JPH0850120A - 液体クロマトグラフィ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラ
ムを具備する液体クロマトグラフィ装置に関し、測定精
度の向上を図ることを目的とする。 【構成】被測定試料を分離する分離用カラム16と、被測
定試料を溶媒と共に分離用カラム16に供給する流路制御
手段14と、供給された被測定試料を分析処理する検出手
段17と、被測定試料を採取してこれを流路制御手段14に
供給する試料注入手段15,22,22a と、溶媒と共に供給さ
れる被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラム30とを具備
し、上記濃縮用カラム30の内容量を 2.0ミリリットル未
満とすると共に、濃縮用カラム30内に、Ｓｉ−Ｒ（Ｒは
疎水性基）結合、及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結
合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体
よりなるカラム充填剤を充填した構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体クロマトグラフィ装
置に係り、特に被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラム
を具備する液体クロマトグラフィ装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】液体クロマトグラフィ装置は化学物質を
分離・定量する化学分析手段として広く使われている。
特に、内径が１〜２ｍｍのセミミクロカラムを使った液
体クロマトグラフィ装置は高感度、高分解能および高精
度な分析結果を提供できる利点を有しており、活発な研
究がなされている。

【０００３】ここで、液体クロマトグラフィ装置に内設
され、試料溶液の濃縮処理を行うために用いられる濃縮
用カラムに注目する。濃縮用カラムの内部にはカラム充
填剤が充填されており、試料溶液はこのカラム充填剤に
より濃縮処理が行われる。例えば、液体クロマトグラフ
ィ装置を血清等の各種物質の混合試料の分離，分析に用
いた場合、生体成分である血清等はタンパク質成分を多
量に含んでいるために、このタンパク質成分がカラム充
填剤に吸着してしまい濃縮作用が低下してしまう。この
ため、従来ではカラム充填剤による濃縮作用の低下を防
止するために、予め試料よりタンパク質を除去する前処
理を行っていた。

【０００４】しかるに、このような前処理操作は多大の
時間と労力を要し、かつ分析精度を低下させるという問
題を有している。そこで、近年これらの除タンパク操作
を行うことなく装置内に直接タンパク質成分含有試料を
注入し、この注入されたタンパク質成分含有試料を濃縮
しうるカラム充填剤が提供されるようになってきてい
る。

【０００５】これらの改良されたカラム充填剤は、多孔
性ガラスやシリカゲルを担体とし、その細孔内表面に特
性の異なる物質を設けた構成とされている。そして、こ
のカラム充填剤を用いれば、血清中のタンパク質は巨大
分子なので細孔内に入らず、且つ親水性の外表面（孔外
面）に吸着されることなくカラムを素通りし、比較的小
さな薬物等の分子は疎水性の内表面（孔内面）に吸着す
ることとなる。

【０００６】このようなカラム充填剤の具体例として
は、特開昭６０−５６２５６号公報に記載されたものが
挙げられる。このカラム充填剤では、オクタデシルシリ
ル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシリカの外表面にタン
パク質をコートしている。このコート用タンパク質はウ
シ血清アルブミン等よりなり、該タンパク質をＯＤＳ結
合シリカに吸着・変性させることによりカラム充填剤を
得ている。

【０００７】しかしながら、上述したカラム充填剤の
内、タンパク質をコートしＯＤＳシリカ充填剤では、使
用が長期に渡ると吸着・変性したタンパク質が溶離を起
こすことがあり、また高分離効率のカラムが得られない
等、耐久性や分離能の点で問題を残している。

【０００８】このような問題点を改良するため、特開昭
６１−６５１５９号公報及び特開平１−１２３１４５号
公報に記載されたように、 多孔質担体の内表面及び外表面に疎水性基を導入す
る。 それ自信が巨大分子であり、シリカ等の細孔内に侵入
できない酵素を用いて外表面の疎水性基だけを切断す
る。 その後、外表面に親水性基を導入する。 ことにより、カラム充填剤を得る方法も開発されてい
る。

【０００９】具体的には、特開昭６１−６５１５９号公
報記載の方法では、グリセリルプロピル基を導入した多
孔性シリカを出発原料とし、これにカルボニルジイミダ
ソールを介してオリゴペプチドを結合させ、タンパク質
加水分解酵素であるカルボキシペプチターゼＡを用いて
加水分解を行うことにより外表面のフェニルアラニン側
鎖を切断している。その結果、カラム充填剤の内表面に
は疎水性リガンドとしてグリシル−フェニルアラニルフ
ェニル−アラニンが残り、外表面には親水性のグリシル
ーグリセリルプロピル基となる。

【００１０】一方、特開平１−１２３１４５号公報に記
載の方法は、アミノプロピル基を導入した多孔性シリカ
を出発原料として、トリエチルアミン存在下、オクタノ
イルクロリドを反応させ、アミド結合を介して疎水性基
を導入し、次にポリミキシン・アシラーゼにより外表面
のアシル基を加水分解し、外表面のアミノ基をグリシド
ールとの反応を行うことにより親水基とする方法であ
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかるに、液体クロマ
トグラフィ装置に配設される濃縮用カラム３０のカラム
充填剤として特開昭６１−６５１５９号公報或いは特開
平１−１２３１４５号公報に開示されたものを用いる
と、各公報に開示されたカラム充填剤は酵素反応を利用
しているため、カラム充填剤の製造構成が複雑化すると
共に得られたカラム充填剤の特性にバラツキが生じやす
いという問題点があった。

【００１２】また、従来の液体クロマトグラフィ装置で
は、濃縮用カラムの内容積が２．０ミリリットル以上と
大きい容積を有していたため、供給された試料溶液が却
って濃縮用カラム内で希釈されてしまい、検出精度が低
下してしまうという問題点があった。この問題点は、特
に注入される試料量が少ない場合には検出精度に大きく
影響を与えてしまう。

