JPH08501219A - 鏡像異性２−アルカン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 すべての場合にシュウドモナス プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプティダ）５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ及びシュウドモナス クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３の１つ又は両方を用いて、式Ｉ（式中、Ａ及びＲ¹は明細書中に定義されたとおりである）の２−アルキルニトリルを対応する２−アルカン酸に転化し、２−アルキルニトリルを対応するアミドに転化し、そして２−アルキルアミドを対応する酸に転化する。

Description

【発明の詳細な説明】 鏡像異性２−アルカン酸の製造方法 一般式 Ｘ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨの多くの農薬及び医薬は、ラセミ体又はジアス テレオマー混合物として現在市場に出されている。他のエナンチオマー／ジアス テレオマーが不活性又は有害でありさえするのに対して、多くの場合、生理学的 作用は唯一のエナンチオマー／ジアステレオマーから得られる。エナンチオマー を分割するための一定の化学及び酵素技術が知られている。例えば、国際公開第 ９２／０５２７５号は、順次生物学的に触媒作用を及ぼす２段階法で、対応する ニトリルのラセミ体から鏡像異性アミド中間体を経由して（Ｓ）−２−アルカン 酸をエナンチオ選択的に製造する方法を開示する。 先行技術には、Ａ−１又はＡ−２部分のいずれかを含む式Ｉのアミドを対応す る酸に立体特異的に転化する本発明の方法を示唆するものは何もなく、開示され る溶媒系中における特定の微生物による特定のニトリルの対応するアミドへの立 体特異的な転化を示唆するものも何もなく、ニトリルを直接対応する酸に立体特 異的に転化する１段階の２種微生物方法を示唆するものも何もない。発明の要約 本発明は、式Ｉ 式中、Ａは からなる群より選択され、 Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₄アルキルであり； Ｒ²はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル；ＯＣＦ₂Ｈ； 又はＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＮＨであり；そして Ｒ³はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル：又はＣ₁〜 Ｃ₃アルコキシである； の（Ｓ）−アミドあるいは（Ｒ）−及び（Ｓ）−アミド混合物を対応する鏡像異 性（Ｓ）−カルボン酸へそれぞれ転化あるいは立体特異的に転化する方法であっ て、溶媒中で前記アミドをシュウドモナス クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３に接触させることを含む方法に関す る。好ましいのは、ＡがＡ−１であり、Ｒ¹がＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、Ｒ²がＣｌ であり、そしてアミドが（Ｓ）−アミドである上記方法である。また好ましいの は、ＡがＡ−２であり、Ｒ¹がメチルであり、Ｒ³がメトキシであり、そしてアミ ドがラセミ体である方法である。変換用の溶媒は水性緩衝液あるいは水性緩衝液 と有機溶媒の二相混合液であってよい。 また、本発明は、式II （式中、Ｒ¹及びＲ²は式Ｉの化合物で定義されたとおりである） の（Ｓ）−ニトリルあるいは（Ｒ）−及び（Ｓ）−ニトリル混合物を対応する鏡 像異性（Ｓ）−カルボン酸へそれぞれ転化あるいは立体特異的に転化する方法で あって、溶媒中で前記ニトリルをシュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３及び シュウドモナス プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）５Ｂ−Ｍ ＧＮ−２ｐの混合物に接触させ、そして生成物を回収することを含む方法に関す る。好ましいのは、Ｒ¹がＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、Ｒ²がＣｌであり、そしてニト リルがラセミ体である方法である。また、変換用の溶媒は水性緩衝液あるいは水 性緩衝液と有機溶媒の二相混合液であり得る。 さらに、本発明は、式IIの（Ｓ）−ニトリルあるいは式IIの（Ｒ）−及び（Ｓ ）−ニトリル混合物を対応する鏡像異性（Ｓ）−アミドへそれぞれ転化あるいは 立体特異的に転化する方法であって、水性緩衝液と有機溶媒の二相混合液中で前 記ニトリルをシュウドモナス プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐに接触させ、そし て生成物を回収することを含む方法に関する。 