JPH0850122A - 化学発光検出用充填剤およびそれを用いる分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高速液体クロマトグラフィーに於て化学発光
検出法による物質の分析法を、簡便化し経済性を高める
とともに、安定な測定を可能にする。 【構成】 発光助剤を必要としない化学発光検出器用化
学発光試薬を共有結合で固定化した充填剤並びに本充填
剤を化学発光検出器中のフローセルに充填した高速液体
クロマトグラフィー及びフローインジェクションによる
過酸化水素の分析法。 【効果】 多くの化学発光系の反応条件であるアルカリ
条件下で充分安定に使用でき、また高価な化学発光試薬
を常時送液する必要がないので、装置の簡便化及び試薬
の浪費を防ぐことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体クロマトグラフィ
ー及びフローインジェクションにおいて化学発光検出法
により物質を分析する技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルカリ条件下、過酸化水素と反応して
強い発光を与える化学発光試薬として従来よりルミノー
ル、ルシゲニン、アクリジン誘導体等が知られている
（臨床検査、１５３頁、Vol.２９、No. ２、１９８５
年）。この際ルミノールなどは、鉄錯体、ヘモグロビン
などの発光助剤により発光反応が触媒されることが知ら
れている。一方アクリジン誘導体、インドール誘導体な
どは、強塩基性下、過酸化水素、溶存酸素などの酸化剤
のみとの反応で発光が生じる。またこれらの反応と高速
液体クロマトグラフィーを用いて酸化剤などを分析、検
出する際に、ルミノールやルシゲニンをアルカリ溶液に
添加し反応液として送液し、分析対象物質と混合させて
発光させる方法が他の手法に比べて高感度であるため多
数報告されている（ぶんせき、４４２頁、No. ６、１９
８９年等）。中でもアクリジン誘導体は、標識化剤とし
てタンパク質のイムノアッセイへの利用により従来測定
不可能であったバセドウ氏病などの低濃度の血中甲状腺
刺激ホルモン（TSH ）が測定可能になるなど、発光収率
が高いことが知られている。（「生物発光と化学発光」
８７頁、広川書店、昭和６４年）

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】発光助剤を必要としな
い化学発光検出法を用いた液体クロマトグラフィーおよ
びフローインジェクション分析において、化学発光試薬
を節約すると同時に、バックグラウンドのゆらぎを低下
させ高感度な分析を可能にすることが本発明の目的であ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明による発光助剤を
必要としない化学発光試薬を固定化した充填剤（以下、
本発明に関わる充填剤と称する。）を用いることによ
り、上記目的が達成されることを見いだした。即ち、本
発明に関わる充填剤を化学発光検出器中のフローセルに
充填して用いることにより、化学発光試薬溶液を送液す
ることなしに、酸化還元物質（酸化剤及び溶存酸素存在
下では還元剤）を高感度で定量することが可能であるこ
とを見出した。

【０００５】すなわち、本発明は（１）発光助剤を必要
としない化学発光試薬を溶媒に不溶性の担体に固定化し
た化学発光検出溶充填剤、（２）上記（１）記載の充填
剤を用いる液体クロマトグラフィー及びフローインジェ
クションによる酸化還元物質の分析法に関する。

【０００６】本発明に用いられる化学発光試薬は、発光
助剤なしで酸化還元によってジオキセタン構造を経て発
光可能な化合物で、直接あるいは、アミノ基、またはカ
ルボキシル基、および水酸基、チオール基、アルデヒド
基、エポキシ基、ハロゲン基のような担体と化学結合が
可能な官能基を有する化学発光試薬であれば特に制限は
なく、アクリジン誘導体、シュウ酸誘導体、インドール
誘導体などがある。それぞれの誘導体については置換基
効果など種々調べられている（N.SUGIYAMA and M.AKUT
AGAWA:Bull.Chem.Soc.Jpn.,40,240(1967) など）。すな
わちアクリジン骨格１０位が、メチル基、エチル基、あ
るいはフェニル基などアルキル基、アリール基、アラル
キル基の電子供与性の官能基を有することで４級化され
９位にカルボキシル基あるいはそのエステル体などを有
しているものなどが挙げられる。同様にインドール骨格
の３位および／または５位には、メチル基、ヒドロキシ
ル基、あるいはフェニル基など電子供与性の官能基を有
しているものなどが挙げられる。

