JPH07504332A - 黒色アスペルギルスカタラーゼ−ｒの産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高いレベルの内因性カタラーゼ酵素（ｃａｔＲ遺伝子産生物、カタラ ーゼ−Ｒ）を産生ずる一方で、グルコン酸ナトリウム老廃物を最小限しか産生じ ない黒色アスペルギルス（＾印ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）の新しい菌株 を産生ずる遺伝工学技術の適用に関するものである。特に、内因性ｃａ　ｔＲ遺 伝子プロモーターを黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子プ ロモーターで置換することにより、高いレベルのカタラーゼ−Ｒが産生される。

黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ遺伝子プロモーターを用いた結果、カタラ ーゼ−Ｒが高いレベルとなるだけでなく、カタラーゼを合成するための誘導物質 として機能する過酸化水素が必要なくなる。また、内因性グルコースオキシダー ゼ（ｇｏｘＡ）遺伝子を使用しないことにより、グルコン酸ナトリウム老廃物の レベルが大幅に減少し、それにより、高価な老廃物を取り扱う必要性が最小限と なる。

発明の背景 カタラーゼ［過酸化水素：過酸化水素オキシドレダクターゼ（ＥＣ１，１１゜１ ．６）］は、以下の化学式にしたがって過酸化水素（Ｈ２０２）が酸素（０□） および水（Ｈ２Ｏ）へ転化するのを触媒する酵素である二これらの混存酵素は様 々な動物組織、植物および微生物から精製されてきた（チャンスおよびメーリー １９５５Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　２　：　７６４−７９１　；ジョ ーンズおよびウィルソン１９７８、Ｈ，シンゲル（編集者）、生物学系における 金属イオン、第７巻、マーセル　デツカ−社、ニューヨーク）。特徴のあるほと んど全ての形態の酵素は、４つのポリペプチドサブユニットからなり、各々のサ ブユニットは５０，０００から６０．０００までの範囲の分子量を有し、サブユ ニット当たり１つのプロトヘミン補欠分子族を有している（ワッサーマンおよび ハルチン１９８１Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２１２　 ：　３８５−３９２　；　バーティグおよびルイス１９８６Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１６０　；４ｇ？　−４９０）。ウシ肝カタラーゼはこの種の酵 素でもっとも広く研究されたものである［ションバウムおよびチャンス１９７６ 酵素（Ｐ、　Ｄ、ボイヤー、編集者）第３版、第１３巻、３６３−４０８頁、ア カデミツクプレス、ニューヨーク）。ウシ肝カタラーゼの完全なアミノ酸配列お よび三次元構造は公知である（シュレダー等、１９８２Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２１４　：　３９７−４１２　；　７−シー等、１ ９８１Ｊ、蓋ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５２　：　４６５−４９９　）。

生化学的見地および生化学的見地からはよく研究されていないけれども、糸状菌 類から得たカタラーゼには、それらを哺乳類から得たカタラーゼとは区別される いくつかの特徴がある。サブユニット数およびヘム含有量（ｈｅｍｅ　ｃｏｎｔ ｅｎｔ）においては類似しているが、菌類カタラーゼ（ｆｕｎｇａｌ　ｃａｔａ ｌａａｅ　）は、他の微生物から得たカタラーゼより相当大きい分子であり、８ ０．０００から９７．０００までの範囲におよぶサブユニット分子量を有する（ パンシュタイン等、１９８６Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８８　：６３−７ ２．ジャコブおよびオーム−ジョンソン１９？９Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８　：　 ２９６７−２９７５　；ジョーンズ等、１９ｇ７Ｂｉｏｃｈｉｔ　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ａｃｔａ９１３　：　３９５−３９８　）　ｏより重要なことには、黒色 アスペルギルスのような菌類からのカタラーゼは、５ＤＳ１グルグルアルデヒド による不活化に対して、そしてタンパク質分解に対してウシ肝カタラーゼよりも 安定であり、シアン化物、アジドおよびフッ化物のようなカタラーゼ阻害因子に 対する親和性が低い（ワッサーマンおよびハルチン１９８１Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２１２　：　３８５−３９２　）　ｏさらに、 黒色アスペルギルスカタラーゼは、極端なｐＨ１過酸化水素および温度にさらし た場合にウシ肝カタラーゼより著しく安定である（スコツトおよびハマ−１９６ ０Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ　２２　：　２２９−２３７　）　ｏ菌類カタラーゼ は安定性という利点を有しているが、菌類カタラーゼに対応するウシ肝カタラー ゼのような哺乳類酵素は一般的により高い触媒活性を有する（グラフト等、１９ ７ｇ　、キクチートリイ等、１９８２）。しかしながら、酵素の安定性は、酵素 を生物工学的に使用する際の重要な要素であるので、特に高濃度過酸化水素の中 和を必要とする用途について、菌類カタラーゼを使用することに多大な関心が寄 せられている。バスデバンおよびウェイランド（１９９０Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１ ．　Ｂｉｏｅｎｇ、　３６：７８３〜７８９）は、Ｈ２０□中の非活性化の速度 は、ウシ肝カタラーゼよりも黒色アスペルギルスカタラーゼのほうが少なくとも １桁低いことを発見した。これらの２種類の酵素の安定性の差異はおそらく、そ のタンパク質の組成−および構造特性における差異に帰するものであろう［バス デバンおよびウェイランド、１９９０Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．　Ｂｉｏｅｎｇ、 　３６　：　７８３−７８９　］。