また、本発明は、式IIIの（Ｓ）−ニトリルあるいは式IIIの（Ｒ）−及び（Ｓ ）−ニトリル混合物を対応するアミドを経由して鏡像異性（Ｓ）−カルボン酸へ それぞれ転化あるいは立体特異的に転化する方法であって、溶媒中でシュウドモ ナス クロロラフィス Ｂ２３に接触させ、そして生成物を回収することを含む 方法に関する。所望であれば、アミド中間体を単離できる。 （式中、Ｒ¹及びＲ³は式Ｉの化合物で定義されたとおりである） 好ましいのは、（Ｓ）−２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオニトリ ルあるいは（Ｒ）−及び（Ｓ）−２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオ ニトリル混合物を対応する鏡像異性（Ｓ）−カルボン酸へそれぞれ転化あるいは 立体特異的に転化する方法であって、溶媒中でシュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３に接触させ、そして生成物を回収することを含む方法である。発明の詳細 本発明の方法により製造される（Ｓ）−２−アルカンカルボン酸は式 を有する。 本発明に用いる微生物は、シュウドモナス プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ プティダ）５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ及びシュウドモナス クロロラフィス（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３である。本発明の方法 は、それら微生物及び／又は該微生物からのアミダーゼ及びニトリルヒドラター ゼ酵素の使用を含むものと理解されるべきである。 術語「立体特異的」は立体特異的である化学反応を指す。術語「鏡像異性」は 単一のエナンチオマーであり、そして他のエナンチオマーを実 質的に含まない化合物を指す。反応が「立体特異的」であるか「立体選択的」で あるかどうかは生成物（Ｒ）−及び（Ｓ）−エナンチオマーのエナンチオマー比 （Ｅ）により決定される。Ｅは２種のエナンチオマーの生成速度比に対応する。 Ｅが７より大きい場合、反応は立体特異的であり、そしてＥが７又はそれより小 さい場合、反応は立体選択的である。好ましい反応はＥが８．５より大きいもの であり、そして最も好ましい反応はＥが１０又はそれより大きいものである。 ＡがＡ−１である式IIの（Ｒ）−及び（Ｓ）−ニトリル混合物を対応する鏡像 異性（Ｓ）−酸に転化する方法において、立体特異的ニトリルヒドラターゼの生 産に適する培地の存在下、微生物の培養によって得られるＰ．プティダ ５Ｂ− ＭＧＮ−２ｐに由来する立体特異的ニトリルヒドラターゼ酵素の作用により、ニ トリルのアミドへの加水分解が達成される。Ｐ．プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ は誘導物質なしで酵素を本質的に生産するため、この培地には適切な成長用窒素 源（例えば、塩化アンモニウム）を含めることが必要なだけである。このように して得られるニトリルヒドラターゼは（Ｒ）−及び（Ｓ）−ニトリル混合物に添 加され、対応する（Ｓ）−アミドが生産される。 アミド中間体はＰ．クロロラフィス Ｂ２３に由来する立体特異的アミダーゼ 酵素により加水分解され、対応する（Ｓ）−酸が生産される。ニトリルから酸へ の変換を行う１つの方法は、Ｐ．プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐからニトリルヒ ドラターゼ酵素をそしてＰ．クロロラフィス Ｂ２３からアミダーゼ酵素を集め 、そして生物学的に認識された方法で一の酵素製剤としてこれらの酵素を一緒に 用いることである。 ニトリルが式IIに示すものでありそしてＡがＡ−２である場合、対応 する（Ｓ）−酸への立体特異的転化は、Ｐ．プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐを存 在させずにＰ．クロロラフィス Ｂ２３を用いて成し遂げられ得る。転化中にお ける中間体は対応するアミドである。ニトリルのアミドへの転化は立体特異的で はないが、ラセミ体又は鏡像異性に富んだアミドの（Ｓ）−酸への転化は立体特 異的である。 微生物学的転化で用いられる最も通常の溶媒は水性緩衝液である。しかし、ほ とんどの有機基質は水にほんのわずかしか溶解しないため、微生物反応濃度は通 常の有機化学変換の場合よりも顕著に低い。大量の生成物を製造するためには、 大きな反応容器を使用せざるを得ず、あるいは数多くの反応を行わざるを得ない 。本発明の方法は、水性緩衝液と有機溶媒を含む二相溶媒を採用できる。