JPH08502896A - 酵母菌中でのリボフラビン合成 - Google Patents
酵母菌中でのリボフラビン合成Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、酵母菌からのリボフラビン生合成遺伝子および遺伝子生成物を記載している。更に、リボフラビンのためのベクターおよび組換え体製造法が記載されている。
Description
【発明の詳細な説明】
酵母菌中でのリボフラビン合成
本発明は、酵母菌中でのリボフラビン生合成のための遺伝子、該遺伝子でコー
ディングされた蛋白質並びに前記遺伝子および遺伝子生成物の使用下でのリボフ
ラビンの製造のための遺伝子工学的方法に関する。
エレモテチウム・アシュビイィ（Eremothecium ashbyii）またはアシュビヤ・
ゴッシュピイィ（Ashbya gossypii）のような真菌類の発酵によるリボフラビン
の製造は公知である（The Merck Index Windholz他、Merck & Co.刊、第１１８
３頁、１９８３年）。
欧州特許第４０５３７０号明細書の記載には、バシラス・サチリス（Bacillus
subtilis）からリボフラビン生合成遺伝子の形質転換によって得られたリボフ
ラビン過剰生産菌株が記載されている。
細菌および真核生物中でのリボフラビン生合成の遺伝的特徴は異なっているの
で、バシラス・サチリスからの上記の遺伝子は、真核性の生産生物、例えばサッ
カロミセス・セレビシエ（Saccharomyses cerevisiae）またはアシュビヤ・ゴッ
シュピイィを用いるリボフラビンのための組換え体製造法には適していない。
従って、課題は、リボフラビン生合成遺伝子を真核生物から単離し、該リボフ
ラビン生合成遺伝子を用い
て真核性の生産生物中でのリボフラビンのための組換え体製造法を提供すること
であった。
前記課題に応じて、酵母菌サッカロミヤス・セレビシエ中にリボフラビン生合
成の酵素のためにGTPから出発してコーディングしている６個の遺伝子（rib−遺
伝子）が見出され、かつ単離された。
前記遺伝子および該遺伝子の遺伝子生成物（ポリペプチド）は、配列プロトコ
ル中にその一次構造とともに記載され、かつ以下の分類を有する：
SEQ ID NO １：rib−１−遺伝子
SEQ ID NO ２：rib−１−遺伝子生成物（GTP−シクロヒドロラーゼII）
SEQ ID NO ３：rib−２−遺伝子
SEQ ID NO ４：rib−２−遺伝子生成物（DRAP−デアミナーゼ）
SEQ ID NO ５：rib−３−遺伝子
SEQ ID NO ６：rib−３−遺伝子生成物（DBP−シンターゼ）
SEQ ID NO ７：rib−４−遺伝子
SEQ ID NO ８：rib−４−遺伝子生成物（DMRL−シンターゼ）
SEQ ID NO ９：rib−５−遺伝子
SEQ ID NO １０：rib−５−遺伝子生成物（リボフラビン−シンターゼ）
SEQ ID NO １１：rib−７−遺伝子
SEQ ID NO １２：rib−７−遺伝子生成物（HTP−レダクターゼ）
グアノシン三リン酸（GTP）は、GTP−シクロヒドロラーゼII（rib−１−遺伝
子生成物）によって２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４−（３Ｈ）−ピ
リミジン−５−リン酸塩に変化する。引続き、前記化
合物は、rib−７−遺伝子生成物によって２，５−ジアミノリビチルアミノ−２
，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジン−５−リン酸塩に還元され、次に、rib−２−
遺伝子生成物によって脱アミン化されて５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，
４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンになる。引続き、rib−４−遺伝子生成物
触媒された反応中で、Ｃ４−化合物DBPが添加され、６，７−ジメチル−８−リ
ビチルルマジン（DMRL）を生成し、該６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン
からrib−５−遺伝子生成物触媒された反応中でリボフラビンが生成する。Ｃ４
−化合物DBP（Ｌ−３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−リン酸塩）は、
Ｄ−リブロース−５−リン酸塩から、rib−３−遺伝子生成物触媒された反応中
で形成される。
SEQ ID NO １、３、５、７、９、１１中に記載されたＤＮＡ配列は、SEQ ID N
O ２、４、６、８、１０、１２中に記載されているポリペプチドのためにコーデ
ィングしている。また、上記のＤＮＡ配列以外に、遺伝暗号の縮重の結果、別の
ＤＮＡ配列を有するが、しかし、同じポリペプチドのためにコーディングしてい
るものも適している。更に、上記のＤＮＡ配列に対して９０％以上が相同であり
、かつ同じ生物学的活料を有する遺伝子生成物のためにコーディングしているよ
うなＤＮＡ配列も本発明の対象である。この種のＤＮＡ配列は、SEQ ID NO １、
３、５、７、９、１１中に
記載されたＤＮＡ配列から出発して、例えば常用のハイブリッド形成法またはＰ
ＣＲ技術を用いて、サッカロミヤス・セレビシエとは別の真核生物から単離する
ことができる。
更に、本発明の対象は、本発明によるＤＮＡ配列の１個またはそれ以上を有す
る発現ベクターである。
同様に、本発明によるＤＮＡ配列または発現ベクターを用いて形質転換された
宿主生物は、本発明の対象に属する。有利に、宿主生物としては、真核性の生物
、特に有利にサッカロミセスまたはアシュビヤ種のものが使用される。
更に、本発明により形質転換された宿主生物が自体公知の方法で、発酵によっ
て培養され、発酵の間に軽精査っリボフラビンが発酵培地から単離され、かつ場
合によっては精製されるリボフラビンのための組換え体製造法は本発明に属する
。
rib−遺伝子およびrib−遺伝子生成物は、実施例および配列プロトコル中に記
載されたのと同様にして単離することができ、かつ特性決定することができる。
実施例
酵母菌からのリボフラビン生合成遺伝子（rib−遺伝子）のクローニング
形質転換のための複数の適当な選択マーカー（Ｍａ
ｔＯ、ｈｉｓ３Ａ１、ｌｅｕ２−３、１１２、ｕｒａ３−５２）を含有する酵母
菌株ＪＣ２ａを、rib−突然変異を誘発させることを意図してＥＭＳで突然変異
させた。レプリカ平板から単離されていたリボフラビン栄養要求性突然変異体の
蓄積試験、相補試験および成長試験は、名称ＡＪ１２６、ＡＪ１２２、ＪＡ１１
８、ＡＪ２１、ＡＪ１８およびＡＪ１２を有する単離体が、それぞれrib−遺伝
子（ribｌ、rib２、rib３、rib４、rib５およびrib７）に該当していたことを証
明した。
６個のrib−遺伝子の相応する野生型複製体を得るために、上記のrib−突然変
異体の全てを、ゲノム酵母菌ライブラリーからのＤＮＡ５０〜１００μｇを用い
て形質転換させた。
