JPH08501221A

JPH08501221A - アルデヒドデヒドロゲナーゼー１遺伝子を形質導入しうるレトロウイルスベクター及び前記ベクターの使用

Info

Publication number: JPH08501221A
Application number: JP6522424A
Authority: JP
Inventors: ダラーファベラ、リカード; ジアンニ、アレスサンドロ・マッシモ
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1993-04-01
Filing date: 1994-04-01
Publication date: 1996-02-13
Also published as: CN1109260A; AU6623994A; PL306549A1; HU9403377D0; RU94046095A; US6268138B1; WO1994023015A1; FI945665A7; KR950701969A; HUT75717A; IL109168A0; CA2135912A1; NZ265472A; FI945665A0; EP0648261A4; US5888820A; EP0648261A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はグルタミルシステインシンセターゼ又はこれらの組合せをコードする核酸分子を含有するウイルス及びレトロウイルスベクターを提供する。更に本発明は、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を提供する。加えて、本発明は、患者中のシクロホスファミドの毒性効果を減少するための方法であって、患者の造血細胞をレトロウイルスべクターを有する造血細胞で置き換えることを具備した方法を提供する。更に本発明は、哺乳類細胞に選択マーカーを導入するための方法であって、該細胞にヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を形質移入することを具備した方法を提供する。最後に、本発明は、注目のタンパクを発現する哺乳類細胞を選択する方法であって、ａ）該注目のタンパクをコードする核酸分子及びヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有する核酸分子を、該細胞に導入すること；ｂ）得られた形質移入細胞を培養すること；及びｃ）ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞を選択することを具備した方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の名称〕アルデヒドデヒドロゲナーゼ−１遺伝子を形質導入しうるレトロウイルスベクター及び前記ベクターの使用本出願は、１９９３年４月１に提出された米国特許出願シリアルナンバー０８／０４１，７２２の一部継続出願であり、その内容は参照文献として本出願の一部をなす。この出願を通して、種々の刊行物が、著者の名前及び刊行年によって括弧内で参照されている。これらの刊行物の完全な引用は、本明細書の最後、即ち請求の範囲の直前に列挙してある。これらの刊行物の開示は、本発明に関連する分野の状態をより完全に説明するために、参照文献によって完全に本出願の一部をなす。〔本発明の背景〕自己の骨髄移植戦略における最近の進歩は、骨髄毒性剤（薬物又は放射線）で処理された患者に、自己の抹消血（ＣＤ３４⁺）「幹細胞」を再注入することによって、通常の造血が迅速に回復されうることが示されたことである（Gian-ni ，et al.，Lancet 2:580，1989）。加えてごく最近、ＣＤ３４⁺細胞が、in vit orにおいて特異的な遺伝子を発現するレトロウイルスベクターを用いて、高効率で形質導入されうることが報告された（Bregni，etal.，Blood80:1418，1992）。これらの技術は、数種のアプローチに道を開くものであり、このアプローチでは、自己のＣＤ３４⁺ 細胞に特異的な遺伝子をin vitroで形質導入し、次いで患者に再接種することが、治療として十分な遺伝子を形質導入するために用いうる。この遺伝子治療のアプローチには、癌患者における高投与量骨髄毒性化学療法での引き続きの治療を可能にする薬物耐性造血細胞の再構築が含まれる。〔発明の概要〕本発明は、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有するベクターを提供する。加えて、本発明は、ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するベクターを提供する。加えて、本発明は、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクターを提供する。加えて、本発明は、ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクターを提供する。加えて、本発明は、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するベクターを提供する。更に本発明は、患者中のシクロホスファミドの毒性効果を減少するための方法であって、患者の造血細胞を、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクターを有する造血細胞で置き換え、これによって、患者のシクロホスファミド毒性効果を減少することを具備した方法を提供する。更に本発明は、哺乳類細胞に選択マーカーを導入するための方法であって、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を該細胞に形質移入することを具備した方法を提供する。更に本発明は、関心のあるタンパク質を発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ．）該細胞に、関心のあるタンパク質をコードする核酸分子及びヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有する核酸分子を導入すること；ｂ．）得られた形質移入された細胞を培養すること；ｃ．）ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞を選択し、これによって関心のあるタンパク質を発現する細胞を得ること；を具備した方法を提供する。更に本発明は、患者中のシクロホスファミドの毒性効果を減少するための方法であって、患者の造血細胞を、ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクターを有する造血細胞で置き換え、これによって患者のシクロホスファミドの毒性効果を減少することを具備した方法を提供する。本発明は更に、哺乳類細胞に選択マーカーを導入するための方法であって、ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を該細胞に形質移入することを具備した方法を提供する。加えて本発明は、関心のあるタンパク質を発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ．）該細胞に、興味のあるタンパク質をコードする核酸分子及びヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有する核酸分子を導入すること；ｂ．）得られた形質移入された細胞を培養すること；ｃ．）ヒトグルタミルシステインシンセターゼを発現する細胞を選択し、これによって関心のあるタンパク質を発現する細胞を得ることを具備した方法を提供する。加えて本発明は、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を提供する。該単離された哺乳類核酸分子は、実質的に図４（SEQ ID NO: 1）に示されるのと同じ配列を有しうる。更に本発明は、グルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を提供する。該単離された哺乳類核酸分子は、実質的に図６（SEQ ID NO: 3）に示されるのと同様の配列を有しうる。更に本発明は、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はグルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子の核酸分子配列と特異的にハイブリッド化しうる少なくとも１５のヌクレオチドからなる核酸分子を提供する。更に本発明は、細胞中でのアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得、そのようにして得られたｍＲＮＡを、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された哺乳類核酸分子のラベルされた核酸分子とハイブリッド化する条件下で接触させ、該分子にハイブリッド化されたｍＲＮＡの存在を検出すること、及びこれによって細胞中の細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出することを具備した方法を提供する。更に本発明は、哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で宿主ベクター系の宿主細胞を増殖させ、そのように産生されたポリペプチドを回収することを具備した方法を提供する。加えて本発明は、細胞中でのグルタミルシステインシンセターゼの発現を検出する方法であって、細胞からの全ｍＲＮＡを得ること、そのようにして得られたｍＲＮＡを、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された哺乳類核酸分子のラベルされた核酸分子とハイブリッド化する条件下で接触させ、該分子にハイブリッド化されたｍＲＮＡの存在を検出し、これによって細胞中での細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出することを具備した方法を提供する。加えて本発明は、哺乳類グルタミルシステインシンセターゼの生物活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で宿主ベクター系の宿主細胞を増殖し、そのように産生されたポリペプチドを回収することを具備した方法を提供する。