JPH08503302A

JPH08503302A - 尿中における性行為感染症に関連する微生物に対する抗体のイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH08503302A
Application number: JP6512481A
Authority: JP
Inventors: アーノビツツ，ハワード・ビー; ゴツトフリード，トビー・デイ; ロビンソン，デイビツド・ジエイ
Original assignee: カリプト・インコーポレイテツド
Priority date: 1992-11-18
Filing date: 1993-11-17
Publication date: 1996-04-09
Also published as: WO1994011736A1; EP0670042A1; IL107628A0; EP0670042A4; US5516638A; AU5611494A; CA2149642A1

Abstract

(57)【要約】この発明は、生物学的サンプル、好ましくは尿中における性行為感染症に関連する微生物（例えば、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））に対する抗体の存在を検出する方法を提供する。この方法は、サンプルを微生物由来の抗原と接触させて、抗原−抗体複合体の形成を検出することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】尿中における性行為感染症に関連する微生物に対する抗体のイムノアッセイ発明の背景本発明は生物学的サンプル、典型的には尿中の抗体の測定のための診断キットおよび方法に関する。より詳しくは、本発明は性行為感染症に関連する微生物に対する抗体を検出するための方法およびキットに関する。性行為感染症（ＳＴＤ）は、梅毒、淋病、軟性下疳、鼠径リンパ肉芽腫および鼠径部肉芽腫のような従来の性病を含む。この用語はまた、性行為感染すると報告されているヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１および−２）、肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−２）および他のウイルスによって引き起こされる増大しつつある多数の他の疾病も包含する。大抵のＳＴＤは孤立した問題としては存在せず、多くの病原体による複合の感染が一般的である。典型的にはＳＴＤの存在は、しばしば他のより深刻な感染の危険に結び付く性行為の高い危険性を示す。潜在的に不治のウイルス性ＳＴＤ（例えば、ＨＩＶ感染）の重大性が増しているので、これらの感染を減らすために全てのＳＴＤの早期検出がより重要になっている。ＳＴＤは典型的には性行為の頻度が高く性行為の相手を頻繁に変えるコア集団に蔓延している。これらの疾病が拡がるのを抑制するために、淋病、クラミジア感染、梅毒およびＨＩＶ感染のスクリーニングテストは廉価で、広く入手し易くかつ安全でなければならない。大抵の現在行われている検出法は抗原または特定の病原体に対する抗体の存在の血清学的テストに依存している。これらのアッセイは、疾病を有する疑いのある患者から血液または血清を得る侵略的な方法に依存している。これらの方法は、無菌の針、注射器、スキンクレンザーおよび包帯のような比較的高価な道具を必要とし、サンプルの収集および分析に従事する健康管理人を害し得る場合もある。したがって、非侵略的であり比較的廉価な、ＳＴＤに関連する病原体の存在のテストが切迫して必要とされている。発明の概要本発明は生物学的サンプル、好ましくは尿中における性行為感染症に関連する微生物に対する抗体の存在を検出する方法を提供する。該方法は、サンプルを微生物からの抗原と接触させ、抗原−抗体複合体の形成を検出することからなる。該方法は例えばクラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に対する抗体を検出するのに使用し得る。この場合、好ましい抗原は主要外膜タンパク質（ｍａｊｏｒｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＯＭＰ）のようなクラミジアの表面タンパク質である。１つの実施態様において、該方法は抗原を固体表面に、共有結合でまたは非共有結合で結合させるステップを含む。抗原−抗体複合体は好ましくは標識抗−ヒト抗体を使用して検出する。別の実施態様において、サンプル中の抗体を固体表面に結合させる。これらの方法においては、抗原は好ましくは標識されており、抗原−抗体複合体は固体表面上のラベルを測定して検出する。ラベルを必要とするこれらの方法においてはラベルは典型的には、アルカリホスファターゼのような検出し得る酵素である。または、放射性ラベルを使用し得る。該方法は標識成分を必ずしも使用する必要がなく、この場合、抗原−抗体複合体は複合体の凝集の存在により検出される。最後に、本発明はまた、尿中における性行為感染症に関連する微生物に対する抗体の存在を検出するキットも提供する。該キットは抗体と反応して免疫複合体を形成し得る抗原、標識系および尿サンプルの調製のための緩衝溶液を含む。図面の簡単な説明図１は尿サンプル中におけるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在を示すイムノブロットである。