該酵母菌ライブラリーは、動原体ベクターＹＣｐ５０中に使用されており、か
つ前記の形でＡＴＣＣ（No．37415）得ることができる。この形質転換を、酢酸
リチウム法（イトウ他、J.Bacteriol.153、163、1983年）により実施した。形質
転換細胞を、ウラシルおよびリボフラビンなしの合成完全培地上の同時的にウラ
シルおよびリボフラビンプロトトロフィーに選択した。頻度は受容株に応じて１
０-4〜１０-5であった。プラスミドを、大腸菌（E.Coli）を全体の酵母菌ＤＮＡ
を用いて形質転換することおよびアンピリシリン耐性に選択ことによって正の形
質転換細胞から単離した。
rib−相補遺伝子領域を、サブクローニングによって局在化した。第１図から
明らかなように、rib１遺伝子を、マルチコピーベクター（multi-copy Vector）
ＹＥｐ３５２中でサブクローニングされ、かつプラスミドｐＪＲ３０１を生じた
１．７ｋｂ ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上に局在化した。相応して
、rib２を、２．７ｋｂ ＳａｃＩ−ＳａｃＩフラグメント（ｐＪＲ６２０中で
サブクローニングした、第２図）上に局在化し、rib３−遺伝子を１．５ｋｂ
ＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（ｐＪＲ６３３中でサブクローニングした、
第３図）上に局在化し、rib４遺伝子を１．７ｋｂ ＢｇｌＩ−ＨｐａＩＩフラ
グメント（ｐＪＲ６１中でサブクローニングした、第４図）上に局在化し、rib
５−遺伝子を２．２ｋｂ ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩフラグメント（ｐＪＲ２３５中で
サブクローニングした、第５図）上に局在化し、かつrib７−遺伝子を１．６ｋ
ｂ ＢｃｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｐＪＲ６３２中でサブクローニングし
た、第６図）上に局在化した。
相応するｐＪＲ−プラスミドの挿入を、サンガーのジデオキシ法（Dideoxymet
hode von Sanger）を用いて双方の鎖の上で配列決定した。コーディングする領
域の分析により、全ての場合に、５００ｂｐを上廻る開放読み枠を生じた。
配列プロトコル
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：BASFアクチエンゲゼルシャフト
（Ｂ）町：カール-ボッシュ-シュトラーセ38
（Ｃ）市：ルードウイッヒスハーフェン
（Ｅ）国：ドイツ連邦共和国
（Ｆ）郵便番号：D-67056
（Ｇ）電話：0621/6048526
（Ｈ）テレファックス：0621/6043123
（Ｉ）テレックス：1762175170
（ii）発明の名称：酵母菌中でのリボフラビンの合成
（iii）配列の数：12
（iv）コンピューター読み取り可能形：
（Ａ）媒体型：フロッピーデイスク
（Ｂ）コンピューター：IBM PCコンパチブル
（Ｃ）オペレーテイング システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース #1.0，バージヨン #1
.25（EPA）
（２）SEQ ID NO：１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：1747塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNS（ゲノム）
（iii）ハイボヤテイカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）本来の起源：
（Ａ）生物名：サッカロミヤス・セレビシエ
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：５’UTR
（Ｂ）位置：１..258
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：CDS
（Ｂ）位置：259..1296
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：３’UTR
（Ｂ）位置：1297..1747
（xi）配列名：SEQ ID NO：１：
（２）SEQ ID NO：２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：345アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：蛋白質
（xi）配列名：SEQ ID NO：２：
（２）SEQ ID NO：３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：3086塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNS（ゲノム）
（iii）ハイポセテイカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）本来の起源：
（Ａ）生物名：サッカロミセス・セレビシエ
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：５’UTR
（Ｂ）位置：１..592
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：CDS
（Ｂ）位置：593..2368
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：３’UTR
（Ｂ）位置：2369..3086
（xi）配列名：SEQ ID NO：３：
（２）SEQ ID NO：４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：591アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：蛋白質
（xi）配列名：SEQ ID NO：４：
（２）SEQ ID NO：５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：1529塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNS（ゲノム）
（iii）ハイポセテイカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）本来の起源：
（Ａ）生物名：サッカロミセス・セレビシエ
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：５’UTR
（Ｂ）位置：１..522
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：CDS
（Ｂ）位置：523..1149
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：３’UTR