二相溶 媒は反応をより高濃度で行わせることを可能にし、このことは製造規模で微生物 学的転化を使用する実用性を高める。 適切な水性緩衝液はリン酸塩及びピロリン酸塩を含む。「有機溶媒」はＣ₈− Ｃ₁₈炭化水素、トルエン及びフタル酸ジブチルならびにそれらの単相混合物を含 む群から選択される単一の非水性液体と定義される。有機溶媒に対する水性緩衝 液の比は約９５：５〜５０：５０の範囲に及ぶことができる。 Ｐ．クロロラフィス Ｂ２３を用いる（Ｒ）−及び（Ｓ）−アミド混合物の処 理は（Ｓ）−酸と未転化（Ｒ）−アミドの混合物を生産する。アミドを酸から分 離した後、アミドを公知の方法でアミドのラセミ体にラセミ化できるが、これを 既に述べたように再利用でき、そして加水分解できる。トルエン又は別の非水性 溶媒中で、第四級アンモニウム官能基を含むアニオン交換樹脂、例えばＡｍｂｅ ｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲＡ −４００（ＯＨ）を用いてアミドを還流することにより、ラセミ化を成し遂げる ことができる（国際公開第９２／０１０６２号を参照）。 （Ｒ）−及び（Ｓ）−ニトリル混合物から出発して（Ｓ）−酸を製造する本明 細書で開示する方法は、また主たる副生成物として（Ｒ）−ニトリルも製造する 。例えば、ニトリルの塩基中和及び溶媒抽出によって所望の酸からニトリルを分 離した後に、（Ｒ）−ニトリルの再利用もラセミ化に必要である。有機溶媒中で 、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲΛ−４００（ＯＨ）、Ａｍｂｅｒｌｙ ｓｔ（商標）Ａ−２６又はＤｏｗｅｘ（商標）ＩＸ８（水酸化物イオンで交換後 ）などのような強塩基性のイオン交換樹脂を用いて鏡像異性又は鏡像異性に富ん だニトリルをニトリルのラセミ体に転化できる。その結果、この方法は、ニトリ ルの対応するアミド又は酸への加水分解を実質的に伴わずにニトリルの高ラセミ 体を生産する。リサイクル工程は、（Ｓ）−酸を培地から連続的に除去し、そし て副生成物（Ｒ）−ニトリルをラセミ化し、そしてさらにそれを連続工程（それ をさらなるアルキルニトリルと組合せ、そして酵素混合物と接触させてアルキル 酸を生成する）で再利用できるように構成することができる（国際公開第９２／ ０５２７５号を参照）。 本発明は、単独で幾つかの転化に使用される生物学的材料 Ｐ．クロロラフィ ス Ｂ２３、及びＰ．クロロラフィス Ｂ２３とＰ．プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ− ２ｐの組み合わせ生物学的材料を使用してニトリルを（Ｓ）−酸に転化すること を特徴とする。微生物 Ｐ．プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐは、ブダペスト条約 の規定によりＮＲＲＬ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅｒａｃ ｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕ． Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔ ｕｒｅ，１８１５ Ｎ ｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔ．，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ）に寄託され、 受託番号 ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６８号がついている。この菌株はテキサス州Ｏ ｒａｎｇｅで採取された土壌から単離された。以下の改変培地（ＰＲ基本培地） を用いて標準濃縮方法を使用した。Ｐ．プティダ ５−Ｂ−ＭＧＮ−２ｐの単離 物はバクト・ブレイン・ハート・インフュージョン寒天上を繰り返し通過させて Ｐ．プティダ ５−Ｂ−ＭＧＮ−２ｐの単離物を精製し、続いて濃縮ニトリルか らアンモニアの生産についてスクリーニングを行い、そして国際公開第９２／０ ５２７５号に開示された方法により同定した。シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７）は、日本国 ３０５ 茨城県筑波市 東１−１−３の工業技術院微生物工業技術研究所から得られるニットウ化学（Ｎ ｉｔｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の特許菌株である。 Ｐ．クロロラフィス Ｂ２３及びＰ．プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐを以下に 述べるようなＰＲ基本培地で増殖した。 