JPH08502053A - アルジネート‐生物活性剤配合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、酸に不安定な生物分解性スペーサー結合を経由して接続されたアルジネート‐生物活性剤配合体である。この配合体は、生物活性剤を低いｐＨ環境中に存在するターゲットに、ターゲット表面に又はターゲット内部中に配達するために効果的である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 アルジネート‐生物活性剤配合体発明の背景 抗腫瘍又は抗新生物剤の由々しい欠点の一つは、それらが正常な分裂する細胞 と腫瘍細胞とを区別することができないことである。正常な分裂する細胞に作用 する時には、これらの薬剤は、望ましくない副作用、例えば嘔吐、アポレシア（ ａｐｏｌｅｃｉａ）及び骨髄毒性を引き起こす。それらの心臓毒性は、投薬量制 限に対する主な一因である。 Ｋｏｐｅｃｅｋらの米国特許第５，０３７，８８３号は、ペプチドスペーサー を通して生物活性分子と結合された、目標にする部分を有し、そして必要に応じ た橋かけ結合を有する、不活性な合成のＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタク リルアミドポリマー状担体を含む薬配合体を述べている。これらのペプチドスペ ーサーは、２〜６種の天然に産出するアミノ酸を含む。 Ｙａｎｇらのｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．８５， ｐｐ．１１８９〜１１９３（１９８８）は、ヒトの黒色腫と関係したタンパク質 多糖類（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）に向けられたモノクロナール抗体と配合さ れたドキソルビシンを述べている。この配合体は、ヌードマウスにおける定着さ れた腫瘍異種移植片の成長を抑制する。 ＤｉｌｌｍａｎらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．４８，ｐｐ． ６０９７〜６１０２（１９８８）は、遊離酸と比較しての酸に不安定なダウノル ビシン‐モノクロナール抗体免疫配合体の優位性を述べている。 ＳｈｅｎらのＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌ．１０２，ｎｏ．３， ｐｐ．１０４８〜１０５４（１９８１）は、ダウノマイシンと巨大分子担体との 間のシス−アコニチルスペーサーを述べている。発明の要約 本発明は、（ａ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び （ｂ）生物活性剤 から成り、アルジネート及び生物活性剤が生物分解性スペーサー結合を経由して 接続されている、アルジネート‐生物活性剤配合体である。好ましくは、この結 合は酸に不安定な結合である。 本発明はまた、本発明の少なくとも一種の配合体及び不活性で生理学的に受け 入れられる担体を含む製薬組成物から成る。これらの組成物は、経口的に又は注 射によって、例えば腹腔内、静脈内若しくは筋肉内注射によって投与することが できる。図面の簡単な説明 図１は、時間に関するダウノマイシン生体外放出パーセントを示す。 図２は、時間に関するダウノマイシン生体外放出μｇ／ｍｌを示す。 図３は、腫瘍細胞成長に対するダウノマイシン放出の効果を示す。発明の詳細な説明 本発明は、生物活性物質の制御された放出とアルジネートの有益な生物学的特 性との組み合わせを可能にする。無毒性アルジネートは有益な薬理学的活性を誘 発する固有の特性を示し、そして生物活性物質（薬及びプロドラグ（ｐｒｏｄｒ ｕｇｓ）を含む）に共有結合される時には、アルジネートは物質の放出の速度を 制御するために使用することができる。 アルジネートは、本明細書中で使用される時には、アルギン酸ナトリウム、ア ルギン酸のナトリウム塩又はアルギン（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１１ ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，の４ １頁を参照せよ）を指す。アルジネートは、巨大な茶色の海草（Ｍａｃｒｏｃｙ ｓｔｉｓ Ｄｙｒｉｆｅｒａ ）若しくはトクサケルプ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄ ｉｇｉｔａｔａ ）から又は糖ケルプ（Ｌａｍｉｎａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）か ら抽出されたゲル化する多糖類である。海草中では、多糖類は、混合ナト リウム及び／又はカリウム、カルシウム及びマグネシウム塩として存在する。ア ルジネートは、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．の一つの部門であるＫｅｌｃ ｏ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から商業的に入手できる。 本発明において有用な種々のアルジネートは、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｄ．，Ｈ ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｒｅ ｓｉｎｓ（１９８０）の第２章、“アルジネート”中でＩ．