図２はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ尿抗体エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）の結果を示す。好適実施態様の説明本発明はＳＴＤに関連する微生物に対する抗体の検出に関する。本明細書中「ＳＴＤに関連する微生物」とは、細菌、マイコプラズマ、スピロヘータ、原生動物、カビ等のような非ウイルス性の、典型的には単細胞の病原体である。多くの微生物がＳＴＤに関連づけられてきており、本発明の方法を使用してアッセイし得る。例としては、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ）、鼠径部肉芽腫症菌（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、急性尿道炎菌（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｐ．）（例えば、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｐｉｒｕｍおよびＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、トキソプラズマゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）、アクチノマイセスイスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｓｒａｅｌｉｉ）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓｐｐ．）、トレポネーマパリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ）、トリコモナスバジナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）並びにカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。本発明方法のＳＴＤに関連する微生物を検出する能力を、非特異性尿道炎（ＮＧＵ）の通常の病原体であるクラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出により説明する。この属のメンバーは、ヒトを含む広範囲の宿主を有する。米国において、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の約４００万の症例が毎年報告されている。感染の発症には骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、女性の不妊症、眼の感染症および肺の感染症を含む。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓは複雑な生活環を有する偏性細胞内細菌である。伝染性体は基本小体として知られており、宿主の中および間に拡がることのできる形態である。非感染性の形態は網状体と呼ばれる。該微生物が成熟すると、網状体は感染性基本小体に戻る。女性において、基本小体は尿道上皮細胞に感染すると考えられている。ＰＩＤの場合の５０％までが「サイレントキャリヤー」状態、すなわち、微生物を単離するのが難しくかつ血清学テストで陰性であるかまたは曖昧である状態で存在し得ると判定されている。免疫学的結合アッセイ特定の微生物の存在は、免疫学的結果に基づくいくつかのよく認識されている特異的結合アッセイを使用して検出し得る。（例えば米国特許第４，３６６，２４１号、同４，３７６，１１０号、同４，５１７，２８８号および同４，８３７，１６８号明細書参照。これらは参考として本明細書中に含めることとする。）本発明の一般的方法を概説するものとして、「ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第７版（Ｄ．ＳｔｉｔｅｓおよびＡ．Ｔｅｒｒ編）１９９１も参照のこと。これは参考として本明細書中に含めることとする。本発明のアッセイは、競合的でも非競合的でもよい。競合的結合アッセイにおいて、サンプル被測定物質（この場合、ＳＴＤに関連する微生物に対する標的抗体）は、固体表面に結合された捕獲試薬（例えば、標的微生物由来の抗原）上の特異的結合部位に対して、標識された被測定物質と競合する。捕獲試薬に結合された標識・被測定物質の濃度はサンプル中に存在する遊離の被測定物質の量に反比例する。非競合アッセイは典型的にはサンドイッチアッセイであって、サンプル被測定物質（標的抗体）が２つの被測定物質特異的結合試薬の間に結合される方法である。結合試薬の内の１つは捕獲試薬として使用されかつ固体表面上に結合している。もう一方の結合試薬は標識されかつ得られた複合体を目視または機器手段により測定または検出するために使用される。捕獲試薬と標識された結合試薬との多数の組合せを使用し得る。例えば、標的微生物由来の抗原が捕獲試薬として使用し得、ヒト抗体の不変領域に特異的な標識抗ヒト抗体を標識された結合試薬として使用し得る。ヒトイムノグロブリン不変領域（例えば、γまたはμ）に特異的なヤギ、ヒツジおよび他の非ヒト抗体は当業界で良く知られている。または、抗ヒト抗体は捕獲試薬であり得、抗原をラベル化し得る。プロテインＡまたはプロテインＧのような、ヒトイムノグロブリン不変領域に特異的に結合し得る他のタンパク質もまた捕獲試薬または標識された結合試薬として使用され得る。