診診断酵素キラのために、グルコースからのグルコン酸ナトリウムの酵素的産生 のために、Ｈ，Ｏ□老廃物の中和のために、食品と飲料中への０２の生成および ／またはＨ，Ｏ□の除去のために、黒色アスペルギルスからのカタラーゼ標品が 市販されている。従来より、ウシ肝カタラーゼは診断目的と製薬関連用途につい て好ましい酵素であった（例えば、コンタクトレンズの洗浄／消毒／Ｈ２Ｏ２中 和）。しかしながら、ヨーロッパのウシの群にＢＳＥ　（ウシ海綿状エンセファ ０バシー）として知られている遅発ウィルス病が最近発生したこと、およびこの 病気が人間に広がるかもしれないという恐れ［ディーラ−およびラシー１９９１ Ｎｕｔｒ。

Ｂｅａｌｔｈ　（パイセスタ−）　７　：　１１７−１３４　；ディーラ−およ びラシー１９９０Ｆｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７　：　２５３−２８０１の ために、はとんどの工業用途のためにウシ肝カタラーゼの代替物を発見すること に関心が集まっている。

黒色アスペルギルス中でカタラーゼの合成を調節することに関する情報はほとん ど公表されていない。しかしながら、グルコースまたは脂肪酸上で微生物が成長 している間に、Ｈ２Ｏ２の生成に対応してカタラーゼが産生されることが分って いる。例えば、グルコースの代謝中、糖を酸化してグルコン酸塩を得ることによ りＨ２Ｃ，が形成される。酵素であるグルコースオキシダーゼによりこの反応は 触媒される・ 脂肪酸の細胞代謝によっても、カタラーゼの形成を誘発するＨ２Ｏ２が生成され る。その細胞代謝は、ベルオキシソームとして知られている特定の小器官中で行 なわれる。しかしながら、わずかに関連する菌類（酵母）、サツカロミセス属セ レビンアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、その菌類の脂肪酸上での成長中 に特定のカタラーゼが誘発される。カタラーゼ−Ａ（異型）と称するこのカタラ ーゼは、脂肪酸の酸化が行なわれるベルオキシソーム中に主に制限される。第２ のサツカロミセス属セレビシアエ酵素、カタラーゼ−Ｔ（定型）は、様々な他の 代謝ストレスおよび環境ストレスに応じて合成される溶性細胞質酵素である。こ れらの２つの酵母カタラーゼは、ＣＴＡｌおよびＣＴＴＩと称する２つの異なる 核遺伝子の産生物である。同様に、２つのカタラーゼ遺伝子を黒色アスペルギル ス（ジェネンカー　インターナショナル社、非公表）から単離した。酵母ＣＴＡ Ｉ遺伝子に対する交雑によりクローニングされた黒色アスペルギルスｃａｔＡ遺 伝子は、脂肪酸上での成長中に主に誘発され、おそらくはベルオキシソーム中に あるカタラーゼ酵素をコード化する。この酵素（カタラーゼ−Ａ）はこの時点で は商業的には重要なものではないが、ｃａｔＲと称する２番目にクローニングさ れた黒色アスペルギルス　カタラーゼ遺伝子は、市販のカタラーゼ標品において 主要な活性を示す溶性細胞質酵素（カタラーゼ−Ｒ）をコード化する。

黒色アスペルギルス　カタラーゼに対して明確な商業的関心がもたれているため に、多量のｃａｔＲ遺伝子産生物を産生する黒色アスペルギルス菌株を得ること が好ましい。さらに、誘発物質として過酸化水素を産生ずる必要なく高いレベル のカタラーゼ合成を行なうことが非常に好ましい。過酸化水素の生成には、廃棄 物処理の問題を呈するグルコン酸ナトリウムの形成が伴う。したがって、黒色ア スペルギルスのカタラーゼ産生菌株による大規模な発酵において、グルコン酸塩 の産生を最小限とすることが非常に望ましいことである。本発明はこれらの目的 の全てを同時に達成する解決策を開示する。

