JPH10501140A

JPH10501140A - レトロウィルス遺伝子療法ベクター及びそれに基く治療方法

Info

Publication number: JPH10501140A
Application number: JP8502162A
Authority: JP
Inventors: リビアー，イザベル; ケー．コーエン，ローレンス; ギルド，ブラッド; エフ．レイフィールド，ローリ; ロビンズ，ポール; シー．マリガン，リチャード
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1994-06-02
Filing date: 1995-05-16
Publication date: 1998-02-03
Also published as: WO1995034669A2; AU2637695A; US6544771B1; EP0763122A1; CA2191845A1; WO1995034669A3; AU709477B2

Abstract

(57)【要約】注目の遺伝子のための挿入部位を含み、そして広範囲の種類のトランスフェクトされた細胞型において注目の遺伝子に由来する高レベルのタンパク質を発現することができるレトロウィルスベクターが開示される。また、選択可能マーカーを欠いており、従って、マーカー生成物、たとえば抗生物質の同時発現を伴わないで、種々の疾病状態の処理においてヒト遺伝子療法のためにそれらのレトロウィルスベクターを適切にするレトロウィルスベクターが開示される。それらのレトロウィルスベクターは、特に、一定のパッケージング細胞系への使用のために適切である。

Description

【発明の詳細な説明】レトロウィルス遺伝子療法ベクター及びそれに基く治療方法１．序説本発明は、遺伝子治療ベクター及び方法に向けられ、そして広範囲の哺乳類標的細胞中に対象のいづれかの遺伝子を効果的に伝達することができる新規の種々の組換えレトロウィルスベクターを提供する。本発明の組換えレトロウィルスベクターにより形質導入される細胞は所望の遺伝子生成物を長期間、高いレベルで発現することができる。従って、そのような形質導入された細胞は、一定のタンパク質又は他のポリペプチドの生成を永久的に増大し又は付加することが治療的に所望される広範囲の種類の疾病の処置に有用である。選択可能マーカーを欠いている本発明の好ましいベクターが、記載されており、そしてそれは、マーカー遺伝子生成物、たとえば抗生物質の同時生成が所望されないか又は許容できない疾病の処置における体細胞遺伝子療法のために特に有用である。２．発明の背景哺乳類細胞を遺伝子的に構築するための多くの方法が存在する。多量の種々のポリペプチドを生成する必要性及び細胞における種々の遺伝子欠損を是正する必要性を包含するいくつかの理由のために哺乳類細胞を遺伝子的に構築することに多大の興味が存在する。前記方法は外来性遺伝子の発現の効率、レベル及び全遺伝子構築工程の効率のような要因に関してお互い劇的に異っている。特に有用であることがわかっている哺乳類細胞を遺伝子的に構築する１つの方法は、レトロウィルスベクターによる。レトロウィルスベクター及びそれらの使用は、多くの出版物、たとえばMann，など．、Cell 3 3：153-159(1983)及び Cone and Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 : 6349 -6353(1984)に記載されている。レトロウィルスベクターは、レトロウィルスを遺伝子的に操作することによって生成される。レトロウィルスは RNAウィルスであり；すなわち、そのウィルスゲノムは RNA である。しかしながら、このゲノム RNAは、形質導入された細胞の染色体 DNA中に安定して且つ効果的に組込まれる DNAコピー中に逆転写される。この安定して組込まれた DNAコピーは、プロウィルスとして言及され、そしていづれか他の遺伝子として娘細胞により受け継がれる。図１に示されるように、野生型レトロウィルスゲノム及びプロウィルス DNAは３種の Psi遺伝子、すなわち gag， pol及び env遺伝子を有し、それらは２つの長い末端反復(LTR)配列を端に有する。 ga g 遺伝子は内部構造（ヌクレオカプシド）タンパク質をコードし； pol遺伝子は RNA指図された DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし；そして env遺伝子はウィルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５′及び３′LTR は、ビリオン RNAの転写及びポリアデニル化を促進するように作用する。ゲノムの逆転写（tRNAプライマー結合部位）及び粒子中へのウィルス RNAの効果的なエンキャプシド化(Psi部位)のために必要な配列が５′LTRに隣接する。Mu lligan，R.C.，Experimental Manipulation of Gene Expression，M.Inoue(ed) ，155-173(1983)；Mann，R.，など．、Cell，33：153-159(1983)； Cone，R.D． and R.C.Mulligan，Proceedings of the National Academy of Sciences ，U.S. A.，81：6349-6353(1984)。エンキャプシド化（又は感染性ビリオン中へのレトロウィルス RNAのパッケージング）のために必要な配列がウィルスゲノムに不在である場合、ゲノム RNAのエンキャプシド化を妨げる cis作用性欠損がもたらされる。しかしながら、その得られる変異体は、すべてのビリオンタンパク質の合成をまだ指図することができる。Mulligan及び協同研究者は、それらの Psi配列が欠失されているレトロウィルスゲノム、及び染色体中に安定して組込まれた変異体ゲノムを含む細胞系を記載する。Mulligan，R.C.，Experimental Manipulat ion of Gene Expression ，M.Inouye(ed)，155-173（1983）；Mann，R.，など．、Cell，33：153-159（1983）；Cone，R.D．and R.C.Mulligan，Proceedings of the National Academy of Sciences ，U.S.A.，81：6349-6353(1984)。利用できるレトロウィルスベクター及びそれらの使用に対するさらなる詳細は、特許及び特許出版物、たとえばヨーロッパ特許出願 EPA 0178220、アメリカ特許第 4,4 05,712号、Gilboa，Biotechniques 4：504-512（1986）（Ｎ₂レトロウィルスベクターを記載する）に見出され得る。それらの特許及び出版物の技法は、引用により本明細書に組込まれる。レトロウィルスベクターは、そのレトロウィルスベクターが標的細胞を“感染 ”し、そして標的細胞ゲノム中に組込むその高い効能のために、哺乳類細胞を変性するために特に有用である。さらに、レトロウィルスベクターは、そのベクターが広範囲の種及び組織からの哺乳類細胞を感染することができるレトロウィルスに基づかれているので、ひじょうに有用である。哺乳類細胞のゲノム中に挿入するレトロウィルスベクターの能力が、ヒト及び動物における遺伝子疾患の遺伝子療法への使用のためにそれらを特に有望な候補体にした。遺伝子治療は典型的には、（１）新規の遺伝子材料を患者の細胞にインビボで付加し、又は（２）身体から患者の細胞を除去し、その細胞中に新規の遺伝子材料を付加し、そしてそれらを身体中に再導入すること、すなわちインビトロ遺伝子療法を包含する。レトロウィルスベクターを用いて種々の細胞における遺伝子療法をいかに実施するかについての議論は、たとえば1989年９月19日に発行されたアメリカ特許第 4,868,116号及び1990年12月25日に発行されたアメリカ特許第 4,980,286号（上皮細胞）、1989年８月10日に公開されたWO89／07136( 肝細胞)、1990年７月25日に公開されたEP第 378,576号（線維芽細胞）、及び198 9年７月15日に公開されたWO89／05345 及び1990年６月28日に公開されたWO90／0 6997(内皮細胞)に見出され得、そしてそれらの開示は引用により本明細書に組込まれる。遺伝子療法の種々の技法のために有用であるためには、適切なレトロウィルスベクターは、これまで利用できたことがない特定の特徴を必要とする。“患者” の細胞のゲノム中へのレトロウィルスベクターの組込みのための選択を必要とするそのレトロウィルスベクターを使用することは通常、実施可能ではないので、遺伝子療法における患者の細胞のインビボ遺伝子操作への使用のために前記ベクターのそれらの特定の必要条件のための必要な主要源が存在する。たとえば、典型的なレトロウィルスベクター、たとえばWilliams，など．、Nature 310：476- 480(1984)に記載されるMSV DHFR−NEO は、遺伝子的に変性された細胞を検出するための適切なマーカーとしてネオマイシン耐性を使用する。従って、そのようなネオマイシン耐性レトロウィルスベクターに関しては、患者はインビボ遺伝子療法を通して細胞の遺伝子修復をもたらすために、高レベルのネオマイシンに暴露されることが必要とされるであろう。さらに、インビボ及びインビトロ遺伝子療法においては、ヒト遺伝子体細胞治療を受ける細胞においてマーカー遺伝子の遺伝子生成物を生成することは所望されない。たとえば、サラセミアを治癒するためにヘモグロビン遺伝子置換を受ける血液細胞において高レベルのネオマイシンホスホトランスフェラーゼを生成する治療的理由は存在しない。従って、ゲノム中に効果的に組込み、所望するレベルの対象の遺伝子生成物を発現し、そしてマーカー生成物、たとえば抗体の同時生成又は発現を伴わないで高力価で生成されるレトロウィルスベクターを開発することが所望される造血細胞を包含する疾病のための効果的遺伝子治療を開発するための努力における相当の進行にもかかわらず、多くの実質的な技術的障害が存在する。第１に、ネズミ造血幹細胞中への遺伝子の効果的移行を可能にする種々の形質導入法が開発されて来たが、大きな動物の再構成細胞中への効果的な遺伝子移行を達成することはまだ不可能である。どの程度この問題（たとえば、不十分な力価、宿主範囲）がベクターに関連しているのか、又は適切な標的細胞の増殖及び／又は効果的な移植を得るための最適な条件に関する知識の欠乏の結果に関連しているのかは、現在のところ不明である。第２の主要な技術的障害は、挿入された遺伝子の造血細胞における高レベルの構成的なインビボ発現を得るための適切なシグナルを有するレトロウィルスベクターの開発に関する。多くのグループが形質導入された骨髄細胞により再構成されたマウスにおいて遺伝子の発現を示して来たが、他のものは困難性を経験して来た（10−12）。全体的に、インビボでの遺伝子発現のために重要なベクター企画の特徴に関する少数の一般的な原現が現われて来た。特に、ベクター主鎖、挿入された遺伝子、ウィルス力価、形質導入法における差異のために、異なったベクターの性能を直接的に比較し、そして造血細胞における遺伝子発現をインビボで最とも決定的にもたらすベクター企画の特徴を決定することは不可能であった。さらに、少数の研究が、長期間（たとえば移植受容体の寿命の間）、移行された遺伝子の発現する能力、すなわち造血細胞を包含する疾病のための遺伝子療法の明白に重要な目的を試験して来た。３．発明の要約本発明は、体細胞遺伝子療法に使用され得る新規の種類のレトロウィルスベクターに向けられる。本発明のレトロウィルスベクターは、対象の遺伝子のための挿入部位を含み、そして広範囲の種類のトランスフェクトされた細胞型において所望するレベルのコードされたタンパク質を発現することができる。本発明の１つの観点において、対象のレトロウィルスに由来する５′LTR 及び３′LTR 及び対象の遺伝子のための挿入部位を、操作可能的な組合せで含んで成るレトロウィルスベクターが供給され、そしてここで、前記ベクターにおける g ag ， env又は pol遺伝子の少なくとも１つが不完全又は欠陥性である。前記ベクターは好ましくは、スプライスドナー部位及びスプライス受容体部位を含み、ここで前記スプライス受容体部位は、対象の遺伝子が挿入される部位から上流に位置している。また、前記ベクターは所望には、挿入部位中に挿入されるヌクレオチド配列の転写体が生成されるように機能的に位置する gag転写プロモーターを含み、そしてここで前記転写体は gag５′未翻訳領域を含む。本発明の好ましいベクターは選択可能マーカーを欠いており、従って、マーカー遺伝子生成物、たとえば抗生物質薬物マーカーは同時生成され又は同時発現されないので、ヒト体細胞遺伝子療法においてそれらをより所望のものにする。本発明のベクターに組込まれる対象の遺伝子は、対象のホルモン、酵素、受容体又は薬物を生成するいづれかの遺伝子であり得る。レトロウィルスベクターは、ヒト又は動物体細胞遺伝子療法のために広範囲の種類の細胞型に使用され得る、本明細書に定義されるような、一定のパッケージング細胞と組合して、最とも適切に使用される。本発明の特に好ましいレトロウィルスベクターは、図２ｃ及び３に示されるように“MFG”として本明細書において定義され、そしてプラスミドがそれを含み、そして特に、プラスミド MFGは ATCC NO．68,754の認識特徴を有する。本発明はまた、上記ベクターに類似するが、しかし対象の種々の遺伝子の発現を制御するために非−LTR エンハンサー及びα−グロビン転写プロモーター配列をさらに含んで成るレトロウィルスベクターにも向けられる。本発明のこの観点は特に、サイトメガロウィルスからのエンハンサー配列の使用を提供する。エンハンサー配列が３′LTR から欠失され、従ってゲノム中へのベクターの組込みに基づいて５′LTR の不活性化をもたらすベクターもまた供給される。α−グロビンプロモーター含有ベクターα−SGC が特に供給され、そして特に、図４に示されるもの、及びそれを含むプラスミド及び特に、ATCC NO．68,755の認識特徴を有するプラスミドα−SGCが供給される。４．図面の簡単な説明図１は野生型ネズミ白血病ウィルス（レトロウィルス）ゲノムの概略図である。図２はレトロウィルスベクターの概略図であり、個々は本発明において有用な組換えゲノムを有する。図２ａは pLJであり、そして図２ｂは pEmであり、図２ｃは MFGであり、そして図２ｄはα−SGC である。図３はレトロウィルスベクターMFGの概略図である。図４はレトロウィルスベクターα−SGC の概略図である。