更に本発明は、アミノ酸分子である細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼに対する抗体を提供する。更に本発明は、アミノ酸分子であるグルタミルシステインシンセターゼに対する抗体を提供する。加えて本発明は、生物学的サンプル中の哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの量を測定するための免疫測定法であって、ａ）生物学的サンプルを少なくとも１種の抗体、即ちモノクローナル若しくはポリクローナルと接触し、前記抗体と細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼとの複合体を形成させること；及びｂ）前記生物学的サンプル中の細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの量を前記複合体の量を測定することによって測定することを具備した免疫測定法を提供する。更に本発明は、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はグルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を含有する遺伝子導入非ヒト哺乳類を提供する。加えて本発明は、遺伝子導入非ヒト型哺乳類であって、該哺乳類のゲノムが、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡと相補的なアンチセンスＤＮＡを具備し、該アンチセンスＤＮＡが細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるような位置に配置され、該アンチセンスｍＲＮＡが哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡにハイブリッド化され、これによってその翻訳が減少されることになるものを提供する。更に本発明は、生物学的サンプルの哺乳類グルタミルシステインシンセターゼの量を測定するための免疫測定法であって、ａ）該生物学的サンプルを少なくとも一種の抗体、即ちモノクローナル若しくはポリクローナルと接触し、前記抗体及びグルタミルシステインシンセターゼの複合体を形成すること；及びｂ）前記生物学的サンプルのグルタミルシステインシンセターゼの量を前記複合体の量を測定することによって測定することを具備した免疫測定法を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１ pLAIDO-SNプラスミド構成。但し、ALDH1＝ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１、pG=pGEM、B=BamH1、Bg=BglII、S=SalI、E=EcoRI、X=XbaI、X h=Xhol、H=HpaIである。図２ pLAIDO-Xプラスミドの構築。図３ pLAldo-SNで形質転換K562細胞（Lozzio，1975）のマフォスファミド耐性（Maphosphamide-resis-tance）。MPAはマフォスファミドである。グラフは、３つの異なった実験の平均値±標準偏差を表す。図４１８４２ｂｐの完全な長さのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Aldh-1）ｃＤＮＡ配列（SEQ．ID．NO．1）のヌクレオチド配列。翻訳開始コドン（ATG）の先には、フレーム中で翻訳終止コドン、ｔａｇ（下線を付した）が位置する。図５アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Aldh-1）のアミノ酸配列（SEQ．ID．NO ．2）。図６２９０４ｂｐの完全な長さのグルタミルシステインシンセターゼ（γ− ＧＣＳ）ｃＤＮＡ配列（SEQ．ID．NO．3）のヌクレオチド配列。翻訳開始コドン（ATG）の先には、フレーム中で翻訳終止コドン、ｔｇａ（下線を付した）が位置する。図７グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ＧＣＳ）のアミノ酸配列（SE Q．ID．NO．4）図８ pLGCS-Xプラスミドの構築。〔発明の詳細な説明〕本出願の全体に渡って、特異的なヌクレオチドの関連物は、核酸のコーディングストランド上に存在するヌクレオチドにある。以下の標準的な略語は、独特のヌクレオチドを示すために本明細書の全体に渡って使用される。Ｃ＝シトシンＡ＝アデノシンＴ＝チミジンＧ＝グアノシン「遺伝子（gene）」は核酸分子を意味し、その配列は、個々のタンパク質の通常の調節を受ける産生に対して要求される情報であって、構造をコードする配列、プロモータ及びエンハンサーを含む情報を全て含有している。主発明のＤＮＡ分子はまた、ポリペプチド類似体、フラグメント、又は抗原性ポリペプチドの誘導体をコードするＤＮＡ分子であって、一以上のアミノ酸残基の性質又は配置に関して天然に発生する形態とは異なっているもの（タンパク質に対して特徴づけられた全残基よりも少ない残基を含有する欠失類似体、置換類似体であって１以上の特徴づけられた残基が他の残基によって置換されたもの、及び追加類似体であって１以上のアミノ酸残基が、ポリペプチドの末端若しくは中間部分に加わったもの）、並びに該ＤＮＡ分子が天然に発生する形態の幾つか若しくは全ての性質を担っているものも含有する。これらの分子には、選ばれた非哺乳類宿主による発現に「好ましい（ Preferred）」コドンの取り込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素によって切断される部位の供給；及び容易に発現されるベクターの構築を促進する追加の開始、末端若しくは中間ＤＮＡ配列の供給が含まれる。ここで説明され、クレームされたＤＮＡは、ポリペプチドのアミノ酸配列に関するこれらが提供する情報、及び種々の組換え技術によるポリペプチドの大量合成の生成物として有用である。該分子は、新たなクローニングベクター及び発現ベクター、形質転換及び形質移入された原核及び真核宿主細胞、並びにポリペプチド及び関連生成物を発現しうるこのような宿主細胞の培養増殖に、新規で有用な方法を得るために有効である。本発明は、ベクターであって、その複製に必須でない領域内のある部位に挿入されたヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクターを提供する。該ベクターは、ウイルス性ベクターでありうる。更に、該ウイルス性ベクターは、二本鎖ＤＮＡウイルスベクターでありうる。一態様では、上記核酸分子はＲＮＡでありうる。他の態様では、該核酸分子はＤＮＡでありうる。更なる態様では、該ＤＮＡ分子は、ゲノムである。更なる態様では、該ＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡである。更に、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は、実質的に図４に示されるのと同様の配列（ SEQ．ID．NO： 1）でありうる。加えて本発明は、レトロウイルスベクターであって、その複製に必須でない該ベクターの領域内のある部位に挿入されたヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクターを提供する。該ベクターはレトロウイルスベクターでありうる。更に該レトロウイルスベクターは二重鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターでありうる。本発明において用いられるように、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ１と交換可能に使用される。加えて、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、完全な長さのヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼである。本発明は上記レトロウイルスベクターであって、該ベクターが、二つの長鎖末端繰り返し配列に対応するネズミウイルスからのＤＮＡ、及びパッケージングシグナルを含有するものを提供する。一つの態様では、該ネズミウイルスは、マロネー（Moloney）ネズミ白血病ウイルスである。他の態様では、該ネズミウイルスは、マロネー（Maloney）ネズミ肉腫ウイルスである。更なる態様では、３’末端繰り返し配列がマロネーネズミ白血病ウイルスに存在するものに対応し、５’末端繰り返し配列がマロネーネズミ肉腫ウイルスに対応する。ベクターは、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス乳ガンウイルス（MMTV）、マロネーネズミ白血病ウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ＤＮＡ放出システム（delivery system）、即ちリポソーム、並びにプラスミド放出システムを含有するが、これらに限定されない。パッケージングシグナルが、遺伝子発現に重要なスプライス供与体及びスプライス受容体を含有しうることは当分野で周知である。レトロウイルスベクターは、更に第二の哺乳類遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含有しうる。該第二の哺乳類遺伝子は、哺乳類細胞から誘導され、哺乳類細胞に通常発現されるタンパク質をコードする。該第二の哺乳類遺伝子は、ＤＮＡ発現のプロモーターに外科的（operably）に結合されたｃＤＮＡ配列又はゲノムＤＮＡ配列でありうる。本発明の一態様では、第二の哺乳類遺伝子は、選択し得ない表現型（non-selectable phenotype）をコードする遺伝子である。ここで使用された「選択し得ない表現型」とは、通常の任意の手段、即ち、薬剤、熱若しくは他の従来用いられている選択圧によって選択することができない遺伝子の発現を意味する。選択し得ない表現型とは、細胞の混合物を含有する系（その幾つかが選択し得ない表現型に対して陽性の細胞を含有し、その幾つかが陰性である）が、選択し得ない表現型に陽性の細胞のみをうまく扱うことで生き残らせるような通常の手段によっては取り扱うことができないことを意味する。本発明の実施に従った有用な選択し得ない表現型をコードする遺伝子には、インスリン、β−グロブリン及び主要な組織適合性遺伝子が含まれる。