発明の概要 カタラーゼ合成の誘発物質として過酸化水素を供給する必要なくカタラーゼ−Ｒ （ｃａｔＲ遺伝子産生物）の発現を増大できることを発見した。同時に、グルコ ースオキシダーゼ遺伝子の発現を排除することにより（ｇｏｘＡ遺伝子の欠失に より）、グルコン酸塩老廃物の産生を最小限とし、それにより、高価な老廃物の 処理工程が必要なくなることを発見した。

本発明は、黒色アスペルギルス　グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子のプロモ ーター要素とターミネータ−要素が機能的に付着した黒色アスペルギルス　カタ ラーゼ−Ｒ（ｃａｔＲ遺伝子）をコード化する遺伝子を提供する。それと共に、 黒色アスペルギルス　グルコースオキシダーゼ（ｇｏｘＡ）遺伝子の暗号領域を 、標的とした遺伝子置換戦略を用いて破壊した。本発明はまた、過酸化水素を誘 発することなく高いレベルのカタラーゼ−Ｒを発現できる形質転換黒色アスペル ギルス微生物を提供する。この微生物は、ｃａｔＲ遺伝子からなる機能発現ユニ ットを含有している。このｃａ　ｔＲ遺伝子に、黒色アスペルギルスｇｌａＡ遺 伝子プロモーター配列およびターミネータ−配列が機能的に付着している。

本発明は、黒色アスペルギルスｇｌａＡプロモーターの操作的な制御下でＣａｔ Ｒ遺伝子の染色体的に完全なコピーを含有する形質転換黒色アスペルギルス細胞 を成長せしめることからなる、多量のカタラーゼ−Ｒの産生方法を開示している 。

図面 第１図は、黒色アスペルギルスｇａ　ＩＡプロモーター、ｃａｔＲ暗号領域、ｇ ｌａＡターミネータ−および黒色アスペルギルスｐｙ　ｒＧ遺伝子を含むｅａｔ Ｒ発現プラスミドの構成を模式的に示した図である。Ｎｏｔ■およびＰｍｅｌで 切断することによりこれらの生物を有する線状断片（Ｅ　Ｃ２Ｌ）を削除し、こ の線状断片を、宿主菌株黒色アスペルギルスΔｇｏｘＡ　ｐｙｒＧ　ｍｅｔｃを 形質転換するのに用いた。

第２図は、黒色アスペルギルスｃａ　ｔＲ遺伝子のヌクレオチド配列および推測 したアミノ酸配列並びにフランキング領域を示した図である。６つのヌクレオチ ドおよび５つのヌクレオチドを認識する酵素の制限部位も示している。イントロ ンを点線で表示している。カタラーゼ−Ｒタンパク質から直接配列決定されたペ プチドに対応する推測アミノ酸配列を実線を用いて下線で示している。

第３図は、黒色アスペルギルスΔｇｏｘＡ　ｐｙｔＧ　ｍｅｔＣを形質転換する のに用いた線状断片（Ｅ　Ｃ２Ｌ）の完全なヌクレオチド配列である。

第４図において、パネルＡは、グルコースオキシダーゼ（ｇｏｘＡ）遺伝子を欠 失するための黒色アスペルギルスベクターの構成を示した概略図である。Ｓｍａ ｌ−Ｃｌａｌ区域を含有する線状断片を削除して、宿主菌株黒色アスペルギルス ｐｙ　ｒＧを形質転換するのに用いた。パネルＢは、結果としてｇｏｘＡ暗号領 域を黒色アスペルギルスｐｙｒＧ遺伝子で置換することになる。ｇｏｘＡ座での 予期した組込み操作を示す図である。

第５図は、ｃａ　ｔＲ発現カセット（Ｅ　Ｃ２Ｌ）により形質転換した黒色アス ペルギルスΔｇｏｘＡ　ｐｙｒＧ　ｍｅｔＣの菌株中のカタラーゼ産生を示すグ ラフである。元の親菌株である黒色アスペルギルスＦＳ−１および宿主菌株黒色 アスペルギルスΔｇｏｘＡ　ｐｙｒＧ　ｍｅｔＣを対照として含む。各々の菌株 について２つずつ成長させた。各々からの検定結果を示す。

実施例 ｃａｔＲ発現ベクターの構成および改良カタラーゼ産生菌株を誘導するのに用い た遺伝子変更を詳細に記載する。以下の実施例において様々な変更を行なえるこ とが当業者には理解されよう。したがって、実施例は限定を意図したものではな い。

黒色アスペルギルスｃａｔＲ遺伝子のクローニングおよびｃａｔＲ発現カセット の構成に用いた技術は、サムプルツク等の１９８９　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ　、＾Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎｕａｌ　（コールド　スプリング　ハーバ−プレス、コ ールド　スプリング　ハーバ−、ニューヨーク）に記載されている従来の技術で ある。

