JPH03218458A - カラム充填剤及びその製造方法 - Google Patents

カラム充填剤及びその製造方法

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JPH03218458A
JPH03218458A JP2083618A JP8361890A JPH03218458A JP H03218458 A JPH03218458 A JP H03218458A JP 2083618 A JP2083618 A JP 2083618A JP 8361890 A JP8361890 A JP 8361890A JP H03218458 A JPH03218458 A JP H03218458A
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carrier
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hydrophilic
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Taketoshi Kanda
武利 神田
Atsuo Sakamoto
坂本　敦男
Tadao Ota
忠男 太田
Yutaka Otsu
裕 大津
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Shiseido Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はカラム充填剤及びその製造方法、特にその活性
基修飾状態の改良に関する。
［従来の技術］ 従来より各種液体試料の分離に充填剤を詰めたカラムが
用いられ、血清等の各種物質の混合試料の分離、分析に
は液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラ
フィ−（ＨＰＬＣ）が汎用され、また工業的にも特定成
分の分離・抽出にカラム充填剤が応用されている。
ところで、血清等のタンパク質成分を多量に含有する生
体成分中の薬物や代謝物等をＨＰＬＣを用いて定量する
場合、タンパク質のカラム充填剤への吸着による弊害を
除去するため、従来は除タンパク等の前処理を必要とし
ていた。
しかし、このような前処理操作は、多大の時間と労力を
要し、且つ分析精度を悪化させるという問題を有してい
る。
そこで、近年これらの除タンパク操作を行うことなく直
接タンパク質成分含有試料を注入し、この試料中に含ま
れる各種成分を分離することのできるカラム充填剤が開
発されている。
これらの改良されたカラム充填剤は、多孔性ガラスやシ
リカゲルを担体として、その細孔内外に異なる性質を付
与したものである。
そして、この充填剤を用いれば血清中のタンパク質（ア
ルブミンやグロプリン）は巨大分子なので細孔内に入ら
ず、且つ観水性の外表面（孔外面）に吸着されることな
くカラムを素通りし、比較的小さな薬物等の分子は疎水
性の内表面（孔内面）に吸着して分離されることとなる
。
このような充填剤の具体例としては、特開昭６０−５６
２５６号公報に記載されたものが挙げられる。この充填
剤では、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を化学結合さ
せたシリカの外表面にタンパク質をコートしている。こ
のコート用タンパク質はウシ血清アルブミンあるいは家
兎血漿タンパク質よりなり、該タンパク質をＯＤＳ結合
シリカに吸着、変性させることにより充填剤を得ている
。
しかしながら、上述した充填剤のうちタンパク質をコー
トしたＯＤＳシリカ充填剤では、使用が長期にわたると
吸着・変性したタンパク質が溶離を起こすことがあり、
また高分離効率のカラムが得られない等、耐久性や分離
能の点で課題を残している。
このような点を改良するため、特開昭６１−６５１５９
号公報及び特開平１−１２３１４５号公報に記載された
ように、 ■多孔質担体の内表面及び外表面に疎水性基を導入する
。
■それ自身が巨大分子であり、シリカ等の細孔内に侵入