図５は TPAの発現を遺伝子的に増大された内皮細胞によりライニングされた合成移植片のイヌ中への移植後の開存性を示す柱状グラフである。図６は第VIII因子ポリペプチドの図である。図６ｂはレトロウィルスベクターを生成するために種々の構造体に使用される制限酵素部位を示す第VIII因子cDNA の図である。図６ｃは垂直線として示される欠失された領域を有する、レトロウィルスベクター中に挿入された第VIII因子cDNAの欠失誘導体の図である。図６ｄはHindIIIと PstＩ部位との間のＢドメインの拡大された図である。Ｈ鎖及びＬ鎖の結合部でのヌクレオチド配列がライン上に示され、そしてその対応するアミノ酸番号がライン下に示される。図７はアセンブルされた最終レトロウィルスベクター、すなわち MFG−第VIII 因子の図である。図８はα−SGC−LacZ組換えレトロウィルスの図である。図９（ａ）及び９（ｂ）は本発明の MFGベクターの構成の概略図を示す。図10は tPA遺伝子の変性、その変性を促進するために使用されるオリゴヌクレオチド及びその変性された tPA遺伝子の MFGベクター中への挿入を示す概略図である。図11．ヒトアデノシンデアミラーゼ(huADA)をコードするレトロウィルスベクターの構造体。（Ａ）MFG−由来の組換えレトロウィルス。MFGベクターはMo−Mu LVに由来する。その５′領域は位置1035で NarＩ部位に拡張し、従ってψ要素(M ann R.など．、Cell，33：153-159，(1983))、スプライスドナー（SD）及び gag コード配列を保持する。gagの開始コドンは、SmaＩリンカーの挿入により変異誘発されている。その５′フラグメントは、env mRNAの生成のために必要なスプライス受容体（SA）を含む NdeＩ（＋5401）−Nla III（＋5780）フラグメントに連結される。点変異（Ａ−Ｃ）が、ヒト ADAコード配列が挿入されている(huADA cDNA（□）内のNcoＩ＋74から AccＩ＋1324まで )env開始コドンを包含する NcoＩ部位中に NlaIII部位を転換した。Daddona，P. E.，など．、J.Biol.Chem. 259：12101-12106,（1984）。Mo−LTR／B2ベクターは、Ｂ２変異（位置＋160 でのＧからＡ）を含む、PEM-ADA ベクター(Wilson，J .M.など．、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 87：439-443，(1990))の 1274bp HindIII − PvuＩフラグメントを、MFGのHindIII−Pvu Ｉフラグメントに連結することによって構成された。MPSVエンハンサーは、３′MPSV−LTR プラスミド(P.Robbins ，Pittsburgh，PAから提供された)からの 385bpの対応するフラグメントにより３′Mo−MuLV LTRの NheＩ−SacＩフラグメントを置換することによって MFG中にクローン化され、MPSV−Enh 構造体が生成される。MPSVE−EnhB2 はMPSV−Enh 及び PEM−ADA 構造体に類似して由来した。MPSV−LTR 構造体においては、pC6 63neoRプラスミド(Ostertag，W.，など．、J.gen.Virol. 67：1361-1371，(1986 ))からの6014bpの BanII−NheＩフラグメントが、MFGベクターからの2694bpのBa nII−NheＩフラグメントにより置換された。Fr−Enh 構造体を生成するためには、MFGの 450bpの NheＩ−KpnＩフラグメントが、pFr−SV(X)プラスミド (Holla nd，など．、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，84：8662-8666，(1987))からのその対応する NheＩ−KpnＩフラグメントにより置換された。Mo−MuLV LTR（□）、MPS V配列（□）、Friend配列（□）。（Ｂ）αＧ−SGC ベクター：pHSGに由来するαＧ−SGC ベクターは、３′LTR において gagの一部及びエンハンサー欠失を担持する(Guild，など．、J.Virol. ，62：3795-3801，(1988))。このベクターにおいて、huADA発現は、ヒトサイトメガロウィルス(CMV)エンハンサー（□）(SpeＩ＋154−NcoＩ＋515 フラグメント)（Boshart，M.など．、Cell ，41：521-530，(1985))、及びα−グロビンプロモーター（□）(PstＩ−57 0−NcoＩ＋37フラグメント)(Braelle，F.E.，Cell，12：1085-1095，(1977))の制御下にある。（Ｃ）組換えレトロウィルスにより感染されたNIH 3T3細胞の DNA分析：標準条件（セクション 11.1を参照のこと）下でのNIH 3T3細胞の感染の後、ゲノム D NAがNheＩにより消化され、そしてhuADA cDNAプローブを用いてサザンブロットにより分析された。個々のレーンは10μｇのゲノム DNAにより負荷された。細胞当たりのプロウィルスのコピー数が、Phosphorimagerにより測定されるようにして、個々のレーン下で示される。左のレーンにおいては、コピー対照は、Mo−LT R ベクターの細胞当たり１つのコピーに対応する。図12．末梢血液細胞におけるヒト ADA発現の分析：（Ａ） BMT 後５〜７ヵ月でのhADA発現の分析。血液サンプルが採血される時は、個々のベクターについて移植の後の日数で示される。hADA活性が IEFにより測定された（セクション 11.1を参照のこと）。個々のサンプルのすぐ上の数は個々の動物を示す。個々の受容体に注入される細胞の数が上記に示され、そして２ ×10⁵〜4.5×10⁶個の細胞に及ぶ。ゲル上の低いバンドは、ネズミ内因性ADA(mAD A)の活性を示し、そして上部バンドはヒトADA(huADA)の活性を示す。対照サンプルは非移植マウスから調製された。イタリック体の数は、図13において詳細に試験されたマウスを示す。（Ｂ） BMT 後５〜７ヵ月で huADAを発現するマウスの割合。ADA比活性（ｒ）は、コンピューター濃度計により図12Ａに基づいて測定されるマウス ADA酵素に対するヒトの強度の比を示す。ｎ₁はｒ＞１である場合のマウスの数を示し、そしてｎ₂は１＜ｒ≦１／４である場合のマウスの数を示す。Ｎは分析されるマウスの合計数を示す。（Ｃ） PBC ５〜７における及び BMT後12〜14ヵ月後のヒト ADA発現の比較。血液サンプルが矢印により示されるように、移植後、２つの明確な時点で採血され、そして図12Ａに記載されるように ADA活性について分析された。個々のマウスはそれらの数（＃）により示される。矢印はmADA及び huADA活性を示す。個々のサンプル下に示される ADA比活性は、マウス酵素バンドに対するヒトの強度の比として決定される。第１の欄に示される％は、個々のベクターについて、BMT後５〜７ヵ月で測定される元の活性(100％)に比較しての BMT後12〜14ヵ月での平均のhADA活性を示す。（ｎ）は平均活性を計算するために使用されるマウスの数を表わす。図13．BMT後12〜14ヵ月での造血細胞画分における huADA発現の定量化。（Ａ）個々のマウスの造血細胞画分における huADA活性の分析。それらの数により示される動物を殺害し、細胞画分を収穫し、そして huADA活性を個々の画分^(a) において IEFにより決定した。酵素活性が合計タンパク質１μｇ／プロウィルスコピー当たりに発現される任意単位で報告される。“０”＝検出できない h uADA活性；“nd”＝測定されなかった。（Ｂ）合計タンパク質１μｇ／プロウィルスコピー当たりの平均ヒト活性。平均 huADA活性があらゆる画分^(a)におけるあらゆる組換えベクターについて示される。Mo−LTR 及び個々の他のベクター間での huADA活性の標準化された差異の統計学的な有意性が記載されるようにして示される^(b)。（Ｃ）細胞当たりの平均プロウィルスコピー数。DNAがすべての動物の個々の細胞画分から単離され、そして huADAプローブを用いてサザンブロット法により分析された。個々のサンプルのために、正確なコピー数が、細胞当たり１つのコピーを有することが知られている細胞クローンを対照として取ることにより、Phosphorimagerを用いて決定された。細胞当たりの平均のプロウィルスコピー数及びその統計学的分析^(b)が個々の細胞画分^(a)におけるあらゆる組換えベクターについて示される。（Ｄ）合計タンパク質１μｇ当たりの平均ヒト ADA活性。平均のhADA活性がプロウィルスコピー数とは無関係に個々のベクターについて決定された。Mo−LTR 及び個々の他のベクター間のhADA活性の差異の有意性が示される。（ａ）：BM、分別されていない骨髄；脾臓、分別されていない脾臓；Ｂリンパ球、脾臓性Ｂリンパ球；Ｔリンパ球、脾臓性Ｔリンパ球；Mac，BMに由来するマクロファージ。（ｂ）星印（★）によりマークされる個々の棒は、１）プールされたBM及び脾臓サンプル；２）Ｂリンパ球；３）Ｔリンパ球；４）マクロファージから製造された分布が、その対応する“Mo−LTR 分布”に比較される場合、統計学的に有意な差異（Ｐ＜0.05）を示す（Student-Fischer's t 試験）ことを示唆する。平均±SDを計算するために使用されるマウスの数（ｎ）は、個々のベクターの下に示され、そして図13Ａにおいて詳細に分析されるマウスに由来する。図14は、Moloneyネズミ白血病ウィルス(“MoMuLV”)(配列番号５)、MFGベクター（配列番号６）及び MFG−Ｓベクター（配列番号７）についての DNA配列の比較を提供する。MoMuLVのヌクレオチド 320−643 が個々の線の上部で示されている。細胞表面 gagタンパク質のための推定上の CTG開始コドン及び細胞質 gagタンパク質のための ATG開始コドンは大文字で示される。gag読み取り枠は下線により示される。“Ｘ”は、ヌクレオチドが未変化であることを示し、そして“−”は、ヌクレオチドが欠失されたことを示す。MFG及び MFG−Ｓを区別するヌクレオチド置換はボックスにより示される。MFG及び MFG−Ｓの両者は、MoMuLVに存在しない gag ORFの ATGに続いてリンカー挿入を有する。図15はレトロウィルスベクター MFG−Ｓの構造を示す。SA＝スプライス受容体、SD＝スプライスドナー、ψ＝パッケージングシグナル。この図は一定の比例に縮小して描かれていないことを注目すること。図16はベクター MFG−Ｓの環状の制限地図である。図17は8045BPのベクター MFG−Ｓ（配列番号７）の DNA配列である。５．発明の詳細な記載本発明はいくつかのレトロウィルスベクターを提供する。提供されるレトロウィルスベクターは、（１）興味あるレトロウィルスに由来する５′及び３′LTR 、前記 LTRのための好ましいレトロウィルス源は Maloneyネズミ白血病ウィルスである、及び（２）興味ある遺伝子のための挿入部位を含む。本発明のレトロウィルスベクターは完全な gag， env又は pol遺伝子のいづれも含まず、その結果、レトロウィルスベクターは標的細胞において独立した複製をすることができない。好ましいレトロウィルスベクターは gagコード配列の一部を含み、好ましくはその部分的 gagコード配列は、レトロウィルスベクターに位置するよう配置されるスプライスドナー部位及びスプライス受容体部位を含んで成り、その結果、そのスプライス受容体部位は興味ある遺伝子のための挿入部位に隣接し、そしてその上部に位置する。対象のベクターの特に好ましい態様においては、転写プロモーターは、 gagプロモーターから開始される転写体が未翻訳の５′gag 配列、及び前記ベクターにおける挿入部位中に挿入される核酸配列から生成される転写体を含むよう配置される。興味あるベクターは好ましくは、選択可能マーカーを含まない。そのようなベクターの好ましい態様は、“ MFG”として命名されるベクターである。本発明のもう１つの観点は、３′LTR における機能的エンハンサー要素を欠いているレトロウィルスベクターを提供することであり、それにより、標的生物のゲノム中への組込みに基づいて５′LTRを不活性化する。本発明のもう１つの観点は、実質的に上記のようなレトロウィルスベクターを提供することであるが、しかしベクターの挿入部位中に挿入される遺伝子の発現を制御するために gagプロモーターを用いる代わりに、ヒトαグロビン遺伝子転写プロモーターが使用される。レトロウィルスベクターα−SGC が特に開示される。本発明のもう１つの観点は、興味ある遺伝子の発現を高めるためにαグロビン転写プロモーターを用いてレトロウィルスベクターにおける LTRに位置しないエンハンサー配列を用いることである。エンハンサー配列がαグロビン転写プロモーターの上流に配置されるベクターが特に興味の対象である。本発明のもう１つの観点は、そのような非−LTR エンハンサー含有ベクターにおけるサイトロメガロウィルスに由来するエンハンサー配列に関する。本発明のもう１つの観点は、レトロウィルスベクターにおける挿入部位中に挿入される発現のための遺伝子を含むレトロウィルスベクターの構造体を提供することである。対象のレトロウィルスベクター中への挿入のための遺伝子は、種々のホルモン、酵素、受容体又は他の薬物のいづれかを含む。本発明は特に、MFG 及びα−SGC のクローニング部位中に（個々に）挿入される TPA及び第VIII因子から成る遺伝子構造体を提供する。野生型レトロウィルスゲノムは、細胞中に新規の遺伝子を導入することができるベクターとして使用するために Cone and Mulligan，前記により変性された。図２に示されるように、 gag， pol及び env遺伝子がすべて除去され、そして n eo 遺伝子をコードする DNAフラグメントがそれらの位置に挿入された。 neo遺伝子は優性の選択可能マーカーとして作用する。組換えゲノムの一部を存続するレトロウィルス配列は、LTRS，tRNA結合部位及び Psiパッケージング部位を含む。 Cepko，C.など．、Cell，37：1053-1062(1984)。発現のための外来性遺伝子の挿入のための部位を含む多くのレトロウィルスベクターを教授する他に、本発明はまた、レトロウィルスベクターが挿入のための部位中に挿入される遺伝子、すなわち外来性遺伝子又は発現のための遺伝子を含む遺伝子構造体を提供する。本発明のベクターへの包含のための外来性遺伝子は、種々のタンパク質をコードすることができる。興味あるタンパク質は、種々のホルモン、成長因子、酵素、リンホカイン、サイトキン、受容体及び同様のものを包含する。