来配列を全く含んでいない。皮膚細胞のトランスフェクション 包帯用のウシ成長ホルモン産生細胞系統を創製するために、ロットマン博士か ら入手したプラスミドｐＮＥＯ−ＣＭＶ−ｂＧＨを用いてＳＣＣ−１３細胞をト ランスフェクションした。ＳＣＣ−１３細胞を２×１０⁵細胞／５０ｃｍ²の割合 で平板に接種し、一晩かけて付着させた。翌日、細胞を１０μｇのｐＮＥＯ−Ｃ ＭＶ−ｂＧＨプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。細胞のトランスフ ェクションは、Ｃｈａｎｅｙ，Ｈｏｗａｒｄ，Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｓａｌｕｓｔｉ ｏ ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙの“Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｔｒａｎｓｆ ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ” ，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２３７−２４４（１９８ ６）に記載のポリブレン法という確立された方法を用いて行った。トランスフェ クションして３日後に、細胞は集密に達するまで増殖した。細胞を収集して、そ れを１／４ずつ新しい培養皿に分けて、一晩かけて付着 させた。次いで、ネオマイシンＧ４１８を２００μｇ／ｍｌの濃度で培地に加え た。Ｇ４１８を含有する新鮮培地を３日おきに培地に加えた。Ｇ４１８は真核生 物細胞を死滅させる。しかし、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を コードしたプラスミドを取り込んだ細胞はＧ４１８に耐性となり、生存してコロ ニーを形成する。コロニーを６週間かけて拡張させ、しかる後にウシ成長ホルモ ンについての特性を調べた。遺伝的改変細胞の産生する成長ホルモンの検出は主 にイムノブロット法という周知の抗体法によって行ったが、免疫組織学的方法や 免疫沈降法を用いることもできる。成長ホルモン分泌皮膚細胞の特徴付け 成長ホルモンを分泌する可能性があると見込まれる細胞を、成長ホルモンの分 泌についてスクリーニングした。直径１０ｃｍの皿（５０ｃｍ²）の中の標準増 殖培地中で細胞を集密に至るまで増殖させた。培地はダルベッコ改変イーグル培 地とハムのＦ−１２栄養培地の３：１比の混合培地であり、上記の添加成分と８ ０ｍｌ／ｌのウシ胎児血清を含んでいた。次いで、細胞を無血清培地に移した。 様々な時点（１〜２４時間）において培地を採取し、濃縮して１２％ポリアクリ ルアミドゲル上で分画した。分画したタンパク質をニトロセルロースにブロッテ ィングし、抗ｂＧＨ一次抗体と共にインキュベートした後、¹²⁵Ｉで標識したプ ロテインＡ（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．）から入手）と共に二 度目のインキュベーションを行った。バンドはＸ線フィルムに露出して視認でき るようにした（オートラジオグラフィー）。 Ｘ線フィルムに露出した後、オートラジオグラフィー像をレーザーデンシトメ ーター法で定量した。 試験開始後１時間という早い段階で、約０．１μｇというかなりの量の成長ホ ルモンが細胞から放出された。２４時間までには、１．０μｇを超えるｂＧＨが 培地中に存在していた。これらの細胞の集密的培養皿１個におよそ２×１０⁶個 の細胞が存在していたので、ホルモン産生レベルは極めて高い。これらの結果か ら、プラスミドｐＮＥＯ−ＣＭＶ−ｂＧＨという構築体が高レベルのホルモンを 産生することが確認できる。包帯完成品からの細胞生産物の放出 封入又は外辺ガスケット型具体例にしたがって包帯を組立てた。しかる後に、 細胞周囲の培地中及び包帯の外の媒質中に分泌された改変細胞生産物の量を測定 することによって、包帯の効率を決定した。包帯の効率は、包帯をラットの創傷 に貼付することによっても決定した。 改変細胞を包帯の中に接種し、上面膜の内側表面に付着させて図２に示す包帯 とした。包帯の内部には、改変細胞を維持するための無血清増殖培地が含まれて いた。包帯は直径７ｃｍの円形であり、１×１０⁶個の細胞を含んでいた。 包帯内の培地中及び包帯外の媒質中の成長ホルモンのレベルを１０日間にわた って毎日測定した。 結果、細胞は最少培地中で１０日間は生存し続けること、並びに細胞が成長ホ ルモンを１日当り１．０μｇ／１×１０⁶細胞の定常速度で内部培地中及び外部 媒質中に放出することを示していた。底面膜は、包帯又は細胞からの成長ホルモ ンの放出を妨害しなかった。 包帯から媒質中への成長因子の放出を検出するために、改変細胞を無血清規定 培地中に移して、１時間から１０日間インキュベートした。