これらのタンパク質は連鎖球菌の細胞壁の通常の構成成分である。これらはいろいろな種からのイムノグロブリン不変領域と強い非免疫原性反応性を示す。一般にＫｒｏｎｖａｌ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１：１４０１−１４０６（１９７３）およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：２５８９−２５４２（１９８５）参照。非競合アッセイはサンドイッチアッセイである必要はない。例えば、サンプル中の抗体は直接固体表面に結合し得る。サンプル中における標的微生物に対する抗体の存在は、その後標識抗原を使用して検出し得る。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析はサンプル中の標的微生物に対する抗体の存在を検出するためにも使用し得る。この技術はサンプル中の標的抗体の存在を確認するための信頼できる方法である。該技術は一般にタンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離し、分離したタンパク質を（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化ナイロンフィルターのような）適当な固体支持体に移し、サンプルと分離したタンパク質とをインキュベートすることを含む。このことにより、サンプル中に存在する特異的標的抗体が前記の各タンパク質に結合する。標的抗体をその後、標識抗ヒト抗体を使用して検出する。標的抗体を検出するこの方法は特異的抗原性タンパク質に対する抗体を検出するという別の利点を有する。他のアッセイフォーマットには特定の分子（例えば、抗体）と結合するように設計されたリポソームを使用しかつカプセル化試薬またはマーカーを放出するリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が含まれる。放出された化学物質はその後標準技術によって検出される（Ｍｏｎｒｏｅ等、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１（１９８６）参照。これは参考として本明細書中に含めることとする）。標識された成分の使用を必要としないアッセイフォーマットもある。例えば、凝集アッセイを標的抗体の存在を検出するために使用し得る。この場合、抗原をコートした粒子が標的抗体を含むサンプルにより凝集させられる。このフォーマットにおいてはいかなる成分も標識される必要はなく、標的抗体の存在は単に目視検査により検出される。上述の通り、アッセイに依存して、抗原、標的抗体または抗ヒト抗体を含むいろいろな成分を固体表面に結合させ得る。生体分子をいろいろな固体表面に固定するための多くの方法が当業界で知られている。例えば、固体表面は膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣまたはポリスチレン）またはビーズで有り得る。所望の成分は共有結合されるかまたは非特異的結合を介して非共有的に結合させる。天然および合成のいろいろな有機および無機ポリマーを固体表面の材料として使用し得る。ポリマーの例にはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース等が含まれる。使用し得る他の材料には紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、セメント等が含まれる。それに加えて、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポポリサッカライド、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドのようなゲルを形成する基質に含まれるものを使用し得る。デキストラン、ポリアルキレングリコールのようないくつかの水相を形成するポリマー、またはリン脂質、長鎖（炭素原子数１２〜２４）アルキルアンモニウム塩のような界面活性剤等もまた適当である。固体表面が多孔性である場合、多様な孔のサイズを系の性質に依存して使用し得る。表面を調製するとき、いろいろな性質を得るために複数の異なった材料を、特にラミネートとして使用し得る。例えば、ゼラチンのようなタンパク質コーティングを非特異性結合を避け、共有結合を単純化し、シグナル検出を強化する等のために使用し得る。化合物と表面との間の共有結合が必要ならば、表面は通常多官能であるかまたは多官能化され得るであろう。表面に存在し得、結合に使用され得る官能基にはカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン性基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が含まれ得る。いろいろな化合物といろいろな表面との結合様式は良く知られており、文献中に詳細に説明されている。例えば「ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＥｎｚｙｍｅｓ」ＩｃｈｉｒｏＣｈｉｂａｔａ著、ＨａｌｓｔｅｄＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９７８およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５３０５９（１９７０）参照。