用語“外来性遺伝子”は、外来性遺伝子を含むレトロウィルスベクターが挿入され得る細胞に対して内因性の核酸配列を包含する。遺伝子疾病を有する個人において不在であるか、少量で生成されるか又は変異形で生成されるポリペプチドをコードするそれらの遺伝子が、発現のための遺伝子として使用するために特に興味あるものである。さらに、外来性遺伝子によりコードされるタンパク質により誘発される組織的な効果を提供するために標的細胞からの分泌のためのポリペプチドをコードする外来性遺伝子を使用することが興味あるものである。興味ある特定の外来性遺伝子は、ヘモグロビン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−10、インターロイキン−11 、等、GM−CSF，Ｇ−CSF，Ｍ−CSF、ヒト成長因子、インスリン、第VIII因子、第IX因子、tPA，LDL受容体、腫瘍壊死因子、PDGF，EGF，NGF，IL−1ra，EPO，β −グロビン及び同様のもの、並びにそれらのタンパク質の生物学的活性ムテインをコードするものを包含する。レトロウィルスベクター中への挿入のための発現のための遺伝子は種々の種からのものであり得るが、しかしながら、興味ある遺伝子のための好ましい種源は、興味ある外来性遺伝子を含むレトロウィルスベクターが挿入される予定であるそれらの種である。本発明のレトロウィルスベクターは典型的には、パッケージング細胞系中に核酸配列をトランスフェクトすることによって使用される。パッケージング細胞系は、それをベクターに転換する間、レトロウィルスから欠失されたウィルス遺伝子機能を含む。従って、ベクター挿入部位中に挿入された発現のための遺伝子を有するか又は有さない本発明のレトロウィルスベクターは、所望する遺伝子構造体を含むトランスフェクトされた感染性ウィルス粒子を生成するためにパッケージング細胞系中に存在することができる。理想的には、パッケージング細胞系は、高い力価の組換えレトロウィルスを生成することができる。好ましいパッケージング細胞系は、Psi−２，Psi−Am，Psi−CRIP及び Psi−CRE を含むが、但しこれだけには限定されない。Psi−２が、レトロウィルスベクター MFG及びα−S GC と共に使用するために特に好ましい。 Mulligan及び共同研究者により記載される Psi−２細胞系は、Moloneyネズミ白血病ウィルス（Mo−MuLV）クローニングである NIH 3T3内皮細胞をpMOV−Psi によりトランスフェクトすることによって創造された。pMOV−Psi はすべてのウィルス遺伝子生成物を発現するが、しかしウィルスゲノムのエンキャプシド化のために必要である Psi配列を欠いている。pMOV−Psi は、マウス（及び近縁のゲッ歯類）細胞上においてのみ存在する受容体を認識するエコトロピックウィルスエンベロープ糖タンパク質を発現する。もう１つの細胞系は、Psi−２−様パッケージング細胞系である Psi−am系である。それらの Psi−am細胞系は変性されたpMOV−Psi−ゲノムを含み、ここでエコトロピックエンベロープ糖タンパク質はアンフォトロピックウィルス 4070A に由来するエンベロープ配列により置換されている(Hartley and Rowe，1976，J ournal of Virology ，19：19-25)。結果として、それらはアンフォトロピック宿主範囲での組換えウィルスの生成のために有用である。Psi−am細胞系を製造するために使用されるレトロウィルスは、広範囲の哺乳類宿主範囲（アンフォトロピック宿主範囲）を有し、そしてヒト細胞を感染するために使用され得る。組換えゲノムが Psiパッケージング配列を有する場合、Psi−am細胞系は感染性レトロウィルス粒子中に組換えレトロウィルスゲノムをパッケージすることができる(Cone and Mulligan，1984，Proceedings of the National Academy of Scien ces ，USA，81：6349-6353)。２種の他のパッケージング細胞系が Psi−CRIP及び Psi−CRE として知られている。それらの細胞系は、それぞれアンフォトロピック及びエコトロピック宿主範囲を有する高い力価の組換えレトロウィルスを安定して生成するクローンを単離するために有用であることが示されている。それらの細胞系は、Danos and Mu lligan，1988，Proceedings of the National Academy of Sciences ， USA，85 ：6460-6464 ; 及び1988年９月１日に出願されたアメリカ特許出願第07／239,54 5 号に記載されている。前記文献及び特許出願の技法は引用により本明細書に組込まれる。Psi−CRIP及び Psi−CRE は、ブダペスト条約下で、それぞれ受託番号 CRL9808及び CRL9807として American Type Cultu re Collection，Rockville，MDに寄託された。 MFGは、２種の損なわれていないオーバーラップする読み取り枠、又は細胞表面及び細胞質 gag−pol ポリタンパク質の両者のアミノ末端タンパク質をコードする ORFを保持する。それらの ORFは、複製−コンピテントウィルスの形成を導びくパッケージング細胞系に存在するウィルス構造コード配列を伴って組換え出来事のための標的領域を提供する。このすでにかけ離れた可能性を最小にするために、MFG gag ORFが、可能な組換え出来事を破壊するような手段で変異誘発され得る。従って、本発明の好ましいレトロウィルスベクターは、細胞表面細胞質 gagポリペプチドのための開始コドンから下流に挿入される停止コドンを有する MFGベクターである。MFG−Ｓと称するこの MFGベクターの特定の態様は、セクション12における例により十分に説明される。本発明はまた、遺伝子発現のための部位中に挿入される発現のための遺伝子を有するレトロウィルスベクターも包含する。種々の遺伝子を組込む種々のベクターが、セクション６〜12における例により特別に記載される。本発明の特定の態様においては、セクション７における例により記載されるように、ヒト組織タイププラスミノーゲン活性化因子(tPA)のための遺伝子を担持する MFG及びα−SGC レトロウィルスベクターが構成され、そて標的内皮細胞を効果的に形質導入し、そして高レベルの tPAの持続される発現を指図するために使用される。セクション９における例により記載される関連する態様においては、ヒト第VIII因子のための遺伝子を担持する MFGベクターが構成され、そして内皮細胞を効果的に形質導入し、そして第VIII因子の発現を指図するために使用される。本発明の組換えレトロウィルスベクターは、インビボで細胞の形質導入を達成することができる。たとえば、セクション10に十分に記載されるように、ベクターα−SGC−LacZは、インビボでネズミ血管内皮細胞を効果的に形質導入し、インビボでのLacZ遺伝子生成物の維持された発現をもたらす。従って、本発明は、遺伝子治療ベクター、及び標的細胞、たとえば血管内皮細胞の現場形質導入のための方法を提供する。本発明のもう１つの観点は、本発明の組換えレトロウィルスベクターによる造血細胞の形質導入、及びそのようなベクターによる遺伝子治療を通しての広範囲の種類の血液学的疾病及び障害の処置に関し、ここで前記疾病及び障害は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：貧血、溶血性疾患、赤血球代謝疾患、異常ヘモグロビン症、サラセミア、好中球機能疾患、白血球減少症、赤血球増加症、骨髄増殖性疾患、白血症、リンパ腫、好酸性疾患、血漿細胞疾患、血液凝固疾患及び同様のもの。セクション11における例により記載される本発明のこの観点の特定の態様においては、興味ある遺伝子を担持する種々の MFG−由来の組換えレトロウィルスベクターが構成され、そして骨髄に存在する造血幹細胞を形質導入するために使用される。そのようなベクターにより形質導入された細胞は、興味ある移行された遺伝子によりコードされる生成物を生成する種々の造血細胞型により特徴づけられる完全な造血システムを再生するために骨髄移植法に使用され得る。セクション11に開示される出願者の骨髄移植研究結果は、多くの異なった MFG−由来のベクターが造血幹細胞を形質導入することができ、そして骨髄移植受容体のほぼ寿命の間、そのような形質導入された幹細胞から生成されるほとんどの造血細胞系における所望する遺伝子生成物の高レベルの発現を指図することを示唆する。その結果はまた、ベクター企画中に組込まれる特定のウィルス LTRの選択が遺伝子発現レベルに影響を及ぼすことも示唆する。セクション11に示される結果の観点においては、本発明の組換えレトロウィルスベクターは、形質導入された骨髄細胞に由来する造血細胞において遺伝子の長期の維持された発現を明確に提供することができる。形質導入後、１年以上、すべての造血系における有意なレベルの遺伝子発現を検出する能力は、この時が骨髄移植受容体の正常な寿命に近いので、有意である。それらの結果はまた、LTR に基づくベクターによる遺伝子発現の不活性又は遮断を示して来たこれまでの研究の場合、ウィルス LTRの利用以外のベクター企画の特定の特徴が以前に推定されたよりも発現における観察される問題に一層寄与することができることも強く示唆する。セクション11に記載されるMPSV−LTR、又はMFG−ADA のＢ２誘導体のいづれかにより供給される発現の絶対的に大きな改良は、異なった細胞系における発現及び観察される発現レベルにおける変動について試験される少数の動物を考慮して、評価することはいく分困難であるけれども、そのデータは、それらのベクターが改良された発現を付与し、そしてその改良が、ほとんどすべての造血系において存在することにおいて、一般的であると思われることを明確に示唆する。従って、本発明はまた、下記段階を包含する、患者の造血細胞における欠陥遺伝子により特徴づけられる血液学的疾病を処理するための方法も提供し、ここで前記段階は、ドナーからの HLA−同一性の同種骨髄細胞を単離し；ベクター挿入部位で欠陥遺伝子に対応する正常な遺伝子を含むように構築された本発明の組換えレトロウィルスベクターにより前記ドナー骨髄細胞を形質導入し；生存細胞の適切な集団を生成するために前記形質導入されたドナー骨髄細胞を培養し；適切な方法を用いて、たとえばシクロホスファミドの投与により（すなわち４日間、１日当たり50mg）、又は全身照射により又はシクロホスファミド又は当業界において良く知られている他の化学療法剤と組合しての全身照射により、患者の免疫システムを破壊し；そしてそれに続いて、適切な量の形質導入されたドナー骨髄細胞（Kg体重当たり）約２〜６×10⁸個の形質導入されたドナー骨髄細胞）を患者に、投与のいづれか適切な経路により、たとえば静脈内注入により投与することを含んで成る。本発明のさらにもう１つの観点は、血管手術への使用のための改良された血管移植片に向けられる。合成血管移植片に関する主な問題は、移植片の閉塞及び不全を導びく、移植片領域における血塞形成、並びに心筋梗塞及び死を誘発するそれらの傾向である。合成血管移植片は、この固有の血栓形成性のために、自己由来の伏在静脈、現在では血管手術方法、たとえば冠状バイパス手術において選択される材料に相当する長期の開存性を決っして達成したことはない。この問題は、マイクロ血管移植片に関して、及び移植片のための利用できる伏在静脈を有さない患者においては、一層手に負えない。本発明は、閉塞性血栓の形成を阻止する改良された内皮形成性血管移植片を提供する。より特定には、本発明の改良された血管移植片は、血栓崩壊剤又は抗血栓剤、たとえば組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子(tPA)のための遺伝子を担持する組換え MFGレトロウィルスベクターにより遺伝子的に形質導入されている内皮細胞により予備供給される。そのような予備供給された血管移植片は、移植片の内腔をライニングする形質導入された内皮細胞により、局部的に、高レベルの血栓崩壊剤又は抗血栓剤を生成し、従って、血栓形成を阻害する。セクション８における例により十分に記載される、本発明のこの観点の特定の態様においては、組換えレトロウィルスベクター MFG−tPA がイヌ内皮細胞を形質導入するために使用され、そしてその形質導入された内皮細胞が、試験動物中に大動脈−腸骨バイパスとして移植片を移植する前、合成血管移植片の内腔表面を内皮形成するために使用される。MFG−tPA−形質導入内皮細胞を供給された移植片は、対照の内皮細胞により供給された移植片に比べて血栓形成を実質的に阻害することができ、そして従って、改良された好都合な割合を示す。従って、そのような改良された抗血栓性血管移植片は、手術工程、たとえば冠状バイパス手術に使用され、そて移植材料のための自己由来の血管系を利用するための必要性を排除できる。種々の合成移植片材料、たとえばポリマー性移植片材料（たとえばポリテトラフルオロエチレン）、テフロン及び同様のもの（但し、これらだけには限定されない）は当業界において知られており、、本発明の改良された移植片を調製するために使用され得る。好ましくは、合成移植片材料は、遺伝子的に変性された内皮細胞により移植片の内腔をライニングする前、フィブリン溶解性的に阻害されたフィブリン接着剤により予備被覆される。内皮形成された合成血管移植片についての最近の論議については、たとえば Zillaなど．、1994，J.Vasc.Surg．19：540-548 ０００Ahlsweds and Williams，1994， Arterioscler.Thromb．14：25-31 を参照のこと。従って、移植片の内腔表面上に、血栓崩壊性又は抗血栓性タンパク質、たとえばヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を生成するために遺伝子的に変性された自己由来の内皮細胞のライニングを含んで成る改良された合成血管移植片が提供され、ここで前記内皮細胞はベクター挿入部位で血栓崩壊性又は抗血栓性タンパク質のためのコード配列を含むように構築された、本発明の組換えレトロウィルスベクターにより親内皮細胞を形質導入することによって、移植片の移植の前、変性されている。本発明のレトロウィルスベクターは、広範囲の種類の細胞タイプ、たとえば上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、筋原細胞、星状細胞、リンパ細胞、腸間膜細胞及び同様のものに使用され得るが、但しこれらだけには限定されない。