PR基本培地 g/L KH₂PO₄ 8.85 クエン酸ナトリウム 0.225 MgSO₄・7H₂O 0.5 FeSO₄・7H₂O 0.05 FeCl₂・4H₂O 0.0015 CoCl₂・6H₂O 0.0002 MnCl₂・4H₂O 0.0001 ZnCl₂ 0.00007 H₃BO₃ 0.000062 NaMoO₄・2H₂O 0.000036 NiCl₂・6H₂O 0.000024 CuCl₂・2H₂O 0.000017 ビオチン 0.00001 葉 酸 0.00005 ピリドキシン・HCl 0.000025 リボフラビン 0.000025 ニコチン酸 0.000025 パントテン酸 0.00025 ビタミンB¹² 0.000007 p-アミノ安息香酸 0.00025 PR基本培地に対して以下の追加及び又は改変を行った。 また、ニトリル又はアミドに代えて２５ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌ又は２５ｍＭ （Ｎ Ｈ₄）₂ＳＯ₄を用いて、ニトリル又はアミド誘導物質なしで、シュウドモナス プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐを増殖させた。 酵素活性の試験では、Ｐ．クロロラフィス Ｂ２３又はＰ．プティダ ５Ｂ− ＭＧＮ−２ｐの０．１ｍＬの凍結保存培養物を１０ｍＬ容量の完全ＰＲ基本培地 に接種した。２５０ｒｐｍで振盪機を用いて室温（２２〜２５℃）で一夜増殖さ せた後、 １０ｍＬの接種原を２Ｌフラスコ中の９９０ｍＬの新鮮培地に添加し た。培地中で気泡を生成させるのに十分なほど高速度の攪拌を伴って、細胞を室 温で一夜成長させた。細胞を遠心分離で採取し、０．８５％塩水で一回洗浄し、 そして貯蔵するために濃縮した細胞ペーストを直ちに−７０℃の冷凍器に入れた 。すべての生物学的転化において、約８０％の水を含む解凍した細胞ペーストを 用いた。 以下の省略を実施例で用いた。 ＣＰＩＮ − ２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチロニト リル ＣＰＩＡｍ − ２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチルアミ ド ＣＰＩＡ − ２−（４−クロロフェニル）−３−メチル酪酸 ＮＰＣＮ − ２−（６−メトキシ−２−ナフチル）−プロピオニト リル ＮＰＡｍ − ２−（６−メトキシ−２−ナフチル）−プロピオンア ミド ＮＰＡＣ − ２−（６−メトキシ−２−ナフチル）−プロピオン酸 ＨＰＬＣ − 高速液体クロマトグラフイー 次のエナンチオマーと混合物を試験した： （Ｓ）−ＣＰＩＮ、（Ｒ）−ＣＰ ＩＮ、（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮ、（Ｓ）−ＣＰＩＡｍ、（Ｒ）−ＣＰＩＡｍ、（Ｒ ，Ｓ）−ＮＰＣＮ及び（Ｒ，Ｓ）−ＮＰＡｍ。 （Ｒ，Ｓ）表示は、示された化合物のラセミ体混合物を示す。基質と緩衝液を 含む１ミリリットルの分析物を以下に示す温度及び時間でインキュベートした。 以下に述べるように、生物学的転化ブロスを抽出し、そしてはじめに逆相ＨＰＬ Ｃで次にキラルＨＰＬＣで分析した。分析方法 ニトリル、微生物の加水分解を経由して誘導されるアミド及び酸生成物の濃度 を逆相ＨＰＬＣにより測定した。紫外線吸収により検出を行った。１．０％のＨ₃ ＰＯ₄で酸性にした７０〜７５％のメタノールと２５〜３０％の水からなる移動 相を採用するＤｕ Ｐｏｎｔ Ｚｏｒｂａｘ （商標）Ｃ１８を用いた。 ニトリル及び得られたアミドと酸生成物のクロマトグラフィー的同定及び定量 を、基準標準品との比較により行った。 Ｃｈｒｏｍｔｅｃｈ（Ｓｗｅｄｅｎ）より得られたα₁−酸糖タンパク質を用 いて、エナンチオマーの分割のためにキラルＨＰＬＣを行った。種々のエナンチ オマーの分割用の移動相を以下に要約する。ニトリル、アミド及び酸 エナンチオマーのキラルＨＰＬＣ分割 エナンチオマー 移動相 ＣＰＩＮ，ＣＰＩＡｍ ９５％ ０．０１Ｍリン酸塩緩衝液 ＣＰＩＡ （ｐＨ ６．０）：５％ エタノール ＮＰＣＮ，ＮＰＡｍ ９５％ ０．０１Ｍリン酸塩緩衝液 ＮＰＡＣ （ｐＨ ５．６）：５％ エタノール 本発明の方法は以下の実施例により例証されている。実施例１〜３は、２８℃ 、３５℃及び５０℃におけるＰ．クロロラフィス Ｂ２３を用いた（Ｓ）−ＣＰ ＩＡｍの加水分解を記述する。２８℃及び３５℃における（Ｒ）−ＣＰＩＡｍの 加水分解についての比較が与えられている（比較テスト１及び２）。 実施例４〜７は、２８℃及び３５℃における（Ｓ）−ＣＰＩＮ及び（Ｒ，Ｓ） −ＣＰＩＮの立体特異的加水分解、すなわち（Ｓ）−ＣＰＩＮ及び（Ｒ）−ＣＰ ＩＮの両方が加水分解されるが、より多くの（Ｓ）−ＣＰＩＮが（Ｓ）−ＣＰＩ Ａｍに転化されていることを記述する。また、（Ｓ）−ＣＰＩＡのみが生成する ため、（Ｓ）−ＣＰＩＡｍの（Ｓ）− ＣＰＩＡへの立体特異的生物学的転化が例証されている。２８℃及び３５℃にお ける（Ｒ）−ＣＰＩＡの加水分解についての比較が与えられている（比較テスト ３及び４）。 