これは参考として本明細書中に含めることとする。共有結合に加えて、アッセイ成分を非共有結合するためのいろいろな方法を使用し得る。非共有結合は典型的には表面への化合物の非特異的吸着である。典型的には表面を標識アッセイ成分の非特異的結合を避けるための第２化合物でブロックする。または、表面を、表面がある成分と非特異的に結合するが顕著には別のものと結合しないように設計する。例えば、コンカナバリンＡのようなレクチンを有する表面は炭水化物含有化合物と結合するがグリコシル化を欠いた標識タンパク質とは結合しないであろう。アッセイ成分の非共有的結合に使用するためのいろいろな固体表面が米国特許第４，４４７，５７６号および同４，２５４，０８２号明細書に概説されており、これらは参考として本明細書中に含めることとする。多くのアッセイフォーマットにおいて、標識されたアッセイ成分が使用されている。本発明の標識系はいろいろな形態であり得る。ラベルは当業界で良く知られた方法に従って、所望のアッセイ成分に直接または間接的にカップリングさせ得る。種々広範なラベルが使用され得る。該成分はいくつかの方法のいずれか１つによって標識され得る。最も一般的な検出方法は³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃまたは³²Ｐ標識化合物等でのオートラジオグラフィーの使用である。非放射性ラベルには標識抗体と結合するリガンド、発蛍光団、化学発光試薬、酵素、および標識リガンドに対する特異的結合相手として働き得る抗体が含まれる。ラベルは必要な感度、化合物との結合のし易さ、必要な安定性および使用し得る機器に依存して選択する。非放射性ラベルはしばしば間接的手段により結合される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は分子に共有結合される。該リガンドはその後、固有に検出し得るかまたは、検出し得る酵素、蛍光化合物または化学発光化合物のようなシグナル系と共有結合された抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ））分子と結合する。多くのリガンドおよび抗リガンドを使用し得る。リガンドが天然の抗リガンドを有する場合、例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾールの場合、リガンドは標識された天然抗リガンドと共に使用し得る。または、いかなるハプテンまたは抗原化合物も抗体と組み合わせて使用し得る。該分子はまた、例えば酵素または発蛍光団との結合によってシグナル発生化合物に直接結合させ得る。ラベルとして興味深い酵素は主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、または酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物にはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が含まれる。化学発光化合物にはルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。使用し得るいろいろな標識系またはシグナル発生系の概説としての米国特許第４，３９１，９０４号明細書を参照のこと。これは参考として本明細書中に含めることとする。本発明において、アッセイに使用する抗原は細胞全体、または標的微生物から単離したタンパク質、または組換えにより製造されたタンパク質で有り得る。例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの場合、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）を使用すると都合が良い。このタンパク質は種々のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ血清型亜型（ｓｅｒｏｖａｒｓ）間の血清学的反応の大方の原因である３９．５ｋＤａの膜糖タンパク質である。この糖タンパク質の単離および同定は米国特許第４，４２７，７８２号明細書に開示されており、これは参考として本明細書中に含めることとする。所望であれば、抗原性タンパク質からの免疫原決定基を含む合成または組換えポリペプチドを抗原として使用し得る。ポリペプチドは天然に起こるようにグリコシル化され得るかまたはグリコシル化は、他の系の組換え発現の結果としてもしくは当業者に良く知られた他の手段によって改変し得る。リンパ球によって特異的に認識される配列の同定はいろいろな方法によって行われ得る。例えば、免疫特異性は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を起こすタンパク質からのオーバーラップしているペプチドの能力を測定することによって決定し得る。このような技術はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓからのＭＯＭＰの決定基を同定するために使用されてきた（Ｉｓｈｉｋａｚｉ等、Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄＩｍｍｕｎ．６０：３７１４− ３７１８（１９９２）、これは参考として本明細書に含めることとする）。