Ｗ．Ｃｏｔｔｒｅｌ ｌ及びＰ．Ｋｏｖａｃｓによって詳細に述べられている。本発明において最も好 ましいのは、天然に誘導された藻のナトリウムアルジネート（また“アルギン” 又は“アルギン酸ナトリウム塩”とも呼ばれる）、例えばＭｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ ． ＫＥＬＴＯＮＥ^TMの下で商業的に販売されているものである。 アルジネートはまた、例えば、Ｊａｒｍａｎらの米国特許第４，２３５，９６ ６号中で述べられたようなシュードモナス及びアゾトバクターの両方の菌株によ って製造された、微生物によって製造された多糖類、“バイオアルギン”を含む 。これらのアルジネートは、Ｄ−マンヌロン及びＬ−グルロン酸残基の部分的に アセチル化された不安定なブロックコポリマーから成る多糖類である。Ｊａｒｍ ａｎらは、製造された多糖類は、分子が部分的にアセチル化されている以外は海 草から製造されたものと類似であることを述べている。 アルジネートはマンヌロン酸及びグルロン酸の両方を含む。種々の茶色の藻か らのアルギン酸中の３種類のポリマー区分の存在が示された。一つの区分は、本 質的にＤ−マンヌロン酸単位から成る。第二区分は、本質的にＬ−グルロン酸単 位から成る。そして、第三区分は、交互するＤ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン 酸残基から成る。 異なるソースからのアルギン酸サンプル中の３つのポリマー区分の割合は、ア ルギン酸をホモポリマーのそして交互する区分に分割するための部分的な酸加水 分解を使用して測定された。 アルジネートの最も重要かつ有用な特性の一つは、カルシウム塩との反応によ ってゲルを生成させる能力である。それらの形を保留しそして応力に抵抗する点 で固体に似ているこれらのゲルは、殆ど１００％の水（通常は、９９．０〜９９ ． ５％の水及び０．５〜１．０％のアルジネート）から成る。 古典的なコロイド術語学におけるゲルは、ゲル点で生成するポリマー連鎖の橋 かけされたネットワークにその特徴的な特性を帰するシステムとして定義される 。 アルジネートは、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）例えば腫瘍ネクローシ スファクター−α、インターロイキン−６及びインターロイキン−１の製造を刺 激する能力を有する。本発明の一つの実施態様においては、アルジネートは抗腫 瘍剤に配合される。抗腫瘍剤のアルジネートへの配合は、アルジネート担体が抗 腫瘍細胞免疫反応を刺激しながら放出を制御することによって薬の治療指数を効 果的に改善する。 本発明のもう一つの実施態様においては、アルジネートは抗生物質に配合され る。これらの配合された抗生物質は、外傷を処置するために殊に有用である。こ の配合体は傷害の場所での抗生物質の放出を効果的に制御し、そしてアルジネー トは傷の治癒を促進する。 本発明は、（ａ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び （ｂ）生物活性剤 から成り、アルジネート及び生物活性剤が生物分解性結合例えば酸に不安定な結 合を経由して共有結合されている、アルジネート‐生物活性剤配合体である。 本発明の配合体は、標準的な製薬の実際に従って、好ましくは製薬上受け入れ ることができる担体又は希釈剤と、必要に応じて既知の補助剤例えば明礬と組み 合わせて、無毒性である製薬組成物においてそして治療上効果的な量で生物例え ば哺乳動物に投与することができる。これらの合成体は、経口的に、非経口的に （例えば静脈内、皮下、筋肉内若しくは骨髄内注射によって）、局所的に、又は 経皮的に（例えば経皮的、経皮の若しくは皮膚を貫く手順によって）投与するこ とができる。 経口使用のためには、本発明の配合体は、例えば、錠剤若しくはカプセルの形 で、又は水性溶液若しくは懸濁液として投与することができる。経口使用のため の錠剤の場合には、一般的に使用される担体は、ラクトース及びコーンスターチ を含む。潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウムもまた、一般に使用される。カ プセルの形の経口投与のためには、有用な希釈剤は、ラクトース及び乾燥された コーンスターチを含む。経口使用のために水性懸濁液が必要とされる時には、活 性成分を、乳化及び懸濁剤と組み合わせる。所望の場合には、ある種の甘味及び ／又は風味剤を添加しても良い。アルジネート‐生物活性剤配合体は、例えば、 アルジネートと混合し、そして引き続いてＣａＣｌ₂の添加によってゲル化させ て、アルジネートビーズを生成させることができる。アルジネートは種々のｐＨ レベル（２〜７）で異なって振る舞い、これは薬放出の一層の制御を可能にする 。 筋肉内の、腹腔内の、皮下のそして静脈内の使用のためには、通常は活性成分 の殺菌溶液が製造され、そして溶液のｐＨは、適切に調節されそして緩衝されな ければならない。静脈内の使用のためには、調合物を等張にするために溶質の全 濃度を制御しなければならない。 好ましくは、アルジネートは、Ｄ−マンヌロン酸残基から本質的に成る第一区 分、Ｌ−グルロン酸残基から本質的に成る第二区分、並びに交互するＤ−マンヌ ロン酸及びＬ−グルロン酸残基から本質的に成る第三区分から成る。 アルジネートの分子量は、患者の腎臓を通る急速な通過を防止するために十分 に大きく、そしてそれでいて妥当な時間内の通過を保証するために十分に小さく なければならない。