実施例８は、（Ｒ，Ｓ）−ＮＰＡｍの（Ｓ）−ＮＰＡＣへの立体特異的加水分 解を記述する。 実施例１０は、シュウドモナス プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ及びＰ．クロ ロラフィス Ｂ２３を用いた（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮの（Ｓ）−ＣＰＩＡへの生物 学的転化を記述する。この２種の微生物／１段階（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮ生物学的 転化では、生成物として（Ｓ）−ＣＰＩＡと（Ｓ）−ＣＰＩＡｍだけが検出され た。 実施例１１は、Ｐ．プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐとＰ．クロロラフィス Ｂ ２３の両方を用いた（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮの（Ｓ）−ＣＰＩＡへの二相（緩衝液 ／有機溶媒）生物学的転化を記述する。この実施例では、主生成物は（Ｓ）−Ｃ ＰＩＡであるが、微量（０．５μモル）の（Ｒ）−ＣＰＩＡｍも生成した。実施例１〜３ならびに比較テスト１及び２ ２８℃、３５℃及び５０℃における シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３を用いた （Ｓ）−ＣＰＩＡｍ及び（Ｒ）−ＣＰＩＡｍの加水分解 シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３の５０ｍｇの凍結細胞ペースト試料 を室温で１ｍＬのリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ値：７．０）に添加した。 これを９．４μモルの（Ｓ）−ＣＰＩＡｍ又は（Ｒ）−ＣＰＩＡｍを含むガラス 瓶に移した。２４又は４８時間、２８℃又は ３５℃又は５０℃でインキュベートした後、反応物を３Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨ３ま で酸性にした。６容量の塩化メチレンを添加し、そして懸濁液を１５〜３０分間 攪拌した。塩化メチレン層を除去し、そして窒素ガス流下蒸発乾固し、さらに残 渣を１ｍＬのメタノールに懸濁させた。メタノール溶液の組成を逆相ＨＰＬＣ及 びキラルＨＰＬＣにより測定し、そしてそれを表１に示す。 （Ｓ）−ＣＰＩＡｍ又は（Ｒ）−ＣＰＩＡｍの不完全な回収は実験誤差又は基 質の細胞への吸着のせいであろう。 実施例４〜７ならびに比較テスト３及び４ ２８℃及び３５℃における シュウドモナス クロロラフィスＢ２３を用いた （Ｓ）−ＣＰＩＮ、（Ｒ）−ＣＰＩＮ及び（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮの 加水分解 シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３の５０ｍｇの凍結細胞ペースト試料 を室温で１ｍＬのリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ値：７．０）又はピロリン 酸塩緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ値：７．５）に添加した。これを１０．４μモルの（ Ｓ）−ＣＰＩＮ又は（Ｒ）−ＣＰＩＮあるいは２０．７μモルの（Ｒ，Ｓ）−Ｃ ＰＩＮのいずれかを含むガラス瓶に移した。４８時間、２８℃及び３５℃でイン キュベートし、引き続いて実施例１〜３と同様に抽出処理した後、抽出上澄みの 組成を逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣにより測定した。結果を表２に示す。 （Ｓ）−ＣＰＩＮ又は（Ｒ）−ＣＰＩＮの不完全な回収は実験誤差又は基質の 細胞への吸着のせいであろう。 実施例８ シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３を用いた （Ｒ，Ｓ）−ＮＰＡｍの加水分解 シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３の１２．５ｍｇの凍結細胞ペースト 試料を室温で１ｍＬのリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ値：７．２）に添加し た。次に、４０μＬのジメチルスルホキシドに溶解した１μモルの（Ｒ，Ｓ）− ＮＰＡｍを添加した。４８時間、２２℃でインキュベートした後、反応物を３Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨ３まで酸性にした。４容量の塩化メチレンを添加し、そして懸 濁液を３０分間攪拌した。塩化メチレン層を除去し、そして窒素ガス流下蒸発乾 固し、さらに残渣を１ｍＬのメタノールに再溶解した。