しかし、本発明の実施は、これらの遺伝子のみをレトロウイルスベクターに挿入することに制限されない。レトロウイルスベクターへの含有及び哺乳類細胞への挿入に適した他の哺乳類遺伝子もまた本発明の実施に包含される。第二の哺乳類遺伝子は、レトロウイルスパッケージング細胞によって、レトロウイルスベクターに第二の哺乳類遺伝子を組み込むことにより、レトロウイルス粒子にパックされる（Banket et al．U．S．Patent No．5,278,056，１月１１日１９９４年発行）。加えて本発明は、ベクターであって、その複製に必須でない該ベクターの領域内のある部位に挿入されたヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するベクターを提供する。該ベクターはウイルスベクターでありうる。更に該ウイルスベクターは二本鎖ＤＮＡウイルスベクターでありうる。一態様では、上記核酸分子はＲＮＡである。他の態様では、該核酸分子はＤＮＡである。更なる態様では、該ＤＮＡ分子はゲノムである。更なる態様では、該ＤＮＡ分子はｃＤＮＡである。更に、グルタミルシステインシンセターゼをコードする該核酸分子は実質的に図６に示された（SEQ．ID NO:3）のと同様の配列である。加えて本発明は、レトロウイルスベクターであって、その複製に必須でないベクターの領域内のある部位に挿入されたヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクターを提供する。一つの態様では、本発明は、二重鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターを含有するプラスミドであって、該ベクターがその複製に必須でないベクターの領域内のある部位に挿入されたヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドを提供する。加えて本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはグルタミルシステインシンセターゼウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを含むプラスミドを提供する。一つの態様では、該プラスミドは、pLAldo-SN（ATCC AccessionNo．6 9238）と称される。該プラスミドpLAldo-SNは、E．coli HB101に導入され、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従ってAmerican TypeCulture Collection （ATCC），12301 ParklawnDrive，Rockville，Mary land 20852，USAに１９９３年２月１０日に寄託された。pLAldo-SNを含有するE ．coli HB101には、ATCC Accession No．69238が与えられている。他の態様では、該プラスミドはpLAldoXと称される。加えて本発明は、pLGCS-X（ATCC Accession No．）と称されるプラスミドを提供する。該プラスミドpLGCS-Xは、E．coli DH5αに導入され、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従ってAmericanType Cultur e Collection （ATCC），12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852 ，USAに１９９４年３月２４日に寄託された。本発明はまた、哺乳類レトロウイルス産生細胞であって、その複製に必須でないベクターの領域内のある部位に挿入されたヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを有する二本鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターを含有する産生細胞を提供する。一つの態様では、pAldo-SNはPA317細胞に導入され、形成された産生細胞は、p LAldo-SN PA317c1.6と称される。この細胞系pLAldo-SN PA317c1.6は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection （ATCC），12301 Parklawn Drive，Rockville， Maryland20852，USAに１９９３年２月１０日に寄託された。pLAldo-SNを含有する該PA317細胞には、ATCC Accession No．CRL 11265が与えられている。本発明はまた、二本鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターを含有するヒト細胞であって、該ベクター、即ちプラスミドpLAldo-SN又はプラスミドpLAldoが、その複製に必須でないベクターの領域内のある部位に挿入されたヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを含有するヒト細胞を提供する。一つの態様では、該ヒト細胞はヒト造血細胞である。他の態様では、該ヒト細胞は骨髄細胞である。加えて本発明は、プラスミド及び適切な宿主を含む細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を提供する。該宿主ベクター系は、細菌細胞、昆虫細胞、ウイルス細胞又は哺乳類細胞である。該プラスミドは、先に議論したようなpLALdo-SN又はpLAldoでありうる。核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡでありうる。更に、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は実質的に図４（SEQ ID NO: 1）に示されたのと同様な配列を有しうる。更に本発明は、プラスミド及び適切な宿主を含むグルタミルシステインシンセターゼの生物活性を有するポリペプチドのための宿主ベクター系を提供する。加えて本発明は、哺乳類細胞に選択マーカーを導入するための方法であって、ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を該細胞に形質移入することを具備した方法を提供する。該核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡでありうる。該核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡでありうる。更にヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子は、実質的に図６（SEQ ID NO: 3）に示したのと同様の配列を有しうる。本発明は患者のシクロホスファミドの毒性効果を減少する方法であって、患者の造血細胞を、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を運ぶ造血細胞で置き換え、これによって患者のシクロホスファミドの毒性効果を減少することを具備した方法を提供する。ここで使用されるシクロホスファミドは、シクロホスファミド、又はシクロホスファミドと同様の機構又は作用形態で癌の化学療法剤として効果的なその誘導体若しくは同族体である。このような誘導体の一例は、マホスファミドである。細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Aldhl）を運ぶ造血細胞を産生する一つの方法は、ベクターの複製に必須でないベクターの領域内のある部位に挿入されたヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを含有した二本鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターを造血細胞に導入することである。Al dhl遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターは、パッケージング細胞に導入され、ウイルス産生細胞系を生じさせうる。次に、生じたウイルスは造血細胞を感染するために使用しうる。同業者に周知の、該ALDHI遺伝子を導入するための他の方法は、この発明に含まれる。このような方法の一つには、電気穿孔法があり、そのほかには、リン酸カルシウム沈殿法、アデノ随伴ウイルスのような他のウイルスベクター系、脂肪導入（lipofection）及び微量注射法が本発明に従って使用しうるが、これらに限定されない。本発明は更に、哺乳類細胞に選択マーカーを導入するための方法であって、該細胞にヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを形質移入することを具備した方法を提供する。加えて本発明は、関心のある蛋白質を発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ）該細胞に、関心のある蛋白質をコードするＤＮＡ及びヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを含有したＤＮＡ分子を導入し；ｂ）得られた形質移入細胞を培養し；ｃ）ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞を選択し、これによって関心のあるタンパク質を発現する細胞を得ることを具備した方法を提供する。一つの態様では、上記方法のステップａ）のＤＮＡ分子はレトロウイルスベクターの一部である。加えて本発明は、関心のあるタンパク質を発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ）該細胞に、関心のあるタンパク質をコードする核酸分子及びヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有する核酸分子を導入すること；ｂ）得られた形質移入細胞を培養すること；ｃ）ヒトグルタミルシステインシンセターゼを発現する細胞を選択し、これによって関心のあるタンパク質を発現する細胞を得ることを具備した方法を提供する。該核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子でありうる。該核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＣＮＡでありうる。更に、ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子は、実質的に図６（SEQ ID NO: 3 ）に示されたのと同様の配列を有しうる。加えて本発明は、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を提供する。該単離された哺乳類核酸分子は、実質的に図４（SEQ ID NO: 1）に示されたのと同様な配列を有しうる。該単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡでありうる。更に該単離された核酸分子は、ヒトから誘導されうる。加えて本発明は、グルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を提供する。該単離された哺乳類核酸分子は、実質的に図４（SE Q ID NO: 1）に示されのと同様の配列を有しうる。該単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡでありうる。更に該単離された核酸分子は、ヒトから誘導されうる。更に本発明は、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はグルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子の核酸分子の配列と特異的にハイブリッド化しうる少なくとも１５の核酸からなる核酸分子を提供する。該核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡでありうる。産生されたこの核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れかである。ここで使用される「特異的にハイブリッド化される」という語旬は、核酸配列自身と相補的な核酸配列を認識し、相補的塩基対間の水素結合を通して二重らせん断片を形成する核酸分子の能力を意味する。核酸プローブ技術は、このようなプローブが、長さを大きく変化させうること、及び放射性同位体若しくは蛍光色素のような検出ラベルで標識され、プローブの検出を促進しうることを容易に認識しうる当業者にとって周知である。ＤＮＡプローブ分子は、当業者に周知の方法を用いて、プラスミド若しくはバクテリオファージのような適切なベクターへアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ分子を挿入し、次いで適切な細菌性宿主細胞を形質転換し、該形質転換された細菌性宿主細胞において複製させ、ＤＮＡプローブを回収することによって製造されうる。別の方法としては、プローブはＤＮＡ合成機によって化学的に生成されうる。加えて本発明は、細胞中におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出する方法であって、該細胞から全ｍＲＮＡを得、そのように得られたｍＲＮＡを、ハイブリッド化する条件下で細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された哺乳類核酸分子よりなる標識された核酸分子と接触させ、該分子にハイブリッド化されたｍＲＮＡの存在を検出し、これによって細胞中での細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出することを具備した方法を提供する。加えて本発明は、哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドの生産を可能にする適切な条件下で宿主ベクター系の宿主細胞を増殖し、そのように産生されたポリペプチドを回収することを具備した方法を提供する。加えて本発明は、細胞のグルタミルシステインシンセターゼの発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得、そのようにして得られた該ｍＲＮＡを、グルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子よりなる標識された核酸分子とハイブリッド化する条件下で接触させ、該分子とハイブリッド化されたｍＲＮＡの存在を測定し、これによって細胞中のグルタミルシステインシンセターゼの発現を検出することを具備した方法を提供する。更に本発明は、哺乳類グルタミルシステインシンセターゼの生物活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で宿主ベクター系の宿主細胞を増殖させ、このようにして産生されたポリペプチドを回収することを具備した方法を提供する。多数の哺乳類細胞を宿主細胞として使用しうる。宿主細胞には、マウス繊維芽細胞NIH 3T3、CHO細胞、HeLa綿胞、Ltk細胞、Cos細胞等が含まれるがこれらに限定されたない。先に説明したような発現プラスミドは、リン酸カルシウム沈殿法、電子穿孔法のような当業者に周知の方法によって哺乳類細胞に形質移入されるのに使用される。また、さもなければ哺乳類アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、例えば微量注射法によって哺乳類細胞に導入され、哺乳類アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又はプラスミドを含有した哺乳類細胞を得ることができる。加えて本発明は、アミノ酸分子である細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼに対する抗体を提供する。該アミノ酸配列は実質的に図５（SEQ ID NO: 2）に示されたのと同様でありうる。該抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体でありうる。これらのペプチドに対するポリクローナル抗体は、選択されたペプチドを用いて動物を免疫することによって作製されうる。モノクローナル抗体は、免疫された動物から得られる抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合し、生じた所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を選択することによるハイブリドーマ法を用いて作製することができる。他の方法として、モノクローナル抗体は、当業者に公知のin vitro技術によって作製されうる。これらの抗体は、生きている動物、ヒト、又は動物若しくはヒトから単離された生物学的組織若しくは液体中の哺乳類アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出するのに有効である。加えて本発明はアミノ酸分子であるグルタミルシステインシンセターゼに対する抗体を提供する。該アミノ酸配列は実質的に図７（SEQ ID NO: 4）に示されたのと同様でありうる。該抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体でありうる。加えて本発明は、生物学的サンプル中の哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの量を測定するための免疫測定法であって、ａ）該生物学的サンプルを少なくとも１種の抗体、モノクローナル若しくはポリクローナルの何れかと接触させ、前記抗体と細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの複合体を形成させ、ｂ）前記生物学的サンプル中の細胞質ゾルデヒドロゲナーゼの量を前記複合体の量を測定することによって測定することを具備した測定法を提供する。加えて本発明は、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を含有する遺伝子導入非ヒト型哺乳類を提供する。加えて本発明は、遺伝子導入非ヒト型哺乳類であって、該哺乳類のゲノムが、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡと相補的なアンチセンスＤＮＡを具備し、該アンチセンスＤＮＡが細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるような位置に配置され、該アンチセンスｍＲＮＡが哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡにハイブリッド化され、これによってその翻訳が減少されることになるものを提供する。更に、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された核酸分子は、実質的に図４（SEQ ID NO: 1）に示されたのと同様の配列を有しうる。加えて本発明は、生物学的サンプル中の哺乳類グルタミルシステインシンセターゼの量を測定するための免疫測定法であって、ａ）該生物学的サンプルを、少なくとも１種の抗体、モノクローナル若しくはポリクローナルの何れかと接触させ、前記抗体とグルタミルシステインシンセターゼの複合体を形成させ、ｂ）前記生物学的サンプル中のグルタミルシステインシンセターゼの量を、前記複合体の量を測定することによって測定することを具備した免疫測定法を提供する。更に本発明は、グルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子を含有する、遺伝子導入非ヒト型哺乳類を提供する。加えて本発明は、遺伝子導入非ヒト型哺乳類であって、該哺乳類のゲノムが、グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡと相補的なアンチセンスＤＮＡを具備し、該アンチセンスＤＮＡがグルタミルシステインシンセターゼをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるような位置に配置され、該アンチセンスｍＲＮＡが哺乳類グルタミルシステインシンセターゼをコードするｍＲＮＡにハイブリッド化され、これによってその翻訳が減少されることになるものを提供する。更にヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された核酸分子は、実質的に図６（SEQ ID NO: 3）に示されたのと同様の配列を有しうる。本発明の一の目的は、以下のようである：即ち、種々の人の癌に広範に使用され、非常に効果的な治療様相を呈する特徴的な抗ガン剤での化学療法である。