できない酵素を用いて外表面の疎水性基だけを切断する
。
■その後、外表面に親水性基を導入する。
ことにより、カラム充填剤を得る方法も開発されている
。
すなわち、特開昭６１−６５１５９号公報記載の方法で
は、グリセリルブ口ピル基を導入した多孔性シリカを出
発原料とし、これにカルボニルジイミダゾールを介して
オリゴペブチド（グリシルーフェニルアラニルーフエニ
ルアラニン等）を結合させ、タンパク質加水分解酵素で
あるカルボキシベブチダーゼＡを用いて加水分解を行う
ことにより外表面のフエニルアラニン側鎖を切断してい
る。
その結果、充填剤の内表面には疎水性リガンドとしてグ
リシルーフエニルアラニルーフエニルアラニンが残り、
外表面は親水性のグリシルーグリセリルブ口ピル基とな
る。
一方、特開平１−１２３１４５号公報記載の方法は、ア
ミノブ口ピル基を導入した多孔性シリカを出発原料とし
て、トリエチルアミン存在下、オクタノイルクロリドを
反応させ、アミド結合を介して疎水性基を導入し、次に
ポリミキシン・アシラーゼにより外表面のアシル基を加
水分解し、外表面のアミノ基をグリシドールとの反応を
行うことにより親水性とする方法である。
［発明が解決しようとする課題］ ところが、特開昭６１−６５１５９号公報あるいは特開
平１−１２３１４５号公報に記載された方法では、酵素
反応を利用しているため、工程が複雑化するとともに得
られた充填剤の特性にバラツキが生じやすいものであっ
た。
また、これらの充填剤は溶離液のｐＨが狭い範囲に限定
されたり、安定した信頼性の高い測定結果を得るのが困
難である等の課題もあった。
本発明は前記従来技術の課題に鑑みてなされたものであ
り、その目的は製造が容易でしかも分離能の高いカラム
用充填剤及びその製造方法を提供することにある。
［課題を解決するための千段］ 前記目的を達成するために本発明者が鋭意検討した結果
、多孔性担体の表面を疎水性基及び親水性基で修飾する
ことによりタンパク含有試料等の分離能が極めて高いカ
ラム充填剤が得られることを見出し、本発明を完成する
に致った。
すなわち本出願の請求項１記載のカラム充填剤は、Ｓｉ
−Ｒ（Ｒは炭素数１〜１８の炭化水素基）結合、及びＳ
　ｉ　−Ｒ’　　（Ｒ’　は末端にポリオキシアルキレ
ン基又は水酸基を一つ以上有する親水性基）結合を有す
るシリコーンポリマーで多孔性担体を被覆したことを特
徴とする。
請求項２記載のカラム充填剤の製造方法は、多孔性担体
に炭化水素基を結合させる炭化水素基修飾工程と、 前記炭化水素基を一部除去する炭化水素基除去工程と、 親水性基を結合させる親水性基修飾工程と、を含むこと
を特徴とする。
請求項３記載のカラム充填剤の製造方法は、多孔性担体
がシリコーンポリマーで被覆されていることを特徴とす
る。
請求項４記載のカラム充填剤の製造方法は、炭化水素基
除去工程ではルイス酸による処理が行われることを特徴
とする。
以下、本発明の構成を詳細に説明する。
本発明において用いられる多孔性担体としては、例えば
液体クロマトグラフィー用の担体として一般に使用され
ている任意の粉体であるシリカゲル、アルミナ、ガラス
ビーズ（例えばボーラスガラス）、ゼオライト、ヒドロ
キシアパタイト又はグラファイト等を使用することがで
きる。また、複合粉体、例えばポリアミド、アクリル樹
脂、又はポリビニルアルコール等の合成樹脂の表面に、
微細な無機粉体、例えばシリカゲル、二酸化チタン又は
ヒドロキシアパタイトを被覆処理した粉体も使用するこ
とができる。
また、多孔性担体の平均粒径は２〜２００μｍで、比表
面積２００〜８００ｍ！／ｇ１４０〜１２０人の細孔を
有するものが好適である。
特に好適な多孔性担体としては、６０〜８０人の細孔を
持ち、比表面積が４００〜６００ｍ２／ｇで粒径３〜５
０μｍの球形あるいは破砕型のシリカゲルである。
また、本発明にがかるカラム充填剤を得るには、以下の
方法に従うことが好適である。
ンリコーンボリマー　　↓韮 前記多孔性担体にＳｉ−Ｈ基を有するシリコーン化合物
を接触させ、表面重合させる。
舷氷乱Ｉｌμ１ 残存するＳｉ−Ｈ基と分子中にビニル基を有する炭化水