次の特許及び特許出版物に開示される細胞型が特に興味あるものである：1989年９月19日に発行されたアメリカ特許第 4,868,116号及び1990年12月25日に発行されたアメリカ特許第 4,980,286号（上皮細胞）、1989年８月10日に公開された P CT／US89／00422、WO89／07136(肝細胞)、1990年７月25日に公開されたEP第 378 ,576号（線維芽細胞）、及び1989年６月15日に公開された PCT／US88／04383、W O89／05345 及び1990年６月28日に公開されたWO／90／06997(内皮細胞)(これらの開示は引用により本明細書に組込まれる)。本発明のベクターは、種々の医学的状態、たとえば癌、遺伝子的基礎の疾病、心肺疾患、内分泌上の疾患及び同様の状態に使用されるが、但しこれらだけには限定されない。本発明は次の例により示されるが、それらの例は本発明を限定するものではない。６．例： MFG及びα−SGC レトロウィルス遺伝治療用ベクターの構成 6.1．材料及び方法 6.1.1．MFGベクター前駆体の構成 6.1.1.1．pMOV−Psi の構成プラスミドpMOV Psiを次の通りに構成した：３種の精製された DNAフラグメントを、pMOV Psi−を構成するために一緒に連結した。第１のフラグメントは、pMOV Psi＋を XhoＩにより完全に消化し、続いて、EcoR Ｉによる部分的消化により得られた。Chumakov，I.など．、Journal of Virolog y ，42: 1088-1098(1982)。MuLVにおいて 2.0Ｕでの XhoＩ部位から延び、３′L TR、３′マウスフランキング配列、pBR322のすべてを通して、そしてEcoR Ｉ部位で終わるフラグメントを、電気泳動分離の後、アガロースゲルから精製した。Vo gelstein，B．and D.Gillespie，Proceedings of the National Academy of Sci ences ，USA ，761 : 615-619(1979)。第２のフラグメントは、6 PMOV Psi＋をBal Ｉにより完全に消化し、続いて５′マウスフランキング配列及び５′LTR を通してpBR322におけるBalＩ部位から、MuLVの 0.7Ｕに位置する BalＩ部位まで延びるフラグメントを精製することによって得られた。次に、HindIIIリンカー（共同研究）を、T4 DNAリガーゼによりこのフラグメントにブラント−連結し、そのフラグメントを過剰のHindIII及びEcoRＩにより消化した。LTR−含有フラグメントを、電気泳動分離の後、アガロースゲルから精製した。最終連結反応に存在する第３のフラグメントを、MuLVの gag ／pol 領域がpSV2中にサブクローン化されているpSV2 gag ／pol から得た。Mulligan，R.C．and P.Berg，Science ，209 : 1422-1427(1980)。pSV2− gag ／pol を XhoＩ及びHindIIIにより完全に消化し、そしてHindIII部位（MuLVの 1.0ＵでPstＩ部位から変えられた）からMuLVの 2 .0ＵでのXhoＩ部位まで延びるフラグメントを、電気泳動分離に続いてアガロースゲルから精製した。次に、それらの３種の DNAフラグメントを、リガーゼ緩衝液（50mMのトリス−HCl〔pH 7.8〕、10mMの MgCl₂、20mMのジチオトレイトール、1.0mMの ATP、50μｇ／mlのウシ血清アルブミン）において、50μｇ／mlの合計 DNA濃度で等モル量で混合し、そしてT4 DNAリガーゼと共に15℃で18時間インキュベートした。Ｅ．コリ HB101を連結された DNAによりトランスフェクトし、そして耐アンピシリン性トランスフェクタントを得た。多くの形質転換体から得られたプラスミド DNAを、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化及びアガロースゲルを通しての電気泳動により所望する構造体についてスクリーンした。Davis，R.W.など．、Methods in Enzymo logy，65 : 404-411(1980)。染色体中に安定して組込まれる Psi変異体を含む細胞系を、XG PRTを発現できるSV40ハイブリッドベクターによるpMOV−Psi 及びpSV2gptの同時トランスフェクションにより製造した。Mulligan，R.C．and P.Berg，Science ，209 : 1422- 1427(1980)。この方法で得られた gpt＋コロニーからの細胞をクローン化し、そして３種の系統： Psi−１，Psi−２及び Psi−３に確立した。 6.1.1.2．pLJの構成 pLJの特徴は、Korman，A.J.など．、Proceedings of the National Academy o f Sciences ．USA，84 : 2150（1987）に記載される。このベクターは次の２種の遺伝子を発現することができる：興味ある遺伝子及び優性の選択可能マーカー、たとえば neo遺伝子。前記興味ある遺伝子を５′LTR に対して遠位のBamHＩ／ SmaＩ／SalＩクローニング部位中に直接的な配向でクローン化し、そして neo遺伝子をクローニング部位であるよりも３′側である（クローニング部位の３′側に位置する）内部プロモーター（SV40からの）に対して遠位に位置する。pLJからの転写は次の２つの部位で開始される：１）興味ある遺伝子の発現を担持する５′LTR 及び２） neo遺伝子の発現を担当する内部SV40プロモーター。pLJの構造体は図２ａに示される。ベクター pLJは図２ａに示される。pLJにおいては、興味ある遺伝子材料が５ ′LTR のすぐ後に挿入される。この遺伝子材料の発現は LTRから転写され、そして neo遺伝子の発現は内部SV40プロモーターから転写される。 6.1.1.3．pEmの構成この単純なベクターにおいては、野生型ウィルスの gag， pol及び envのための完全なコード配列が、発現される唯一の遺伝子である興味ある遺伝子により置換されている。pEmベクターの成分は下記に記載される。５′フランキング配列、５′LTR 及び 400bpの隣接する配列（BamH Ｉ部位まで）はpZIPからである。３ ′フランキング配列及び LTRもまたPZIPであるが；しかしながら、３′LTR から 150bp上流の Cla Ｉ部位を合成BamH Ｉリンカーにより連結し、そしてベクターに存在するBamHＩクローニング部位の他の半分を形成する。pBR322のHindIII ／Eco RＩフラグメントがプラスミド主鎖を形成する。このベクターは、Moloneyネズミ白血病ウィルスの株からクローン化された配列に由来する。類似するベクターが、骨髄増殖性肉腫ウィルスに由来する配列から構成されている。pEmの構造は図2 6に示される。選択可能マーカーを有さないベクターはまた、興味ある遺伝子材料により種々の細胞型、たとえば内皮細胞を形質導入するためにも使用され得る。そのようなベクターは、そのようなマーカーが存在する、前で記載されたベクターの基本的に単純化されたものである。ベクターpEmは図２ｂに示されており；示されるように、ベクターの主成分は５′及び３′LTR、及びそれらの２つの LTR間に挿入される興味ある遺伝子材料である。 6.1.2．MFGベクターの構成 ATCC受託番号 68754自体の特徴を有する MFGベクターは、pEmベクターに由来するが、しかしパッケージング細胞系における組換えゲノムのエンキャプシド化を高めるためにMMLVからの gag配列の10 38個の塩基対、及びスプライス受容体及び転写開始を含む MOV−９に由米する 3 50個の塩基対を含む。MOV−９配列に直接続いて、 Nco Ｉ及びBamH Ｉ部位を含む1 8個の塩基対のオリゴヌクレオチドが存在し、そして前記オリゴヌクレオチドは適切な部位による遺伝子の便利な挿入を可能にする。MMLV LTRは転写を制御し、そしてその得られるmRNAは生来の gag転写体の確実な５′未翻訳領域、続いて挿入された遺伝子の読み取り枠を含む。MFGの構造は図２ｃに示される。MFGのより詳細な地図は図13に提供される。MFGの構成についての詳細は図９（ａ）及び９（ｂ）に提供される。 MFGを、半−GAG レトロウィルスベクター（半−GAG は、Bender，など．、J.V irol. 61 : 1639-1646 に記載される）の５′LTR 含有 Xho Ｉ／NdeＩフラグメントに、 Xho Ｉ／BamHＩ H4 ヒストンプロモーターフラグメントに連結することによって構成した。レトロウィルスベクター pEmを Nde Ｉ及びBamH Ｉにより消化し、そして３′LTR 含有フラグメントを、適切な配向で２つの LTRを含み、そしてまた、ベクターのウィルス部分内にＨ４フラグメントを含む中間のレトロウィルスベクターを生成するために、Ｈ４フラグメントにすでに連結される半−GAG フラグメントに連結した。次に、前記の中間ベクターを、 Nde Ｉによる消化により線状化し、そしてそのベクターの pB322部分における Nde Ｉ部位をポリメラーゼによりフィルインし、そして連結により破壊した。ベクターを続いて Xho Ｉにより消化し、そしてその Xho Ｉ部位を NdeＩリンカーに連結した。ベクターを続いて、BamHＩにより切断し、そして両 LTR及びpBR322配列を含む大きなフラグメントを精製した。 Xho Ｉ及びBamH Ｉを有し、そして次の配列：を有するリンカーを合成し、そして環状のベクター、すなわち図２ｃ，３及び９（ａ）〜９（ｂ）に示されるような MFGを形成するために、明確にされた中間ベクター上のBamHＩ部位及び pMOV9からの Nde Ｉ／XbaＩフラグメント〔NdeＩ端の次のスプライス受容体部位を含む〕の両者に連結した。ベクター MFGを含むプラスミドは、American Type Culture Collectionに寄託され、そして受託番号68,7 54を有する。 6.1.3．α−SGC ベクターの構成 α−SGC ベクター(ATCC受託番号68755)は、tPA遺伝子の発現を調節するために α−グロビン遺伝子からの転写プロモーター配列を利用する。前記プロモーター要素を含む 600塩基対のフラグメントはさらに、確実なα−グロビンmRNAの転写開始及び５′未翻訳領域を含む。サイトロメガロウィルスからの転写エンハンサーを含む 360個の塩基対のフラグメントに続いて、αグロビンプロモーターが存在し、そして前記フラグメントはこの要素からの転写を増強するために使用される。さらに、MMLVエンハンサーを、３′LTR から欠失する。この欠失は、感染に基づいて５′LTR に移行され、そして要素の転写活性化を実質的に不活性化する。α−SGC の構造は図２ｄに示される。α−SGC のより詳細な説明は図４に提供される。α−SGC ベクターを含有するプラスミドはAmerican Type Culture Coll ectionに寄託され、そして受託番号68,755を有する。次の例は、内皮細胞を用いる本発明のレトロウィルスベクターを用いる例を提供する。他の細胞型、たとえば上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞及び他のものもまた、制限なしに適切であることが理解されるであろう。７．例：内皮細胞におけるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の高められた発現に影響を及ぼすためへの MFG及びα−SGC ベクターの使用組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)は、血液凝集体のフィブリン溶解性を促進する内皮細胞により通常分泌されるタンパク質である。ヒト tPAをコードする組換えレトロウィルスベクターを構成し、そして形質導入された内皮細胞から治療的に適切なタンパク質の高められた供給を示すために、イヌ内皮細胞を形質導入するために使用した。 7.1．材料及び方法 7.1.1．tPAをコードする MFG及びα−SGC ベクターの構成組換えレトロウィルスベクター中へのクローニングのための tPA遺伝子の変性は図10に示される。ヒト子宮 tPAのコード配列は、Integrated Genetics Inc．F ramigham MAから得られた、pUCに基づくプラスミドの SalＩ DNAフラグメント内に含まれた。 SalＩフラグメントを、塩基対６での S FaNＩ部位及び元のcDNAの塩基対2090での BglII部位に SalＩリンカーを配置することによって誘導した。そのコード配列は、塩基対13から塩基対1699まで及ぶ。この元のクローンから、セクション6.1.に記載される MFG及びα−SGC ベクター中に直接的にクローン化され得るフラグメントを得た。 SalＩフラグメントをまず、合成 Bam HＩリンカーの付加によ Bam HＩフラグメントに転換し、そして次に、制限酵素 BglIIにより消化し、109個の塩基対のBamH Ｉ〜BglIIフラグメント及び1975個の塩基対の BglII〜BamH Ｉフラグメントを得た。tPAコード配列のミッシングする 100個の塩基対及び翻訳開始コドンを再び創造するために、２つの 104個の塩基対のオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、そしてアニールし、５′端で NcoＩ部位及び３′端で BglII部位を有するフラグメントを創造した。このオリゴヌクレオチドを、1975個の塩基対の部分的 tPA遺伝子の BglII部位上に連結し、元の分子と同一のコード配列を有する2079個の塩基対の tPA遺伝子を創造した。但し、前記 tPA遺伝子は NcoＩ〜BamHＩフラグメントとして容易に得ることができる。それを MFG及びα−SGC ベクター中に直接挿入した（前記得られるベクターはそれぞれ 68727及び 68729のATCC受託番号を与えられた）。それらの操作は標準の分子生物学的技法(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，T.Maniatis ，E.F.Frisch，and J.Sambrook)に従って実施され、そして図２に示される。 7.1.2．MFG−tPA 及びα−SGC−tPA 生成細胞系の調製 MFG−tPA 及びα−SGC−tPA をコードする組換えウィルスを生成する細胞系を、アンフォトロピック宿主範囲の組換えレトロウィルスを生成できる、Danos an d Mulliganの Psiパッケージング細胞系から製造した〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S .A．