【００１３】本発明は上記の点に鑑みてなされたもので
あり、濃縮用カラムとして比較的得ることが容易でかつ
濃縮効率の良好なものを用いると共に濃縮用カラムの内
容積を小さくすることにより、上記の問題点を解決した
液体クロマトグラフィ装置を提供することを目的とす
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明では、ポンプにより供給される溶媒に混在す
る被測定試料を分離する分離用カラムと、 上記ポンプ
と分離用カラムとの間に配設され、ポンプから溶媒を供
給されると共に試料注入配管より被測定試料を供給さ
れ、この被測定試料を溶媒と共に分離用カラムに供給す
る流路制御手段と、上記分離用カラムで分離された被測
定試料が供給されると共に、供給された被測定試料を分
析処理する検出手段と、被測定試料を格納した複数の容
器を担持する試料保持機構と、上記複数の容器の一つか
ら被測定試料を選択的に採取してこれを流路制御手段に
供給する試料注入手段と、上記流路制御手段と分離用カ
ラムとの間に設けられ、溶媒と共に供給される被測定試
料を濃縮処理する濃縮用カラムとを設けており、上記濃
縮用カラムの内容量を２．０ミリリットル未満とすると
共に、上記濃縮用カラム内に、Ｓｉ−Ｒ（Ｒは疎水性
基）結合、及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有
するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりな
るカラム充填剤を充填したことを特徴とするものであ
る。

【００１５】また、上記カラム充填剤における親水性基
Ｒ’を、水酸基を有する親水性基とした構成としてもよ
い。更に、上記カラム充填剤における疎水性基Ｒを、炭
素数１〜１８の炭化水素残基とした構成としてもよい。

【００１６】

【作用】上記構成とされた液体クロマトグラフィ装置で
は、濃縮用カラムの内容量を２．０ミリリットル未満と
されておりその内容積は小さいため、注入される被測定
試料量が少なくても希釈作用は発生せず、よって確実に
濃縮処理を行うことができるため検出精度を向上させる
ことができる。

【００１７】また、濃縮用カラム内に充填されるカラム
充填剤は、Ｓｉ−Ｒ（Ｒは疎水性基）結合、及びＳｉ−
Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマ
ーで被覆された多孔性担体よりなり、この構成のカラム
充填剤はその外表面の一部が親水性であるためにタンパ
ク質等が吸着されることはなく、また安定でしかも分離
能に優れているため、濃縮処理を確実に行うことができ
る。更に、酵素等を用いていないため、これによっても
安定した濃縮処理を実現できる。

【００１８】

【実施例】次に本発明の実施例について図面と共に説明
する。図１乃至図３は、本発明の第１実施例である液体
クロマトグラフィ装置の概略構成図である。

【００１９】本実施例に係る液体クロマトグラフィ装置
は、複数の試料容器２１ａを形成された試料保持部２１
を有し、各試料容器２１ａには被測定試料が保持され
る。この各々の試料容器２１ａは典型的には約２００μ
ｌの容量を有している。また、試料注入管２２はロボッ
ト２２ａにより移動自在に保持されており、ロボット２
２ａの動作により試料注入管２２が位置Ｐ₁ に移動さ
れ、続いて下降動作することにより試料注入管２２は複
数ある試料容器２１ａの内、選択された一つの試料容器
２１ａに挿入される。続いて、シリンジ１５の操作を操
作することにより、被測定試料は試料注入管２２内に吸
入させる。

【００２０】また、図中１４で示すのは六方弁として構
成される第１の切り換えバルブ１４であり、この第１の
切り換えバルブ１４には本発明の要部となる濃縮用カラ
ム３０及び試料注入管２２の先端を受け入れる端部１４
ｘが接続されている。濃縮用カラム３０は、その内容積
が２００マイクロリットル未満と比較的小型のカラムで
あり、後述するカラム充填剤が充填されている。この濃
縮用カラム３０において供給された被測定試料は濃縮さ
れるため、後述する分離用カラム１６及び検出器１７に
は濃縮された被測定試料が供給されることとなり、検査
精度の向上を図ることができる。

【００２１】また、端部１４ｘは被測定試料の注入口と
なる部位であり、試料注入管２２内に採取された被測定
試料は、試料注入管２２を端部１４ｘ内に挿入し再びシ
リンジ１５を操作することにより端部１４ｘ内に注入さ
れる。この際、試料注入管２２はロボット２２ａにより
端部１４ｘに対応した位置Ｐ ₂ に水平移動され、続いて
鉛直方向に移動することにより端部１４ｘ内に挿入され
る。また、試料注入管２２から注入された試料溶液は、
第１の切り換えバルブ１４が図１及び図２に示される状
態の時に濃縮用カラム３０内に供給され、濃縮処理が行
われる構成となっている。

【００２２】また、本実施例に係る液体クロマトグラフ
ィ装置では、検出器１７の試料出口に六方弁として構成
される第２の切り換えバルブ２３が接続されている。こ
の第２の切り換えバルブ２３は、分離用カラム１６で分
離され検出器１７で検出された後排出される被分離試料
を、前記廃液溜め１８と前記試料注入管２２のいずれか
一方に選択的に供給する機能を奏する。図１及び図３に
示す状態では、検出器１７から排出される被分離試料は
矢印で示すように廃液溜め１８に送られる。

【００２３】一方、被分離試料を試料注入管２２に給送
する場合には、図２に示されるように、試料はシリンジ
１５に設けられた継手１５ａ中に形成された流路１５ｂ
を通って試料注入管２２に供給される。流路１５ｂは、
シリンジ１５から供給された試料であろうとも、また弁
２３から供給された試料であろうとも、いずれも前記試
料注入管２２に送られるようにＴ字型に形成されてい
る。