様々な時点で、培地 を回収し、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社のセントリコーン−１０フィルターで濃 縮／脱塩した。このフィルターは分子量１０００ダルトン以上の分子を保持する 。保持されたタンパク質を、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．０）で洗浄して、電気泳動試料緩衝液中に溶解し、１０％アクリルア ミドゲル上で電気泳動した。ｂＧＨ特異抗体によるイムノブロット法並びに放射 性標識¹²⁵ＩプロテインＡ（アマシャム社から入手）により、成長因子を免疫学 的に検出した。図１５は、２４時間の間の包帯からのｂＧＨの放出を示すオート ラジオグラフである。「ｓｔｄ」は０．５μｇのｂＧＨを含有する標準である。ラット創傷への適用 麻酔をかけたラットの剃毛した皮膚に、医用シリコーンゴムでできた円形リン グを接着した。リングの外壁は高さが０．４ｃｍで厚さが０．４ｃｍであった。 リングの中央は４分の１の大きさの開口を有していて、そこが創傷の部位であっ た。このリングの目的は２つある。一つは創傷を準備しかつモニターすることの できる部屋を与えることであり、もう一つは創傷が収縮しないようにするためで ある。 円形の平らな鉄片を熱湯中で７０℃に熱して皮膚の表面に３０秒間押し当てる ことによって創傷を作った。鉄は、創傷室の中にに容易に入れることができるよ うに創傷室の直径よりも若干小さい直径を有していた。この装置及び方法でラッ トの皮膚の表面に均一な火傷を与えることができた。火傷の程度は、鉄片を押し 当てる時間を変えるか或いは何度も押し当てることによって調節することができ る。 ラット創傷の上にゼラチン層を載せた。創傷室よりも若干小さい直径の包帯を ゼラチン層の上に載せて創傷をカバーした。最後に、透明な創傷室カバーで創傷 室を覆った。この創傷室カバーは、外辺部に接着剤が付いた生体適合性フィルム でできていて、この接着剤で創傷室が密封される。密封された創傷室を弾性バン ドで包み、これを縫い合わせることによってその場所に保持してラットからの脱 落及び包帯の損傷を防止した。 この生物学的包帯の産する改変細胞生産物を、創傷室内で回収された液体中に 存在する改変細胞生産物の量を測定することによって決定した。 創傷領域に存在する改変細胞生産物の量はおよそ５０ｎｇであった。放出され る改変細胞生産物の量は、包帯中に存在する改変細胞の濃度を増減することによ って加減することができる。実施例２ ヒト上皮成長因子を産出する包帯 ヒト上皮増殖因子遺伝子をコードする配列とネオマイシン耐性遺伝子を保有す るプラスミドを以下の工程で作製した。プラスミド「ｐＥＣＥ」はカリフォルニ ア大学サンフランシスコ校（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｆｏ ｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）のルター（Ｒｕｔｔｅｒ）博士から入 手したもので、Ｅｌｌｉｓ Ｌ．，Ｃｌａｕｓｅ Ｅ．，Ｍｏｒｇａｎ Ｄ．Ｏ ．，Ｅｄｅｒｙ Ｍ．，Ｒｏｔｈ Ｒ．Ａ．，Ｒｕｔｔｅｒ Ｗ．Ｙ．の“Ｒｅ ｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎ ｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ １１６２ ａｎｄ １１６３ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎ ｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ”，Ｃｅｌｌ，４５． ７２１−７３２（１９８６）に記載の方法にしたがって合成されたものである。 プラスミドｐＥＣＥを図１０に示す。 次に、プラスミドｐＥＣＥを、ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０ターミネータ ーの 間に位置するＳａｌＩ部位で消化した。この消化はニュー・イングランド・バイ オラブズ社から入手したＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて行い、Ｍａｎ ｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ著の“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８２）第１０４ 頁及び第４０５頁（コールドスプリングハーバープレス社，ニューヨーク州コー ルドスプリングハーバー発行）に記載の方法にしたがって、標準制限酵素緩衝液 中において３７℃で２時間行った。得られたＳａｌＩ末端を、次に、約２単位の 仔ウシアルカリホスファターゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入 手）と室温で３分間インキュベートして脱リン酸化した。