85：6460（1988）〕。10μｇの特定化された DNA及び１μｇのプラスミド p SV2neoを同時沈殿せしめ、そして標準のリン酸カルシウムトランスフェクション法によりパッケージング細胞上にトランスフェクトした。安定してトランスフェクトされたクローンを、800μｇ／mlのG418を含む選択培地においての14日間の培養の後に単離した。24時間の培養物の上清液を、個々のクローンの集密的細胞単層から得、そして NIH 3T3細胞を感染せしめるために使用した。その培養上清液を、24時間の暴露の後に除去し、そして 3T3細胞を通常の培地により再供給し、そしてさらに72時間、増殖せしめた。新鮮な培地を６時間、それらの細胞上に配置し、そしてそれらの上清液を、ヒト tPAに対して特異的な市販のELISA（Immunobind-5，American Diagnostica Inc.，N.Y.，N.Y.）によりヒト tPAについてアッセイした。このスクリーンから、MFG−tPA 組換えウィルス又はα−SGC−tPA 組換えウィルスのいづれかを生成するパッケージング細胞系のクローンを選択し、そしてそれぞれ、MFG 68及びα−SGC 22と命名した。 7.1.3．標的の内皮細胞及び MFG−tPA 及びα−SGC−tPA ベクターによる形質導入イヌ内皮細胞を、T.J.Hunter S.P.Schmidt，W.V.Sharp,（1983）Trans.Am.Soc .Artif.Intern.Organs 29 : 177 に記載されるように、コラゲナーゼ消化により外部頸静脈の10cm部分から単離した。細胞を、５％血漿由来のウマ血清、50μｇ／mlの内皮細胞増殖因子及び 100μｇ／mlのヘパリンを含むM199培地を有する、フィブロネクチン被覆された組織培養皿上で増殖せしめた。細胞培養物の純度を、Von Willebrands Factorの存在及び平滑筋細胞特異的α−アクチンの不在についての免疫組織化学アッセイにより決定した。形質導入の前日、内皮細胞を、ヘパリンを含まない培地に 5.5×10³個の細胞／cm²で供給した。次の日、内皮細胞を、８μｇ／mlのポリブレンを添加された個々の生成細胞系に由来する組換えウィルスを含む上清液に24時間、暴露した。ウィルス上清液を除去し、細胞に通常の培地を与え、そして増殖を、分析の前、さらに48時間、進行せしめた。高分子量ゲノム DNA及び全 RNAを、標準の技法(Molecular Cloning-A Laborat ory Manual ，T.Maniatis，E.F.Fritsch，and J.Sambrook)により、内皮細胞の培養物から単離した。前記 DNA及び RNAを、完全なtPA cDNAフラグメントから調製された³²Ｐ−ラベルされた DNAプローブによるハイブリダイゼーション分析により分析した。標準技法が、電気泳動分離、フィルタートランスファー、ハイブリダイゼーション、洗浄及び³²Ｐ−ラベリングのために使用された(Molecular C loning-A Laboratory Manual ，T.Maniatis，E.F.Fritsch，and J.Sambrook)。形質導入されたイヌ内皮細胞におけるヒト tPAの生成は、種特異的免疫細胞学的染色により示された。形質導入された細胞を、３％ホルムアルデヒドに室温で10分間、固定し、そして次に、0.1％ Trit on Ｘ−100 において５分間、透過せしめた。次に、固定された細胞単層を、ヒト tPAに対するネズミモノクローナル抗体と共に、次にアルカリホスファターゼ接合のヤギ抗−マウス抗体と共に、及び最後に、アルカリホスファターゼに対して特異的な色彩試薬と共に連続的にインキュベートした。この方法は特に、ヒト tPAを発現するそれらの細胞を染色し、そして従来の光顕微鏡により可視化され得る。さらに、形質導入された細胞からの tPA分泌を集密的細胞単層から決定した。新鮮な培地を細胞上に６時間、配置し、除去し、そして遠心分離により透明にし、そしてヒト tPAの量を市販のELISA(Immunobind-5，American Diagnostics )により決定した。 7.2．結果形質導入方法の効能を、擬似形質導入された又は MFG−tPA により形質導入された細胞集団の免疫細胞学的染色により示した。図５に示されるように、MFG 68 から収穫されたウィルス上清液への細胞の１回の暴露の後、実質的に全ての細胞は、ヒト tPAを合成しない対照の細胞とは対照的に、ヒト tPAを合成する。これは、形質導入された細胞に対していづれのタイプの選択をも伴わないで達成された。免疫学的アッセイを行ない、形質導入された培養物から分泌される tPAの量を決定した。下記に示されるように、MFG 68又はα−SGC 22のいづれかからの組換えウィルスにより形質導入された細胞は多量のヒト tPAを分泌した。類似する条件下で、培養物中のヒト内皮細胞は典型的には、約１ngの tPAを分泌する〔Hans s，M.，and D.Collen（1987）J.Lab.Clin.Med．109 : 97-104〕。内皮細胞がMFG 68及びα−SGC 22からの組換えウィルスにより形質導入されたことについてのさらなる確認として、DNA及び RNAを形質導入された細胞から単離し、そして放射性ラベルされた tPA遺伝子に対するハイブリダイゼーションにより分析した。DNA分析のオートラジオグラムを行なった。ハイブリダイゼーションは感染されていない対照においては検出されなかったが、しかし適切な分子量の単一のハイブリダイズする種が、２つの組換えベクターにより感染された細胞に見られた。これは、遺伝子情報がそれらの形質導入された細胞のゲノムに移行されたことを示す。それらの細胞から単離された全 RNAのハイブリダイゼーション分析は、タンパク質及び DNA結果を確証する。再び、ハイブリダイゼーションは対照細胞においては検出されなかったが、しかし形質導入された細胞に由来する RNAにおいては、適切なサイズのハイブリダイズするバンド見られる。MFG 68及びα−SGC 22組換えウィルス生成細胞からの RNAはまた、対照として示される。８．例： MFG−tPA−形質導入された内皮細胞により供給された血管移植片のインビボ抗血栓活性 8.1．材料及び方法内皮細胞を、体重20〜25Kgの成長した雌の雑種犬の外部頸静脈から酵素的に収穫し、そして実験室において培養し、そして例７に記載されるようにして純度について分析した。個々の動物から単離された細胞の半分を、前記セクションに記載されるようにして、MFG−tPA 組換えウィルスを生成するMFG 68細胞系からの上清液への暴露により形質導入した。他の半分を擬似形質導入した。個々の集団に対して行なわれた増殖曲線は、増殖特徴において差異を示さなかった。ELISA測定を、個々のバッチの形質導入された細胞に由来する培養上清液に対して行ない、tPAが増強された細胞から分泌されることを確認した。次に、それらの細胞を、十分な数の細胞を得るために、約１週間、実験室において増殖した。細胞が単離された個々の動物のために、発泡性テフロン(W.L.，Gore and Asso ciates，Inc．Flagstaff，AZ)から製造された２つの血管移植片を細胞により供給した。１つの移植片を擬似形質導入された細胞により供給し、そして他の移植片を形質導入された細胞により供給し、高レベルの tPAを分泌せしめた。0.4cm ×14cmの大きさの個々の移植片を、1.5μｇ／cm²のフィブロネクチン(Sigma Che mical Corp.，St.Louis Mo)により予備被覆し、そして次に、2200,000個の内皮細胞／cmにより供給した。次に、移植片を、培養物中においてさらに72時間インキュベートした。移植の前、末端を個々の移植片から切断し、そして細胞被覆面積を確かめるために調べた。細胞が収穫された同じイヌに麻酔をかけ、そして前記供給された移植片の部分 10cmを、大動脈−腸骨バイパスとして移植した。個々のイヌは２つの対側性移植片を受け；１つは対照細胞により供給され、そして他は高レベルの tPAを分泌するよう形質導入された細胞により供給された。移植に続いて、移植片の性能を、超音波により移植片の位置を捜し当て、そしてドプラー測定(Accuson，Inc.)により移植片を通しての血流流を評価するＢ−モードスキャナーにより毎日モニターした。血栓の形成を減じるための薬物は動物には投与されなかった。 8.2．結果６匹の異なった動物における移植片性能の結果を分析した。その結果は図５に示される。上記の移植片モデルは、ひじょうに厳重なモデルであり、そして閉塞性凝集体形成により急速な移植片の機能不全を導びく。通常の移植片の機能は空白の棒により示され、そして機能不全になりつつあるが、しかしまだ、機能的である移植片は斜線の棒により示される。最初の動物においては、対照の移植片及び増強されたレベルの tPAを分泌する形質導入された細胞によりライニングされた移植片（実験）は、移植の後24時間で凝集体の形成により機能不全になった。すべての他の５匹の動物においては、高められたレベルの tPAを分泌する形質導入された細胞によりライニングされた移植片は、単に擬似形質導入された細胞によりライニングされた移植片よりも長く機能した。この差異は24時間〜数ヵ月と変化した。それらの結果は、治療効果が MFG−形質導入された内皮細胞によりインビボで達成され得ることを示す。９．例：内皮細胞においてヒト第ＸIII因子を生成するためへの MFGベクターの使用 9.1．材料及び方法 9.1.1．MFG／第ＸIII因子ベクターの構成内皮細胞を、変性されたヒト第ＸIII因子遺伝子を含むレトロウィルスベクター、すなわちMFG(ATCC受託番号68726)により細胞を形質導入することによってヒト第VIII因子を生成するために遺伝子的に増強した。変性された第ＸIII因子のc DNAは、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ｃ１及びＣ２ドメインのためのコード配列のすべてを含むが、しかしながら、Ｂドメインはアミノ酸 743〜1648を欠失されている。Ｂドメインの除去及び変性された第ＸIII因子遺伝子のレトロウィルスベクター MFG中への挿入は、下記に詳細に記載され、そして図７に示される。５′及び３′未翻訳配列を有さない十分な長さのcDNAを、制限部位 NcoＩ（５ ′）と XhoＩ（３′）との間に挿入されるプラスミドベクターにおいて得た。Ｂドメインの除去のために、第ＸIII因子cDNAを、Ｂドメインの５′及び３′の両側上に配列をつなぐ４個のフラグメントにおけるプラスミドベクター中にサブクローン化した。第VIII因子のcDNAの第１のフラグメントを、プラスミドベクター pUC9における制限部位 SalＩと PstＩとの間にサブクローン化した。プラスミドベクターを、SalＩ及び PstＩにより切断し、そして５′側のホスフェートをウシ腸ホスファターゼを用いて除去した。1591塩基対の XhoＩ（ヌクレオチド7263 ）〜NdeＩ（ヌクレオチド5672）フラグメント、及び 359塩基対の NdeＩ（ヌクレオチド5672）〜pstＩ（ヌクレオチド5313）フラグメント（十分な長さのcDNA からの）を単離し、そして SalＩ／PstＩにより消化されたプラスミドベクターにより連結した。同じ翻訳読み取り枠においてアミノ酸 742〜1649を連結するＢドメインをコードする配列の大部分を除去するために、４種のオリゴヌクレオチドを、168個の塩基対をカバーする５′側HindIII部位及び３′側 PstＩ部位により合成した。それらのオリゴヌクレオチドは、アミノ酸 742、続いてＬ鎖の活性化ペプチドの第１アミノ酸であるアミノ酸1649をコードするオリゴヌクレオチド2427でのHind III部位からヌクレオチド5313での PstＩ部位まで拡張する。プラスミドベクターpUC9を制限酵素HindIII及びPstＩにより消化し、そして５′側のホスフェートをウシ腸ホスファターゼを用いて除去した。オリゴヌクレオチドを、４種の別々の鎖として合成し、キナーゼ処理し、アニーリングし、そしてプラスミドベクターのHindIII部位と PstＩ部位との間に連結した。サブクローン化されたHindIII／PstＩオリゴヌクレオチドを、プラスミドベクターpUC F8における PstＩ／XhoＩフラグメントに並置した。このプラスミドを生成するために、新規のポリリンカーを、使用される制限酵素部位５′SamＩ−B amHＩ−XhoＩ−PstＩ−HindIII−Asp 718−NcoＩ−HpaＩ３′をコードする新規のポリリンカーを有するpUC9プラスミド主鎖中に挿入した。プラスミドベクターを制限酵素BamHＩ及びHindIIIにより消化し、そして５′側のホスフェートをウシ腸ホスファターゼにより除去した。PstＩ／XhoＩサブクローンの部分的な Pst Ｉ／BamHＩ消化物を用いて、３′側の第ＸIII因子フラグメントを単離し、そしてサブクローン化されたオリゴヌクレオチドの PstＩ／HindIII消化物を用いて、Ｈ鎖及びＬ鎖機能フラグメントを単離した。それらを、BamHＩ及びHindIII部位間のプラスミドベクターpUC FB中に連結した。ヌクレオチド2427及び7205間に第VIII因子配列を含むこのサブクローンを Asp 718及びHindIIIにより、消化し、そして５′側ホスフェートをウシ腸ホスファターゼを用いて除去した。制限酵素部位Asp718(ヌクレオチド1961)及びHindIII （ヌクレオチド2427）間に第VIII因子をコードするフラグメントを単離し、そしてプラスミドベクター中に連結し、ヌクレオチド1961からヌクレオチド7205での翻訳停止コドンまでの第ＸIII因子配列を含むサブクローン（pF8 ３′デルタ）を生成した。変性された第ＸIII因子遺伝子を含むレトロウィルスベクターの構成を、レトロウィルスベクターMFGの制限部位 NcoＩ及びBamHＩ間に第ＸIII因子遺伝子を挿入することによって行なった。第ＸIII因子サブクローンpF8 ３′デルタをSmaＩにより消化し、そしてオリゴヌクレオチドリンカーを用いて BglII部位に転換した。Asp 718／ BglIIフラグメントを３′第VIII因子サブクローンから単離し、そして翻訳の開始のための ATGを含む５′第VIII因子フラグメントを、NcoＩ（ヌクレオチド151 ）／Asp 718フラグメント（ヌクレオチド1961）として単離した。レトロウィルスベクター MFGを NcoＩ及びBamHＩにより消化し、そして５′側ホスフェートをウシ腸ホスファターゼを用いて除去した。