【００２４】更に、図示の装置には、分離用カラム１６
およびこれに協働する配管系を洗浄する洗浄液を保持す
る容器２４が設けられ、洗浄液は容器２４からポンプ２
５を経て第２の切り換えバルブ２３に供給される。図１
及び図３に示す状態では、洗浄液は継手１５ａを経て試
料注入管２２に送られこれを洗浄する。試料注入管２２
を洗浄する場合には、ロボット２２ａは針２２を位置Ｐ
₁ やＰ₂ とは異なった廃液回収位置（図示せず）に移動
させる。

【００２５】図２は、図１の装置において第２の切り換
えバルブ２３が回動した状態を示している。図示の状態
では、検出器１７から排出される被分離試料は矢印に沿
って弁２３を通過し、継手１５ａ中の流路１５ｂを経て
針２２に送られる。一方、容器２４からの洗浄液は第２
の切り換えバルブ２３において阻止される。その結果、
ロボット２２ａにより、試料注入管２２を試料保持部２
１上の適当な試料容器２１ａに対応する位置に移動させ
ることにより、検出器１７から排出された被分離試料を
試料容器２１ａ中に回収することが可能になる。

【００２６】特にカラムの内径が１．０〜２．０ｍｍの
セミミクロカラムをクロマトグラフ分離用カラム１６と
して使う場合、溶媒の全流量が高々５０〜２００μｌ／
ｍｉｎと非常に小さいため、溶媒による試料の希釈に伴
う被分離試料の体積の増大は問題にならず、数百μｌの
容量の試料容器２１ａで十分に被分離試料を回収するこ
とができる。

【００２７】また、図３は第１の切り換えバルブ１４が
回動した状態を示している。図示の状態では、端部１４
ｘから濃縮用カラム３０の上端供給口への被測定試料の
供給は阻止され、その代わりに濃縮用カラム３０の上端
供給口にはポンプ１１により溶媒が供給される状態とな
る。また、濃縮用カラム３０の下端排出口は分離用カラ
ム１６に接続された状態となる。よって、濃縮用カラム
３０で濃縮された被測定試料は分離用カラム１６に供給
され、分離用カラム１６により分離された被測定試料は
続いて検出器１７に供給され、所定の分析処理が行われ
る。

【００２８】図４は、発明の第２実施例である液体クロ
マトグラフィ装置を示している。本実施例に係る液体ク
ロマトグラフィ装置は、オートサンプラー４１と六方弁
として構成される６バルブ−スイッチングバルブ（以
下、スイッチングバルブという）４２との間に一次分離
を行う濃縮用カラム４０が配設されている。

【００２９】この濃縮用カラム４０は、その内容積が
２．０ミリリットル未満とされたカラムであり、第１実
施例の液体クロマトグラフィ装置に配設されている濃縮
用カラム３０と同様に、後述するカラム充填剤が充填さ
れている。この濃縮用カラム４０においてオートサンプ
ラー４１から供給された被測定試料は濃縮されるため、
後述する分離用カラム４３及び検出器４４には濃縮され
た被測定試料が供給されることとなり、検査精度の向上
を図ることができる。

【００３０】また、第１実施例で説明した切り換えバル
ブ１４，シリンジ１５，試料注入管２２及びこれらの構
成要素と共に機能する他の構成要素は、オートサンプラ
ー４１内に組み込まれた構成となっている。更に、ポン
プ４５Ａ及びポンプ４５Ｂは、スイッチングバルブ４２
と協働して被測定試料を濃縮用カラム４０，分離用カラ
ム４３及び検出器４４に供給する被測定試料供給システ
ムを構成する。

【００３１】図４に示される構成によれば、被測定試料
はポンプＡにより供給される溶媒（移動相Ａ）と共に、
オートサンプラー４１から濃縮用カラム４０に送られ濃
縮処理が行われる。そして、濃縮用カラム４０において
濃縮された被測定試料は、ポンプ４５Ｂにより供給され
る溶媒（移動相Ｂ）と共に分離処理を行うために分離用
カラム４３に供給される。この際、移動相Ａと移動相Ｂ
の切り換えは、先に述べたスイッチングバルブ４２によ
り行われる。

【００３２】搬送された被測定試料は分離用カラム４３
において分離され、検出器４４において被測定試料に対
して所定の分析処理が行われる。また、上記構成とされ
た液体クロマトグラフィ装置は、分析処理の制御を行う
ためにコンピューターにより構成されるコントローラー
４６を具備している。このコントローラー４６は、オー
トサンプラー４１，スイッチングバルブ４２，及びポン
プ４５Ａ，４５Ｂの駆動制御を行う。

【００３３】尚、上記した２カラムシステムを採用した
液体クロマトグラフィ装置は、従来の分析装置に対して
被測定試料に対する処理を排除できる点で有利であり、
このシステムはサンプルトリートメントフーリーシステ
ムとして一般に用いられている。

【００３４】続いて、コントローラー４６の制御処理に
より実施されるスイッチングバルブ４２の切り換え動作
について説明する。スイッチングバルブ４２はコントロ
ーラー４６の制御処理により、液体クロマトグラフィ装
置内に形成される被測定試料の流路を第１の状態と第２
の状態とに切り換え処理を行う。