本発明のアッセイに使用される生物学的サンプルは、抗体を含む任意の非血液生物学的流体、例えば尿、唾液、脳脊髄液、精液等で有り得る。生物学的サンプルは好ましくは尿である。該サンプルは典型的にはヒト患者から採取されるが該アッセイは、犬、猫、羊、牛および豚のような全ての哺乳類からのサンプル中の抗体を検出するのにも使用し得る。サンプルは所望であれば必要とされる適当な緩衝液による希釈または濃縮によって前処理される。リン酸、トリス等のようないろいろな緩衝剤のいずれか１種を、生理的ｐＨで用いる多くの標準緩衝水溶液のいずれでも使用し得る。測定を通して、インキュベーションおよび／または洗浄ステップが試薬を合せた後毎に必要となり得る。インキュベーションステップは約５秒から数時間、好ましくは約５分から約２４時間の間で変え得る。しかしながら、インキュベーション時間はアッセイフォーマット、被測定物質、溶液の量、濃度等に依存するであろう。通常、アッセイは周囲温度で行われるが１５〜４０℃のような温度範囲で行い得る。別の態様として、本発明はＳＴＤに関連する微生物に対する標的抗体を検出するキットフォーマットを提供し得る。このようなキットには標的抗体によって特異的に認識され得る抗原および、酵素基質等を含む、抗原と標的抗体により形成された免疫複合体を検出するのに適した標識系が含まれる。該キットはまた、尿サンプルの調製および分析のための適当な洗浄用溶液、希釈用緩衝液等を含む。限定的ではなく説明のために以下に実施例を挙げる。実施例実施例Ｉ：この実施例は、本発明のアッセイがウエスタンブロット分析法を使用して、可能性の高い個体の尿中のクラミジアに対する抗体を検出し得ることを説明する。Ａ．Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロットの調製のための材料および方法（１）各々１２％Ｔ分離ゲルおよび４％Ｔスタッキングゲルからなる調製ゲル（ポリアクリルアミド−ＳＤＳスラブゲル；Ｂｉｏ−Ｒａｄ製Ｍｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＩＩＤｕａｌＳｌａｂＣｅｌｌｓｙｓｔｅｍ）を標準法に従って調製した。（２）１０¹⁰基本小体／ｍｌを含むＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＬＧＶ２株４３４［Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．製、カタログ番号Ｒ１２１０１ロット４９９１（５／８／９２）およびロット１９１（１０／２９／９２）］を２×クラミジアサンプル緩衝液［グリセロール２０％；ＳＤＳ２．５％；トリス−ＨＣ１０．１Ｍ；２−メルカプトエタノール５％；ブロモフェノールブルー０．００５％］で０．７５ｍｇ／ｍｌに希釈し（両方のロット）、１００℃で１０分間加熱した。（３）あらかじめ染色したタンパク質分子量標準１４．３Ｋ−２００ＫＭＷ（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ番号６０４１ＬＡ；７種のタンパク質の混合物）を２×クラミジアサンプル緩衝液（上記Ａの（２）の処方）で３．５ｍｇ／ｍｌ（各タンパク質０．５ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、１００℃に５分間加熱した。（４）調製ゲルのそれぞれに変性Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（調製レーン）１００μｇおよび変性ＧｉｂｃｏＢＲＬ標準（参照レーン）１７．５μｇを載置した。これらのサンプルを不連続緩衝系［トリス０．０２５Ｍ；グリシン０．１９２Ｍ；ＳＤＳ０．１％、ｐＨ８．４］中で電気泳動した。（５）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に続いて、参照レーン部分および各調製ゲルの調製レーン部分の約２ｍｍを別々に０．３％のＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅＲ２５０で染色して（揺り動かしているプラットホームに２時間載置、室温）、その後イソプロピルアルコール２２．５％および氷酢酸１０％を含む脱色剤で脱色した。（６）ＰＡＧＥに続いて、調製ゲルの残りの調製レーン部分（Ａの（５）の後）を１× ブロット緩衝液［トリス０．０２５Ｍ；グリシン０．１９２Ｍ；メタノール２０％、ｐＨ８．３］中で約２０分間、別個に平衡化し、その後８０〜９０分間（１１２Ｖ、０．４Ａ）イモビロン−ＰＶＤＦトランスファー膜、孔径０．４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、カタログ番号ＩＰＶＨ３０４ＦＯ）に移した。（７）電気泳動トランスファーに続いて、各トランスファー膜を２ｍｍのストリップに切断し［２０〜２５イムノブロット（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質約４〜５μｇ／イムノブロット）生成］、ナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中ウシ、ウマおよびヤギ血清各３％で個々にブロックした（揺り動かしているプラットポーム上に１．５時間載置、室温）。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓブロットをその後２〜８℃でナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中で貯蔵した（各ブロットのセットは単一のトランスファー膜由来）。