【０００７】本発明に関わる充填剤に用いられる溶媒に
不溶性の担体とは水または塩、有機溶媒を含む水溶液に
不溶なものであれば特に制限はなく、ナイロン、ポリス
チレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリ
カーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、及びこれ
らの共重合体及びこれらの架橋体等の合成高分子、セル
ロースやアガロースなどの天然高分子、シリカ、アルミ
ナ、チタニア等の無機物を例示することができる。な
お、これらの溶媒に不溶性の担体は、担体中にアクリジ
ン誘導体を結合させるための水酸基、アミノ基、カルボ
キシル基、エポキシ基、またはハロゲンのような官能基
を有することが必要である。またこれらの合成高分子
は、フローセルの中に充填可能であればどの様な形状で
も良いが、高密度で充填しなおかつフローセルの耐圧性
能を考えると直径数十μm 〜数百μmの球状であること
が有利である。また化学発光反応はアルカリ条件下で行
われることが多いためアルカリ溶液に不溶であることが
好ましい。

【０００８】化学発光試薬を固定化するに際しては、特
に制限はなく、そのまま直接にまたは例えばプロパンジ
アミン、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオール
ジグリシジルエーテルまたは４−アミノ酪酸のような二
官能性化合物をスペーサーとして用いて行うことができ
る。固定化反応はそれぞれの官能基に応じて適当な溶媒
中で、酸、塩基などのような触媒、または（および）カ
ルボジイミド類、N-ヒドロキシスクシンイミドまたはカ
ルボニルジイミダゾールなどのような縮合剤の存在下、
または非存在下で常法に従って行うことができる。

【０００９】このようにして得られた本発明に関わる充
填剤は、化学発光検出器中のフローセルに充填される
が、この時用いられるフローセルの形状についても特に
制限はなく、キュービックなものや平板状のものでもよ
いが、通常石英ガラス製またはふっ素化樹脂製のチュー
ブを渦巻型またはジグザグに加工した全内容積１００〜
２００μl 程度のものが受光効率を上げるためによく使
用される（図１）。またこのときの発光の検出方式につ
いても、アナログモードあるいはカウンティングモード
どちらでもよい。

【００１０】本発明に関わる充填剤をフローセルに充填
した化学発光検出器を用いた液体クロマトグラフシステ
ム及びフローインジェクションシステム（以下、本発明
に関わるシステムと称する。）を用いて酸化還元物質を
分析するに際しては、図２に示すように、溶離液の他
は、発光試薬の反応最適pHに調製した緩衝液を送るだけ
でよく、場合によっては溶離液をその最適pHにすれば溶
離液を送液するポンプのみで分析可能である。ここでア
クリジン誘導体及びインドール誘導体などは強塩基性下
が好ましい。

【００１１】酸化還元物質の中の酸化剤として特に過酸
化水素の分析は一般分析ばかりでなく特に生体関連物質
の分析の際にも有用である。このとき分析される物質は
分離カラムにより分離された後、過酸化水素生成酵素が
固定化されたポストカラムにより過酸化水素に変換され
て検出される。その使用酵素は分析対象物質に合わせて
適宜選択されるが、場合によっては一段の反応のみでな
く複数の反応を組み合わせ、最終的に得られた過酸化水
素を検出することも可能である。固定化酵素カラム技術
については既に多くの報告があるが、例えば今井一洋
編、「生物発光と化学発光」２３３頁、広川書店（昭和
６４年）などを参考にすることができる。また、本発明
は化学発光試薬によっては還元物質としてアスコルビン
酸や還元糖などについて分析にも応用することができ
る。

【００１２】本発明に関わるシステムを用いて液体クロ
マトグラフィー及びフローインジェクションを行う際の
分析条件については通常行われる塩類や緩衝液を含む溶
離液、温度範囲、および流速などを選択することができ
る。

【００１３】

【実施例】以下に、本発明に関わる充填剤および本発明
に関わるクロマトシステムを用いた分析方法について代
表的な例を示し、更に具体的に説明する。但し、これら
は説明のための単なる例示であって、本発明はこれらに
何ら制限されないのは言うまでもない。

【００１４】実施例１ グリシジルメタクリレートとグリセリンジメタクリレー
トから得られたエポキシ含有ゲル状共重合体に、プロパ
ンジアミンを反応させたアミノ基含有ゲル状共重合体
（アミノ基：乾燥ゲル１g 当り２１７μmol ）１．０g
を０．１M 炭酸水素ナトリウム水溶液２mlに分散させ、
アクリジン誘導体（4-(2- スクシンイミジルオキシカル
ボニルエチル）フェニル-10-メチルアクリジニウム-9-
カルボン酸フッ化硫酸塩 4-(2-Succinimidyloxycarbony
lethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylate fl
uorosulfonate ）１０mgを加えた５０％メタノール溶液
２mlを加え室温で４時間振とうした。ゲルを濾取し未反
応物を除去し、メタノール、蒸留水で順次洗浄し乾燥し
たのちアクリジン誘導体固定化ゲルを得た。未反応物を
HPLCで定量し、７mg固定化されていることが確かめられ
た。