素を反応させるか、又はＳｉ−Ｈ基をアンモニア水等で
Ｓ　ｉ−ＯＨとし、これにトリアルキルク口ルシランを
反応させるかして、全表面が部分的にアルキル基を有す
るシリコーン化合物で被覆された担体を得る。
央化述１１１１ｋ工程 そして、該担体にルイス酸を特定条件で作用させること
によって粉体の表面の一部、特に外表面のアルキル基を
切断する。
級丞Ｉｊ０１ｌＩ程 次いでγ−グリシドキシブ口ピルトリメトキシシラン等
と反応させることによって親水性基を導入する。
本発明において使用されるＳｉ−Ｈ基を有するシリコー
ン化合物は、下記一般式（Ｉ）（Ｒ’ＨＳｉＯ）ａ（Ｒ
”Ｒ”ＳｉＯ）ｂ（Ｒ’Ｒ’Ｒ’ＳｉＯ．７．）．−（
　１）（式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ８は相互に独立に水素原
子であるか又はハロゲン原子の少なくとも１個で置換さ
れていることのある炭素数１〜１０の炭化水素基である
が、Ｒ１．　　Ｒ２　　Ｒ３が同時に水素原子であるこ
とはない。また、Ｒ４．　　Ｒｓ．　　Ｒｌ１は相互に
独立に水素原子であるか又はハロゲン原子に少なくとも
一個で置換されていることのある炭素数１〜１０の炭化
水素基である。ａは０又は１以上の整数であり、ｂはＯ
又は１以上の整数であり、Ｃは０又は２であるが、但し
Ｃが０である場合にはａとｂとの和が３以上の整数であ
るものとする）の少なくとも一種である。
上記（１）のシリコーン化合物は２種の群からなる。
第１の群は、前記式（１）においてｃ＝０の場合に相当
し、下記一般式（ＩＩ） （Ｒ”ＨＳｉＯ）　．　（Ｒ”Ｒ”ＳｉＯ）、　　　　
　　　　−（ＩＩ）（式中Ｒ’，Ｒ″、Ｒ”Ｓａ及びｂ
は前記と同じ意味であるが、好ましくはＲ１、Ｒ２及び
Ｒｌが相互に独立にハロゲン原子に少なくとも一個で置
換されていることのある炭素数１〜１０の炭化水素基で
あり、ａとｂとの和が３以上である）で表わされた環状
シリコーン化合物である。この化合物の代表例を挙げれ
ば以下の通りである。
（式中、 ｎは３〜３００の整数を表わす） 上記の化合物（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ単独で又は
それらの混合物の形で使用することができる。
上記（Ａ）及び（Ｂ）の各式において、ｎ（又はａ＋ｂ
）は好ましくは３〜７である。ｎの値が小さくなるのに
したがってその沸点が低下するので、蒸発して担体上に
吸着する量が多くなる。特に３量体及び４量体は、その
立体性質上、重合しやすいので特に適している。
前記式（ＩＩ）の環状シリコーン化合物の具体例としで
は、ジハイド口ジエンヘキサメチルシク口テトラシロキ
サン、トリハイドロジェンペンタメチルシク口テトラシ
ロキサン、テトラハイド口ジェンテトラメチルシク口テ
トラシロキサン、ジハイド口ジエンオクタメチルシク口
ペンタシロキサン、トリハイドロジェンヘブタメチルシ
ク口ペンタシロキサン、テトラハイド口ジエンヘキサメ
チルシク口ペンタシロキサン、及びペンタハイド口ジエ
ンベンタメチルシク口ペンタシロキサン等を挙げること
ができる。
前記式（１）のシリコーン化合物の第二の群は、前記式
（Ｉ）においてｃ＝２の場合に相当し、下記一般式（Ｉ
ＩＩ） （Ｒ’ＨＳｉＯ）　，　（Ｒ”Ｒ”ＳｉＯ）　ｂ　（Ｒ
’Ｒ’Ｒ’ＳｉＯｔ　７＊）　ｔ　　・・・（ＩＩＩ）
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ”，Ｒ’、Ｒ−Ｒ６、ａ及びｂは
前記と同じ意味であり、Ｃは２であるが、好ましくはＲ
１〜Ｒ６が相互に独立にハロゲン原子の少なくとも１個
で置換されていることのある炭素数１〜１０の炭化水素
基である） で表わされる直鎖状シリコーン化合物である。この化合
物の代表例としては、下記一般式（Ｄ）（式中、ｎは２
〜１００の整数を表わす）で表わされる化合物を挙げる
ことができる。
上記式（ＩＩＩ）の直鎖状シリコーン化合物の具体例と
しては、１，１，１，２，３，４，４．４−オクタメチ
ルテトラシロキサン、１，１，１，２，３，４，５，５