アルジネート分子量は好ましくは約２，０００〜１，０００ ，０００である。更に好ましい分子量は、生物活性物質の投与の方法に依存する 。非経口的に投与される生物活性物質に関しては、約５，０００〜１００，００ ０の分子量を有するアルジネートが好ましい。経口的に、例えばカプセル又は錠 剤として投与される生物活性物質に関しては、２００，０００〜１，０００，０ ００のもっと高い分子量のアルジネートが好ましい。 好ましくは、アルジネートは、配合体結合がそれに結合しているアミノ基を結 合したものである。 好ましい生物活性剤は、抗腫瘍剤及び抗生物質から成る群から選ばれる。好ま しい抗腫瘍剤は、細胞に有毒な薬例えばアンスラサイクリン又はその誘導体であ る。アンスラサイクリンは、好ましくは、ダウノルビシン（またダウノマイシン 又はＤｎｍとも呼ばれる）、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃ ｉｎ）又はこれらの誘導体、更に好ましくはダウノルビシンである。好ましい抗 生物質はアモキシシリン（ａｍｏｘｙｃｉｌｌｉｎ）又はアムピシリンである。 その他の適切な生物活性物質は、アルジネートと結合するための官能ＮＨ₂基 を有するもの、例えば生物活性タンパク質若しくはペプチド、又はアルジネート との配合に先立って、適切な官能基、例えば５−アミノサリチル酸を含むように まず改質されるその他の治療化合物である。 酸に不安定な結合は、約７．４の管のｐＨで生理学的に安定でありそして酸性 条件下で加水分解的に開裂する。それにアルジネートが配合されている薬の放出 は、任意の酸性環境中で、例えば哺乳動物の胃腸管中で、炎症の場所で、腫瘍集 団内部で、又は細胞内で起きる。 を有するシスーアコニチル基であり、ここでこの基はペプチド結台を経由して楽 に結合されそしてペプチド結合を経由してアルジネートに結合されている。 好ましくは、生物活性物質が細胞に有毒な薬である時には、本発明の配合体は 、細胞に有毒な薬理学的活性を保存しそしてｐＨ依存の放出を可能にする。配合 体は、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）／リゾソームの酸性環境及び腫瘍の酸 性環境又は周囲中に細胞に有毒な薬剤を放出する。細胞に有毒な薬剤の毒性は、 錯体が中性のｐＨで血漿中で加水分解されないので減らされる。 本発明はまた、 （ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に有毒な 薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由して接 続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、約７．４のｐＨ環境に 導入すること、 （ｂ）ｐＨを減少させることによって配合体のｐＨ環境を変更すること、並び に （ｃ）アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合を加水分解することから成る 、酸性環境中に細胞に有毒な薬を放出するための方法である。 本発明はまた、 （ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に有毒な 薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由して接 続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、酸性の体の区画、例え ば胃又は腫瘍細胞中に導入すること、並びに （ｂ）アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合を加水分解することから成る 、酸性環境中に細胞に有毒な薬を放出するための方法である。 本発明はまた、 （ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に有毒な 薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由して接 続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、腫瘍細胞表面に導入す ること、並びに （ｂ）腫瘍表面の低いｐＨ周囲中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合 を加水分解して、細胞に有毒な薬を腫瘍周囲に放出することそして細胞膜を通し て細胞に有毒な薬を吸収すること から成る、細胞に有毒な薬を腫瘍に配達するための方法である。 本発明はまた、 （ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に有毒な 薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由して接 続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、新生物状態を有する患 者に導入すること、並びに （ｂ）腫瘍表面の低いｐＨ周囲中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合 を加水分解して、細胞に有毒な薬を腫瘍周囲に放出することそして細胞膜を通し て細胞に有毒な薬を吸収することすること から成る、腫瘍を有する患者中の新生物状態を治療するための方法である。 