（Ｂ）位置：1150..1529
（xi）配列名：SEQ ID NO：５：
（２）SEQ ID NO：６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：208アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：蛋白質
（xi）配列名：SEQ ID NO：６：
（２）SEQ ID NO：７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：1300塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNS（ゲノム）
（iii）ハイポセテイカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）本来の起源：
（Ａ）生物名：サッカロミセス・セレビシエ
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：５’UTR
（Ｂ）位置：１..469
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：CDS
（Ｂ）位置：470..979
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：３’UTR
（Ｂ）位置：980..1300
（xi）配列名：SEQ ID NO：７：
（２）SEQ ID NO：８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：169アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：蛋白質
（xi）配列名：SEQ ID NO：８：
（２）SEQ ID NO：９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：1879塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNS（ゲノム）
（iii）ハイポセテイカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）本来の起源：
（Ａ）生物名：サッカロミセス・セレビシエ
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：５’UTR
（Ｂ）位置：１..179
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：CDS
（Ｂ）位置：180..896
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：３’UTR
（Ｂ）位置：897..1879
（xi）配列名：SEQ ID NO：９：
（２）SEQ ID NO：10に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：238アミノ酸
（Ｂ）ART：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：蛋白質
（xi）配列の名称：SEQ ID NO：10：
（２）SEQ ID NO：11に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：2365塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の形熊：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNS（ゲノム）
（iii）ハイポセテイカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）本来の起源：
（Ａ）生物名：サッカロミセス・セレビシエ
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：５’UTR
（Ｂ）位置：１..1344
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：CDS
（Ｂ）位置：1345..2079
（ix）特徴：
（Ａ）名称/記号：３’UTR
（Ｂ）位置：2080..2365
（xi）配列の名称：SEQ ID NO：11：
（２）SEQ ID NO：12に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：244アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：蛋白質
（xi）配列の名称：SEQ ID NO：12：
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ガルシア−ラミレス，ホセ ハヴィエル
スペイン国 エ―26190 ナルダ カルヴ
ァカ 13
(72)発明者 ゴンザレス−エルナンデス，グロリア ア
ンゲリカ
メキシコ国 200070 アクアスカリエンテ
ス プリヴァダ アンブロシオ ムノス
104
(72)発明者 ブウィトラゴ セルナ，マリア ホセ
スペイン国 エ―37004 サラマンカ ア
ベニダ デ ロス セドロス 33
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．ＤＮＡ配列において、SEQ ID NO ２中に記載されたアミノ酸配列を有するポ リペプチドのためにコーディングすることを特徴とする、ＤＮＡ配列。 ２．ＤＮＡ配列において、SEQ ID NO ４中に記載されたアミノ酸配列を有するリ ペプチドのためにコーディングすることを特徴とする、ＤＮＡ配列。 ３．ＤＮＡ配列において、SEQ ID NO ６中に記載されたアミノ酸配列を有するポ リペプチドのためにコーディングすることを特徴とする、ＤＮＡ配列。 ４．ＤＮＡ配列において、SEQ ID NO ８中に記載されたアミノ酸配列を有するポ リペプチドのためにコーディングすることを特徴とする、ＤＮＡ配列。 ５．ＤＮＡ配列において、SEQ ID NO 10中に記載されたアミノ酸配列を有するポ リペプチドのためにコーディングすることを特徴とする、ＤＮＡ配列。 ６．ＤＮＡ配列において、SEQ ID NO 12中に記載されたアミノ酸配列を有するポ リペプチドのためにコーディングすることを特徴とする、ＤＮＡ配列。 ７．発現ベクターにおいて、請求項１から６までのいずれか１項に記載の１個ま たはそれ以上のＤＮＡ配列を有することを特徴とする、発現ベクター。 ８．リボフラビンのための組換え体製造法において、請求項７に記載の発現ベク ターを使用することを特 徴とする、リボフラビンのための組換え体製造法。 ９．宿主生物において、請求項７に記載の発現ベクターを用いて形質転換されて いることを特徴とする、宿主生物。
Applications Claiming Priority (3)
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