．５一ノナメチルペンタシロキサン、及び１，１，１，
２，３，４，５，６，６．６−デカメチルヘキサシロキ
サン等を挙げることができる。
前記一般式（１）で表わされるシリコーン化合物は、気
相状態又は液相状態で前記多孔性担体と接触させる。気
相状態での接触（気相処理）は、例えば密閉容器を用い
、１２０℃以下好ましくは１００℃以下の温度下で、好
ましくは２　０　０　ｍｍＨｇ以下さらに好ましくは１
　０　０　ｍｍＨｇ以下の圧力下において、前記シリコ
ーン化合物の蒸気を分子状態で担体表面上に接触させる
方法、１２０℃以下好ましくは１００℃以下の温度下で
前記シリコーン化合物とキャリアーガスとの混合ガスを
担体と接触させる方法等により行うことができる。この
気相処理に適したシリコーン化合物としては、例えばテ
トラヒドロテトラエチルシクロテトラシロキサン、テト
ラヒドロテトラメチルシク口テトラシロキサンを挙げる
ことができる。
一方、液相状態での接触（液相処理）は、例えば前記シ
リコーン化合物を溶解することができる揮発性溶媒であ
るベンゼン、ジクロ口メタン、又はクロロホルム等、特
にはへキサンに溶解した１〜５０重量％シリコーン化合
物溶液を担体１重量部に対してシリコーン化合物０．０
１〜１重量部になるように担体に添加すれば良い。この
場合、攪拌下に添加することが好ましい。
担体表面上でのシリコーン化合物の表面重合は前記接触
処理後の担体を温度５０〜２００℃で２時間以上放置あ
るいは攪拌すること比よって行うことができる。
この表面重合は、担体自身の表面活性点の作用？より促
進されるので、特に触媒を加える必要はない。ここで、
「活性点」とはシロキサン結合（Ｓｉ−０−Ｓｉ）また
はＳｉ−Ｈ（ヒドロシリル）基をもつシリコーン化合物
の重合を触媒することのできる部位であり、例えば酸点
、塩基点、酸化点、又は還元点を意味する。表面重合は
、川体表面の活性点がシリコーンポリマーの被膜で覆わ
れてしまうまで行われる。担体自体の活性が非常に弱い
場合には、前記接触処理前又は後の担体にアルカリ触媒
例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチ
ウム、水酸化アンモニウム若しくは水酸化カルシウム等
、アルキル金属触媒例えばジブチル錫等を適宜添加した
後に重合させても良い。
担体表面を被覆したシリコーンポリマー被覆の構造には
２種類のものがある。すなわち、重合がシロキサン結合
（−Ｓ　ｆ　−０−Ｓ　ｉ）の開裂及び再結合によって
起きるシリコーンポリマーでは一Ｓｉ−０−Ｓｉ一単位
の鎖状構造のみを持ち、方重合がＨ，０又は０■の存在
下におけるヒドロシリル結合 （Ｓ ｉ　−Ｈ） 同士の架橋反応によって起 きる場合には、 Ｒ ■ Ｈ Ｒ １ ２−０−Ｓｉ−０一 暢 ＯＨ ＋　２　Ｈ　＊　ｔ １ ０ １ −０−Ｓｉ−０− １ 単位をもつ網状構造をシリコーンポリマーが含むことに
なる。
以上の二つの異なった型の重合は、担体の種類や反応条
件（温度、触媒等）によって、それぞれ単独に進行する
場合と、両方の型の重合が同時に進行する場合とがある
。そして、重合の程度も様々である。
以上のように、本発明においては分子量の低いシリコー
ン化合物を担体と接触させるので、シリコーン化合物が
担体の網孔内部にまで侵入して粉体の実質的全表面上に
付着又は吸着して重合し、シリコーンポリマーの極めて
薄い被膜（３λ〜３０人の被膜）が担体上に形成され、
担体の多孔性が実質的に元のまま維持される。この多孔
性は、続いて実施するビニル化合物付加等によっても実
質的に損われない。
以上の重合反応により担体表面に形成されたシリコーン
ポリマーの分子Ｉｔ（重量平均分子量）は１５万以上で
ある。但し、シリコーン化合物の場合、重合により高分
子化するにつれ、水や有機溶媒に溶けにくくなってしま
い、ポリマーを抽出して分子量を測定することはできず
、また担体表面上にコートされている状態でのポリマー
の分子量を測定することも不可能である。
そこで、重合進行中の各段階のボリマーをクロロホルム
抽出し、ポリスチレン換算でボリマーの分子量を求めた