本発明はまた、 （ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に有毒な 薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由して接 続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、腫瘍細胞表面に導入 すること、 （ｂ）エンドシトーシスによって配合体を腫瘍中に吸収すること、並びに （ｃ）腫瘍内部の低いｐＨ環境中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合 を加水分解して、細胞に有毒な薬を腫瘍内部に放出すること から成る、細胞に有毒な薬を腫瘍に配達するための方法である。 本発明はまた、 （ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に有毒な 薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由して接 続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、腫瘍細胞表面に導入す ること、 （ｂ）エンドシトーシスによって配合体を腫瘍中に吸収すること、並びに （ｃ）腫瘍内部の低いｐＨ環境中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合 を加水分解して、細胞毒を腫瘍内部に放出すること から成る、腫瘍を有する患者における新生物状態を治療するための方法である。 配合体 アルジネート‐Ｓ’−Ｂ’ ［式中、Ｓ’はｐＨに敏感な生物分解性結合体であり、そしてＢ’は生物活性剤 である］ を製造するための一般的な戦略は以下の通りである： “アルジネード”は活性化されたアルジネートであり、そして“Ｓ’-Ｂ’” は活性化されたＳ’-Ｂ’である。ＥＤＣは１−エチル−３−（３−ジメチルア ミノ プロピル）−カルボジイミドである。 一般に、アルジネート‐生物活性剤配合体、好ましくはアルジネート‐細胞に 有毒な薬配合体を製造するための手順は、 （ａ）結合体を細胞に有毒な薬と合わせて結合体で改質された細胞に有毒な薬 を生成させるステップ、 （ｂ）アルジネートを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ ルボジイミドによって活性化するステップ、 （ｃ）活性化されたアルジネートをエチレンジアミンと合わせて、遊離第一級 アミン基を有するアルジネート（アルジネート‐ＮＨ₂）を生成させるステップ 、 （ｄ）結合体で改質された細胞に有毒な薬を１−エチル−３−（３−ジメチル アミノプロピル）−カルボジイミドによって活性化するステップ、及び （ｅ）活性化された結合体で改質された細胞に有毒な薬をアルジネート‐ＮＨ₂ と合わせて、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を生成させるステップを含 む。アルジネート 種々の分子量のアルジネートがＫｅｌｃｏから商業的に入手できる。分子量は また以下の手順に従って変えることができる。低分子量アルジネートの製造 〜１ＯＯｋＤａの分子量を有するアルジネートを得るための方法を以下に述ベ る。低分子量アルジネート（以下ではＦ１、Ｆ２及びＦ３と同定される）を以下 のようにアルジネート（５６）（約４２７ｋＤａの分子量を有するアルジネート ）の制御された分解によって製造した。酢酸中に溶かしたアルジネート（５６） （１％ｖ／ｖ）のサンプルを以下の条件にさらした： （ａ）１２１℃への１５分間の加熱、又は （ｂ）１０５℃への５分間の加熱、又は （ｃ）１００℃への５分間の加熱。 生成した溶液を中和し、そして次に蒸留水に対して手広く透析し、引き続いて 凍結乾燥し、そして次にＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。適切なアルジネート （〜１３１ｋＤａ）は、１００℃へ５分間加熱することによって得られた。 以下の表は、本発明の配合体を製造するために使用された種々のアルジネート を述べる。 アルジネートサンプル 参照番号 Ｍ/Ｇ 海草の種 Ｍｗ Ｍｗ/Ｍｎ 56 高い Macrocystis pyrifera 427000 3.1 55 低い 高い“Ｇ”の海草の混合 763000 2.9 58 高い Macrocystis pyrifera 689000 2.7 Asco 高い Ascophyllum nodosum 690000 3.5 Flavi 低い Lessonia flavicans 797000 2.9 − − アルジネート（５６）から 131000 2.8 − − アルジネート（５６）から 56000 2.9 F3 − アルジネート（５６）から 10000 1.9 Ｍ／Ｇはマンヌロン酸：グルロン酸比である。Ｍｗは、プルラン（ｐｕｌｌｕｌ ａｎ）標準品を使用するサイズ排除‐ＨＰＬＣによって測定された平均分子量で ある。Ｍｗ／Ｍｎは多分散性である。高い“Ｇ”の海草は、Ｌｅｓｓｏｎｉａ ｆｌａｖｉｃａｎｓ及びＬａｍｉｎａｒａ ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａを含む。アル ジネート（５８）はプロピレングリコールアルジネートである。