メタノール溶液の組成を 逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣにより測定し、そしてそれを表３に示す。 （Ｒ，Ｓ）−ＮＰＡｍの不完全な回収は実験誤差又は基質の細胞への吸着のせ いであろう。 実施例９ シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３を用いた （Ｒ，Ｓ）−ＮＰＣＮの加水分解 シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３の１２．５ｍｇの凍結細胞ペースト 試料を室温で１ｍＬのリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ値：７．２）に添加し た。次に、４０μＬのジメチルスルホキシドに溶解 ：７．２）に添加した。次に、４０μＬのジメチルスルホキシドに溶解した１μ モルの（Ｒ，Ｓ）−ＮＰＣＮを添加した。実施例８と同様にインキュベーション と抽出処理を行った後、抽出上澄みの組成を逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣに より測定した。結果を表４に示す。 （Ｒ，Ｓ）−ＮＰＡｍの不完全な回収は実験誤差又は基質の細胞への吸着のせ いであろう。 実施例１０ シュウドモナス プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ及び シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３による （Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮの加水分解 シュウドモナス プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ及びシュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３の５０ミリグラムの凍結細胞ペースト試料を室温で１ ｍＬのピロリン酸塩緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ値：７．５）に添加した。これを２０ ．７μモルの（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮを含むガラス瓶に移した。４８時間、３５℃ でインキュベートし、引き続いて実施例１〜３と同様に抽出処理した後、抽出上 澄みの組成を逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣにより測定した。結果を表５に示 す。 実施例１１ 水性緩衝液／炭化水素混合物中における シュウドモナス プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ及び シュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３による （Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩＮの加水分解 シュウドモナス プティダ ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐ及びシュウドモナス クロロラフィス Ｂ２３の５０ミリグラムの凍結細胞ペースト試料を室温で０ ．８ｍＬのピロリン酸塩緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ値：７．５）に添加した。次に、 Ｓｏｌｔｒｏｌ（商標）２２０に溶解した２０．７μモルの（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＩ Ｎ、Ｃ₁₃〜Ｃ₁₇炭化水素混合物（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ６６ Ｃｏ．）を添加した 。４８時間、３５℃でインキュベートし、引き続いて実施例１〜３と同様に抽出 処理した後、抽出上澄みの組成を逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣにより測定し た。