しかし、ほとんどの化学療法は、それらの効き目を著しく制限し、それらを使用する場合にリスクを生じさせる副作用を有する。特に、化学療法で誘導される血球減少、即ち白血球及び血小板の産生を減少させる通常の造血の抑制（骨髄抑制（myelosuppres-sion））は、癌治療の羅患率、死亡率及びアンダードーズの主要因子である。化学療法で誘導される血球減少を除去する能力によって導かれることは、癌の化学療法のリスクが減少し、特に高い治癒率に導く高投与量での治療が可能となることであると考えられる。本発明は、広く用いられる化学療法剤、シクロホスファミド（ＣＰ）及びその類縁体によって誘導される血球減少の問題を解決することを目的とする。ＣＰは広範なヒト腫瘍に顕著な活性を有する抗ガン剤である。その活性は、急勾配の用量反応関係を持った投与量依存性であり、その用量制限毒性（dose -limiting t oxicity）は骨髄抑制である。ＣＰで誘導される血球減少を治療するために現在用いられ得る戦略は、間接的であり、主に骨髄の再生を刺激しうる特異的な成長因子を用いることによって、抑制された造血の回復を促進させることに基づいている。本提案発明は、薬剤の毒性効果に耐性の造血細胞を供給することによってシクロホスファミドで誘導される血球減少を直接に回避することを目的とする。本発明の一つの戦略は、遺伝子のタンパク生成物が、ＣＰを非毒性で不活性な化合物に代謝しうる遺伝子を導入し、発現することによって、シクロホスファミド（ＣＰ）及びその類縁体に耐性の造血細胞を作製することである。数系統の研究によって、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Aldh）がＣＰの代謝及び耐性に関与していることが示唆された。即ち、該研究は、ｉ）ＣＰの細胞毒性代謝物が、Aldhによって不活性化されうるアルデヒド含有中間体を通して生成される（Struck et al．，1975；Co lvin et al．，1976；Cox et al．，1975；Hill et al．，1972)；ii）Aldh活性のレベルと、種々の細胞系のＣＰ毒性に対抗する能力との間で繰り返し相関が観測される（Cox et al．，1975；Hilton，1984；Lin et al．，1988)；iii）Aldh 活性の阻害がＣＰ毒性の感度を増加させる（Sladek and Land-kamer，1985； Ko hn and Sladek，1987；Sahovic etal．，1988）というものである。加えて、ほとんどの幼若造血細胞は、Aldhを発現するが、この活性は、ＣＰに対する幼若造血細胞の感度と相関して、白血球、血小板及び赤血球を含めた造血細胞の機能的に成熟した子孫で徐々にダウンレギュレートされることが示されている（Kastan et al．，1990）。従って、造血前駆体におけるAldhlの安定な発現によって、造血前駆体及びＣＰに耐性のこれらの子孫が作られる。これらの観察を基にして、ヒトAldh-1遺伝子を運び、発現しうるレトロウイルスベクターがデザインされた。レトロウイルスベクターは、化学療法後の自家骨移植によって骨髄の再増殖に利用される（Gianni et al．，1989）ヒト造血前駆体に遺伝子を形質導入しうる（Bregni et al．， 1992）。本発明の一つの目的は、抗ガン剤であるシクロホスフアミドに耐性を付与できるレトロウイルスベクターを構築することである。これは、シクロホスファミドとその抗癌性類似体に耐性を付与することが示されるヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を用いることによってなされる。ヒトAldhlに対する完全な長さのｃＤＮＡが今回単離され、これが、第一のベクターを構築するために使用された（実験の詳細Ｉ参照）。該ベクターは、ヒトＣＤ３４⁺細胞を含有する種々の標的細胞に特異的な薬物耐性表現型をin vitro（図４、SEQ ID NO: 1）で形質導入しうることが示される。化学療法剤には以下のものが含まれるが、これに限定されない。アルキル化剤、即ちナイトロジェンマスタード、エチレンイミン及びメチルエメラミン（meth ylemelamines）；アルキルスルホネート、ニトロソウレア、並びにトリアゼンである。更に化学療法剤には、抗代謝剤、即ち葉酸アナローグ、ピリミジンアナローグ、プリンアナローグ及び関連阻害剤が含まれる。更に化学療法剤には、天然物、即ちビンカアルカロイド、エピポドフィルロトキシン、抗生物質、酵素、生物学的応答緩和剤（Biological Response Modifier s）が含まれる。更に、化学療法剤には、多方面に渡る薬剤、即ち白金配位錯体、アンチラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、及び副腎皮質抑制剤が含まれる。最後に、化学療法剤には、ホルモン及び拮抗剤、即ち副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、及びゴナドトロピン放出ホルモンアナローグが含まれる。抗癌治療プロトコルにおけるその使用に加えて、ALDH遺伝子が、選択剤としてＣＰを用いたin vivo及びin vitroの両方で形質導入された細胞を選択するための一般な選択マーカーとして使用しうることが多くの観測から示唆される：該多くの観測とは、ｉ）ＣＰは、in vitroにおいて広範な真核細胞で顕著な細胞毒性活性を示す；ii）アルキル化剤に対する薬物耐性の発現が相対的に希であり、特にin vitroでは遅く発生する；iii）ＣＰは、短い曝露の後感受性細胞を殺し、この影響は非常に短い時間内で明らかになることである。従って、Aldh遺伝子を運ぶレトロウイルスベクター及び発現される第二の関連遺伝子は、in vitroで形質導入された細胞の選択に使用され、更にin vivoにおける種々の組織標的からの形質導入細胞の選択に使用されうる。この後者の適用は、形質導入された細胞の強力で連続した選択が必要な場合に、種々の遺伝子治療プロトコルに関連して有用であると思われる。ＣＰが既に人に定評のある薬剤であるという事実は、この戦略が更に有利であることを示している。 Aldhl遺伝子は、優性の選択マーカーとして提供され、in vitro及びin vivoの両方で関心のある第二の遺伝子で形質転換された細胞の選択を可能にする。遺伝子移植実験において選択マーカー遺伝子の必要性は、形質導入された遺伝子の迅速な機能の不活性化に導く通常の低い移植効果及び高頻度の突然変異及び再配列から生じる。従って、選択マーカー遺伝子は、関心のある遺伝子を取り込み、機能的な形態で所定の期間それを発現しうる通常では低い割合の細胞を拡張するための手段を提供する。重要で且つ増大する多数の異なった提案によって明確に示されるように、標的細胞の範囲をできる限り広げるように選択システムを開発することは、遺伝子移植研究の中心的な目標である。 Aldhl遺伝子は、シクロホスファミド感受性細胞に、関心のある非関連で非選択的な遺伝子と共に形質導入された後、非常に貴重な優性の選択マーカーを表すことを約束する。ＡＤＡ不全又はβ−地中海貧血（β−thalassemia）のような遺伝病を癒すためには、問題の欠損遺伝子（即ち、調節配列（regulatory seque nces）を持ち若しくは持たないＡＤＡ若しくはβ−グロブリン遺伝子）で形質導入されうる少量の造血幹細胞を優位にin vivoで拡大させるための戦略を開発することが不可欠である。実際に、in vitroの操作実験で使用された少量の回収幹細胞の仮説的な１００％の形質導入効果さえも、宿主骨髄中で変化せずに、常在性の幹細胞の全プールのマイナーな画分に現れていた。電離放射線及び／又は髄切除薬（myeloablative drugs）で受容者の骨髄を破壊することによって、形質導入された細胞の植え付けを有利にすることは、ＡＤＡ不全及びβ−地中海貧血のような非新生物性疾患にはほとんど受け入れられない。シクロホスファミドは非新生物性疾患（即ち自己免疫疾患）にも広く使用されるアルキル化剤であり、その標準的な投与量及びスケジュールに従った使用は安全であり、主要な急性及び慢性の毒性が全くない。ＡＤＡ及びＡＬＤＨ遺伝子の両方を含有するベクターで形質導入された骨髄細胞を自家移植片として移植された患者に対する多数の経路でのその短期間の投与は、感染細胞に選択的な有利さを付与し、これらの優位なin vivoでの拡張が可能になると期待される。同様の原則は、標的細胞がシクロホスファミド感受性である遺伝子治療の別のモデル（即ち、Ｔ−リンパ球、癌細胞等）に適用される（総説としては、W.F． Anderson，1992参照）。 ALdh1遺伝子は、ヒトグルタミルシステインシンセターゼ接着物（glue）を導入するための選択マーカーとして使用され得、シスプラチン、メルファランのような抗癌性アルキル化剤に対する耐性を付与しうる細胞を生じさせる。ヒトガンマーグルタミルシステインシンセターゼ遺伝子（γ−ＧＣＳ）の発現は、in viv oで種々の主要細胞系におけるアルキル化耐性の獲得と相関関係を示す。Aldh遺伝子は、細胞にγ−ＧＣＳを導入することを促進する選択マーカーとして使用しうる。他の例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染への耐性を付与することができる細胞を生じさせることである。ＨＩＶ感染をウイルスのレベルで妨害することができる優性の負の生成物又はアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、選択マーカーとしてAldhlを用いてＣＤ３４⁺細胞に導入されうる。これらのＤＮＡ配列の導入は、in vivoでのＨＩＶ−耐性Ｔ細胞区分を構成するであろう。選択マーカーとしてAldhl遺伝子を使用する一つの方法には、Aldhl遺伝子及び少なくとも一種の関心のある遺伝子をレトロウイルスベクターへ挿入することが含まれる。Aldhl遺伝子及び関心のある遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターは、パッケージ細胞に導入され、ウイルス産生細胞系を生成する。次いで、生成されたウイルスを用いて細胞を感染させる。当分野で公知の、細胞に選択マーカーを導入する他の方法は、本発明に含まれる。このような方法の一つは、電気穿孔法であり、他のものとしてはリン酸カルシウム沈殿法、アデノ随伴ウイルス系のような他のウイルスベクター系、脂肪導入（lipofection）及び微量注射法が本発明に従って使用しうるが、これらに限定されない。