１、　黒色アスペルギルスｃａｔＲ遺伝子のクローニングおよび特徴付は精製し たカタラーゼ−Ｒを黒色アスペルギルス　カタラーゼの市販の標品（ファームコ ラーゼ１０００、ジェネンカー　インターナショナル社）から得て、一連のタン パク質分解断片を産生じた。これらのペプチド断片についてアミノ酸配列分析を 行なった。アミノ酸配列情報を用いて、λｇｔｌｌライブラリーにおけるＣａｔ Ｒ特異的ｃＤＮＡ配列を同定するための合成りＮＡプローブを設計した。手短に 言うと、ペプチド断片Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔを用いて、下記の配列： を有する３つの合成オリゴヌクレオチドのプール（ｐｏｏｌ）を設計した。

そのアミノ酸からは最小限の変性コドンしか選択されないので、このペプチドを 選択した。３つの合成オリゴヌクレオチドにおける差異は、黒色アスペルギルス の既知のコドン使用パターンにおいて強い偏りがなかった場合に二者択一的なコ ドンの選択を示す。このタンパク質分解断片のこの位置は、第２図に示したペプ チド３に対応する。部分的なｃＤＮＡ断片を有するクローンは、合成りＮＡプロ ーブによる雑種形成により明確に同定され、このクローンについてヌクレオチド 配列分析を行なって、このクローンがカタラーゼ−Ｒをコード化したことを明ら かにした。このクローニングしたｃＤＮＡ断片を用いて、黒色アスペルギルスゲ ノムＤＮＡのライブラリーをプローブした。続いて、金縁（ｅｎｔｉｒｅ）　ｃ 　ａ　ｔ　Ｒ遺伝子およびその上流と下流の転写調節要素を、９．ＯｋｂのＨｉ ｎｄｌｌＩ−Ｘｈｏｌ制限断片として組み立てた。ｃａ　ｔＲ暗号領域のヌクレ オチド配列を決定し、第３図に示す。

２、　黒色アスペルギルスの形質転換に用いたカタラーゼ発現ベクターー力セッ ）　（ＥＣ２）の構成 これらの研究に用いたｃａ　ｔＲ発現ベクターには、よく特徴付けが行なわれた 黒色アスペルギルス　グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子からの転写および翻 訳コントロール信号を利用する。ｃａｔＲプロモーターとは異なって、強いｇ１ ａＡプロモーターには、誘発のためにＨ２０ｘを必要としない。その代わりに、 ｇｌａＡプロモーターは、でんぷん、マルトースまたは他のマルト−オリゴ糖の 存在に応答する（ナンベシレグ等、１９８４１［ｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、　４　：　２３０６−２３１６　；バートン等、１９７２Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、　１１１　：　７７１−７７７　；　７＊−ラー等、１９９０Ｃｕｒｒ 、　Ｇｅｎｅｔ。

１ｇ　：　５３７−５４５　）。したがって、ｇｌａＡプロモーターを使用する ことにより、カタラーゼ合成を誘発するための過酸化水素の生成に依存しないカ タラーゼ産生菌株を構成することができる。ｇｌａＡプロモーターの転写コント ロール下でカタラーゼを発現するためのベクター−カセットの構成を第１図に概 略を示す。この構成の基本的な特性は、グルコアミラーゼ−カタラーゼ発現ユニ ット（すなわち、ｇｌａＡプロモーター＋ｃａ　ｔＲ暗号領域十ｇｌａＡターミ ネータ−）および隣接する選択可能なマーカー（黒色アスペルギルスｐｙｒＧ遺 伝子）は、１つのＮｏ　ｔ　Ｉ　−Ｐｍｅ　Ｉ制限断片上で削除できる（第１図 ）。

ｇｌａＡプロモーター中のＢｇｌ１１部位によりｃａ　ｔＲ暗号領域およびｇ１ ｍＡ１ａＡプロモーターのＤＮＡ区域をｃａｔＲ開始コドン（部位方向付は突然 変異誘発により導入された）から４つの塩基対後の特異的な５ｓｐ１部位に結合 させるように設計し、合成オリゴヌクレオチドリンカー（１３塩基対）を用いて ＣａｔＲ暗号領域をｇｌａＡプロモーターに結合させた。このリンカ−の挿入に より、ｃａ　ｔＲのヌクレオチド配列を、部位方向付は突然変異誘発の前に存在 し、ｃａｔＲ暗号領域をｇｌａＡプロモーターに正確に融合するヌクレオチド配 列に修復する。フォーラ−等（１９９０Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８　：　 ５３７−５４５　）により与えられたｇｌａＡプロモーター領域の記載において 、高いレベルの発現に必要とされる開始コドンのかなり上流にＤＮＡ配列がある ことが注記されている。これらの配列”は、ｃａｔＲ発現カセットの構成に含ま れる１、９ｋｂのｇｌａＡプロモーター区域上に含まれる。これらの配列はおそ らく転写エンハンサ−因子を示すであろう。