このＳａｌＩ消化・脱 リン酸化プラスミドを１％低融点アガロースゲル上での電気泳動によって精製し た。ＳａｌＩ消化及びホスファターゼ処理されたｐＥＣＥプラスミドを含有する 約２．９ｋｂバンドをゲルから単離し、エタノールで沈殿させた。ＥＧＦコード配列の調製 図１１に示す通り、プラスミドｐＵＣＤＳ３は、ヒトＥＧＦコード配列に融合 したＩｇシグナル配列（マウス免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドをコードす る）を含んでいる。プラスミドｐＵＣＤＳ３は、ケース・ウェスターン・リサー ブ大学微生物分子遺伝学科（オハイオ州クリーブランド）のクング（Ｋｕｎｇ） 博士から入手した。このプラスミドの作製法はＳｔｅｒｎ，Ｈａｒｅ，Ｃｅｃｃ ｈｉｎｉ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇの“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆ ａｃｔｏｒ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：３２１−３２４（１９８７）に記載さ れている。プラスミドｐＵＣＤＳ３を最初に１０単位の制限エンドヌクレアーゼ ＸｂａＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手）を用いて３７℃で ２時間消化して、２単位のアルカリホスファターゼで３分間脱リン酸化した後、 １％アガロースゲル上でのゲル電気泳動で精製した。約３．０ｋｂのＸｂａＩ消 化プラスミドを単離した。 アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ヘイワード）から入手できる市販のＤＮＡ合成機を 用いて、次に示す通り、内部ＳａｌＩ制限部位の両端に隣接したＸｂａＩ付着末 端を有する二本鎖 配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。 ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手したポリヌクレオチドキナー ゼを用いて上記オリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸化した後、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）中で２５℃で２ 時間インキュベートしてアニーリングした。これらの工程は、上記Ｍａｎｉａｔ ｉｓ他の成書の第１２２−１２６頁及び第２４２頁に記載の標準法にしたがって 行った。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを１：１のモル比で上記ＸｂａＩ 消化ｐＵＣＤＳ３と混合して、２単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イング ランド・バイオラブズ社から入手）を用いて１５℃で１５時間連結した。連結体 を大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションした。ただし、どんな大腸菌株を 用いても満足すべき結果が得られるはずである。アンピシリン耐性コロニーを選 択した。ＸｂａＩ部位に新たにＳａｌＩ部位が挿入されたプラスミドを保有する クローンを単離した。このプラスミドを「ｐＵＣＤＳ３−ＳａｌＩと名付け、図 １２に示す。このプラスミドは、２か所のＳａｌＩ部位の間にクローン化された Ｉｇシグナル配列−ヒトＥＧＦ融合遺伝子を含んでいる。ＳａｌＩ消化・ホスファターゼ処理ｐＥＣＥへのＥＧＦコード配列の移入 プラスミドｐＵＣＤＳ３−ＳａｌＩを３７℃で２時間ＳａｌＩで消化した。Ｉ ｇシグナル配列-ヒトＥＧＦ融合遺伝子を含有するインサートは約０．５ｋｂで あった。これは１％低融点アガロースゲル上での電気泳動によって精製し、約０ ．５ｋｂのバンドを単離してエタノールで沈殿させた。このインサートを、Ｓａ ｌＩで消化しホスファターゼ処理しておいたｐＥＣＥと１：１のモル比で混合し 、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で１５時間連結した。連結混液を 大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションして、アンピシリン耐性コロニーを 選択した。クローンを単離したところ、そのクローンは、ＳａｌＩ部位にクロー ン化されたＩｇシグナル配列−ヒトＥＧＦ融合遺伝子を含んでおり、その融合遺 伝子はｐＥＣＥに存在するＳＶ４０プロモーターからの発現に対して正しく配向 していた。このプラスミド 「ｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ」を図１３に示す。ｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦへのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の移入 プラスミドｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦを標準条件下において３７℃で２時間Ｂａｍ ＨＩ消化し、２単位のアルカリホスファターゼを標準条件下で用いて室温で３分 間脱リン酸化した。このプラスミドをラウス肉種ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ ー及びＳＶ４０ターミネーターの調節下におかれたネオマイシンホスホトランス フェラーゼ遺伝子を含有するＢａｍＨＩカセットと１：１モル比で連結した。 「ＮＥＯ」と呼ばれるこのカセットの構築法は、Ｒｏｒｋｅ ａｎｄ Ｅｃｋｅ ｒｔの“Ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｅｌ ｌ ｔｙｐｅｓ；ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｒｏｓｓ−ｌ ｉｎｋｉｎｇ ｂｙ ｔｙｐｅ Ｉ ａｎｄ ｔｙｐｅ II ｔｒａｎｓｇｌｕ ｔａｍｉｎａｓｅ”，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９７：５４３−５ ４８（１９９１）に記載されている。上記の連結は連結緩衝液中で２単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを標準条件下で１５℃で１５時間用いて行った。 連結体を大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションし、アンピシリン耐性コ ロニーを選択した。ＢａｍＨＩカセットがｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦに連結している ことを検証するために、特定のクローンを精製して、ＢａｍＨＩで消化し、１％ アガロースゲル上で電気泳動した。約３．２ｋｂのｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ断片及 び約９．０ｋｂのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子含有カセット（ ＮＥＯ）の存在から、連結していることが確認できた。得られたプラスミドをｐ ＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ−ＮＥＯと名付けた。ｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ−ＮＥＯによるＳＣＣ−１３細胞のトランスフェクション ヒトＥＧＦ産生皮膚細胞系統を創製するために、ＳＣＣ−１３ｂＧＨ細胞の創 製するために用いた上述の方法と同じ方法で、プラスミドｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ −ＮＥＯを用いてＳＣＣ−１３細胞をトランスフェクションした。２００μｇ／ ｍｌのネオマイシンＧ４１８でネオマイシン耐性コロニーを選択した。得られた クローンを、ＥＧＦの産生及びＥＧＦの培地中への分泌について調べた。 具体的には、バイオメディカル・テクノロジー社（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ストウム）から入手可能 な、ヒト上皮増殖因子に対する抗体を含んだラジオイムノアッセイキットを用い て、培地中に存在するヒト増殖因子の量を求めた。２４時間後に１０⁶個の細胞 からおよそ９４ｐｇが分泌された。 上述の実施例では、増殖因子のような所望の細胞生産物を発現する遺伝子のプ ロモーターとして特定のウイルス由来高レベル構成プロモーターを使用したが、 ＣＭＶプロモーター、ラウス肉種ウイルス（ＲＳＶ）及びモロニーマウス白血病 ウイルスプロモーターのような他のウイルス由来プロモーターを使用することも できることを理解すべきである。例えば、重金属で誘導されるプロモーター（メ タロチオネインプロモーターなど）や、ビタミンやホルモンに応答するプロモー ター（レチノイン酸誘導性プロモーターなど）のような誘導プロモーターを使用 することもできる。例えばアクチンのような細胞性遺伝子から単離された構成的 活性プロモーターを使用することもできる。 同様に、多種多様なターミネーターを使用することができ、例えば、細胞性遺 伝子ターミネーター（ウシ成長ホルモンターミネーターやアクチン遺伝子ターミ ネーターなど）やウイルスプロモーター（ＳＶ４０ターミネーターなど）が使用 できる。さらに、人工的に構築したＤＮＡ配列で全体的又は部分的に構成される プロモーターを使用してもよい。 