ところ、最大１５万のボリマーが存在することが確認さ
れた。従って、クロロホルムに抽出されない状態にまで
充分に重合させたボリマーの分子量は、１５万以上であ
ると言うことができるが、より詳しく分子量を確認する
ことは困難である。
ところで、担体表面を被覆したシリコーンポリマー中に
は、未反応のＳｉ−Ｈ基が残存してるいる。このＳ　ｉ
　−　１｛基に、分子中にビニル基を有する炭化水素を
反応させることによって、Ｓｉ一炭化水素結合を有する
シリコーンポリマーとすることができる。
前記のビニル化合物としては、例えば一般式Ｒ　ｓ　　
Ｃ　Ｈ　＝Ｃ　Ｈ　　　Ｒ＊（式中、Ｒ．及びＲ９は、
相互に独立に水素原子、炭素数１〜４０のアルキル基、
炭素数４〜８のシクロアルキル基若しくはシクロアルケ
ニル基、又は炭素数１〜２０のアルキル基で置換されて
いることのあるアリール基である） で表わされる化合物を使用することができる。
前記一般式で表わされるビニル化合物は、Ｒ，及びＲ０
がともに水素原子であるエチレン、Ｒ．及びＲ．の一方
が水素原子であって他方が水素原子以外・の置換基であ
るビニル化合物例えばα−オレフィン化合物、Ｒ．及び
Ｒ９がともに水素原子以外の同じ置換基である対称形ビ
ニル化合物、あるいはＲｓ及びＲ，が水素以外の異なる
置換基である非対称形ビニル化合物のいずれかであって
も良い。
好ましいビニル化合物は、前記一般式においてＲ．及び
Ｒ，が相互に独立に、水素原子；炭素数４〜２０のアル
キル基例えば１−ヘキシル基、１一オクチル基、１−デ
シル基、１−ドデシル基、１−ヘキサデシル基、又は１
−オクタデシル基；シクロヘキシル基又はシクロへキセ
ニル基；フェニル基又はナフチル基；又は炭素数１〜４
の低級アルキル基で置換されているフェニル基又はナフ
チル基であるビニル化合物である。
Ｒ．が水素原子であり、Ｒｌｌがエチル基、ヘキシル基
、ヘキサデシル基、又はフエニル基であるビニル化合物
を付加させると、それぞれ従来の化学結合型充填剤の０
４一タイプ、Ｃ６−タイプ、Ｃ　１８−タイプ又はフェ
ニルタイプに相当するものを得ることができる。
前記ビニル化合物と前記シリコーンポリマー被覆粉体と
の反応は、例えば溶媒の存在下において５０〜３００℃
、気相あるいは液相で２時間以上接触させることにより
行うことができる。触媒としては、白金属触媒すなわち
ルテニウム、ロジウム、パラジウム、オスミウム、イリ
ジウム又は白金の化合物が適している。特にパラジウム
化合物及び白金化合物が良好である。
この反応の確認はＦＴ−Ｉ　Ｒ装置を用いた拡散反射ス
ペクトルの測定により行える。すなわち、２１６０ｃｍ
−’のＳｉ−Ｈ基の吸収は、ビニル化合物の付加により
吸収強度が大幅に減少し、これに変って２８００ｃｍ−
’　〜３０００ｃｍ−’に新たにアルキル基に基づく吸
収が表われる。従って、この吸収強度の比を求めること
によって反応率が計算される。
このようにして得られたＳｉ一炭化水素結合を有するシ
リコーンポリマーで被覆された担体は、それ自体液体ク
ロマトグラフィー用充填剤として有用であり、市販品（
ＣＡＰＣＥＬＬ　　ＰＡＫＣ，。、同Ｃ．、同ＰＨＥＮ
ＹＬ，■資生堂製）として人手できる。
本発明にかかる液体クロマトグラフィー用充填剤を得る
ためには、上記のようにして得たシリコーンポリマー被
覆担体の、少なくとも細孔部以外の表面の一部を親水性
に変える必要がある。
そのために、以下の二段階の処理が必要になる。
（１）Ｓｉ一炭化水素結合の切断 上記シリコーンポリマー被覆担体に触媒を加え、有機溶
媒中で還流・反応させる。
ここで用いる触媒としては、塩化アルミニウム、フッ化
ホウ素、臭化鉄等のルイス酸が挙げられる。
有機溶媒は触媒と反応しないものであればよく、二硫化
炭素、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素系溶
媒が好ましい。この反応によって、担体の表面には下記
（２）のシランカップリング剤との反応基が生成される
。
（２）親水性基の付加反応 上記（１）で得られた担体をγ−グリシドキシブ口ビル
トリメトキシシラン、γ−グリシドキシブ口ピルモノメ