第VIII因子フラグメントをレトロウィルスベクター中に連結し、最終の第VIII因子レトロウィルス構造体を得た。図６を参照のこと。 9.1.2．MFG／第VIII因子生成細胞系の調製レトロウィルス粒子を生成する細胞系を、Bestwickなど.(Proc.Natl.Acad.Sci .USA 85 : 5404-5408(1988))により記載されるようにして、等数のエコトロピックパッケージング細胞 Psi CRE及びアンフォトロピックパッケージング細胞CRIP 中へのレトロウィルスベクター MFG／第VIII因子のトランスフェクションにより生成した。２種の宿主範囲のパッケージング細胞間に生じる重感染の程度をモニターするために、生物学的活性の第VIII因子の生成を、Kabi Diagnostica Coate st for Factor VIII，Helena Laboratories，Beaumont，Texasを用いて測定し、そしてウィルス RNAの生成を RNAドットブロット分析により測定した。トランスフェクション後21日で、トランスフェクトされたパッケージング細胞の混合物を、アンフォトロピックパッケージング細胞系Psi CRIP−HIS と共に同時培養した。CRIP HISパッケージング細胞系は、前に記載されたCRIPパッケージング細胞系の変異体である。CRIP HISパッケージング細胞系は、Psi CRIPパッケージング細胞系と同一であるが、但しレトロウィルスエンベロープ遺伝子はpSV2−HIS プラスミド DNA、すなわち異なった優性の選択可能マーカー遺伝子による同時トランスフェクションにより細胞中に導入された。パッケージング細胞系を、形質導入粒子の同種アンフォトロピックレトロウィルス原液を単離するために１：１の比で培養した。アンフォトロピックパッケージング細胞系CRIP HISの重感染は、変性されたヒト第VIII因子遺伝子を効果的に形質導入する組換えレトロウィルスを生成する安定した細胞系、すなわちHIS 19の生成を導びいた。レトロウィルス導入性細胞系の抗生物質選択は、高い力価の組換えレトロウィルスを生成する細胞系を単離するために必要とされなかった。その細胞系のゲノム DNAが、生成細胞系に存在するレトロウィルスベクターの組込まれたコピーの数を決定するためにサザンブロットハイブリダイゼーション分析により特徴づけられた。レトロウィルス生成細胞系におけるコピー数は約 0.5であり、従って平均50％のCRIP−HIS パッケージング細胞は変性された第VIII因子遺伝子を有するレトロウィルスベクターのコピーを含む。レトロウィルスベクター及び変性された第VIII因子遺伝子は損なわれておらず、従って、パッケージング細胞系における DNAのいづれの欠失又は再配置をも有さない。レトロウィルスベクターのコピー数は、レトロウィルス生成細胞系の連続した継代で一定して存続する。最高の力価の組換えレトロウィルスを得るために、HIS 19が、ヒスチジンを含まない選択培地において３継代、続いて完全なDMEM培地において４継代、伝えられた。レトロウィルス粒子の生成のために、HIS 19を、10cmの細胞培養皿に５×10⁵〜１×10⁶個の細胞で接種された。接種後48時間で、すなわち約70％の集密度で、新鮮な培地（DMEM＋10％ウシ血清）を、形質導入のための組換えレトロウィルスの源として、24時間後、収集のためのプレート上に添加した。 9.1.3．内皮細胞の形質導入変性された第VIII因子遺伝子を、頸静脈から単離されたイヌ内皮細胞中に形質導入した。内皮細胞を、５％血漿由来の血清（ウマ）、 100μｇ／mlのヘパリン、及び50μｇ／mlの内皮細胞増殖因子を含む完全M199培地に３×10⁵個の細胞／10cm皿で４〜６時間、接種した。次に、細胞を、５％血漿由来の血清及び 100μｇ／mlの内皮細胞増殖因子を含むM199培地（これは、形質導入工程の効率に悪影響を及ぼすヘパリンを含まない）において一晩インキュベートした。細胞を、新鮮なウィルス上清液及びポリブレン（８μｇ／ml）に24 時間、暴露した。ウィルス上清液の除去の後、細胞を、約70％〜80％の集密度に増殖するために、５％血漿由来の血清、100μｇ／mlの内皮細胞増殖因子を含むM 199培地中に添加した。その時点で、培地を、５％の加熱不活性化されたウシ胎児血清（66℃で２時間の加熱）及び50μｇ／mlのECGFを含むM199培地に変えた。 24時間のインキュベーションに続いて、培地を集め、そしてKabi Coatestにより生物学的活性第VIII因子についてアッセイした。 9.2．結果：内皮細胞のインビトロ形質導入このレトロウィルス生成細胞系により、50％〜75％の内皮細胞を、サザンブロット分析により決定されるようにして形質導入した。第VIII因子を、組換えレトロウィルスへの１回の暴露によりこの頻度で形質導入し、そして形質導入された細胞の抗生物質選択は伴わなかった。形質導入された内皮細胞は、組換えレトロウィルスゲノムの完全なコピー及び変性された第VIII因子遺伝子（いづれの欠失又は再配置をも含まない）を含む。遺伝子的に増強された内皮細胞からの生物学的活性第VIII因子の生成の速度は、400ng／５×10⁶個の細胞／24時間であった。 10．例：内皮のインビボ形質導入前記例に記載されるようにして製造された組換えレトロウィルスの標準原液を用いて、内皮細胞のインビボ形質導入を示すデータを、ここに記載されるようにして生成した。このアプローチは、動脈表面に対する一定の損傷が小片の内皮細胞を除去し、そしてこの露出された部分が欠損部の端からの新しい内皮細胞の増殖により22時間以内で治癒する、以前に公開された観察(Reidy MA，Schwartz SM，Lab Invest 44 : 301-308(1981))に基づかれている。細胞分裂は、組換えレトロウィルスによる効果的な形質導入のための必要条件であり、そして針金による内皮の損傷は、内皮細胞増殖を誘発する可能性ある多くの方法の１つである。本発明の方法は、内皮細胞増殖を誘発するために一定の損傷の Reidy's技法を用い、次に組換えレトロウィルスベクターを含む上清液に直接的に増殖細胞を暴露する。本発明の初期実験は、この方法が内皮細胞を都合良く形質導入することの能力を提供し、従って、新規の遺伝子配列の好都合な導入のための組織培養技法の必要性を実質的に回避する。この方法は次の２つの手術工程を必要とする：第１の工程は血管表面を傷つけることから成り（本明細書においては右腸骨動脈について記載されている）、そして内皮細胞の増殖を誘発する。第２の工程は、遠位の動脈樹からの血液の流れを妨げながら、血管表面上で複製を受ける細胞に組換えレトロウィルスを供給することを含んで成る。実施の単純さのために、前記工程は腸骨動脈について記載されている。 10.1．材料及び方法インビボでの遺伝子移行を示すために、本発明者は、α−SGC ベクター（図２ｄ及び４）に基づく改良されたベクターを有する、1987年(Price J．Turner D． Cepko C．1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 : 156160)に出版されたマーカー遺伝子概念を使用した。β−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子をα−SGC ベクター中に挿入し、図８に示されるα−SGC−LacZベクターを生成した。この組換え構造体をCripパッケージング細胞系中に移行し、そして高い力価のα−SGC−LacZ組換えレトロウィルスを生成するt Crip細胞のクローンを、例９に記載されるようにして単離した。α−SGC−LacZ組換えレトロウィルスの原物を、インビボ形質導入のために使用した。実験動物（ウサギ）に麻酔をかけ（ケタミン／キシラジン）、両方の鼠径部の毛をそり、そして準備し、そして動物を手術テーブル上に置いた。左右の垂直な鼠径部の切開を通して、通常の、表面の及び深在の大腿部動脈を露出した。右側上に（傷つけられた側）、通常の大腿部動脈から離れた小さな枝を縛り、単離された動脈部分からの流出が内部の腸骨動脈を通してのみ生じることを確保する。必要なら、鼠径靭帯を分割し、そして血管を腹膜後腔に従がえ、すべての横の枝の完全な制御を確かめた。右側の表面の大腿部動脈(SFA)を、その深在開始下約 1.5cmで３−０の絹により縛り、SFAの制御を SFA／深在結合部で得、そして横の動脈切開を行なった。血管壁との接触を確保するために弾性を提供するようそれ自体二重にされた細い針金（20ゲージの血管内カテーテルのスタイレットを使用した）を、通常の大腿部及び腸骨動脈の逆方向に通し、一定の損傷を生成した。針金を除き、20ゲージの血管カテーテルを動脈切開により挿入し、そして次の手術工程でのすぐの接近のために下にある筋肉に固定した。切開は層に近く、そして動物は回復した。 20時間後、α−SGC−LAC−Ｚベクターの生成体から収穫され、そして８μｇ／ mlの最終濃度にポリブレンにより補充された、組換えウィルス含有上清液を、インビボ形質導入のために使用した。動物を再び麻酔をかけ、そして両切開を滅菌した環境で再び行なった。前に露出された右の腸骨血管に障害を与えないで傷つけられた部分上の右の腸骨血管を制御するために、＃３の Fogarty^TMバルーン塞栓切除用カテーテルを左の表面大腿部動脈に動脈切除を通して挿入し、大動脈分岐に通し、そしてバルーンをふくらませ、血流を中断した。右の大腿深動脈を閉塞した。組換えレトロウィルスを含む上清液（10ml）を、右の S FAに前もって配置された血管カテーテルを通して手動注入により導入した。上清液は右の通常の大腿部動脈から右の外部腸骨動脈に及び右の内部腸骨動脈中に逆方向型式で流れた。右の内部腸骨動脈を通り過ぎることによって、上清液のための開放性流出を可能にし、そして十分の10mlの上清液を徐々に注入することができる。今日まで行なわれた実験において、上清液は４〜８分間、血管壁に暴露されて来た。次に、右及び左側からカテーテルを除き、止血を行ない、そして切開部を閉じた。 10〜14日後、動物に麻酔をかけ、その後、殺害した。麻酔の後及び露出の前、開存性を遠位血管の直接的な触診により評価した。腎下大動脈及び下大静脈を手術により露出し、カニューレ挿入し、そしてその下部の先端の血管を、生理学的圧力（90mmhg）で、ヘパリン化されたリンガーラクテート（２Ｕ／ml）によりフラッシュした。ネンブタールの致死量を投与し、そして動脈を、0.1Ｍのカコジレート中、0.5％のグルタルアルデヒド溶液において10分間、灌流下で固定した。大動脈及び両腸骨動脈を連続して切除し、そして１mMの MgCl₂を含むリン酸緩衝溶液(PBS)によりすすいだ。次に、血管を、ｘ−gal 基質において37℃で１〜1 .5 時間インキュベートすることによりlacZ活性について染色した。反応が完結した後、ｘ−gal 溶液を洗浄し、そして PBSにより交換した。 10.2．結果２種の実験がこの方法により完結された。両実験は、細胞質パターンでの選択的な濃い青色の染色により可視化されるように、動脈の表面上の細胞においての lacZ遺伝子生成物の現場発現により示されるように成功したインビボ形質導入を示した。Reidyなど．により記載される損傷及び増殖のパターンと矛盾しない濃く染色された青色細胞が、針金により傷つけられ、α−SGC−LacZ組換えレトロウィルスに暴露され、固定され、そしてlacZ活性のために染色された外部腸骨動脈の断片の表面上に見出される。 11．例：いくつかの組換え MFG−ADA レトロウィルスベクターにより形質導入された造血幹細胞によるヒトアデノシンデアミナーゼのインビボ発現同じ遺伝子生成物、ヒトアデノシンデアミナーゼ(huADA)、及び転写制御配列において特に異なる同じベクター主鎖をコードするいくつかの異なった MFG−基礎のベクターを構成し、そしてネズミ造血幹細胞を効果的に形質導入するそれらの能力について評価した。形質導入された幹細胞を、骨髄移植実験、及び移植に続いて、種々の造血細胞による huADAの長期のベクター介在発現に使用した。 11.1．方法及び材料 11.1.1．組換えレトロウィルスベクター及びレトロウィルス生成細胞の生成 αＧ−SGC ベクターを除くすべての組換えレトロウィルス構造体は、図11Ａに記載されるレトロウィルスベクターMFG（MFG／Mo−LTR)に基づかれている。生成されるすべての新規構造体を、DNA配列決定により確かめた。レトロウィルス生成細胞系を、Danos and Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：6460-6 464 により前で記載されたように、アンフォトロピックパッケージング細胞系ψ CRIP中に、プラスミドpSV2−Neo により個々のレトロウィルスプラスミドを同時トランスフェクトすることによって生成した。細胞を有さない上清液を、１mg／ mlでのG418(Gibco BRL，Grand Island，NY)の存在下での10日間の選択の後に収穫し、そしてψCRE 細胞を感染せしめるために使用した。αＧ−SGC 生成体を、 CRE細胞中への直接的なトランスフェクションの後に単離した。限界希釈により得られるベクター当たり25個のクローンを、サザンブロット分析により高い力価についてスクリーンした。５×10⁵個の NIH 3T3細胞を、８μｇ／mlのポリブレン（Sigma Che mical Co.，St.Louis，MO）の存在下で、ウィルス生成クローンからの24時間の上清液 0.5mlにより感染せしめることによって、滴定を行なった。ゲノム DNAをサザンブロット分析のために抽出し、標的の集団に組込まれるプロウィルスコピーの数を定量化した。選択されたウィルス生成細胞系におけるＢ２変異の存在及び感染された 3T3細胞へのその伝達を確かめるために、Mo−MuLVヌクレオチド72 −92及び 470−490 に対応する PCRプライマーを用いて、400bpのフラグメントを増幅し、次にそれを配列決定した（fmol^TMDNA Sequencing System，Promega, Madison，WI）。ψCRE ウィルス生成細胞からの上清液及び移植受容体からの血漿を、移動アッセイ(Wiosonなど．、1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：439-44 3)に基づいて複製−コンピテントウィルスの存在について試験した。