【００１５】実施例２ 実施例１で得られた充填剤を化学発光検出器中のフロー
セル（内径１．０mm、長さ６００mm）のフッ素化樹脂製
チューブに充填し、本発明に関わるシステムを用いて種
々の濃度の過酸化水素水溶液を分析した。結果は図３に
示すように、過酸化水素濃度と化学発光強度との間に高
い直線関係が得られた。 分析条件 溶離液 H₂O 流速 0.5ml/min 0.1M NaHPO₄-NaOH 液 (pH11.0) 流速 0.5ml/min

【００１６】実施例３ グリシジルメタクリレートとグリセリンジメタクリレー
トから得られたエポキシ基含有ゲル状共重合体のエポキ
シ基を水により開環変性し、ついで１，４−ブタンジグ
リシジルエーテルを反応させ更に１，３−プロパンジア
ミンを反応させたアミノ基含有ゲル状共重合体（アミノ
基：乾燥ゲル１g 当り７０μmol ）１．０g を、インド
ール誘導体（6-aminoskatole）１０mgを溶解したジメチ
ルホルムアミド溶液２mlに加え室温で３０分間振とうし
た。ゲルを濾取し未反応物を除去し、メタノール、蒸留
水で順次洗浄し乾燥したのちインドール誘導体固定化ゲ
ルを得た。未反応物をHPLCで定量し５mg固定化されてい
ることが確かめられた。

【００１７】実施例４ 実施例２に於て実施例１で得られた充填剤の代わりに実
施例３で得られた充填剤を用いて、同様に過酸化水素水
溶液の分析を行った。結果は図４に示すように過酸化水
素濃度と化学発光強度との間に高い直線関係が得られ
た。

【００１８】実施例５ 実施例３に於て用いたアクリジン誘導体の代わりに１０
位がフェニル基に置換されたアクリジン誘導体を用い同
様の反応を行った。ゲルを濾取し未反応物を除去し、メ
タノール、蒸留水で順次洗浄し乾燥したのちアクリジン
誘導体固定化ゲルを得た。未反応物をHPLCで定量し８mg
固定化されていることが確かめられた。

【００１９】実施例６ 実施例２に於て実施例１で得られた充填剤の代わりに実
施例５で得られた充填剤を用いて、同様に過酸化水素水
溶液の分析を行った。結果は他のアクリジン誘導体固定
化ゲルを用いたときと同様に過酸化水素濃度と化学発光
強度との間に高い直線関係が得られた。

【００２０】

【発明の効果】本発明に関わる充填剤は溶媒に不溶性の
担体に安定な共有結合により発光助剤を用いない化学発
光試薬を結合させたものであり、多くの化学発光系の至
適pHであるアルカリ条件下でも充分に安定に使用するこ
とができ、また比較的高価な化学発光試薬を常時送液す
る必要がないので試薬の浪費を防ぐばかりでなく、その
ために起因するバックグラウンドのゆらぎが発生せず、
ノイズレベルを下げることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】フローセルの形状の例を示したものである。

【図２】本発明に関わるクロマトシステムのダイヤグラ
ムである。

【図３】アクリジン誘導体を固定化した充填剤を用いた
ときの過酸化水素と化学発光強度との関係を示す。

【図４】インドール誘導体を固定化した充填剤を用いた
ときの過酸化水素と化学発光強度との関係を示す。

【符号の説明】

１ 光透過性チューブ １Ａ 光透過性チューブ １Ｂ 光透過性チューブ ２ 反射面 ３ 突起 ４ 窓板 ５ セル板 ６ 長尺溝 ６Ａ 長尺溝 ６Ｂ 長尺溝 ７ 溶離液 ８ ポンプ ９ インジェクター １０ カラム １１ 化学発光検出器 １２ 記録計 １３ アルカリ溶液

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 発光助剤を必要としない化学発光試薬を
   溶媒に不溶の担体に固定化した化学発光検出用充填剤。
2. 【請求項２】 化学発光試薬がアクリジン誘導体である
   請求項１記載の化学発光検出用充填剤。
3. 【請求項３】 化学発光試薬がインドール誘導体である
   請求項１記載の化学発光検出用充填剤。
4. 【請求項４】 請求項１記載の充填剤を用いる、液体ク
   ロマトグラフィーまたはフローインジェクションによる
   酸化還元物質の分析方法。
5. 【請求項５】 請求項２記載の充填剤を用いる、液体ク
   ロマトグラフィーまたはフローインジェクションによる
   酸化還元物質の分析方法。
6. 【請求項６】 請求項３記載の充填剤を用いる、液体ク
   ロマトグラフィーまたはフローインジェクションによる
   酸化還元物質の分析方法。