まとめとして、Aldhl遺伝子を運ぶレトロウイルスベクタ−は、ｉ）抗癌治療の管理における高投与量ＣＰでの治療を可能にする造血細胞及びこれらの後代にＣＰ耐性を付与するため； ii） in vitro 又はin vivoでレトロウイルス的に形質導入された細胞を選択するための一般的なマーカーとしてＣＰ−耐性を使用するために使用される。本発明は、以下の実験の詳細によってよりよく理解されるであろう。しかし、当業者であれば、議論された特徴的な方法及び結果は、これ以後の請求の範囲でより完全に開示される本発明の単なる例示にすぎないことを容易に認識するであろう。実験の詳細Ｉ．アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターの構築Ａ．pLAldo-SNプラスミドの構築（図１）１）ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Aldhl）の完全な長さのｃＤＮＡのクローニング Clonentechから得たヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（HL1115A）を、L.C.Hsu （Hsu，L.，et al.，1985）によって快く供与された、部分的ｃＤＮＡプローブでスクリーニングした。Aldhlと命名されたこのプローブは、１０２０ｂｐコード配列及び５４０ｂｐ３’フランキング配列に対応する。部分的ｃＤＮＡクローン、pGAldh1-Aは、ＡＴＧまで４６ｂｐを欠く１４７１ｂｐのクローニング配列及び２７２ｂｐの３’フランキングを有して単離された。残りの５’配列を得るために、該ゲノム配列でデザインされた５’末端プライマー（Hsu，et al.，1989）及び利用可能な配列を基にした３’末端プライマーを用いてゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。このプライマーは、クローニングの目的のためのXba I及びBal II部位を含む。Xba I及びBal II消化の後ＰＣＲ生成物は、pGAldh1-Aにサブクローニングされ、１５１８ｂｐのコード配列からなる完全な長さのｃＤＮＡ、pGA1doを含有するプラスミドになる。ここで、PGAI DHI-Aに対する天然のBal II部位の５’及びゲノムＰＣＲ生成物に対する３’は、読み枠を保持するために使用される。２）ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を運ぶレトロウイルスベクタープラスミドの構築 pGAIdoのEco RI及びSal Ｉ消化で誘導され、３’付着末端（3' recessive en d）を充填されたヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、即ち完全な長さのｃＤＮＡAldo（図６、SEQ ID NO: 1）を、D.Miller （Miller，D.，and Rosma n，G.，1989）によって快よく提供された両栄養性レトロウイルスベクターであるpLXSNのHpa Iにサブクローンし、pLAldo-SNを生成させた。Ｂ．pLAldoXプラスミドの構築（図２） pGAldoのEco RI及びSal Ｉ消化から誘導され、３’付着末端（３’recessive end）を充填されたヒト細胞質ゾルデヒドロゲナーゼ、即ち完全な長さのｃＤＮＡ、Aldoを、Dr.Miller（Miller，D.，and Rosman，G.，1989）から得られたネオマイシン遺伝子を含有するpLNSXベクターにサブクローニングした。誘導されたプラスミドは、６，１３７塩基対を含有する。次に、消化されたベクターは充填され、更にStulで消化され、仔ウシ腸管ホスファターゼ（carf-intestinal ph osphatase）（ＣＩＰ）で処理され、ＬＭＰ精製された。次に、この消化されたベクターは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ−１遺伝子を含有する予め精製された pAldoフラグメントで結紮された。アルデヒドデヒドロゲナーゼ−１遺伝子はベクターの５’ＴＬＲの下流に位置し、このように形成されたプラスミドはpLAldoXと呼ばれ、６，４９５の塩基対の長さである。Ｃ．レトロウイルスの発生 Aldoを運ぶ両栄養性レトロウイルスベクターを発生させるために、プラスミド pLAldo-SNがΨ２エコトロピツクパッケージング細胞系（Mulligan，R.（Mann，e t al.，（1983） Cell 33:153- 159）から得られる）にＣａＰＯ₄沈殿法によって形質移入された。４８時間後、エコトロピックAldo-SNウイルスを含有した形質移入された細胞系の上清を、両栄養性パッケージング細胞系PA317を感染させるために使用した（ATCC CRL 9078から得られた）（Miller，D.，and Buttimor ｅ，C.，（1986）Mol. Cell. Biol.6: 2895）。感染細胞は、ネオマイシンを含有する培地で選別され、３０コロニーを更にウイルス力価に対する特性及びAldh 1ＲＮＡ発現に対して単離した。pLAldo-SN PA317cl．６、２２及び３は最も高い力価とAldh1ＲＮＡ発現を有することが示された。上記実験は、プラスミド、pLAldo-SNを用いて行われた。レトロウイルスもまた、プラスミドpLAldoXを用いて同様に生成されうる。 II. pLAldo-SN形質導入細胞におけるマホスファミド耐性の証明１）Ｋ５６２細胞の感染 pLAIdo-SN PA317 cl.6細胞から得たウイルスを含有した上清を、ヒト多能性白血性細胞系であるＫ５６２細胞を感染するために使用した。野生型（ｃｔｒ）及びpLAldo-SN感染Ｋ５６２細胞を、１×１０⁶細胞／mlで、３７℃で３０分間異なる濃度のマホスファミド（MPA）にさらし、次いで３〜５×１０³細胞／プレートで、３５mmのプレートにおいて、０．３％寒天培地中でプレート化した。３７℃ 及び５％ＣＯ２で１２日間培養した後に、ＭＰＡ耐性を、ＭＰＡ選別細胞ｖｓ非選別細胞からのコロニー増殖のパーセンテージとして記録した。図３のグラフは、３種類の異なる実験の平均値±標準偏差を表す。この結果は、pLAdIdo-SNが形質導入されたＫ５６２細胞が、２０から８０μＭの範囲の濃度でＭＰＡに増加した耐性を示すことを表している。２）正常ヒト造血始原細胞の感染白血球搬出法、次いでフィコールーハイパック遠心法によって得られるヒト造血始原細胞を、アイコーブ修飾ダルベッコ培地（Iscove Modified Dulbecco Med ium）（ＩＭＤＭ）＋２０％ＦＣＳ＋ＩＬ３＋ＩＬ６中で２日間、前培養し、次いでPA317-pLAldo-SNクローンからの異なった上清で感染させた。次に細胞を１ ×１０⁶細胞／mlで３７℃で３０分間、５μＭのマホスファミド（ＭＰＡ）にさらし、ＩＭＤＭ＋２０％ＦＣＳ＋５６３７ＣＭ１０％（膀胱癌制御培地（bladde r carcinoma conditioned media））＋ＩＬ３＋ＩＬ６＋ＧＭ−ＣＳＦ＋アイドロコルチゾン（idro- cortisone）１０^-6Ｍ中において、１００細胞／ウェルで、９６マルチウェルプレートの６０ウェルにプレート化した。ＭＰＡ耐性は、３７℃及び５％ＣＯ₂で１２日間培養した後に増殖した陽性細胞の数として記録した。以下の表１に示されたこの結果は、３種の異なったLAldo-SNウイルスコロニー（これは、対応するPA317-pLAldo-SN細胞コロニーから生じた）がＭＰＡ耐性を付与されることを示しており、該耐性はＭＰＡ処理後に成長しうる細胞の数として点数化されている。 III. in vivoにおける選択マーカーとしてのヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の使用ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びヒトグルコセレブロシダーゼ（ GCase）遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターの構築 Aldo-GCaseレトロウイルスベクターは、ネオ選択マーカーを除去し、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列を挿入することによってNTGプラスミド（Correll，1989）から生成されうる。ヒト造血始原細胞は、ｒ−ｈｕ−ＩＬ３で処理（５ｇ／kg／日で７日間の連続的なiv誘導）され、次いでｒｈＧＭ−ＣＳＦ又はｒｈＧ−ＣＳＦの何れかで３〜５日更に処理（両方とも５ｇ／kg／日）されたゴーシェ病患者からの白血球搬出によって得ることができる。１日の白血球搬出は、３×１０⁹のＣＤ３４⁺細胞（ Siena et al.， 1991）が達成されるまで繰り返されうる。各々の白血球搬出からの軽い部分の細胞をフィコールーハイパーク（Ficol- H ypaque）遠心によって得、高力価のAldo-GCaseベクターを含まないヘルパーウイルスを産生するPA317から得られる臨床グレードの上清で感染した。引き続いて感染では、各々の白血球搬出から得られたアリコートを３７℃で３０分間５μＭのＭＰＡにさらし、上述のようにプレート化した。１２日後に、形質導入の影響を評価するためにＭＰＡ耐性を点数化した。感染細胞のバルクを遠心によって洗浄し、凍結せずに直ちに再注入した。シクロホスファミドを用いるin vivo処理は、わずか１２日後で開始し、次にＭＰＡ耐性クローンの割合を評価した。感染の効果が３０％の場合のみ（Bregni，et a l.，1992）、患者をシクロホスフアミドで治療しうる。２種の異なった選別プロトコルを引き続き試験した。第一のプロトコルに従えば、化学療法と組み合わせて許容される基準のスケジュール通り、シクロホスファミドを連続１４日間、一日当たり１００ｍｇ／ｍ²で与えた（Canellos etal.，1976）。治療の前に、骨髄吸引物をAl do-GCase感染及びＭＰＡ耐性クローンの基準頻度を決定するために得た。骨髄吸引を治療の最後で繰り返し、結果を基準データと比較した。形質移入細胞の割合に関して、変化が観測されないか又は僅かであり、Aldo-GCase遺伝子を運ぶ細胞が同定されたならば、高投与量のシクロホスファミドを用いた別のプロトコルを試験しうる。５から７ｇ／ｍ²のシクロホスフアミドを注入し、次いでreGM-CSF 又はrhG-CFSを投与した（Gianni et al.，1990）。