【００３５】スイッチングバルブ４２が第１の状態とな
っている時、ポンプ４５Ａの発生するポンプ圧によりオ
ートサンプラー４１から移動相Ａと共に圧送される被測
定試料は、濃縮用カラム４０を通過した後にスイッチン
グバルブ４２に供給され、更に被測定試料は図中実線で
示されるラインに沿って図示されない廃液貯蔵槽に向け
進んでゆく。この際、被測定試料に含まれる分析対象と
なる物質のみが濃縮用カラム４０に捕獲され濃縮処理さ
れる。また、同時に移動相Ｂもポンプ４５Ｂの発生する
ポンプ圧によりスイッチングバルブ１０に供給され、図
４に実線で示すラインに沿って分離用カラム４３及に向
け流れる構成となっている。

【００３６】一方、コントローラー４６の制御処理によ
りスイッチングバルブ４２が第２の状態となると、濃縮
用カラム４０において濃縮された被測定試料は、分析を
行うために図４に破線で示すラインに沿って流れ分離用
カラム４３に供給される。一方、ポンプ４５Ｂから供給
される移動相Ｂは、図中破線で示されるラインに沿って
図示しない廃液貯蔵槽に流出される構成となっている。

【００３７】ここで、濃縮用カラム３０，４０に充填さ
れる充填剤に注目して以下説明する。本実施例において
は、濃縮用カラム３０，４０に充填される充填剤とし
て、Ｓｉ−Ｒ（Ｒは疎水性基）結合、及びＳｉ−Ｒ’
（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで
被覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤を使用して
いる。この構成のカラム充填剤を使用することにより、
例えばタンパク質成分を含有する血清等を被測定試料と
して用いた場合におけるタンパク質の分離能を高めるこ
とができ、よって濃縮処理を確実かつ安定して行うこと
が可能となる。以下、本実施例で用いるカラム充填剤の
具体的構成について説明する。

【００３８】本実施例において用いられる多孔性担体と
しては、例えば液体クロマトグラフィー用の担体として
一般に使用されている任意の粉体であるシリカゲル、ア
ルミナ、ガラスビーズ（例えばポーラスガラス）、ゼオ
ライト、ヒドロキシアパタイト又はグラファイト等を使
用することができる。また、複合粉体、例えばポリアミ
ド、アクリル樹脂、又はポリビニルアルコール等の合成
樹脂の表面に、微細な無機粉体、例えはシリカゲル、二
酸化チタン又はヒドロキシアパタイトを被覆処理した粉
体も使用することができる。

【００３９】また、多孔性担体の平均粒径は２〜２００
μｍで、比表面積２００〜３００ｍ ² ／ｇ、４０〜１２
０Åの細孔を有するものが好適である。特に好適な多孔
性担体としては、６０〜８０Åの細孔を持ち、比表面積
が４００〜６００ｍ² ／ｇで粒径３〜５０μｍの球形あ
るいは破砕型のシリカゲルである。

【００４０】本発明において使用されるＳｉ−Ｈ基を有
するシリコーン化合物は、下記一般式化１

【００４１】

【化１】

【００４２】（化１中Ｒ¹ ，Ｒ² 及びＲ³ は相互に独立
に水素原子であるか又はハロゲン原子の少なくとも１個
で置換されていることのある炭素数１〜１０の炭化水素
基であるが、Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ が同時に水素原子である
ことはない。また、Ｒ⁴ ，Ｒ ⁵ ，Ｒ⁶ は相互に独立に水
素原子であるか又はハロゲン原子に少なくとも一個で置
換されていることのある炭素数１〜１０の炭化水素基で
ある。ａは０又は１以上の整数であり、ｂは０又は１以
上の整数であり、ｃは０又は２であるが、但しｃが０で
ある場合にはａとｂとの和が３以上の整数であるものと
する）の少なくとも一種である。

【００４３】上記化１のシリコーン化合物は２種の群か
らなる。第１の群は、前記化１においてｃ＝０の場合に
相当し、下記一般式化２

【００４４】

【化２】

【００４５】（化２中Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ 、ａ及びｂは前
記と同じ意味であるが、好ましくはＲ¹ ，Ｒ² 及びＲ³
が相互に独立にハロゲン原子に少なくとも一個で置換さ
れていることのある炭素数１〜１０の炭化水素基であ
り、ａとｂとの和が３以上である）で表わされた環状シ
リコーン化合物である。

【００４６】この化合物の代表例を挙げれば以下の通り
である。

【００４７】

【化３】

【００４８】

【化４】

【００４９】上記の化３及び化４で示される化合物は、
それぞれ単独で又はそれらの混合物の形で使用すること
ができる。上記化３及び化４の各式において、ｎ（又は
ａ＋ｂ）は好ましくは３〜７である。ｎの値が小さくな
るのに従ってその沸点が低下するので、蒸発して担体上
に吸着する量が多くなる。特に３量体及び４量体は、そ
の立体性質上、重合しやすいので特に適している。

【００５０】前記式化２の環状シリコーン化合物の具体
例としては、ジハイドロジェンヘキサメチルシクロテト
ラシロキサン、トリハイドロジェンベンタメチルシクロ
テトラシロキサン、テトラハイドロジェンテトラメチル
シクロテトラシロキサン、ジハイドロジェンオクタメチ
ルシクロペンタシロキサン、トリハイドロジェンヘプタ
メチルシクロペンタシロキサン、テトラハイドロジェン
ヘキサメチルシクロペンタンシロキサン、及びペンタハ
イドロジェンペンタメチルシクロペンタシロキサン等を
挙げることができる。

【００５１】前記式化１のシリコーン化合物の第二の群
は、前記式化１において、ｃ＝２の場合に相当し、下記
一般式化５

【００５２】

【化５】

【００５３】（化５中Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ ，
Ｒ⁶ 、ａ及びｂは前記と同じ意味であり、ｃは２である
が、好ましくはＲ¹ 〜Ｒ⁶ が相互に独立にハロゲン原子
の少なくとも１個で置換されていることのある炭素数１
〜１０炭化水素基である）で表わされるシリコーン化合
物である。この化合物の代表例としては、下記一般式化
６