チルジクロルシラン、γ−グリシドキシブ口ビルジメチ
ルモノクロルシラン、３．４−エボキシブタンモノメチ
ルジクロルシラン、３，４−エポキシブタントリエトキ
シシラン、ジγ−グリシドキシブ口ビルジク口ルシラン
等のカップリング剤の有機溶媒溶液に加え、還流下で反
応させることによって指示薬（メチルレッド）溶液が赤
色を示さなくなるまで親水性基の付加を行う。さらに必
要に応じて、例えばγ−グリシドキシブロピルトリメチ
ルシランの場合には、末端のエポキシ環を過塩素酸水溶
液等で開環し水酸基とする等の反応を行う。
以上のようにして得た充填剤は、化学結合型を特徴とす
る従来の充填剤とはタイプが異なり、使用可能なｐＨ範
囲も２〜１０と極めて広く、従来の充填剤では用い得な
かったアルカリ性溶媒でも使用でき、安定性も非常に良
い。
また、本発明にかかる充填剤を用いて血漿等の生体成分
中の薬物や代謝物をＨＰＬＣを用いて定量する場合、繁
雑な前処理なしに生体成分を直接注入しても精度よく分
析が可能である。
［発明の効果］ 本発明にかかるカラム充填剤は、シリコーン樹脂が担体
を均一にコートした樹脂カプセル型であるため、個々の
粉体の持つ極性基（例えばシリカゲルのシラノール基）
の影響をほとんど受けない。
また、充填剤の少なくとも外表面の一部は親水性である
ため、タンパク質等の吸着は行われず、安定でしかも分
離能に優れた充填剤を得ることができる。
［実施例］ 以下、本発明の好適な実施例をさらに詳細に説明する。
なお、本発明はこれにより限定されるものではない。ま
た、配合量は重量％で示す。
大Ｕよ 約６０人の細孔を有し、平均粒径５μｍの球形シリカゲ
ル粉体１０ｇと環状シリコーン化合物（式Ｉにおいて、
Ｒ　Ｉ＝　Ｃ　Ｈ　ｓ、ａ＝３〜５、ｂ＝０、Ｃ＝Ｏの
もの）２ｇとを、両者が連結された別々の密封容器にと
り、環状シリコーン化合物を窒素パブリングすることに
よって気相状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重
合させた。
続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温槽内
において１０５℃で１時間加熱した。
冷却後、粉体を３００ｍｌのナス型フラスコに取り、こ
れに触媒として塩化白金酸のトリ一〇一オクチルメチル
アンモニウム塩１ｍｇと、１−オクタデセン５０ｍｇと
を加えて油浴中において１２０℃で５時間還流加熱した
後、グラスフィルター（Ｇ一４）を用いて濾過し、さら
にクロロホルム１００＋ｎｌで洗浄し、しかる後１０５
℃の恒温槽に入れ１時間乾燥させた。
次いで乾燥粉体を３００ｍｌのナス型フラスコにとり、
これに２８％アンモニア水１０ｍｌ，及びメタノール９
０ｍｌ加えて水浴中で５時間還流加熱した。これをグラ
スフィルターで濾過し、続いてメタノール５０ａ＋１で
洗浄濾過し、しかる後１０５℃の恒温槽に入れ４時間乾
燥させた。
次いで得られた粉末５ｇをとり、触媒として塩化アルミ
ニウムを１．３３ｇ加え、二硫化炭素中で３０分間加熱
還流させ、冷却後濾過、洗浄、６０℃、２ａ＋ｍＨｇで
５時間乾燥した。次にこの粉末を１５％γ−グリシドキ
シブ口ビルトリメトキシシランのトルエン溶液に加え、
還流下で１６時間反応させた。反応後濾過し、トルエン
、次いでアセトンで充分洗浄し、乾燥した。
次にこの粉末に過塩素酸でｐＨを１．　０〜２．０に調
整した水を加え、８０℃で４時間攪拌しながら反応させ
た。反応後、濾液が酸性を示さなくなるまで水で充分に
洗浄し、その後アセトンで洗浄し乾燥して本実施例にか
かる液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
上記粉体３ｇをパッカーとボンブを用い、内径４．６１
ｌｌＩＩ１１長さ１０ｃｍのステンレススチール製カラ
ムに平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成した。
本カラムを高速液体クロマトグラフに接続し、メタノー
ル／リン酸緩衝液（０．０２Ｍ，ｐＨ＝６．８６）＝１
０／９０を移動相として用いて１ｍｌ／分の流速で流し