同様に、カタラーゼ−Ｒ遺伝子終止コドンの下流にある天然発生Ｃ１ａ１部位に よりｇｌａＡターミネータ−区域をｃａ　ｔＲの３′−末端に連結した。Ｃｌａ Ｉ部位に隣接するＸｂａＩ部位を、合成りＮＡクリンカを用いて取り込み、ター ミネータ−融合を完了するのに用いた。このターミネータ−区域は、ジェネンヵ ーのキモシン発現ベクターに用いた区域と同一の区域である（クレン等、１９８ ７Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．５　：　３６９−３７６　）　。このターミネータ −区域は、適切なポリアゾニレ−ジョンと転写の終止に必要な情報をコード化す る。黒色アスペルギルスｐｙｒＧ遺伝子を含有する制限断片（ウィルソン等、１ ９８８Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　：　２３３９）を、金縁のグ ルコアミラーゼ−カタラーゼ−選択可能マーカーカセットを１つの制限断片（こ の断片（Ｅ　Ｃ２Ｌ）のヌクレオチド配列は第３図に示している）上にコード化 するように、ｇｌａＡターミネータ−に隣接してサブクローニングした。

３、カタラーゼの産生に用いるべき黒色アスペルギルス菌株の開発グルコアミラ ーゼ−カタラーゼのカセットを発現するための宿主として用いた黒色アスペルギ ルス菌株の特徴としては、ａ）　ウリジン要求の栄養素要求性、特にｐｙｒＧ栄 養素要求性突然変位、ｂ）　グルコースオキシダーゼをコード化する遺伝子、ｇ ｏｘＡの欠失、および Ｃ）　メチオニン要求の栄養素要求性、特に細胞をシスタチオカーゼ（ｍｅｔＣ ）活性の欠損したものにする突然変位が挙げられる。ｍｅｔＣマーカーは高いレ ベルのカタラーゼ−Ｒの発現には必要とされないが、このマーカーは、政府の規 制機関（ｇｏｖｅｒｍｅｎｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ａｇｅｎｃｉｅｓ　）の 制限生存能力規定（ｓｕｒｖｉｖａｂｉｌｉｔｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を満 足するために宿主菌株の特性として含んだ。上述したカタラーゼ発現カセットを 用いて、黒色アベルギルスΔｇｏｘＡ　ｐｙｒＧ　ｍｅｔＣ菌株を形質転換し、 産生じた形質転換体を、高いレベルのカタラーゼを産生する能力について振とう フラスコ培養体中でスクリーニングした。これらの形質転換体から、最高のカタ ラーゼ産生体をさらなる研究のために選択した。振とうフラスコ培養体を、以下 のレシピにしたがって作成した５０ｍ１の液体培地中、３３℃で２日間に亘り成 長させた：各々１リットルの培地を作成するために、マルトデキストリン［スタ レイ２００　、Ａ、Ｅ、スタレイ社、（１００ｇ）　］　、硫酸アンモニウム（ ４ｇＬ塩化カルシウム（０，４ｇ）、硫酸マグネシウム（０，６ｇ）　、コーン ステイープリカー［アーカー　ダニエルミツドランド社、（１０ｇ）］　、およ びリン酸カリウム（３ｇ）を加える；蒸留水で容量を５００　ｍ　ｌにし、ｐＨ を７．０に調節し、溶液をオートクレーブした；それとは別に、蒸留水中で１２ ％の炭酸カルシウムの溶液５００　ｍ　ｌを作成し、ｐＨを７．０に調節し、溶 液をオートクレーブした。２つの殺菌混合物を無菌状態で混合し、１リツトルの カタラーゼ産生培地を得た。２日間におよび成長させた後、濾過により菌糸を収 穫しくミラクロス、カルバイオケム社）、細胞を液体窒素中で迅速に冷凍した。

電気コーヒーグラインダー中で約６０秒間、または微細な粉末が得られまで、冷 凍ペレットを粉砕することにより細胞を粉砕した。粉砕した細胞を、１００　ｍ Ｍの蟻酸ナトリウム、ｐＨ７，０，０１％のドデシル硫酸ナトリウム、および各 々１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物ならびにペプスタチンを含有する 抽出物緩衝液中で再度懸濁させた。約１５００　ｇでの遠心分離により不溶性デ ブリ（ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、抽出物中の溶性カタラーゼの活性を前述した方 法により測定した（パティおよびボネットーモーリー、１９５３Ｂｕｌｌ　Ｓｏ ｃ、　Ｂｉｏｌ、　３５　：　１１７７　；テラニジ等、１９７４Ａｇｒｉｃ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｉ、３８　：　１２１３）　ｏカタラーゼ産生微生物を産 生ずる特定の方法を以下に概説する。ここに記載する全ての研究に用いた親菌株 は、黒色アスペルギルスＦＳ−１（ＮＲＲＬ３）であった。