【００５４】

【化６】

【００５５】で表わされる化合物を挙げることができ
る。上記式化５の直鎖状シリコーン化合物の具体例とし
ては、１，１，１，２，３，４，４，４−オクタメチル
テトラシロキサン、１，１，１，２，３，４，５，５，
５−ノナメチルペンタシロキサン、及び１，１，１，
２，３，４，５，６，６，６−デカメチルヘキサシロキ
サン等を挙げることができる。前記一般式化１で表わさ
れるシリコーン化合物は、気相状態又は液相状態で前記
多孔性担体と接触させる。

【００５６】気相状態での接触（気相処理）は、例えば
密閉容器を用い、１２０℃以下好ましくは１００℃以下
の温度下で、好ましくは２００mmHg以下さらに好ましく
は１００mmHg以下の圧力下において、前記シリコーン化
合物の蒸気を分子状態で担体表面上に接触させる方法、
１２０℃以下好ましくは１００℃以下の温度下で前記シ
リコーン化合物とキャリア−ガスとの混合ガスを担体と
接触させる方法等により行うことができる。この気相処
理に適したシリコーン化合物としては、例えばテトラヒ
ドロテトラエチルシクロテトラシロキサン、テトラヒド
ロテトラメチルシクロテトラシロキサンを挙げることが
できる。

【００５７】一方、液相状態での接触（液相処理）は、
例えば前記シリコーン化合物を溶解することができる揮
発性溶媒であるベンゼン、ジクロロメタン、又はクロロ
ホルム等、特にはヘキサンに溶解した１〜５０重量％シ
リコーン化合物溶液を担体１重量部に対してシリコーン
化合物０．０１〜１重量部になるように担体に添加すれ
ば良い。この場合、攪拌下に添加することが好ましい。
担体表面上でのシリコーン化合物の表面重合は前記接触
処理後の担体を温度５０〜２００℃で２時間以上放置或
いは攪拌することによって行うことができる。

【００５８】この表面重合は、担体自身の表面活性点の
作用により促進されるので、特に触媒を加える必要はな
い。ここで、「活性点」とはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ
−Ｓｉ）又はＳｉ−Ｈ（ヒドロシリル）基をもつシリコ
ーン化合物の重合を触媒することのできる部位であり、
例えば酸点、塩基点、酸化点、又は還元点を意味する。
表面重合は、担体表面の活性点がシリコーンポリマーの
被膜で覆われてしまうまで行われる。担体自体の活性が
非常に弱い場合には、前記接触処理前又は後の担体にア
ルカリ触媒例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
水酸化リリウム、水酸化アンモニウム若しくは水酸化カ
ルシウム等、アルキル金属触媒例えばジブチル錫等を適
宜添加した後に重合させても良い。

【００５９】担体表面を被覆したシリコーンポリマー被
覆の構造には２種類のものがある。すなわち、重合がシ
ロキサン結合（−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の開裂及び再結合に
よって起きるシリコーンポリマーでは−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ
−単位の鎖状構造のみを持ち、一方重合がＨ₂ Ｏ又はＯ
₂ の存在下におけるヒドロシリル結合（Ｓｉ−Ｈ）同士
の架橋反応によって起きる場合には、

【００６０】

【化７】

【００６１】から誘導される。

【００６２】

【化８】

【００６３】単位をもつ網状構造をシリコーンポリマー
が含むことになる。以上の二つの異なった型の重合は、
担体の種類や反応条件（温度、触媒等）によって、それ
ぞれ単独に進行する場合と、両方の型の重合が同時に進
行する場合とがある。そして、重合の程度も様々であ
る。以上のように、本発明においては分子量の低いシリ
コーン化合物を担体と接触させるので、シリコーン化合
物が担体の細孔内部まで侵入して粉体の実質的全表面上
に付着又は吸着して重合し、シリコーンポリマーの極め
て薄い被覆（３Å〜３０Åの被覆）が担体上に形成さ
れ、担体の多孔性が実質的に元のまま維持される。この
多孔性は、続いて実施するビニル化合物付加等によって
も実質的に損なわない。

【００６４】以上の重合反応により担体表面に形成され
たシリコーンポリマーの分子量（重量平均分子量）は１
５万以上である。但し、シリコーン化合物の場合、重合
により高分子化するにつれ、水や有機溶媒に溶けにくく
なってしまい、ポリマーを抽出して分子量を測定するこ
とはできず、また担体表面上にコートされている状態で
のポリマーの分子量を測定することも不可能である。

【００６５】そこで、重合進行中の各段階のポリマーを
クロロホルム抽出し、ポリスチレン換算でポリマーの分
子量を求めたところ、最大１５万のポリマーが存在する
ことが確認された。従って、クロロホルムに抽出されな
い状態にまで充分に重合させたポリマーの分子量は、１
５万以上であると言うことができるが、より詳しく分子
量を確認することは困難である。

【００６６】疎水性基 ところで、担体表面を被覆したシリコーンポリマー中に
は、未反応のＳｉ−Ｈ基が残存している。このＳｉ−Ｈ
基に、分子中にビニル基を有する炭化水素を反応させる
ことによって、Ｓｉ−Ｃ結合を有するシリコーンポリマ
ーとすることができる。前記のビニル化合物としては、
例えば一般式

【００６７】

【化９】

【００６８】（式中、Ｒ₈ 及びＲ₉ は、相互に独立に水
素原子、炭素数１〜４０のアルキル基、炭素数４〜８の
シクロアルキル基若しくはシクロアルケニル基、又は炭
素数１〜２０のアルキル基で置換されていることのある
アリール基である）で表わされる化合物を使用すること
ができる。