、ヒト血漿１０μＱを注入し、ＵＶ検出器を用いて２８
０ｎｍで検出し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムのタンパク質のピーク面積は、
本カラムの代りに内径０．　　６ｍｍ，長さ２ｍのステ
ンレスコイルを用いて同様の操作をして得られたクロマ
トグラムのタンパク質のピーク面積と同一であるところ
から、タンパク質は本発明の充填剤には吸着されず、ほ
ぼ１００％回収されることが示唆された。
続いて、薬物を含有する血漿について測定した。
カフェインおよびテオフィリン各７９．２μｇにヒト血
漿０．　　５ｍｌを加えた試験液を二つ作成し、３７℃
で３時間インキユベートした。一方の試験液は直接注入
用の試料（試料１）とし、もう一方の試料は限外濾過し
、タンパク質を除去して遊離の薬物だけを測定する。す
なわち試料１との比較でタンパク質に結合した薬物量を
測定するための試料（試料２）とした。
試料１及び試料２を前記と同様の方法で本発明の充填剤
を充填したカラムを接続した高速液体クロマトグラフに
かけ、ＵＶ検出器を用いて２５４ｎｍで検出し、クロマ
トグラムを得た。
結果を次の表−１、表−２に示す。
表−１ 試料１ 表−２ 試料２ 前記表−１及び表−２から明らかなように、本発明にか
かる充填剤は、タンパク質の吸着が全くなく、血清や血
漿等の生体成分中の薬物や代謝物を高速液体クロマトグ
ラフを用いて定量する場合、繁雑な前処理なしに生体成
分を直接注入可能な充填剤であることが明かとされた。
大ｍｌス ＣＡＰＣＥＬＬ　　ＰＡＫ　　Ｃ＠（＠資生堂製）５ｇ
を取り、触媒として塩化アルミニウムを０．８ｇ加え、
二硫化炭素中で３０分間加熱還流させ、冷却後濾過、洗
浄、６０℃、２　ｍｍ｝Ｉｇで５時間乾燥した。次にこ
の粉末を１５％γ−グリシドキシブ口ビルトリメトキシ
シランのトルエン溶液に加え、還流下で１６時間反応さ
せた。反応後濾過し、トルエン、次いでアセトンで充分
洗浄し乾燥した。
次にこの粉末に過塩素酸でｐＨを１．０〜２．０に調整
した水を加え、８０℃で４時間攪拌しながら反応させた
。反応後、濾液が酸性を示さなくなるまで水で充分に洗
浄し、その後アセトンで洗浄し乾燥して本発明にかかる
液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
続いて、本カラムを用いて薬物を含有する血漿について
測定した。
本カラムを高速液体クロマトグラフに接続し、メタノー
ル／リン酸緩衝液（０．０２Ｍ，ｐＨ＝６．８６）＝２
／９８を移動相として用いてｌｍｌＺ分の流速で流し、
試験液（実施例１で用いた試料１と同一組成のもの）を
直接注入し、Ｕ■検出器を用いて２５４ｎｍで検出し、 クロマトグラムを 得た。
結果を次の表−３に示す。
表−３ 試料３

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）Ｓｉ−Ｒ（Ｒは炭素数１〜１８の炭化水素よりな
    る炭化水素基）結合、及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は末端にポ
    リオキシアルキレン基又は水酸基を一つ以上有する親水
    性基）結合を有するシリコーンポリマーで多孔性担体を
    被覆したことを特徴とするカラム充填剤。
  2. （２）多孔性担体に炭化水素基を結合させる炭化水素基
    修飾工程と、 前記炭化水素基を一部除去する炭化水素基除去工程と、 親水性基を結合させる親水性基修飾工程と、を含むこと
    を特徴とするカラム充填剤の製造方法。
  3. （３）請求項２記載の方法において、多孔性担体はシリ
    コーンポリマーで被覆されていることを特徴とするカラ
    ム充填剤の製造方法。
  4. （４）請求項２又は３記載の方法において、炭化水素基
    除去工程ではルイス酸による処理が行われることを特徴
    とするカラム充填剤の製造方法。
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