黒色アスペルギルスＦＳ−１ｐｙｒＧ菌株の単離オロチン酸の中毒性類似体（ａ ｎａｌｏｇ）である５〜フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）を用いて、糸状菌類並 びに酵母においてウリジン要求の栄養素要求株を選択した（）７ンハーテイング フエルト等、１９８７Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、２０６　：　７ｌ−７ ５）。

オロチジン−５′−モノホスフェート　デカルボキシラーゼ（ｐｙｒＧ遺伝子産 生物）中で欠失している菌類菌株は、ＦＯＡに対して耐性であり、成長のための 外因性ウリジンを要求する。黒色アスペルギルスｐｙ　ｒＧ遺伝子をクローニン グしくウィルソン等、１９８８Ｎｕｃ１．＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　：　２ ３３９）　、Ｉ）　Ｖ　ｒ　Ｇ変異体菌株の形質転換のための選択可能なマーカ ーとして用いた。ｐｙｒＧ栄養素要求株のための陽性選択としてＦＯＡを使用す る利点は、過剰の突然変異誘発およびスクリーニングを必要とせずに自発的変異 体を選択できることにある。黒色アスペルギルスＦＳ−１ｐｙｒＧ変異体を選択 する方法は以下のとおりである：黒色アスペルギルスＦＳ−１の胞子を、２ｍｇ ／ｍｌのウリジンおよび１．２ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含有する最小培地プレート の表面上に広げた。耐性コロニー（ＦＯＡ’）カ、３７℃での２−３日間の成長 後に明らかとなった。６つのＦＯＡ’コロニーからの胞子を、ＦＯＡを含有する 新鮮な培地上に線条接種し、単離したコロニーを分析のために採取した。６つの ＦＯＡ’コロニーのうちの３つは、成長のためにウリジンを要求することが示さ れた。どのウリジン要求の菌株が非機能的ｐｙｒＧ遺伝子を有するか否かを測定 するために、アスペルギルス　ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝 子を含有するプラスミドにより形質転換される（すなわち、補助される）能力に ついて各々の菌株を試験した。１つの菌株（ＦＳ−１ｐｙｒＧ１）のみが、ｐｙ ｒＧ突然変異を担持したことを示す形質転換体（１ｇｇのＤＮＡ当たり約１０の 形質転換体の頻度）を形成した。この菌株を続いての実験に用いた。

黒色アスペルギルスＦＳ−１ΔｇｏｘＡ菌株の産生ｇｏｘＡ遺伝子中で染色体を 削除するために、ｇｏｘＡ遺伝子からの５′−および３′−フランキングＤＮＡ 配列と、ｇｏｘＡ暗号領域の部分に挿入された選択可能ｐｙ　ｒＧ遺伝子とを含 有するベクターを構成した（第４図を参照のこと）。

ｇｏｘＡ遺伝子のヌクレオチド配列に関する完全な情報については、フレデリッ ク等、１９９０Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｉ、２６５　：３７９２−３８０２お よびクリークバウム等、１９８９ＦＥＢＳＬｅｔｔ、２５５　：６３−６６を参 照のこと。手短に言うと、黒色アスペルギルスＦＳ−１ｇｏｘＡ遺伝子を含む４ ．１ｋｂのＣ１ａＩ−Ｓｍａｌ断片をｐＵｃ２１Ｂ−誘導体（ＥｃｏＲ１部位を そこからあらかじめ除去した）中にサブクローニングし、ｐＵｃ２１８ｇｏｘＡ を得た。いずれかの末端に２７ｂｐと１６ｂｐのｐＵｃ４Ｘｔ。