【００６９】前記一般式で表わされるビニル化合物はＲ
₈ 及びＲ₉ がともに水素原子であるエチレン、Ｒ₈ 及び
Ｒ₉ の一方が水素原子であって他方が水素原子以外の置
換基であるビニル化合物例えばα−オレフィン化合物、
Ｒ₈ 及びＲ₉ がともに水素原子以外の同じ置換基である
対称形ビニル化合物、或いはＲ₈ 及びＲ₉ が水素以外の
異なる置換基である非対称形ビニル化合物のいずれであ
っても良い。

【００７０】好ましいビニル化合物は、前記一般式にお
いてＲ₈ 及びＲ₉ が相互に独立に、水素原子；炭素数４
〜２０のアルキル基例えば１−ヘキシル基、１−オクチ
ル基、１−デシル基、１−ドデシル基、１−ヘキサデシ
ル基、又は１−オクタデシル基；シクロヘキシル基又は
シクロヘキセニル基；フェニル基又はナフチル基；又は
炭素数１〜４の低級アルキル基で置換されているフェニ
ル基又はナフチル基であるビニル化合物である。

【００７１】Ｒ₈ が水素原子であり、Ｒ₉ がエチル基、
ヘキシル基、ヘキサデシル基、又はフェニル基であるビ
ニル化合物を付加させると、それぞれ従来の化学結合型
充填剤のＣ₄ −タイプ、Ｃ₈ −タイプ、Ｃ₁₆−タイプ又
はフェニルタイプに相当するものを得ることができる。
前記ビニル化合物と前記シリコーンポリマー被覆粉体と
の反応は、例えば、溶媒の存在下において５０〜３００
℃、気相或いは液相で２時間以上接触させることにより
行うことができる。触媒としては、白金属触媒すなわち
ルテニウム、ロジウム、パラジウム、オスミウム、イリ
ジウム又は白金の化合物が適している。特にパラジウム
化合物及び白金化合物が良好である。

【００７２】この反応の確認はＦＴ−ＩＲ装置を用いた
拡散反射スペクトルの測定により行える。すなわち、２
１６０ｃｍ^-1のＳｉ−Ｈ基の吸収は、ビニル化合物の付
加により吸収強度が大幅に減少し、これに変って２８０
０ｃｍ^-1〜３０００ｃｍ^-1に新たにアルキル基に基づく
吸収が表われる。従って、この吸収強度の比を求めるこ
とによって反応率が計算される。

【００７３】親水性基 本実施例にかかる液体クロマトグラフィー用充填剤を得
るためには、上記のようにして得たシリコーンポリマー
被覆担体の表面のＳｉＨ基の一部を親水性に変える必要
がある。ここで、親水性基としては、次の化１０に示す
テトラオール等が用いられる。

【００７４】

【化１０】

【００７５】なお、このテトラオールは次のように合成
される。

【００７６】

【化１１】

【００７７】ここで、ジグリセリンをポリグリセリンと
すれば、ポリオールが形成され、これらもまた本発明の
親水性基として用い得る。また、親水性基としては、次
の化１１に示すポリオキシエチレンアリルエーテルを用
いることも好適である。なお、このポリオキシエチレン
アリルエーテルは化１１に示すようにアリルアルコール
にエチレンオキサイドを付加させることによって合成す
ることができる。

【００７８】以上のようにして得た充填剤は、化学結合
型を特徴とする従来の充填剤とはタイプが異なり、使用
可能なｐＨ範囲も２〜１０と極めて広く、従来の充填剤
では用い得なかったアルカリ性溶媒でも使用でき、安全
性も非常に良い。また、本実施例にかかる充填剤を用い
て血清等の生体成分中の薬物や代謝物を液体クロマトグ
ラフィ装置を用いて定量する場合、繁雑な前処理なしに
生体成分を直接注入しても輝度よく分析が可能である。
なお、本発明により得られる充填剤は、完全なポリマー
コート型であり、ルイス酸を用いないため、２−エチル
ピリジンやＮ，Ｎ’−ジメチルアニリンのような塩基性
物質も溶出可能である。

【００７９】疎水性化−親水性化法 本実施例にかかる充填剤は、シリコーンポリマーで被覆
された多孔性担体を、まず疎水性化し、その次に親水性
化する方法で製造することができる。すなわち、図５
（Ａ）に示すように多孔性担体１０の表面を、前述した
方法によりシリコーンポリマー１２で被覆する。この
際、シリコーン単体の有する−ＳｉＨ基は重合に用いら
れるが、そのすべてが消費されてしまうわけではない。
そして、図５（Ｂ）に示すようにそのシリコーンポリマ
ー１２に残存する−ＳｉＨ基と、二重結合を有する疎水
性基Ｒを反応させ、−ＳｉＲ基１４とする。なお、ここ
でシリコーンポリマー１２のすべての−ＳｉＨ基が−Ｓ
ｉＲ基となってしまうと、後の親水性水性基導入が行い
得ないので、疎水性基Ｒの添加量ないし反応条件を目的
に応じて定める。

【００８０】次に図５（Ｃ）に示すようにシリコーンポ
リマー１２の未反応−ＳｉＨ基と、二重結合を有する親
水性基Ｒ’（図中○−で示す）１６を反応させ、親水性
の−ＳｉＲ’基を形成する。従って、シリコーンポリマ
ー１２の表面は、疎水性基Ｒと親水性基Ｒ’により修飾
されたいわゆるミックスドファンクション構造となり、
両基の修飾割合等により特異的な溶離特性を得ることが
できる。なお、疎水性化−親水性化法は、特に保持に大
きな影響を及ぼす疎水性基の導入が容易に制御可能なた
め、疎水性基の導入量を調整することにより保持の大き
さを調整できる利点がある。