本発明で用いたネオマイシン遺伝子マーカー外にも、ピューロマイシンやハイ グロマイシンなどの他のマーカーも使用できることも理解すべきである。遺伝子 マーカーは、上記実施例で用いたものと異なるプロモーター及び／又はターミネ ーターと共に使用できる。好適なプロモーター及びターミネーターには、例えば 、前段で述べたターミネーター及びプロモーターが含まれる。 増殖因子のような改変細胞生産物を創傷に適用するための手段として包帯を説 明してきたが、包帯はホルモンや抗生物質のような他の分子を産生する遺伝的改 変細胞を含んでなるものであってもよい。また、包帯は、創傷の治療に有用なこ のような他の分子を供給するために用いることもできるし、或いは病気及び損傷 の体系的な治療のためにこのような分子を非創傷組織を通して患者に経皮的に供 給するために用いることもできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 7019−4Ｃ Ａ６１Ｌ 15/03 (72)発明者 エカート、リチャード・エル アメリカ合衆国、オハイオ州 44119、ユ ークリッド、クレストランド・ロード 17806 (72)発明者 スミス、ダニエル・ジェイ アメリカ合衆国、オハイオ州 44224、ス トゥ、ドレズラー・トレイル 4682 (72)発明者 シェイファー、アーウィン アメリカ合衆国、オハイオ州 44108、ブ レイトナル、コーニング・ドライブ 313

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．細胞培養培地を収容するためのチャンバーを画定する第一の膜部材と 第二の膜部材であって、 ｂ．第一の膜部材と第二の膜部材の一方は培地及び培地中の培養細胞の生 産物に対して実質的に不透過性であり、 ｃ．第一の膜部材と第二の膜部材のもう一方は培地中の培養細胞の生産物 に対して実質的に透過性であるもの を含んでなる包帯。 ２．請求項１記載の包帯において、第一の膜部材と第二の膜部材の外辺部が接 合されていることを特徴とする包帯。 ３．請求項１記載の包帯において、チャンバー内にセパレーター手段が設けら れていて、当該セパレーター手段が第一の膜部材と第二の膜部材の接合部に隣接 して位置していることを特徴とする包帯。 ４．請求項２記載の包帯において、第一の膜部材が上面膜であり、第二の膜部 材が創傷の上に位置すべき底面膜であることを特徴とする包帯。 ５．請求項４記載の包帯にして、上面膜と底面膜の外辺部の接合部に隣接して 、上記チャンバー内におかれたセパレーター手段をさらに含んでなることを特徴 とする包帯。 ６．請求項４記載の包帯にして、上面膜及び底面膜の各々に接合したセパレー ター手段をさらに含んでなることを特徴とする包帯。 ７．請求項４記載の包帯において、上面膜の外辺部をセパレーターの上面に接 合し、かつ底面膜の外辺部をセパレーターの底面に接合することによって、上面 膜と底面膜の外辺部が接合していることを特徴とする包帯。 ８．請求項４記載の包帯において、上面膜がポリエチレン又はポリプロピレン でできていることを特徴とする包帯。 ９．請求項４記載の包帯において、底面膜が不織ポリエチレン又はポリプロピ レン繊維でできていることを特徴とする包帯。 １０．請求項４記載の包帯において、 ａ．上面膜が透過性上層と下層を含んでなり、当該下層が培地及び培地中 の培養 細胞の生産物に対して不透過性であること、並びに ｂ．底面膜が培地中の培養細胞の生産物に対して透過性であること を特徴とする包帯。 １１．請求項１０記載の包帯において、上面膜の透過性上層及び底面膜の各々が 不織ポリエチレン又はポリプロピレンでできていることを特徴とする包帯。 １２．請求項４記載の包帯にして、チャンバーを横断して張られたセパレーター であって、かつ細胞の付着を促す親水性表面をもつフィルムを含んでなるセパレ ーターをさらに含んでなることを特徴とする包帯。 １３．請求項１又は請求項４記載の包帯にして、当該包帯と創傷との間に間隔を おくための手段をさらに含んでなることを特徴とする包帯。 １４．請求項１又は請求項４記載の包帯にして、チャンバー内に収容された細胞 培養培地をさらに含んでなることを特徴とする包帯。 １５．請求項１又は請求項４記載の包帯において、細胞培養培地がチャンバー内 のゲル化材に含まれていることを特徴とする包帯。 １６．請求項１又は請求項４記載の包帯にして、チャンバー内に収容された細胞 を含んだ細胞培養培地をさらに含んでなることを特徴とする包帯。 １７．創傷を治療するための方法にして、当該創傷に請求項１６記載の包帯を適 用することを特徴とする方法。 １８．請求項１７記載の創傷を治療するための方法にして、創傷と包帯の間に創 傷保護材を適用する段階をさらに含んでなることを特徴とする方法。 １９．創傷を治療するための方法にして、創傷に請求項１６記載の包帯であって 各々異なる創傷治癒因子を産生する細胞を含んでなる複数個の包帯を逐次適用す ることを特徴とする方法。 ２０．細胞を収容するための封入チャンバーを有するエンベロープを含んでなる 包帯にして、当該エンベロープは一部分が透過性部分によって画定されており、 当該透過性部分は約５０００００ダルトン以下の分子量の分子に対して透過性で あることを特徴とする包帯。 ２１．包帯にして、 ａ．上面膜及び透過性底面膜及びそれらの間のチャンバーを含んでなるエ ンベロ ープであって、上面膜が底面膜と連結して漏れ止めシールを与えているエンベロ ープ、 ｂ．細胞生産物を産生する細胞であって、チャンバー内に入っている細胞 、及び ｃ．細胞を維持するための培地であって、チャンバー内に入れられていて 、細胞を取り囲む培地 を含んでなる包帯。 ２２．請求項２１記載の発明において、細胞が真核生物であることを特徴とする 発明。 ２３．請求項２１記載の発明において、上面膜と底面膜の間に挿入されたセパレ ーターをさらに含んでなることを特徴とする発明。 ２４．請求項２３記載の発明において、上記の両方の膜がさらに外辺部を含んで いて、セパレーターが上面膜の外辺部と底面膜の外辺部の間に挿入されているこ とを特徴とする発明。 ２５．請求項２１記載の発明にして、包帯と創傷との間に間隔をおくためのスペ ーサーをさらに含んでなることを特徴とする発明。 ２６．請求項２１記載の発明にして、上面膜の上に、包帯を支持及び保護するた めの可撓性材料の層をさらに含んでなることを特徴とする発明。 ２７．請求項２１記載の発明にして、底面膜の底面側に配置されたフィルムをさ らに含んでなることを特徴とする発明。 ２８．ヒト上皮増殖因子を産生するための遺伝的改変細胞にして、 ａ．以下のｉ及びii： ｉ．プロモーター遺伝子、ヒト上皮増殖因子遺伝子及びターミネーター 遺伝子を含んでなる上皮増殖因子遺伝子配列、 ii．プロモーター遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子及びターミネーター遺 伝子を含んでなる抗生物質耐性遺伝子配列 を含んでなるプラスミド、及び ｂ．細胞 を含んでなる遺伝的改変細胞。 ２９．請求項２８記載の発明において、抗生物質プロモーターがサイトメガロウ イルスプロモーター遺伝子を含んでなることを特徴とする発明。 ３０．請求項２８記載の発明において、ターミネーターがＳＶ４０ターミネータ ー遺伝子を含んでなることを特徴とする発明。 ３１．請求項２８記載の発明において、耐性遺伝子がネオマイシンホスホトラン スフェラーゼ遺伝子を含んでなることを特徴とする発明。 ３２．請求項２８記載の発明において、細胞がＳＣＣ−１３細胞であることを特 徴とする発明。 ３３．改変細胞生産物を産生する遺伝的改変細胞を作製する方法にして、以下の ａ〜ｆの段階： ａ．上皮増殖因子をコードする遺伝子配列とプロモーターを含んでなるプ ラスミドを準備する段階、 ｂ．次いで、プラスミド（ｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ）に薬剤耐性付与遺伝子 を挿入して第二のプラスミドを作製する段階、 ｃ．トランスフェクション用の細胞を準備する段階、 ｄ．次いで、第二のプラスミド（ｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ）で細胞をトラン スフェクションする段階、 ｅ．上記薬剤耐性遺伝子が与える耐性の対象となる薬剤の存在下でトラン スフェクションした細胞を増殖させて、第二のプラスミドを保有する細胞を単離 する段階、 ｆ．単離細胞を上皮成長因子の産生について確認する段階 を含んでなる方法。 ３４．以下のａ〜ｆ： ａ．Ｉｇシグナル配列、 ｂ．上皮成長因子遺伝子、 ｃ．切断部位、 ｄ．ターミネーター、 ｅ．上皮成長因子遺伝子とターミネーターの間に挿入された少なくとも１ つの切断部位、及び ｆ．Ｉｇシグナル配列と上皮成長因子遺伝子の間に挿入された少なくとも １つの切断部位 を含んでなるプラスミド。 ３５．以下のａ〜ｆ： ａ．プロモーター、 ｂ．上皮成長因子遺伝子 ｃ．プロモーターと上皮成長因子遺伝子の間に挿入された少なくとも１つ の切断部位 ｄ．ターミネーター、 ｅ．上皮成長因子遺伝子とターミネーターの間に挿入された少なくとも１ つの切断部位、及び ｆ．ターミネーターの後に位置する切断部位 を含んでなるプラスミド。 ３６．請求項４１記載のプラスミドにして、 ａ．薬剤耐性付与遺伝子 ｂ．薬剤耐性付与遺伝子の発現を促進するプロモーター、及び ｃ．ターミネーター をさらに含んでなることを特徴とするプラスミド。 ３７．ヒト成長因子を含んでなるプラスミド。 ３８．ヒトＰＤＧＦ又はＥＧＦ又はＴＧＦを含んでなるプラスミド。 ３９．図１２、図１３又は図１４に示すプラスミド。 ４０．ヒトＰＤＧＦ又はＥＧＦ又はＴＧＦ又はｂＧＨを産生する天然には存在し ない細胞。 ４１．ＰＤＧＦ又はＥＧＦ又はＴＧＦ又はｂＧＨを産生するベクターでトランス フェクションした大腸菌。