ＭＴＴ分析法による種々のアルジネートの生物適合性評価 ポリマー及び薬を評価するために使用されるこの分析法は、可溶性テトラゾリ ウム染料であるＭＴＴを着色された水不溶性ホルマザン結晶に還元する生活力の ある細胞の能力を基にしている。この分析法は、９６のくぼみのミクロ滴定プレ ート（平底）中で実施した。 合流点では、Ｂ１６Ｆ１０細胞を以下のように分離した：媒体の除去に続いて 、細胞を殺菌したＰＢＳで２回洗浄して過剰の媒体を除去した。トリプシン‐Ｅ ＤＴＡ溶液（２ｍｌ）を添加しそしてフラスコをゆるやかに３０秒間攪拌した。 次に、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液を真空ラインに接続されたパスツールピペット を使用して取り出し、そして細胞を３７℃で１分間培養して分離を可能にした。 細胞を媒体（５ｍｌ／フラスコ）中で懸濁させ、そして１０⁴細胞／ｍｌの濃度 を与えるようにそれに応じて希釈した。 細胞を含む媒体（２００μｌ）をマルチチャンネルピペットによって各々のく ぼみ中に分配したが、例外として第一列のくぼみは媒体だけ（２００μｌ）で満 たしそして“ブランク”くぼみと名付けた（ミクロ滴定プレート読み取り装置に よって零点規正するために使用された）。１０⁴細胞／ｍｌの接種密度がＢ１６ Ｆ１０細胞にとって最適であることが以前に見い出された。何故ならば、ポリマ ー／薬を細胞めっきの２４時間後に、丁度細胞がそれらの指数関数的な相に入り 始めた時に添加することができ、そしてＭＴＴ分析法を７２時間後に実施して、 未処理対照に関して約１．５のホルマザンの吸光度に関する平均値を得たからで ある。３７℃での２４時間の培養（５％ＣＯ₂）の後で、媒体を吸引によって取 り出しそして幾つかのくぼみにおいては種々の濃度でポリマー／薬を含む媒体（ ２００μｌ、６回の反復実験）によって置き換えた。残りのくぼみを媒体だけ（ ２００μｌ）で置き換えそして“未処理対照”と名付けた。成長媒体−ＭＥＭ中 のアルジネートの乏しい溶解度（高濃度の二価金属の存在による）のために、す べてのアルジネート原料溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）は、牛の胎児の血清（１０％ｖ ／ｖ）及びＬ−グルタミン（１％ｖ／ｖ）を追加されたＨａｍのＦ１０媒体中で 製造した。次に、これらの原料溶液を濾過（Ｆｌｏｗｐｏｒｅ Ｄ、０．２μｍ のフィルター）によって殺菌し、そして細胞への添加に先立ってＭＥＭによって 希釈した。ＨａｍのＦ１０媒体に起因する細胞に対する有害な影響を、Ｈａｍの Ｆ１０媒体が同じ比でＭＥＭによって希釈されそして次に細胞に添加されるとこ ろの対照くぼみによって説明した。 ６７時間の培養（３７℃、５％ＣＯ₂）の後で、ＭＴＴの殺菌した溶液（２０ μｌ、ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ）を各々のくぼみに添加し、そしてプレートを更 に５時間の期間の間（全部で７２時間）培養器中に置いた。同じ時間の期間で、 媒体を、真空ラインに接続された皮下の針の助けによって取り出した。各々のく ぼみへの分光光度級のＤＭＳＯ（２００μｌ）の添加によってホルマザン結晶を 溶かし、そしてミクロ滴定プレート読み取り装置を使用して５５０ｎｍで吸光度 を測定した。 各々の処理の結果を適切な対照（未処理細胞）のパーセントとして表した。 以下のアルジネートをマウス黒色腫細胞系Ｂ１６Ｆ１Ｏに対して試験した： アルジネート 濃度範囲(mg/ml) 56 0.1-5.0 55 0.1-5.0 58 0.1-5.0 Asco 0.1-2.5^* Flavi 0.1-1.0^* アルジネート427 kDa 0.05-1.0 アルジネート90 kDa 0.05-1.0 アルジネート35 kDa 0.05-1.0 F3 0.05-10 ＊ それらは０．２ｍフィルターを通して濾過するには余りにも粘性すぎるので 、これより高い濃度を使用することはできなかった。 ５ｍｇ／ｍｌで毒性であったプロピレングリコールアルジネート（ＰＧＡ）を 除いて、試験したすべてのアルジネートはこれらの実験において使用された濃度 では毒性ではなかった。予期されたように、ポリ−Ｌ−リジンは非常に低い濃度 においてさえ毒性であった。ＰＧＡの毒性は、タンパク質の第一級アミン基とポ リマーの反応性エステル基との反応による細胞表面膜タンパク質の共有結合に起 因するのであろう。これは、膜の摂動及び結局は細胞死を導く可能性がある。毒 性はまた、組織培養における培養に際してアルジネートから放出されがちである プロピレングリコールから生じた可能性がある。 実施例１ アルジネート‐ＮＨ₂の製造 アルジネート（５６）（５００ｍｇ）を水（５０ｍｌ）中に溶かし、そしてＨ Ｃｌ（０．１Ｍ）によってｐＨを４．７５に調節した。固体の１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（６０ｍｇ）を添加 し、そしてＨＣｌ（０．１Ｍ）の添加によってｐＨを一定に維持した。１時間後 に、この溶液を、４０倍過剰のエチレンジアミンを含む溶液に滴加した。ＮａＯ Ｈ（０．１Ｍ）によってｐＨを４．７５に調節し、そしてこの溶液を室温で攪拌 し続けた。１時間後に、ｐＨを６に上げそして混合物を更に１時間攪拌し続けた 。次に、ＮａＯＨ（５Ｍ）によってｐＨを１２に増加させ、そしてＮａＣｌ（４ ．５ｇ）を添加した。これは、静電気的に結合されたジアミンを解離させるため に必要であった。次に、最後の溶液をまず炭酸塩緩衝液（ｐＨ １１．