本研究においては、Hartman and Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047-8051 により記載されるようにして、サルモネラチピムリム(Salmonella typhimuri m)ヒスチジノールデヒドロゲナーゼを発現する組換えレトロウィルスゲノムを検出できるよう、アッセイを改良した。ゲノム DNAを、Seifなど．、1991，Methods Mol.Cell.Biol．２：216-217 に記載されるようにして調製し、そして NheＩ又はEc1136II（プロウィルス構造のために）及び NcoＩ又はBamHＩ（プロウィルス組込みパターンのために）により消化した。ハイブリダイゼーションフィルターを、hADA cDNAの 721bpの³²Ｐ− ラベルされたBamHＩ−BglIIフラグメントによりプローブした（Multiprime DNA Labeling System，Amersham）。コピー数を、プロウィルスの単一コピーにより感染された細胞系に生成されるバンドの強度に比較して、Phosphor imager(Fuji Bio-Imaging，Fuji Medical Systems，Stamford CT)に基づいて決定した。不均等な負荷を考慮して、バンドシグナルを、ネズミ内因性 ADAバンドに対して標準化した。 11.1.2．組換えレトロウィルスベクターによるネズミ骨髄細胞の形質導入及び形質導入された細胞のマウス中への移植骨髄（BM）細胞を、Kg体重当たり 150mgの５−フルオロウラシルの静脈内注入の後６日で、(Wilsonなど．、前記)(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)により前で記載されるようにして、C57BL／6J雄マウスの脛骨及び大腿骨から得た。形質導入を、10％（ｖ／ｖ）WEHI−3B上清液及び４μｇ／mlのポリブレンの存在下で、BM細胞を、ψCRE 生成体の単層上で48時間、同時培養することによって達成した。非付着性細胞を収穫し、そしてマウス当たり２×10⁵〜4.5×10⁶個の生存細胞を、尾の静脈を通して、全身体を照射された（11Gy）同系の雌宿主中に注入した。移植されたマウスを、移植後12〜14ヵ月で殺害し、そして末梢血液、 EM、脾臓、脾臓由来のＢ及びＴリンパ球及びBM由来のマクロファージのサンプルを、プロウィルスの存在及び酵素発現の存在について分析した。Ｂ及びＴ細胞を、それぞれ10μｇ／mlのリポ多糖類(LPS)及び２μｇ／mlのコンカナバリンＡ(Si gma)による72時間の刺激の後に収穫した。85％以上の細胞は、FACS分析により決定される場合、Ｂ又はＴリンパ球であった。BM細胞を、20％（ｖ／ｖ）のL929細胞上清液を含む培地において培養した。10〜11日後に収穫された細胞の95％以上は、形態学的分析により決定される場合、マクロファージであった。 11.1.3．アデノシンデアミナーゼ活性アイソザイム−比活性を、Wilsonなど．、前記に記載されるようにして、非変性等電点電気泳動（IEF）(Multiphor II，Electropho resis System，Pharmacia LKB，Piscataway，NJ)により細胞溶解物において検出した。全タンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ(Bio-Rad，Melville，N Y)を用いて個々のサンプルについて決定した。固定された量の全タンパク質を、 IEFゲル上に負荷した（末梢血液細胞(PBC)のためには 300μｇ、BMのためには15 0μｇ、脾臓、マクロファージ及びＢリンパ球のためには 120μｇ、Ｔリンパ球のためには75μｇ）。12分間の染色反応の後、ゲルを固定し、そして個々のバンドの比色強度を、コンピューター化されたデンシトメーター(Computing Densito meter，Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)を用いて定量化した。 11.2．結果 11.2.1．ヒトアデノシンデアミナーゼをコードする組換えレトロウィルスの生成 MFGレトロウィルスベクター中へのヒト DNA配列の挿入も、ウィルスエンベロープ ATGにより通常支配されるサブゲノムウィルス転写体と同一の転写体において一定の位置でADA cDNAの開始 ATGコドンを配置するために行なった。選択マーカーはベクターには存在しない。Bowtell and 協同研究者(Botwelなど．、1987 ，Mol.Biol.Med．４：229-250 ； Botwellなど．、1988，J.Virol．62：2464-24 73)及びOstertag(Beck-Engeserなど．、1991，Hum.Gene Therapy ２：61-70)による研究は、ベクターにおける骨髄増殖性ウィルス(MPSV)LTRの転写活性を示した。本発明者は、Mo−MLV LTRSの代わりに、MPSVのエンハンサー（３′MoLV LTR に位置する）又は５′及び３′の両 MoMLV LTRのいづれかを有する MFG-ADA の誘導体を生成した。さらに、前の研究は、Moloney Friend Virusエンハンサー配列の実質的に新規の性質を示唆した(Hollandなど．、1987，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 84：8662-8666 ； Boszeなど．、1988，EMB O 5：1615-1623 ； Thiesenなど．、1988，J.Virol．62：614-618)。従って、MF G−ADA 誘導体は、類似するFriendエンハンサー配列により置換されたMo−MLV エンハンサー配列により生成された。本発明者はまた、Ｂ２と命名された、ウィルスtRNA一次結合部位に突然変異を担持する MFG−ADA MPSVエンハンサー配列の MPSV LTR含有誘導体及び MFG−ADA の誘導体も生成した(Barklisなど．、1986， Cell 47：391-397 ；Weiherなど．、1987，J.Virol．61：2742-2746)。最後に、 LTR−基礎のベクター、及び挿入された遺伝子の発現のために内部プロモーターを用いるベクターの比較を提供するために、本発明者はαSGC−ADA を生成した。このベクターは、ヒトαグロビンプロモーター及び CMVエンハンサー配列から成るハイブリッド転写要素を利用し、そして３′LTR にエンハンサー配列の欠失を担持する。上記構造体の個々の正確な構造は、セクション 11.1.1.に記載されている。上記ベクターのすべてを、ψCRE パッケージング細胞系にパッケージングした。個々のベクターのために、約25個のクローン化されたパッケージング細胞系を、ウィルス生成について試験し、そして最高のコピー数で正しいプロウィルス構造を伝達する特定の細胞系を、のちでの使用のためにサザンブロット分析により選択した。Ｂ２変異を保持しており、そしてそれを NIH 3T3細胞に伝達することができる、Mo−LTR／B2及びMPSV−Enh／B2構造体のためのウィルス生成細胞クローンを選択するために、本発明者は、PCRにより増幅し、そして生成体及び感染された細胞の両者にＢ２差異を包含する 400bpのフラグメントを配列決定した。前記変異はウィルス生成細胞クローンの半分〜１／４に示され、そしてそれが生成体細胞に存在する場合、標的細胞に伝達されることが示された。２つの構造体の個々についての５〜７個のクローンの PCR分析の後、高い力価のクローンを同定した。個々のベクターを示す選択された生成体細胞から得られたウィルスにより感染された NIH 3T3細胞から単離された DNAのサザンブロットが図11Ｃに示される。そのデータは、正しいプロウィルス構造が高い効率で細胞に伝達されたすべての場合に存在することを示唆する。NIH 3T3細胞の形質導入についてのすべてのウィルスの伝達効率は、細胞当たり 0.7〜3.6 の範囲のプロウィルスのコピーであった。それらのウィルス生成クローンを用いて、例 11.2.2.及び 11.2.3.に記載される実験を行なった。 11.2.2．組換え MFG−ADA ベクターにより形質導入されたネズミ骨髄移植受容体におけるヒトアデノシンデアミナーゼの検出及び定量化形質導入された造血幹細胞に由来する細胞におけるヒトアデノシンデアミナーゼ(huADA)発現をインビボで調査するために、マウスを、セクション 11.1.2.に記載されるようにして、組換えウィルス生成細胞と共に同時培養された 2.5×10⁵ 〜4.5×10⁶個のBM細胞により移植した。15〜18匹のマウスを、構造体当たり移植した。ベクター介在の遺伝子発現を評価することにおける第１の段階は、セクション 11.1.3.に記載されるアッセイを用いて、移植後５〜７ヵ月で、再構成された動物の末端血液細胞(PBC)における huADA酵素活性を分析することを包含した（図12）。このアッセイにおいてはヒト ADA活性は、ネズミ ADA活性から容易に分離され得、そして２つの活性の相対レベルは現場ラベルされた反応生成物の強度のデンシトメトリー測定により評価され得る。このアッセイは、酵素活性の量に比例したシグナルを生成する。組換え MFG−ADA ベクターにより形質導入された細胞により再集団化されたマウスにおいて、93匹の移植された動物のうち90匹が h uADAを発現した。それらの移植された動物の83％（77／93）において、huADAの発現のレベルは、内因性ネズミADA(mADA)発現のレベルに等しいか又はそれ以上であった。それらのマウスの14％（13／93）において、huADAのレベルはネズミ ADAの１／４〜３／４の程度で存在した。わずか３％（３／93）の動物が検出可能なレベルで huADAを発現しなかった。αＧ−SGC−感染された細胞により再構成されたマウスにおいて、11匹のうちわずか４匹のマウスがネズミ酵素に接近したレベルで huADAを発現し、そして６匹はより低いレベルで huADAを発現した（図12）。このベクターからの huADAを発現するマウスの低い％は、たぶん、それらの動物の組織に検出されるプロウィルスの低いコピー数によるものである。それらの研究におけるマウスからマウスに観察されるネズミ活性に対するヒト活性の平均比に基づけば、データは、Mo−MLV LTR よりもむしろMPSV LTRを利用する MFG−ADA 誘導体が他の構造体よりも適度に多い量の酵素を生成した（約２倍）ことを示唆する。しかしながら、このデータは、プロウィルスの DNAコピー数における実質的な差異は考慮していない。 11.2.3．骨髄移植に続いて種々の造血細胞系によるヒトアデノシンデアミナーゼの長期のインビボ発現骨髄移植の後７ヵ月で末梢血液において有意な遺伝子発現を示した骨髄移植片受容体の高い頻度に基づいて、少数の動物を、移植後、長期間（１年以上）で多くの異なった造血細胞型におけるベクター発現についてさらに試験した。それらの研究の第１段階は、末梢血液における酵素発現についてこれまで分析されたマウス再分析することであった。図12Ｂに示されるように、２つの時点（個々の I EFゲルトラック下に示される）でのヒト及びマウス酵素の相対量の比較は、huAD A発現におけるいづれかの有意な低下が時間と共に生じたかどうかについてはほとんど示唆しない。異なったベクターによりラベルされたボックスに示されるように、７ヵ月で観察される発現の約80％が、１年後、持続する。αSGC−ADA 処理された細胞により移植されたマウスにおいては、発現におけるわずかに一層の有意な低下が観察された。次の一連の実験においては、異なった造血細胞型における huADAの発現を、個々の細胞集団を分別し、そして酵素活性及びプロウィルスのコピー数を定量化することによって試験した。この分析は、（ｉ）MFG−ADA；（ii）MFG−ADA(＋B2) ;（iii）MFG−ADA(Friendエンハンサー)；（iv）MFG−ADA(MPSV−LTR)；又は（ｖ）α−SGC−ADA のいづれかにより形質導入された細胞により移植された３〜５匹の動物を包含した。酵素及び DNA分析にゆだねられる細胞集団は、完全な骨髄、完全な脾臓及び分別されたマクロファージ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球を包含した。いくつかの異なった手段で発現され、得られたすべてのデータの編集は図13に示される。パネルＡは個々のマウスを表わすデータを示し、そして他のパネルは平均値を示す。集合的には、データは次の通りに要約され得る：１．異なったウィルスにより達成れる平均プロウィルスコピー数：図13のパネルＣは、有意な割合の異なった造血細胞集団が移植後１年以上でさえ、プロウィルス配列を担持することを示す。α−SGC−ADA 動物を除いて、少数の細胞がプロウィルスを担持しているように見える場合、他のベクターの個々はすべての系統において比較できるプロウィルスコピー数(0.2〜0.7 のコピー／細胞)を生成した。誤差の棒は、マウスからマウスにわたって、プロウィルスコピー数に有意な変動が存在することを示す。特定の形質導入された幹細胞クローンが異なった系統に不均等に寄与し、コピー数における観察される変動を引き起こすことが可能である。２．異なったウィルスにより達成される huADAの平均発現レベル：図13、パネルＤに示される結果は、平均して、異なったベクターにより異なった造血細胞系に達成される、著しく類似するレベルの遺伝子発現が存在することを示唆する。この結論は、試験されるベクターが、かなりの程度、遺伝子発現の組織特異性を示さず、そして従って、発現が特定の細胞系に必要とされ、さらに他の細胞において許容される種々の用途のために十分に有用であることを示唆するために、ひじょうに重要である。図13、パネルＢ及びＤに示される結果は、すべてのベクターが異なった造血細胞系に遺伝子発現を生成せしめるが、MoLTR−B2、及び MFG−ADA のMPSV−LTR 誘導体の両者は、親の MFG−ADA ベクターに関して、ほとんどの系統に高レベルの遺伝子発現を生成せしめるように思えることを示す。マウスからマウスにわたっての発現レベルの有意な変動、及び試験される比較的少数の動物のために、データの統計学的分析を提供することは重要であった。図13のパネルＢ及びＤに示されるように、星印で示される棒は、親の MFG−ADA ベクターについての値に関して統計学的に有意である値を示す。このデータは、Ｂ２及びMPSV LTR誘導体のみが MFG−ADA ベクターに関して発現の有意な差異を示すことを示唆する。Ｂ２ベクターの場合、有意性は、マウスからマウスにわたって観察される発現レベルの広い変動のために、Ｔリンパ球系のためには確立され得ない。