【００８１】親水性化−疎水性化法 本実施例にかかる充填剤は、シリコーンポリマーで被覆
された多孔性担体を、まず親水性化し、その次に疎水性
化する方法でも製造することができる。すなわち、図６
（Ａ）に示すように多孔性担体１０の表面を、シリコー
ンポリマー１２で被覆する。そして、図６（Ｂ）に示す
ようにそのシリコーンポリマー１２に残存する−ＳｉＨ
基と、二重結合を有する親水性基Ｒ’（図中○−で示
す）１６を反応させ、−ＳｉＲ’基１６とする。なお、
ここでシリコーンポリマー１２のすべてのＳｉＨ基が−
ＳｉＲ’基１６となってしまうと、後の疎水性基導入が
行い得ないので、親水性基Ｒ’の添加量ないし反応条件
を目的に応じて定める。

【００８２】次に図６（Ｃ）に示すようにシリコーンポ
リマー１２の未反応−ＳｉＨ基と、二重結合を有する疎
水性基Ｒを反応させ、親水性の−ＳｉＲ基１４を形成す
る。この親水性化−疎水性化法は、先に親水性化を行う
ため、その親水性化率は大きく、タンパク質の吸着は少
ない。親水性化反応は、水中で行うことが望ましく、シ
リコーンポリマーで覆われたシリカゲルは揆水性があ
り、反応は細孔外表面から起こっていく。従って、細孔
外表面は相対的に細孔内表面と比較してより親水性であ
ると考えられる。疎水性化は相対的に外より内で起こり
やすいと考えられる。

【００８３】疎水、親水性化同時処理法 本実施例にかかる充填剤は、シリコーンポリマーで被覆
された多孔性担体の親水性化及び疎水性化を同時に行う
方法でも製造することができる。すなわち、図７（Ａ）
に示すように多孔性担体１０の表面を、シリコーンポリ
マー１２で被覆する。そして、図７（Ｂ）に示すように
そのシリコーンポリマー１２の残存する−ＳｉＨ基と、
末端に二重結合を有する疎水性基Ｒ、及び末端に二重結
合を有する親水性基Ｒ’（図中○−で示す）を反応さ
せ、親水性の−ＳｉＲ基１４及び疎水性の−ＳｉＲ’基
１６とする。

【００８４】この、疎水、親水性化同時処理法は、反応
が一回でよいという利点がある。相対的に疎水性基（ス
チレン等）の化合物を親水性の化合物（テトラオール、
ポリオール等）よりその添加量を少なくし、反応性の違
い（疎水性基の化合物は親水性基化合物よりかさ高くな
く、反応性よりは高いと考えられる）によって目的とす
る充填剤を得ることができる。反応溶媒としてはアルコ
ール（スチレン及びテトラオール等を同時に混合するこ
とも可能）が望ましい。

【００８５】疎水性化−エポキシ化−親水性化法 本実施例にかかる充填剤は、シリコーンポリマーで被覆
された多孔性担体を、まず疎水性化し、その次にエポキ
シ基を有するエポキシ化合物を導入し、該末端エポキシ
基に親水性基を結合させて親水性化する方法で製造する
ことができる。すなわち、図８（Ａ）に示すように、多
孔性担体１０の表面を、前述した方法によりシリコーン
ポリマー１２で被覆する。

【００８６】そして、図８（Ｂ）に示すようにそのシリ
コーンポリマー１２に残存する−ＳｉＨ基と、二重結合
を有する疎水性基Ｒを反応させ、−ＳｉＲ基１４とす
る。なお、ここでシリコーンポリマー１２のすべての−
ＳｉＨ基が−ＳｉＲ基となってしまうと、後の親水性基
導入が行い得ないので、疎水性基Ｒの添加量ないし反応
条件を目的に応じて定める。

【００８７】次に図８（Ｃ）に示すようにシリコーンポ
リマー１２の未反応−ＳｉＨ基と、二重結合及びエポキ
シ基を有するエポキシ化合物１８を反応させる。このた
め、エポキシ化合物は二重結合端でシリコーンポリマー
と結合し、エポキシ基を有する状態となる。次に図８
（Ｄ）に示すように親水性基（図中○で示す）２０を反
応させ、親水性のＳｉＲ’基１６を形成する。

【００８８】この、疎水性化−エポキシ化−親水性化法
は、先に疎水性基を導入した後、まずアリルグリシジル
エーテル（末端に二重結合、もう一つの末端にエポキシ
基）のようなテトラオールよりかさ高くない基を導入
し、さらにグリセリンやジグリセリンを反応させること
により、親水性化密度を大きくすることが可能である。
このため、タンパク質の回収率が高くなる。例えば、ま
ず始めに疎水性基（フェニル基）を導入し、その後アリ
ルグリシジルエーテル（一方の末端に二重結合をもち、
好ましくは他方の末端にエポキシ基をもつもの）を結合
させ、ジグリセリン，グリセリン等の−ＯＨ基或いは−
ＣＯＯＨ基のような親水性基をもつものをエポキシ基に
結合させる。

【００８９】疎水性基及びアリルグリシジルエーテルの
ような末端に二重結合をもつものと、Ｓｉ−Ｈ基の反応
は白金酸等を触媒とし反応させる（ヒドロシリル化）。
また、エポキシ基とジグリセリン等の反応は、ルイス
酸、四級アンモニウム塩、三級アミン等が用いられる。
なお、アリルグリシジルエーテル付加後、酸性溶液中で
エポキシ環を開環させ、ジオール型にするだけでもよ
い。