注入は、シクロホスファミドの濃度が約５μＭに上昇するのを防ぐために上記よりも長く続けうる（１２時間に変えて２４時間）。ＭＰＡ陽性骨髄コロニーを、シクロホスファミド処理の前後でＰＣＲ及びＭＰＡ体耐性によって評価した。IV. グルタミルシステインシンセターゼ遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターの構築Ａ．pLGCS-Xプラスミドの構築（図８）完全な長さのγ−ＧＣＳｃＤＮＡを得るために、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Clonentech，HL 1123）を、R.T. Mulcahyから得た部分γ−ＧＣＳｃＤＮＡプローブ（pst Iフラグメント、図２に示された配列中のヌクレオチド１１３７〜１８９７）でスクリーニングした。２種のオーバーラップしたｃＤＮＡクローンをスパンした２９０４ｂｐ．のｃＤＮＡ配列と共に挿入した物を内部HindIII部位（１０４７の位置）を用いて結紮し、プラスミドｐＢＫ２−３ＧＧＣＳ（図８）を生じさせた。次いで、このプラスミドをSac Iで消化し、３’付着末端をＴ４ポリメラーゼを用いて充填し、挿入物を低融点（図３中のＬＭＰ）アガロースで分取用電気泳動で単離した。次に、フラグメントは、Ｔ４リガーゼを用いて（BcII消化、Klenowフラグメントポリメラーゼによる５’付着末端充填（５’-protruding fill-in）、S tuI消化、及び仔ウシ腸管ホスファターゼでの脱ホスホリル化によって得られた）pLXベクターの平滑末端に結紮され、ｐＬＧＣＳ−Ｘベクターを生じる。参照文献シーケンスリスト（１）一般情報：（ｉ）出願人：ニューヨーク市コロンビア大学の理事（ii）発明の名称：アルデヒドデヒドロゲナーゼを形質導入しうるレトロウイルスベクター及び前記ベクターの使用（iii）配列の数４（iv）連絡先住所：（Ａ）宛名人：クーパー＆ダンハム（Ｂ）ストリート：３０ロックフェラープラザ（Ｃ）市：ニューヨーク（Ｄ）州：ニューヨーク（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号：10112 （ｖ）コンピュータ読み込み可能形式：（Ａ）メディアタイブ：フロッビーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：パテントインリリース＃1.24 （vi）本出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：１９９４年４月１日（vii）従来出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／０４１，７２２（Ｂ）出願日：１９９３年４月１日（viii）代理人／エージェント情報：（Ａ）名称：ホワイト，ジョーンＰ．（Ｂ）登録番号：２８，６７８（Ｃ）参照／ドケット番号：４２９９０−Ａ−ＰＣＴ（ix）テレコミュニケーション情報：（Ａ）電話：２１２−９７７−９５５０（Ｂ）テレファックス：２１２−６６４−０５２５（２）SEQ ID NO: 1の情報：（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：１８４２塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖状：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（iii）仮定：Ｎ（iv）アンチセンス：Ｎ（ｖ）フラグメントタイプ：Ｎ−末端（ix）特徴：（Ａ）名前／鍵：ＣＤＳ（Ｂ）位置：２．．１５６８（xi）配列表：SEQ ID NO: 1：（２）SEQ ID NO: 2の情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：５２２アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子タイプ：タンパク（xi）配列表：SEQ ID NO: 2：（２）SEQ ID NO: 3の情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：２９０４塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖状：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（iii）仮定：Ｎ（iv）アンチセンス：Ｎ（ｖ）フラグメントタイプ：Ｎ−末端（ix）特徴：（Ａ）名前／鍵：ＣＤＳ（Ｂ）位置：３６３．．２２７４（Ｄ）他の情報：（xi）配列表：SEQ ID NO: 3：（２）SEQ ID NO: 4の情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：６３７アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子タイプ：タンパク（xi）配列表：SEQ ID NO: 4：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ０７Ｋ 16/40 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 9/02 9359−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/573 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＧＡ 9454−4Ｃ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＰ 9284−4ＣＧ０１Ｎ 33/536 Ｚ 8310−2Ｊ (72)発明者ジアンニ、アレスサンドロ・マッシモイタリア国、20135 ミラノ、ビア・エル・ムラトリ 29

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有するベクター。２．請求の範囲第１項に記載のベクターであって、該ベクターが二重鎖ＤＮＡウイルスベクターであるもの。３．請求の範囲第２項に記載の二重鎖ＤＮＡウイルスベクターであって、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子が実質的に図４に示されるのと同じ配列（SEQ ID NO: 1）を有するウイルスベクター。４．ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクター。５．請求の範囲第４項に記載のレトロウイルスベクターであって、該レトロウイルスベクターが二重鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターであるもの。６．請求の範囲第５項に記載の二重鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターであって、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子が、実質的に図４に示されるのと同様の配列（SEQ ID NO: 1）を有するウイルスベクター。７．ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するウイルスベクター。８．請求の範囲第７項に記載のベクターであって、該ベクターが二重鎖ＤＮＡウイルスベクターであるもの。９．請求の範囲第８項に記載の二重鎖ＤＮＡウイルスベクターであって、グルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子が、実質的に図６に示されるのと同様の配列（SEQ ID NO: 3）を有するウイルスベクター。１０．ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するレトロウイルスベクター。１１．請求の範囲第１０項に記載のレトロウイルスベクターであって、該レトロウイルスベクターが二重鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターであるもの。１２．請求の範囲第１１項に記載の二重鎖ＤＮＡレトロウイルスベクターであって、グルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子が、実質的に図６に示されるのと同様の配列（SEQ ID NO: 3）を有するレトロウイルスベクター。１３．ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有するベクター。１４．請求の範囲第４項又は第１０項に記載のレトロウイルスベクターであって、ネズミウイルスが、マロネーネズミ（Moloney murine）白血病ウイルスであるレトロウイルスベクター。１５．請求の範囲第４項又は第１０項に記載のレトロウイルスベクターであって、該ネズミウイルスがマロネーネズミ（Maloney murine）肉腫ウイルスであるレトロウイルス。１６．請求の範囲第４項又は第１０項に記載のレトロウイルスベクターであって、３’長鎖末端繰り返し配列が、マロネーネズミ白血病ウイルスに存在するものに対応し、５’ 長鎖末端繰り返し配列が、マロネーネズミ肉腫ウイルスに存在するものに対応するレトロウイルス。１７．請求の範囲第４項又は第１０項に記載のレトロウイルスベクターを含有するプラスミド。１８． pLAldo-SN（ATCC Accession No. 69238）と称される請求の範囲第１７項に記載のプラスミド。１９． pLAldoと称される請求の範囲第１８項に記載のプラスミド。２０． pLGCS-X（ATCC Accession No. ）と称される請求の範囲第１７項に記載のプラスミド。２１．哺乳類レトロウイルス産生細胞であって、請求の範囲第４項若しくは第１０項に記載のベクター、又は請求の範囲第１８項、第１９項若しくは２０項に記載のプラスミドを含有する細胞。２２． pLAldo-SN PA317．cl．6（ATCC AccessionNo．CRL 11265）と称される請求の範囲第１８項に記載の産生細胞。２３．請求の範囲第１項若しくは第７項に記載のベクター、又は請求の範囲第１８項若しくは第１９項に記載のプラスミドを含有するヒト細胞。２４．請求の範囲第２３項に記載の造血ヒト細胞。２５．請求の範囲第２４項に記載の骨髄細胞。２６．