ポリリンカーＤＮＡを有するＥｃｏＲＩ断片として、黒色アスペルギルスｐｙｒ Ｇ遺伝子をｐＵＣ４ＸＬから単離した。ＥｃｏＲＩによる切断を行なって、ｇ。

ｘＡ暗号領域を続いて除去し、残りのプラスミド断片を、黒色アスペルギルスｐ ｙｒＧ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ断片に連結してｐＵｃ２１８ΔｇｏｘＡを産 生した。このプラスミドから、ｇｏｘＡ遺伝子の５′−および３′−フランキン グ領域を含有するｇｏｘＡ暗号配列の部分が除去されて機能的ｐｙｒＧ遺伝子に より置換された４、７５ｋｂのＳｍａｌ−Ｘｂａｌ制限断片を単離した。ウリジ ン原栄養体性の選択により黒色アスペルギルスＦＳ−１，ｐｙｒＧｌを形質転換 するためにこの断片を使用した結果、グルコースオキシダーゼ　インジケータプ レート上で青色とならなかったいくつかの菌株を単離することになった（ウィツ トビーン等、１９９０＾ｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ 、　３３　：　６８３−６８６　）　ｏ　これらのｇｏｘＡ−欠損形質転換体か ら抽出したゲノムＤＮＡのサザンプロット分析により、ΔＨｏｘＡ：　：ｐｙｒ ＧカセットはｇｏｘＡ座で相同組換え操作により統合されたことが示された（第 ４Ｂ図に図示した）。言い換えれば、選択可能なｐｙｒＧ遺伝子がｇｏｘＡ暗号 領域を置換したことになる。

第５図に示すように、ΔｇｏｘＡ変異体中でのカタラーゼ産生は、親菌株ＦＳ− １より約３分の１から約６分の１であった。これらのデータは、グルコースオキ シダーゼが存在しない場合に、過酸化水素がほとんど産生されず、代わりにカタ ラーゼの産生に悪影響を及ぼすことを示すものと解釈される。

黒色アスペルギルスＦＳ−１ΔｇｏｘＡ　ｐｙｒＧ菌株の単離上述したようにＦ ＯＡを用いて、黒色アスペルギルスΔｇｏｘＡの自発的ウリンン要求の変異体を 選択した。この工程は、ｐｙｒＧをベースとするＥＣ２カセツトによる菌株の続 いての形質転換に必要であった。

黒色アスペルギルスＦＳ−１ΔｇｏｘＡ　ｐｙｒＧ　ｍｅｔＣ菌株の単離環境中 における組換え体力クラーゼ産生微生物の生存能力を制限するために、メチオニ ン要求の栄養素要求性を以下の方法で導入した。黒色アスペルギルスΔｇｏｘＡ 　ＰｙｒＧを紫外線で突然変異誘発しく９５％死滅）、生存したものについてア スペルギルス最小培地中で濾過集積を行なった。この技術により、好ましくない 原栄養株を発芽させて成長させ、濾過により除去できる菌糸を形成させた。

栄養素要求性細胞は最小培地では発芽または成長できず、したがって、多孔性フ ィルタ（例えば、ミラクロス、カルバイオケム社）を通過する。数回の濾過およ び成長の後、残りの胞子を完全培地上に平板培養した。これらのプレートからの コロニーを最小培地アガー上および新鮮な完全培地プレートにパッチングした。

完全培地では成長するが最小アガーでは成長しないものは栄養素要求性を有する ものである。栄養素要求株の個体群から、メチオニンを補った最小培地上で成長 した１つのコロニーを同定した。さらなる試験により、その菌株はメチオニン生 合成経路の特定の工程が欠損していることが分かった。成長は、ホモシスティン またはメチオニンのいずれかの添加により維持されるだが、ホモセリンまたはシ スメチオニンのいずれによっても維持されなかった。メチオニンについての既知 の生合成経路に基づいて、このメチオニン要求の栄養素要求株はシスタチオカー ゼ活性が欠損したと思われ、したがって、他の微生物の慣習によりｍｅｔｃと称 した。

ｐＵＣ−ＥＣ２プラスミドのＰｍｅｌとＮｏｔｌによる切断、および予備的ゲル 電気泳動によるＥＣ２断片の精製の後に、カタラーゼ発現カセット（線状形態） を単離した。精製したＤＮＡ断片を用いて黒色アスペルギルスΔｇｏｘＡ　ｐｙ ｒＧｍｅｔＣ菌株を形質転換し、原栄養性形質転換体を、カタラーゼを産生ずる 能力について振とうフラスコ培養中でスクリーニングした。振とうフラスコ中で スクリーニングした約５０の形質転換体から、対照菌株より著しく高いカタラー ゼレベルを産生じた１０の形質転換体を同定した。これらの１０の菌株を二重振 とうフラスコ培養中で再評価し、カタラーゼ活性検定の結果を第５図に示す。１ ０の菌株のうち９の菌株が、親菌株ＦＳ−１より著しく高いレベルのカタラーゼ −Ｒを産生じた。２つの形質転換体（ＥＣ２Ｌ−１９、ＥＣ２Ｌ−２３）は振と うフラスコ培養中で、黒色アスペルギルスＦＳ−１により産生されたレベルより もおおよそ１０から１５倍のカタラーゼを産生じ、大規模な産生条件下での試験 にこれらの菌株を選択した。１０リツトルと５０．０００リツトルの規模での発 酵実験により、形質転換体ＥＣ２Ｌ−２３からのカタラーゼ−Ｒ産生は、振とう フラスコ研究に見られたカタラーゼ−Ｒの発現のレベルに対応することが示され た。