同様に、統計学的有意性は、MFG−ADA のMPSV−LTR 誘導体の場合、マクロファージ系のためには確立され得ない。図13、パネルＡに提供されるデータを表わすのに有用なもう１つの手段は、mgタンパク質当たりのプロウィルスコピー数当たりよりもむしろ、mg タンパク質当たりの個々の系統における発現のレベルを考慮することである。データのこの表示は個々のベクターの全体の性能の評価に、たぶん最とも関連している。なぜならば、それはベクターの固有の発現能力及びベクターの細胞を形質導入する能力の両者を考慮するからである。興味あることには、個々のベクター（αSGC−ADA ベクターを除く）により達成される比較できるプロウィルスコピー数のために、図13、パネルＤにおけるデータは、パネルＢに示されるデータにひじょうに類似している。再び FFG−ADA マウスに関する遺伝子発現における統計学的に有意な差異がＢ２及びMPSV−LTR ベクターの両者に関して観察された。パネルＢに提供されるデータとは対照的に、マクロファージにおけるＢ２ベクターの発現は、MFG−ADA により達成される発現とは有意に異ならなかった。 12．例：改良された安全性特徴を有する MFGベクター誘導体 MFG−Ｓベクターは、相同の組換え出来事を通して複製−コンピテントウィルスの形成の可能性をより一層、最小にするように企画された FGFベクターの誘導体である。特に、MFGは、細胞表面及び細胞質 gag−pol ポリタンパク質の両者のアミノ末端部分をコードする２種の損なわれていないオーバーラップする読み取り枠(“ORF”)を保持する。それらの ORFは、複製−コンピテントウィルスの形成を導びくことができるパッケージング細胞系に存在する、ウィルス構造コード配列と共に組換え出来事のための標的領域を提供する。このすでに遠隔の可能性を最小にするために、MFG−Ｓベクターを、３種の特定の突然変異が ORFを破壊するためにウィルス gag領域中に導入され、そしてそれにより、いづれかの適切なサイズの細胞表面又は細胞質 gag−関連ポリペプチドのいづれかの発現の可能性を最小にできるように構成した。 MFG−Ｓレトロウィルスベクターを生成するために、MFGレトロウィルスベクターへの特定の突然変異が、図14に MFG及び MFG−Ｓの DNA配列の直接的な比較により示される。それらは、ヌクレオチド1256でのＡのＴへの変化及びヌクレオチド1478でのＣのＴへの変異である。それらの突然変異は、細胞表面又は細胞質 g agポリペプチドのための開始コドンから下流に停止コドンを創造し、そしてそれぞれ、その対応する gag−関連 ORFを84及び15のヌクレオチドに減じる。第３の突然変異は、ヌクレオチド1273でＴをＡに変える DNA配列に構築された。この変化は、ORFに影響を及ぼさないが、しかしパッケージング機能のために理論的に重要であるステムループを保持するヌクレオチド1252とペアーリングする塩基のための可能性を保持する補足的な変化である。 MFG−Ｓレトロウィルスの顕著な特徴及びヌクレオチド位置によるそれらの所在が下記表IIに列挙される。図15は、MFG−Ｓレトロウィルスベクターの構造特徴を示す。その MFG−Ｓベクターは、次の部分から成る：（１）５′LTR、及びヌクレオチド1039で NarＩ部位に延長する下流の配列(NarＩは NdeＩ部位に転換された)を含むMo−MuLV DN Aフラグメント；（２）レトロウィルス配列のヌクレオチド位置 626でのSmalリンカー；（３）位置5401での NdeＩ部位からヌクレオチド位置5674での XbaＩ部位まで延びるMo−MuLV DNAフラグメント；（４）NcoＩ部位（CTAGACTTGCCATGGCG CGATC）を含む合成二本鎖 DNAフラグメント；（５）ヌクレオチド位置7672で Cl aＩ（BamHＩ部位に転換されている）部位から３′LTR まで延びるMo−MULVフラグメント；及び（６）pBR322細菌プラスミド配列。ヌクレオチド置換は、MFG− ＳベクターにおけるMo−MuLV配列の位置1256，1273及び1478で合成された。それらのヌクレオチド位置はベクターのHindIII部位に関する（図17における MFG− Ｓの完全なヌクレオチド配列を参照のこと）。MFGのプロウィルス転写単位は、５′端上にマウスゲノム配列の 396個のヌクレオチド及び３′端上に 697個のヌクレオチドを有する。cDNA配列は、ユニーク NcoＩ部位とBamHＩ部位との間に挿入され得る。フランキングマウスゲノム及びプロウィルス配列は、pBR322のHind III部位とEcoRＩ部位との間にクローン化される。pBR322におけるBamHＩ部位は排除された。図16は、MFG−Ｓベクターの環状制限地図を提供する。図18は、 MFGベクターの制限地図を表の形で提供する。 13．生物学的寄託 1991年10月３日、出願者は、American Type Culture Collection，Rockville ，Md.，USA（ATCC）に、本明細書においてATCC受託番号第 68726号として記載される、第VIII因子挿入体を有するプラスミド MFG、本明細書においてATCC受託番号第 68727号として記載される、tPA挿入体を有するプラスミド MFG、本明細書においてATCC受託番号第 68728号として与えられる第VIII因子として与えられる、第VIII因子挿入体を有するプラスミドα−SGC、及び本明細書においてATCC受託番号第 68729号として与えられる、tPA挿入体を有するプラスミドα−SGC を寄託した。1991年10月９日、出願者は、American Type Culture Collection，Ro ckville，MD.，USA（ATCC）に、本明細書においてATCC受託番号第 68754号として記載されるプラスミド MFG及び ATCC受託番号第 68755として記載されるプラスミドα−SGC を寄託した。それらの寄託は、特許手続きのために及びブダペスト条約下での規定のために、微生物の寄託の国際認識に基づくブダペスト条約の規定下で行なわれた。これは、寄託の日から30年間、生存培養物の維持を確かにする。生物は、ブダペスト条約の条件下でATCCにより入手可能にされ、そして出願者と適切なアメリカ特許の発行に基づいて制限されない利用性を確かにするATCCとの間での合意に従う。寄託された菌株の利用性は、特許法に従っていづれかの政府の権威下で許可される権利に違反して本発明を実施するための許可として解釈されるものではない。当業者は、本明細書に特別に記載される本発明の特定の態様の多くの同等物を認識し、又は日常の実験を用いて確かめることができる。そのような同等物は、次の請求の範囲に包含される予定である。本明細書に引用されるすべての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リビアー，イザベルアメリカ合衆国，マサチューセッツ 02114，ボストン，ウエストシーダーストリート 90 (72)発明者コーエン，ローレンスケー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，キャボットドライブ 5670 (72)発明者ギルド，ブラッドアメリカ合衆国，マサチューセッツ 01742，コンコード，リバーデールロード 109 (72)発明者レイフィールド，ローリエフ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94123, サンフランシスコ，ビーチストリート＃５ 2249 (72)発明者ロビンズ，ポールアメリカ合衆国，ペンシルバニア 15216, マウントレバノン，オーバールックドライブ 527 (72)発明者マリガン，リチャードシー. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 01773，リンカーン，サンディヒルロード２

Claims

【特許請求の範囲】１．注目のレトロウィルスに由来する５′LTR 及び３′LTR、及び注目の遺伝子のための挿入部位を、操作可能な組合せで含んで成る、完全な gag， env又は pol 遺伝子を含まない組換えレトロウィルスベクター。２．前記ベクターがさらに、 gagコード配列の一部を含んで成る請求の範囲第１項記載の組換えレトロウィルスベクター。３．前記 gagコード配列がスプライスドナー部位及びスプライス受容体部位を含んで成り、ここで前記スプライス受容体部位が注目の前記遺伝子から上流に位置する請求の範囲第２項記載の組換えレトロウィルスベクター。４．前記ベクターが、前記挿入部位中に挿入されるヌクレオチド配列の転写体が生成されるように機能的に配置された gag転写プロモーターをさらに含んで成り、ここで前記転写体が gag５′未翻訳領域を含んで成る請求の範囲第３項記載の組換えレトロウィルスベクター。５．前記ベクターが選択可能マーカーを含まない請求の範囲第４項記載の組換えレトロウィルスベクター。６．前記ベクターが ATCC 68,754の同一特徴を有する MFGである請求の範囲第５項記載の組換えレトロウィルスベクター。７．前記ベクターがさらに、前記挿入部位中に挿入される発現のための遺伝子を含んで成る請求の範囲第１項記載の組換えレトロウィルスベクター。８．発現のための前記遺伝子が、ホルモン、酵素、受容体及び薬物から成る群から選択される請求の範囲第７項記載の組換えレトロウィルスベクター。９．発現のための前記遺伝子が第VIII因子又は tPAである請求の範囲第８項記載の組換えレトロウィルスベクター。 10．前記ベクターがさらに、α−グロビン転写プロモーターを含んで成る請求の範囲第１項記載の組換えレトロウィルスベクター。 11．前記ベクターがさらに、前記α−グロビン転写プロモーターに自然に連結されるα−グロビン遺伝子の５′未翻訳領域の部分を含んで成る請求の範囲第10 項記載の組換えレトロウィルスベクター。 12．前記ベクターがさらに、前記５′又は３′LTR に存在しないエンハンサー配列を含んで成る請求の範囲第11項記載の組換えレトロウィルスベクター。 13．前記エンハンサー配列が、前記転写プロモーターから上流に位置する請求の範囲第12項記載の組換えレトロウィルスベクター。 14．前記エンハンサー配列がサイトロメガロウィルスエンハンサー配列である請求の範囲第13項記載の組換えレトロウィルスベクター。 15．前記ベクターがATCC No．68755の同一特徴を有するα−SGCである請求の範囲第14項記載の組換えレトロウィルスベクター。 16．前記３′LTR が機能的エンハンサー配列を含まない請求の範囲第10項記載の組換えレトロウィルスベクター。 17．前記ベクターがさらに、前記挿入部位中に挿入される発現のための遺伝子を含んで成る請求の範囲第10項記載の組換えレトロウィルスベクター。 18．発現のための前記遺伝子が、ホルモン、酵素、受容体及び薬物から成る群から選択される請求の範囲第10項記載の組換えレトロウィルスベクター。 19．発現のための前記遺伝子が第VIII因子又は tPAである請求の範囲第18項記載の組換えレトロウィルスベクター。 20．請求の範囲第１〜19のいづれか１項記載のレトロウィルスベクターのコード配列によりトランスフェクトされた組換えレトロウィルス細胞系。 21．ネズミ白血病ウィルスに由来する５′LTR 及び３′LTR、及び注目の遺伝子のための挿入部位を操作可能な組合せで含んで成る、完全な gag， env又は g ol 遺伝子を含まない組換えレトロウィルスベクター。 22．外因性エンハンサーをさらに含んで成る請求の範囲第21項記載の組換えレトロウィルスベクター。 23．前記外因性エンハンサーが骨髄増殖性肉腫ウィルスに由来する請求の範囲第22項記載の組換えレトロウィルスベクター。 24．前記外因性エンハンサーが Molony Friendウィルスに由来する請求の範囲第22項記載の組換えレトロウィルスベクター。 25．Ｂ２突然変異をさらに含んで成る請求の範囲第21，22，23、又は24のいづれか１項記載の組換えレトロウィルスベクター。 26．前記３′LTR が骨髄増殖性肉腫ウィルスに由来する３′LTR により置換される請求の範囲第21，22，23、又は24のいづれか１項記載の組換えレトロウィルスベクター。 27．Ｂ２突然変異をさらに含んで成る請求の範囲第26項記載の組換えレトロウィルスベクター。 28．前記５′LTR が骨髄増殖性肉腫ウィルスに由来する５′LTRにより置換される請求の範囲第21，22，23又は24のいづれか１項記載の組換えレトロウィルスベクター。 29．Ｂ２突然変異をさらに含んで成る請求の範囲第28項記載の組換えレトロウィルスベクター。 30．前記５′LTR 及び３′LTR の両者が、それぞれ、骨髄増殖性肉腫ウィルスに由来する５′LTR 及び３′LTR により置換される請求の範囲第21 ，22，23又は24のいづれか１項記載の組換えレトロウィルスベクター。 31．Ｂ２突然変異をさらに含んで成る請求の範囲第30項記載の組換えレトロウィルスベクター。 32．造血幹細胞が興味ある遺伝子の生成物を発現するようその造血幹細胞を遺伝子的に変性するための方法であって：（ａ）挿入部位で前記注目の遺伝子を含むよう請求の範囲第21項記載の組換えレトロウィルスベクターを構築し；そして（ｂ）前記組換えレトロウィルスベクターにより造血幹細胞を形質導入することを含んで成る方法。 33．患者の造血細胞における欠陥遺伝子により特徴づけられる血液学的疾病を処理するための方法であって：（ａ）ドナーから同種の HLA−同一性骨髄細胞を単離し；（ｂ）ベクター挿入部位で欠陥遺伝子に対応する正常な遺伝子を含むように構築された、請求の範囲第21項記載の組換えレトロウィルスベクターにより前記ドナー骨髄細胞を形質導入し；（ｃ）前記形質導入されたドナー骨髄細胞を培養し；（ｄ）前記患者の免疫システムを破壊し；そして（ｅ）患者の免疫システムの破壊に続いて、静脈注入を通して患者にKg体重当たり約２〜６×10⁸個の形質導入されたドナー骨髄細胞を投与することを含んで成る方法。 34．移植片の管腔表面上にヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を生成するよう遺伝子的に変性された自己由来の内皮細胞のライニングを含んで成る改良された合成血管移植片であって、ここで前記内皮細胞が、ベクター挿入部位でヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のためのコード配列を含むよう構築された、請求の範囲第１〜19のいづれか１項記載の組換えレトロウィルスベクターにより親内皮細胞を形質導入することによって、移植片の移植の前、変性されている合成血管移植片。