細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチドの産生のための宿主ベクター系であって、請求の範囲第１８項、第１９項又は第２０項に記載のプラスミド及び適切な宿主を包含する宿主ベクター系。２７．請求の範囲第２６項に記載の宿主ベクター系であって、該適切な宿主が細菌細胞、昆虫細胞ウイルス細胞又は哺乳類細胞である宿主ベクター系。２８．患者のシクロホスファミドの毒性効果を減少するための方法であって、患者の造血細胞を、患者中のシクロホスファミドの毒性効果を減少するように請求の範囲第２３項に記載の造血細胞で置き換えることを具備した方法。２９．哺乳類細胞に選択マーカーを導入するための方法であって、該細胞に、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を形質移入することを具備した方法。３０．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、該核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＭＡである方法。３１．請求の範囲第３０項に記載の方法であって、該核酸分子が実質的に図４に示されるのと同様の配列（SEQ IDNO: 1）を有する方法。３２．関心のあるタンパクを発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ．該細胞に、該関心のあるタンパクをコードする核酸分子及びヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含有する核酸分子を導入すること；ｂ．生じた形質移入された細胞を培養すること；及びｃ．関心のあるタンパクを発現する細胞を得るように、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞を選択することを具備した方法。３３．請求の範囲第３２項に記載の方法であって、該核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡである方法。３４．請求の範囲第３２項に記載の方法であって、ヒト細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子が、実質的に図４に示されるのと同様の配列（SEQ IDNO: 1）を有する方法。３５．請求の範囲第３２項に記載の方法であって、該ステップ（ａ）のＤＮＡ分子がレトロウイルスベクターの一部である方法。３６．哺乳類細胞に選択マーカーを導入するための方法であって、該細胞に、ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を形質移入することを具備した方法。３７．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、該核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡである方法。３８．請求の範囲第３７項に記載の方法であって、該核酸分子が、実質的に図６に示されるのと同様の配列（SEQID NO: 3）を有する方法。３９．関心のあるタンパクを発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ．該細胞に、該関心のあるタンパクをコードする核酸分子及びヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子を含有する核酸分子を導入すること；ｂ．生じた形質移入細胞を培養すること；及びｃ．関心のあるタンパクを発現する細胞を得るように、ヒトグルタミルシステインシンセターゼを発現する細胞を選択すること；を具備した方法。４０．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、該核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡである方法。４１．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、該ヒトグルタミルシステインシンセターゼをコードする核酸分子が、実質的に図６に示されるのと同様の配列（SEQ ID NO:3）を有する方法。４２．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、該ステップ（ａ）のＤＮＡ分子がレトロウイルスベクターの一部である方法。４３．細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離された哺乳類核酸分子。４４．請求の範囲第４３項に記載の単離された哺乳類核酸分子であって、該核酸分子が実質的に図４に示されるのと同様の配列（SEQ ID NO: 1）を有する核酸分子。４５．グルタミルシステインシンセターゼをコードする単離された哺乳類核酸分子。４６．請求の範囲第４５項に記載の単離された哺乳類核酸分子であって、該核酸分子が、実質的に図６に示されたのと同様の配列（SEQ ID NO: 3）を有する核酸分子。４７．請求の範囲第４３項又は第４５項に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。４８．請求の範囲第４３項又は第４５項に記載の単離された哺乳類ｃＤＮＡ分子。４９．請求の範囲第４３項又は第４５項に記載の単離された哺乳類ＲＮＡ分子。５０．請求の範囲第４４項又は第４６項に記載の単離された哺乳類核酸分子であって、該核酸分子がヒトから誘導される核酸分子。５１．請求の範囲第４３項又は第４５項の核酸分子の配列と特異的にハイブリッド化しうる少なくとも１５のヌクレオチドよりなる核酸分子。５２．請求の範囲第５１項に記載の少なくとも１５のヌクレオチドよりなる核酸分子であって、該分子がＤＮＡ又はＲＮＡであるもの。５３．細胞中のアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得、そのように得られたｍＲＮＡを、ハイブリッド化する条件下で請求の範囲第４９項の標識された核酸分子と接触し、該分子へハイブリッド化されたｍＲＮＡの存在を測定し、これによって細胞中のアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を検出することを具備した方法。５４．哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、請求の範囲第２６項に記載の宿主ベクター系の宿主細胞を、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で増殖し、そのように産生されたポリペプチドを回収することを具備した方法。５５．細胞中のグルタミルシステインシンセターゼの発現を検出する方法であって、該細胞から全ｍＲＮＡを得、そのように得られたｍＲＮＡを、ハイブリッド化する条件で請求の範囲第４９項に記載の標識された核酸分子と接触し、該分子へハイブリッド化されたｍＲＮＡの存在を測定し、これによって細胞中の細胞質ゾルグルタミルシステインシンセターゼの発現を検出することを具備した方法。５６．哺乳類細胞質ゾルグルタミルシステインシンセターゼの生物活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、請求の範囲第２６項に記載の宿主ベクター系の宿主細胞を、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で増殖させ、そのように産生されたポリペプチドを回収することを具備した方法。５７．アミノ酸分子である細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼに対する抗体。５８．請求の範囲第５７項に記載の抗体であって、該アミノ酸配列が、実質的に図５（SEQ ID NO: 2）に示されたのと同様である抗体。５９．アミノ酸分子であるグルタミルシステインシンセターゼに対する抗体。６０．請求の範囲第５９項に記載の抗体であって、該アミノ酸配列が、実質的に図６（SEQ ID NO: 4）に示されるのと同様である抗体。６１．請求の範囲第５７項又は５９項に記載の抗体であって、該抗体がモノクローナルである抗体。６２．請求の範囲第５７項又は５９項に記載の抗体であって、該抗体がポリクローナルである抗体。６３．生物学的サンプル中の哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの量を測定するための免疫検定法であって、ａ）該生物学的サンプルを請求の範囲第５７項に記載の少なくとも１種の抗体と接触し、前記抗体と該細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼとの複合体を形成させ、ｂ）前記生物学的サンプル中の細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼの量を、前記複合体の量を測定することによって測定するステップを具備した免疫検定法。６４．請求の範囲第４３項又は第４５項に記載の単離された核酸分子を含有する遺伝子導入非ヒト型哺乳類。６５．請求の範囲第６４項に記載の遺伝子導入非ヒト型哺乳類であって、該単離された哺乳類核酸分子が、実質的に図４に示されたのと同様の配列（SEQ ID NO: 1）を有する遺伝子導入非ヒト型哺乳類。６６．遺伝子導入非ヒト型哺乳類であって、該哺乳類のゲノムが、細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡと相補的なアンチセンスＤＮＡを具備し、該アンチセンスＤＮＡが細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるような位置に配置され、該アンチセンスｍＲＮＡが哺乳類細胞質ゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡにハイブリッド化され、これによってその翻訳が減少される遺伝子導入非ヒト哺乳類。６７．生物学的サンプル中の哺乳類グルタミルシステインシンセターゼの量を測定するための免疫検定法であって、ａ）該生物学的サンプルを、請求の範囲第５９項に記載の少なくとも一種の抗体と接触させ、前記抗体と該グルタミルシステインシンセターゼとの複合体を形成させること；及びｂ）前記生物学的サンプル中の細胞質ゾルグルタミルシステインシンセターゼの量を前記複合体の量を測定することによって測定するステップを具備した免疫検定法。