さらに、黒色アスペルギルスＥＣ２Ｌ−２３および親菌株ＦＳ−１の発酵中に産 生された有機酸のＨＰＬＣ分析により、以下の量のグルコン酸ナトリウムが産生 されたのが示された。

菌株　グルコン酸ナトリウム（ｍｇ／Ｌ）Ｆ　Ｓ　−１＞２００．０００ ＥＣ２Ｌ−２３（２７エ程）４８ ＥＣ２Ｌ−２３（２８工程）１２３ これらのデータは、形質転換体ＥＣ２Ｌ−２３によりグルコン酸ナトリウム老廃 物の産生が劇的に減少することを示している。

く つ ロコ ド） Ｑ Ｃ） ト） ＦＩＧｔＪＲＥ　５゜ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１５１ ０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：６８） （Ｃ１２Ｎ　１／１５ Ｃ１２Ｒ１：６８） （Ｃ１２Ｎ　９１０８ Ｃ１２Ｒ１：６８） （８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＣＡ、　ＦＩ、ＪＰＩ Ｃ１２Ｒ１：６８） （７２）発明者　フォーラ−、ティモジ−アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４０６１　レッドウッド　シティ　ハル　アヴエニュー　１７３８ （７２）発明者　レイ、マイケル　ダブリュアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４４０２　サン　マテオ　フィフティーンスアヴエニュ−１３７

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．黒色アスペルギルスｃａｔＲ遺伝子から実質的になる遺伝子配列であって、 天然黒色アスペルギルスｃａｔＲプロモーターが欠失しており、アスペルギルス グルコアミラーゼプロモーター遺伝子が機能的に付着していることを特徴とする 遺伝子配列。
2. ２．アスペルギルスグルコアミラーゼプロモーターが黒色アスペルギルスからの ものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の遺伝子配列。
3. ３．黒色アスペルギルスゲノム中に統合できるベクターの複製可能プラスミド中 に挿入されていることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の遺伝子 配列。
4. ４．黒色アスペルギルスからのカタラーゼ−Ｒをコード化する遺伝子配列。
5. ５．アスペルギルスからのカタラーゼ−Ｒをコード化する遺伝子配列であって、 配列認識番号４の配列、または１つもしくは多数の、カタラーゼ活性を有するカ タラーゼ−Ｒをコード化する逆位、塩基置換、欠失または挿入を含むことを特徴 とする遺伝子配列。
6. ６．黒色アスペルギルスｃａｔＲプロモーターを含まずアスペルギルスｃａｔＲ 遺伝子を含む遺伝子により形質転換された黒色アスペルギルスであって、アスペ ルギルスグルコアミラーゼプロモーター遺伝子が機能的に付着していることを特 徴とする黒色アスペルギルス。
7. ７．前記アスペルギルスグルコアミラーゼプロモーターが黒色アスペルギルスか らのものであることを特徴とする請求の範囲第６項記載の黒色アスペルギルス。
8. ８．天然ｃａｔＲプロモーターが欠失していることを特徴とする請求の範囲第６ 項記載の黒色アスペルギルス。
9. ９．天然グルコースオキシダーゼ遺伝子が欠失していることを特徴とする請求の 範囲第６項記載の黒色アスペルギルス。
10. １０．ｃａｔＲ遺伝子の遺伝子産生物を産生する方法であって、炭素および窒素 の同化源を用いて、アスペルギルスグルコアミラーゼプロモーターが機能的に付 着したｃａｔＲ遺伝子により形質転換された黒色アスペルギルスを培養すること からなる方法。
11. １１．前記アスペルギルスグルコアミラーゼプロモーターが黒色アスペルギルス からのものであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．黒色アスペルギルスからの実質的に純粋なカタラーゼ−Ｒ。
13. １３．配列認識番号５のアミノ酸配列または機能的に同等な種もしくはその対立 変種からなる、アスペルギルスより単離したカタラーゼ−Ｒタンパク質。
14. １４．ｃａｔＲ遺伝子の遺伝子産生物を産生する方法であって、ｃａｔＲ遺伝子 断片からなる組換えＤＮＡベクターにより黒色アスペルギルス宿主を形質転換し 、該黒色アスペルギルス宿主を、前記ｃａｔＲ遺伝子断片が転写され翻訳される 条件下で培養する各工程からなることを特徴とする方法。
15. １５．前記ｃａｔＲ遺伝子断片が、配列認識番号６に示された配列またはカタラ ーゼ活性を有する該配列の一部分からなることを特徴とする請求の範囲第１４項 記載の方法。