電気泳動トランスファーに続いて、各調製レーン（ゲル）をＡの（５）の指示にしたがって染色しかつ脱色した。Ｂ．Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロットに対して、以下に簡単に概説するようにウエスタンブロット法を行った：（１）精製した、ＭＯＭＰに対するＩｇＧ₁モノクローナル抗体［ＢｉｏｄｅｓｉｇｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製カタログ番号Ｃ６５６５１Ｍ（１００μ ｇ／ｍｌ）］を使用してＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット上の３９．５ＫＭＷＭＯＭＰの位置を同定した。（２）ＭＯＭＰに対するモノクローナル抗体は、各イムノブロットのセット（イムノブロットの各セットは単一のトランスファー膜由来）を用いて必要に応じてランされるべきである。（３）Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロットを、室温で揺り動かしているプラットホーム上の別の容器中に入れた。（４）Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロットをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（トリス５０ｍＭ；ＮａＣｌ２００ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ−２００．３％、ｐＨ７．２±０．２）１ｍｌで、少なくとも２分間４回洗浄した（続いて吸引した）。（５）ウェスタンブロットＷＢサンプル希釈液０．２５ｍｌ（ナトリウムアジド０．１％を含有するＴＢＳ中、ウシ、ウマおよびヤギ血清各３％プラス、ウシＩｇＧをコートしたビーズ、ウマＩｇＧをコートしたビーズおよびヤギＩｇＧをコートしたビーズ各０．０１％プラス、ＮＰ−４００．１％）をサンプルの希釈のために調製した。（６）選択した尿サンプル集団を以下に概説する：ａ．ＨＩＶ−１陰性尿プール：０２１５−１７−１。ｂ．ＡＲＣ／ＡＩＤＳ；ＨＩＶ−１陽性集団：Ｕ−０４３０８；Ｕ−０４３１１；Ｕ−０４２３６；Ｕ−０４２４０。ｃ．薬剤リハビリテーション集団：ＤＲ１〜２１。ｄ．保険申請者集団：ＩＡ１〜２０。（７）あらかじめＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに感染した個体から得た血清サンプルを尿Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓウエスタンブロットスクリーニングに含めた。（８）サンプルインキュベーション法：ａ．Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット３セットを使用した：４９９１ −３；１９１−１；１９１−２［各セットはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを１００μｇ／ゲル（約４〜５μｇ／イムノブロット）で載置したゲル由来］。ｂ．試薬ブランクをＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット（ＷＢサンプル希釈剤０．５ｍｌ／容器）３セットそれぞれに含めた。ヤギ抗−ヒト（ＧＡＨ）結合体（Ｂの（１０）のａ参照）をこれらの試薬ブランクに加えて使用したことに注意。ｃ．ヒト陽性血清をポリプロピレンチューブ中でＷＢサンプル希釈剤で１／１００に希釈し、適用し得るように容器に移した（０．５ｍｌ／容器）。１／１００ヒト陽性血清をＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット３セットそれぞれに含ませたことに注意。ｄ．正常マウス血清をポリプロピレンチューブ中でＷＢサンプル希釈剤で１／２００に希釈し、適用し得るように容器に移した（０．５ｍｌ／容器）。１／２００正常マウス血清をＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット３セットそれぞれに含ませたことに注意。ｅ．Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＭＯＭＰに対するモノクローナル抗体をポリプロピレンチューブ中でＷＢサンプル希釈剤で１／５（２０μｇ／ｍｌ）に希釈し、適用し得るように容器に移した（０．５ｍｌ／容器）。２０μｇ／ｍｌＭＯＭＰモノクローナルをＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット３セットそれぞれに含ませたことに注意。ｆ．尿サンプル０．２５ｍｌをＷＢサンプル希釈剤０．２５ｍｌを含む容器に各尿サンプルを１／２に希釈するために加えた。ｇ．サンプルを室温で１晩Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロットと揺り動かしているプラットホーム上でインキュベートした（１５時間）。（９）サンプルのインキュベーションに続いて、サンプルを容器から吸引し、イムノブロットをＢの（４）に記載のように洗浄した。（１０）結合体の調製：ａ．