結果を表６に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:38 1:40）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式Ｉ 式中、Ａは からなる群より選択され、 Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₄アルキルであり； Ｒ²はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル；ＯＣＦ₂Ｈ； 又はＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＮＨであり；そして Ｒ³はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル；又はＣ₁〜 Ｃ₃アルコキシである； の（Ｓ）−アミドあるいは（Ｒ）−及び（Ｓ）−アミド混合物を対応する鏡像異 性（Ｓ）−カルボン酸へそれぞれ転化あるいは立体特異的に転化する方法であっ て、溶媒中で前記アミドをシュウドモナス クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３に接触させ、そして前記鏡像異性（ Ｓ）−カルボン酸を回収することを含む方法。 ２．ＡがＡ−１であり、Ｒ¹がＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、Ｒ³がＣｌであり、そして アミドが（Ｓ）−アミドである請求の範囲第１項記載の方法。 ３．ＡがＡ−２であり、Ｒ¹がメチルであり、Ｒ³がメトキシであり、そ してアミドがラセミ体である請求の範囲第１項記載の方法。 ４．溶媒が水性緩衝液と有機溶媒の二相混合液である請求の範囲第１項記載の方 法。 ５．式 式中、Ａは からなる群より選択され、 Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₄アルキルであり； Ｒ²はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル；ＯＣＦ₂Ｈ； 又はＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＮＨであり；そして Ｒ³はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル；又はＣ₁〜 Ｃ₃アルコキシである； の（Ｓ）−ニトリルあるいは（Ｒ）−及び（Ｓ）−ニトリル混合物を対応するア ミドを経由して鏡像異性（Ｓ）−カルボン酸へそれぞれ転化あるいは立体特異的 に転化する方法であって、溶媒中で前記ニトリルをシュウドモナス クロロラフ ィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３に接触させ 、そして前記鏡像異性（Ｓ）−カルボン酸を回収することを含む方法。 ６．ニトリルが２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオニトリルのラセミ 体又は２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチロニトリ ルのラセミ体である請求の範囲第５項記載の方法。 ７．中間体アミドの単離を含む請求の範囲第５項記載の方法。 ８．式II 式中、 Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₄アルキルであり；そして Ｒ²はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル；ＯＣＦ₂Ｈ； 又はＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＮＨである； の（Ｓ）−ニトリルあるいは（Ｒ）−及び（Ｓ）−ニトリル混合物を対応する鏡 像異性（Ｓ）−カルボン酸へそれぞれ転化あるいは立体特異的に転化する方法で あって、溶媒中で前記ニトリルをシュウドモナス クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３及びシュウドモナス プティ ダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐの混合物に接 触させ、そして前記鏡像異性（Ｓ）−カルボン酸を回収することを含む方法。 ９．Ｒ¹がＣＨ（ＣＨ₃）₂であり、Ｒ²がＣｌであり、そしてニトリルがラセミ体 である請求の範囲第８項記載の方法。 １０．溶媒が水性緩衝液と有機溶媒の二相混合液である請求の範囲第８項記載の 方法。 １１．式II 式中、 Ｒ¹はＣ_１〜Ｃ₄アルキルであり；そして Ｒ²はＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＯＨ；Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル；ＯＣＦ₂Ｈ； 又はＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＮＨである； の（Ｓ）−ニトリルあるいは（Ｒ）−及び（Ｓ）−ニトリル混合物を対応する鏡 像異性（Ｓ）−アミドへそれぞれ転化あるいは立体特異的に転化する方法であっ て、水性緩衝液と有機溶媒の二相混合液中で前記ニトリルをシュウドモナス プ ティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐに接触さ せ、そして前記鏡像異性（Ｓ）−アミドを回収することを含む方法。