３）に対 してそして次に蒸留水に対して広く透析した。 先行するＥＤＣによる活性化なしでアルジネートをエチレンジアミンと混合す る対照もまた実施した。同一のプロトコールを使用して、アルジネート‐アミン 基を含むチロシンアミドを製造した。 ポリマーのアミン含量は、ｏ−フタルアルデヒド法によって推定した。アルジネート‐ＮＨ₂への配合のための生物活性剤の製造 Ｎ−シス−アコニチル‐ダウノマイシン（Ｎ−シス−アコニチル‐Ｄｎｍ） Ｄｎｍ（６ｍｇ）を１ｍｌのＮａ₂ＨＰＯ₄緩衝液（ｐＨ ９．０）中に溶かし 、そして氷の上で保持した。次に、無水シスーアコニット酸（１０ｍｇ）を攪拌 しながらゆっくりと添加し、そしてＮａＯＨ（０．５Ｍ）の添加によってｐＨを ９で保持した。この溶液を、０℃で１０分間そして次に室温１５分間混合した。 次に、反応混合物を水によって３ｍｌとし、そして氷の上に放置した。 Ｎ−シス−アコニチル‐ＤｎｍをＨＣｌ（１．０Ｍ）によって沈殿させ、そし て氷の上で０．５時間保持した。遠心分離の後で、ＮａＯＨ（０．１Ｍ）を少し 添加して、沈殿を水の中に溶かした。この精製手順を繰り返し、そしてＮａＯＨ （０．１Ｍ）を少し添加して、最後の沈殿を水（０．５ｍｌ）の中に溶かした。 生成物の濃度は、４７５ｎｍでの吸光度を測ることによって測定した。生成物は 、 ＴＬＣ（溶媒：ジクロロメタン／メタノール／酢酸／水−３０：４：１：０．５ ）によって調べた。アルジネート‐ダウノマイシン配合体の合成 アンスラサイクリン抗生物質は、最も広く使用される抗腫瘍剤である。ダウノ マイシンは、主に白血病の処置において使用されるが、すべての抗新生物剤の場 合におけるように、ダウノマイシンは、正常な分裂する細胞と腫瘍細胞とを十分 に区別せず、そして副作用例えば嘔吐、脱毛及び骨髄毒性が伴う。加えてダウノ マイシンは、しばしば投与量を限定する心臓毒性を示す。 アルジネート‐Ｄｎｍ配合体は、現存の配合体を凌ぐそしてそれらに勝る利点 を提供する。第一に、ダウノマイシンは、７．４の管のｐＨにおいて安定である 酸に敏感な結合体、即ち無水シス−アコニット酸を経由してアルジネートに結合 されている。一度巨大分子の配合体が目標細胞によって取り込まれると、薬は、 加水分解的な開裂の機構を経由してエンドソーム及びリソソームのもっと酸性の 環境中で開裂される。第二に、アルジネート担体は生体内で生物分解性であり、 そしてそれ故この担体は生物からもっと容易に除去される。 この合成のために２つのタイプのアルジネート、即ち高い’Ｍ’のアルジネー ト（５６）及びアルジネート‐チロシンアミドを使用した。後者は、配合体を^{12 5} Ｉで放射線同位元素ラベルしてその薬物動態学を研究することを可能にするた めに使用した。 Ｎ−シス−アコニチル‐Ｄｎｍの溶液（ｐＨ ７．０）に、当量の固体ＥＤＣ を添加した。この溶液を室温で２０分間攪拌し、そして次に連続的に攪拌しなが らアルジネート‐ＮＨ₂溶液（１％ ｗ／ｖ）を滴加した。この混合物を５時間 （アルジネート‐チロシンアミド‐ＮＨ₂）又は２４時間（アルジネート（５６ ）‐ＮＨ₂）反応せしめた。 遊離のダウノマイシンを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（２．６ｘ６０ｃ ｍ）上に結合されたポリマーから分離した。結合されたダウノマイシンの量は４ ７５ｎｍでの吸光度を測ることによって測定され、そしてＴＬＣを使用して遊離 のダウノマイシンは存在しないことが見い出された。生成物の構造を以下に示す アルジネート‐ダウノマイシン配合体の構造 遊離の第一級アミン基を含むアルジネートを成功裏に合成した。イオン的に結 合されたジアミンの量は殆ど無視できた。 ポリマー アミン含量（モル％） アルジネート(56) 3.7 アルジネート(56) −対照 0.09 アルジネート‐ チロシンアミド 4.5 アルジネート‐チロシンアミド‐ＮＨ₂のサンプルをＳＥ−ＨＰＬＣによって 分析した時に、それは未改質アルジネートとほぼ同じ保持時間で溶出したが、こ れは橋かけ結合又は分解が存在しなかったことを示す。 Ｎ−シス−アコニチル‐Ｄｎｍの合成は、Ｔ．Ｌ．Ｃ．（Ｒｆ_Dnm＝０．０９ 、ＲＦ_{シス-アルコニチル-Dnm}＝０．３）によって確認された。アルジネートに結合され たダウノマイシンの量を以下に示す。 ポリマー Ｄｎｍ（％ ｗ／ｗ） アルジネート−チロシンアミド−Ｄｎｍ ２ アルジネート(56)‐Ｄｎｍ １ どちらの調合物中でも遊離のダウノマイシンはＴ．Ｌ．Ｃ．によって検出され なかった（Ｒｆ_{アルシ゛ネート-Dnm}＝０）。両方のポリマーのダウノマイシン含量は低 く、そしてアルジネート上の遊離のアミン基の僅かに小さな部分だけがＮ−シス −アコニチル‐Ｄｎｍと反応した。これは、少なくとも部分的に立体障害に起因 しているらしい。もっと高い薬含量は、もっと高い量のアミン基（＞１０モル％ ）を有するアルジネートを製造し、次にこれをＮ−シス−アコニチル‐Ｄｎｍに 結合させることによって達成することができる。必要な場合には、もっと低い分 子量のアルジネートを使用することができる。 実施例２ アルジネート‐Ｄｎｍ配合体の細胞毒性 マウスの黒色腫細胞系Ｂ１６Ｆ１０の生体外での生存能力に対するアルジネー ト、アルジネート‐Ｄｎｍ配合体、ダウノマイシン及びポリ−Ｌ−リジンの効果 をＭＴＴ分析によって評価した。未改質のアルジネートは、５ｍｇ／ｍｌほど高 い濃度においてさえ毒性ではなかった。対照的に、ポリカチオンであるポリ−Ｌ −リジンは５０ｍｇ／ｍｌで毒性であった。