【００９０】図９は、上記したカラム充填剤を濃縮用カ
ラム３０，４０に充填して分析処理を行った実験例を示
している。図９（Ａ）は従来のカラム充填剤を濃縮用カ
ラム３０，４０に充填して分析処理を行った実験例を示
しており、また図９（Ｂ）及び図９（Ｃ）は上記した本
実施例に係るカラム充填剤を濃縮用カラム３０，４０に
充填して分析処理を行った実験例を示している。

【００９１】また、図９（Ｂ）の実験結果は被測定試料
の導入量を２０マイクロリットル，濃度を１／２０，濃
縮時間を３分間とした結果を示しており、図９（Ｃ）の
実験結果は被測定試料の導入量を８０マイクロリット
ル，濃度を１／８０，濃縮時間を３分間とした結果を示
している。また、図９（Ａ）〜（Ｂ）において分析目的
物のピークを図中Ｓで示している。

【００９２】同図から明らかなように、従来用いていた
カラム充填剤に比べて、上記した本実施例に係るカラム
充填剤を用いて分析処理を行った実験例の方が分析目的
物のピーク（Ｓで示す）が急峻に現れており、保持され
ない成分（タンパク質等）に起因したピーク（Ｐで示
す）が低減していることが判る。これは、本実施例に係
るカラム充填剤がその外表面の一部が親水性であるため
にタンパク質等が吸着されず、また分離能に優れている
ことに起因するものである。また、前記した説明から明
らかなように、本実施例に係るカラム充填剤は酵素等を
用いていないため、これによっても安定した濃縮処理を
実現でき、よって良好な分析結果が得られるものと考え
られる。

【００９３】

【発明の効果】上述の如く本発明のよれば、濃縮用カラ
ムの内容量を２．０ミリリットル未満とされておりその
内容積は小さいため、注入される被測定試料量が少なく
ても希釈作用は発生せず、よって確実に濃縮処理を行う
ことができるため検出精度を向上させることができる。

【００９４】また、濃縮用カラム内に充填されるカラム
充填剤は、Ｓｉ−Ｒ（Ｒは疎水性基）結合、及びＳｉ−
Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマ
ーで被覆された多孔性担体よりなり、この構成のカラム
充填剤はその外表面の一部が親水性であるためにタンパ
ク質等が吸着されることはなく、また安定でしかも分離
能に優れているため、濃縮処理を確実に行うことができ
る。更に、酵素等を用いていないため、これによっても
安定した濃縮処理を実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の概略構成図である。

【図２】本発明の第１実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の動作を説明するための概略構成図である。

【図３】本発明の第１実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の動作を説明するための概略構成図である。

【図４】本発明の第２実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の概略構成図である。

【図５】本発明の一実施例である液体クロマトグラフィ
装置に用いるカラム充填剤の疎水性化−親水性化の工程
説明図である。

【図６】本発明の一実施例である液体クロマトグラフィ
装置に用いるカラム充填剤の疎水性化−親水性化の工程
説明図である。

【図７】本発明の一実施例である液体クロマトグラフィ
装置に用いるカラム充填剤の親水性化同時処理法の工程
説明図である。

【図８】本発明の一実施例である液体クロマトグラフィ
装置に用いるカラム充填剤の疎水性化−エポキシ化−親
水性化の工程説明図である。

【図９】本発明の効果を説明するための図である。

【符号の説明】

１１，２５，４５Ａ，４５Ｂ ポンプ １４ 第１の切り換えバルブ １４ｘ 試料注入口 １５ シリンジ １５ａ 継手 １５ｂ 流路 １６，４３ 分離用カラム １７，４４ 検出器 １８ 廃液溜め ２１ 試料保持機構 ２１ａ 試料容器 ２２ 試料注入管 ２３ 第２の切り換えバルブ ３０，４０ 分離用カラム ４１ オートサンプラー ４２ スイッチングバルブ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 城田 修 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂研究所内 (72)発明者 大津 裕 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂研究所内 (72)発明者 山口 道広 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂研究所内 (72)発明者 鶴田 久生 京都府京都市伏見区深草西浦町８丁目47の １ 医理化機器株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポンプにより供給される溶媒に混在する
   被測定試料を分離する分離用カラムと、 該ポンプと該分離用カラムとの間に配設され、該ポンプ
   から該溶媒を供給されると共に試料注入配管より該被測
   定試料を供給され、該被測定試料を該溶媒と共に該分離
   用カラムに供給する流路制御手段と、 該分離用カラムで分離された該被測定試料が供給される
   と共に、供給された該被測定試料を分析処理する検出手
   段と、 該被測定試料を格納した複数の容器を担持する試料保持
   機構と、 前記複数の容器の一つから該被測定試料を選択的に採取
   してこれを該流路制御手段に供給する試料注入手段と、 該流路制御手段と該分離用カラムとの間に設けられ、該
   溶媒と共に供給される該被測定試料を濃縮処理する濃縮
   用カラムとを設けており、 該濃縮用カラムの内容量を２．０ミリリットル未満とす
   ると共に、 該濃縮用カラム内に、Ｓｉ−Ｒ（Ｒは疎水性基）結合、
   及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコ
   ーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充
   填剤を充填してなる構成としたことを特徴とする液体ク
   ロマトグラフィ装置。
2. 【請求項２】 該カラム充填剤における親水性基Ｒ’
   を、水酸基を有する親水性基としたことを特徴とする請
   求項１記載の液体クロマトグラフィ装置。
3. 【請求項３】 該カラム充填剤における疎水性基Ｒを、
   炭素数１〜１８の炭化水素残基としたことを特徴とする
   請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィ装置。