アルジネート‐Ｄｎｍ配合体は細胞 毒性活性を示したが、これは薬の活性が配合反応を通して保存されたことを 示す。配合体は遊離の薬よりも約５００倍低い毒性であった。これは、配合体の 細胞の入り口が細胞内取り込み作用、即ち遊離の薬の進入の機構（拡散）よりも 遅いプロセスに限定されているので予期される。更にまた、生体外で観察される 毒性は、主に、調合物中の遊離の薬に起因していた。これは、ＲＰ−ＨＰＬＣに よって推定されそしてアルジネートに結合された全ダウノマイシンの０．６１重 量％であることが見い出された。 実施例３ アルジネート‐Ｄｎｍ配合体からのダウノマイシンの制御された放出 アルジネート（５６）‐Ｄｎｍ配合体のサンプルを、ｐＨ５、６及び７でクエ ン酸塩／リン酸塩緩衝液中で３７℃で培養し、そしてＤｎｍの放出をＲＰ−ＨＰ ＬＣ分析によって追跡した。結果は、ｐＨ７では４８時間にわたって放出された Ｄｎｍは殆ど存在しないことを示した。ｐＨが減少するにつれて放出の速度は増 加した。４８時間では、ｐＨ６及び５でそれぞれ全ダウノマイシンの約８％（５ ．９５ｍｇ）及び２３％（１５．７９ｍｇ）が放出された。図１は、種々の条件 下でのアルジネート‐ダウノマイシン配合体からのダウノマイシンの、４８時間 にわたるパーセント放出プロフィールを示す。図２は、種々の条件下でのアルジ ネート‐ダウノマイシン配合体からのダウノマイシンの、４８時間にわたるμｇ ／ｍｌ放出プロフィールを示す。 実施例４ アルジネート‐シス−アコニチルダウノマイシンの生体内での抗腫瘍活性 雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１０⁵の生育可能なＢ１６ｆ１０黒色腫細胞 を皮下注射した。腫瘍を定着せしめ（約７０ｍｍ²の面積）、そしてマウスの１ ｋｇあたり各々５ｍｇの投与量の遊離のダウノマイシン、アルジネート‐シス− アコニチル‐Ｄｎｍ又はアルジネート及びダウノマイシンの混合物によって一回 の腹腔内の注射を使用して処置した。腫瘍成長及び生き残り時間を監視した。 アルジネート‐シス−アコニチル−Ｄｎｍは、腫瘍成長の速度における顕著な 減少を引き起こした。図３は、数日間にわたる腫瘍面積成長を示す。 アルジネート‐シス−アコニチル−Ｄｎｍは、寿命期間における増加（１４． １％）を引き起こした。遊離のダウノマイシンは寿命期間を６．２５％だけ増加 させ、そしてアルジネート及びダウノマイシンの混合物は寿命期間を４．２５％ だけ増加させた。遊離のダウノマイシンを受けた何匹かの動物は毒性の徴候を示 した。アルジネート‐シス−アコニチル−Ｄｎｍを受けた動物はいずれも毒性の 徴候を示さなかった。それ故、実施例中で例示したよりも多い配合体投与量を投 与することが可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び （ｂ）生物活性剤 から成り、アルジネート及び生物活性剤が生物分解性スペーサー結合を経由して 接続されている、アルジネート‐生物活性剤配合体。 ２．アルジネート約２，０００〜１，０００，０００の分子量を有する、請求 の範囲１記載の配合体。 ３．アルジネートが約５，０００〜１００，０００の分子量を有する、請求の 範囲２記載の配合体。 ４．アルジネートが約２００，０００〜１，０００，０００の分子量を有する 、請求の範囲２記載の配合体。 ５．アルジネートが約６５，０００〜７５，０００の分子量を有する、請求の 範囲３記載の配合体。 ６．アルジネート約６００，０００〜８００，０００の分子量を有する、請求 の範囲４記載の配合体。 ７．アルジネートが結び付けられた官能アミノ基を有する、請求の範囲１記載 の配合体。 ８．生物活性剤が細胞に有毒な薬である、請求の範囲１記載の配合体。 ９．細胞に有毒な薬がアンスラサイクリンである、請求の範囲８記載の配合体 。 １０．アンスラサイクリンがダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン 又はそれらの誘導体である、請求の範囲９記載の配合体。 １１．アンスラサイクリンがドキソルビシンである、請求の範囲１０記載の配 合体。 １２．生物活性剤が抗菌剤である、請求の範囲１記載の配合体。 １３．抗菌剤がアモキシシリン又はアムピシリンである、請求の範囲１２記載 の配合体。 １４．生物分解性スペーサー結合が約７．４の管のｐＨで生理学的に安定であ る酸に不安定な結合である、請求の範囲１記載の配合体。 １５．酸に不安定な結合が酸性条件下で加水分解的に開裂する、請求の範囲１ ４記載の配合体。 １６．アルジネートと薬との間の酸に不安定な結合が式 を有するシスーアコニチル基である、請求の範囲１５記載の配合体。 １７．アルジネートが結び付けられた官能アミノ基を有しそしてシス−アコニ チル基がペプチド結合を経由してアルジネートに結び付けられている、請求の範 囲１６記載の配合体。 １８．（ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に 有毒な薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由 して接続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、約７．４のｐＨ 環境に導入すること、 （ｂ）ｐＨを減少させることによって配合体のｐＨ環境を変更すること、並び に （ｃ）アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合を加水分解することから成る 、酸性環境中に細胞に有毒な薬を放出するための方法。 １９．（ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に 有毒な薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由 して接続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、酸性の体の区画 中に導入すること、並びに （ｂ）アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合を加水分解することから成る 、酸性環境中に細胞に有毒な薬を放出するための方法。 ２０．酸性の体の区画が胃又は腫瘍細胞である、請求の範囲１９記載の方法。 ２１．（ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に 有毒な薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由 して接続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、腫瘍細胞表面 に導入すること、並びに （ｂ）腫瘍表面の低いｐＨ周囲中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合 を加水分解して、細胞に有毒な薬を腫瘍周囲に放出することそして細胞膜を通し て細胞に有毒な薬を吸収することすること から成る、細胞に有毒な薬を腫瘍に配達するための方法。 ２２．（ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に 有毒な薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由 して接続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、新生物状態を有 する患者に導入すること、並びに （ｂ）腫瘍表面の低いｐＨ周囲中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合 を加水分解して、細胞に有毒な薬を腫瘍周囲に放出することそして細胞膜を通し て細胞に有毒な薬を吸収すること から成る、腫瘍を有する患者中の新生物状態を治療するための方法。 ２３．（ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に 有毒な薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由 して接続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、腫瘍細胞表面に 導入すること、 （ｂ）エンドシトーシスによって配合体を腫瘍中に吸収すること、並びに （ ｃ）腫瘍内部の低いｐＨ環境中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合を加 水分解して、細胞に有毒な薬を腫瘍内部に放出すること から成る、細胞に有毒な薬を腫瘍に配達するための方法。 ２４．（ａ）（ｉ）アルジネート又はアルジネート誘導体、及び（ii）細胞に 有毒な薬から成り、アルジネート及び細胞に有毒な薬が酸に不安定な結合を経由 して接続されている、アルジネート‐細胞に有毒な薬配合体を、腫瘍細胞表面に 導入すること、 （ｂ）エンドシトーシスによって配合体を腫瘍中に吸収すること、並びに （ｃ）腫瘍内部の低いｐＨ環境中でアルジネート‐細胞に有毒な薬配合体結合 を加水分解して、細胞毒を腫瘍内部に放出すること から成る、腫瘍を有する患者における新生物状態を治療するための方法。 ２５．不活性な生理学的に受け入れられる担体と一緒の、治療上効果的な無毒 性量の請求の範囲１から１７のいずれか一つに記載の少なくとも一種のアルジネ ート‐生物活性剤配合体から成る製薬組成物。 ２６．治療上効果的な無毒性量の請求の範囲１から１７のいずれか一つに記載 の合成体、及び製薬賦形剤を含む医療調合物。 ２７．哺乳動物における新生物状態又はバクテリア感染の治療のための医療調 合物の製造のための、請求の範囲１から１７のいずれか一つに記載の合成体の使 用。 ２８．（ａ）結合体を生物活性剤と合わせて結合体で改質された生物活性剤を 生成させるステップ、 （ｂ）アルジネートを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ ルボジイミドによって活性化するステップ、 （ｃ）活性化されたアルジネートをエチレンジアミンと合わせて、遊離第一級 アミン基を有するアルジネート（アルジネ−ト−ＮＨ₂）を生成させるステップ 、 （ｄ）結合体で改質された生物活性剤を１−エチル−３−（３−ジメチルアミ ノプロピル）−カルボジイミドによって活性化するステップ、及び （ｅ）このような活性化された結合体で改質された生物活性剤を該アルジネー ト−ＮＨ₂と合わせて、アルジネート生物活性剤配合体を生成させるステップか ら成る、選ばれた分子量範囲内のアルジネート、生物分解性スペーサー結合を生 成させるための結合体化合物、及び生物活性剤から請求の範囲１から１７のいず れか一つに記載のアルジネート‐生物活性剤配合体を製造するための方法。 ２９．生物活性剤が細胞に有毒な薬である、請求の範囲２８記載の方法。