アルカリホスファターゼを結合したアフィニティー精製ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）［ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製カタログ番号１０９−０５５−１２８９］をナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中の５％ヤギ血清で１／２０００に希釈した。１／２０００ＧＡＨ結合体０．５ｍｌを、尿サンプル（Ｂの（８）のｆ参照）、ヒト陽性血清サンプル（Ｂの（８）のｃ参照）または試薬ブランク（Ｂの（８）のｂ参照）とあらかじめインキュベートしておいた各イムノブロットに加えた。ｂ．アルカリホスファターゼを結合したアフィニティー精製ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）［ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製カタログ番号１１５−０５５−１００］をナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中の５％ヤギ血清で１／２０００に希釈した。１／２０００ＧＡＭ結合体０．５ｍｌを、ＭＯＭＰモノクローナル（Ｂの（８）のｅ参照）または正常マウス血清（Ｂの（８）のｄ参照）とインキュベートしておいたイムノブロットに加えた。（１１）イムノブロットを結合体と１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、結合体を容器から吸引した。（１２）イムノブロットをＢの（４）に記載の通り２回洗浄した。（１３）イムノブロットをＢの（４）に記載の通りさらに２回洗浄したがアルカリホスファターゼ用１×基質緩衝液［１０× 基質緩衝液（Ｚｙｍｅｄ製カタログ番号００−２２０８）を超純水で１×に希釈して調製］を使用した。（１４）基質溶液［アルカリホスファターゼ用１×基質緩衝液（Ｂの（１３）参照）中ＢＣＩＰ０．０５ｍｇ／ｍｌプラスＮＢＴ０．１％］０．５ｍｌを各イムノブロットに加えた。（１５）イムノブロットを基質溶液と１０分間インキュベートした。（１６）基質溶液を吸引し、イムノブロットを超純水１ｍｌで少なくとも２分間４回洗浄（次いで吸引）した。（１７）結果を記録する前にイムノブロットトレイを覆い、最低１時間空気乾燥した。Ｃ．Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＰＡＧＥおよびタンパク質トランスファーの結果（１）Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓロット４９９１に相当する調製ゲルの参照レーン部分（および２ｍｍの調製レーンストリップ）は、ＰＡＧＥおよびゲル処理の後に、標準に対して４３ＫＭＷおよび１８．４ＫＭＷバンドのすぐ下に移動するはっきりしたバンドならびに標準に対して４３ＫＭＷバンドの上および下に移動する不明瞭な複数のバンドを示した。タンパク質移動およびゲル処理の後の残りの調製ゲルと参照レーン部分（および２ｍｍの調製レーンストリップ）との比較により、膜へのタンパク質移動は５０％を超えないことが示された。（２）Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓロット１９１に相当する調製ゲルの参照レーン部分（および２ｍｍの調製レーンストリップ）は、ＰＡＧＥおよびゲル処理の後に、標準に対して４３ＫＭＷおよび１８．４ＫＭＷバンドのすぐ下ならびに染色剤フロント（１４．３ＫＭＷバンド）に移動するはっきりしたバンドを示した。標準に対して４３ＫＭＷバンドの上および下に移動する不明瞭な複数のバンドもまた観察された。タンパク質移動およびゲル処理の後の残りの調製ゲルと参照レーン部分（および２ｍｍの調製レーンストリップ）との比較により、膜へのタンパク質移動は５０％を超えないことが示された。Ｄ．選択した尿のスクリーニングに関するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓウエスタンブロットの結果薬剤リハビリテーション集団からのサンプルイムノブロットを図１に示した。全ての集団のイムノブロットの結果は表１に示した。ＥＩＡＯ．Ｄ．値（実施例２）を簡単な比較のために表１に含めた。表１において、陰性のテスト結果は乾燥したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット上にいかなるバンドまたはバックグランドもないことを示す。陽性テスト結果は乾燥したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット上のＭＯＭＰに対する反応性を示す（ＭＯＭＰモノクローナルとインキュベートしたイムノブロットと比較して）。中間のテスト結果は乾燥したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット上に１つ以上のバンドであって、陽性の特徴および／または乾燥したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロットに沿ったバックグランドと一致しないバンドのいずれかのパターンを示す。Ｅ．表１の結果のまとめａ．０２１５−１７−１（ＨＩＶ陰性尿プール）は陰性の結果を示した。ｂ．ＡＲＣ／ＡＩＤＳ；ＨＩＶ−１陽性被検者由来の３／４の尿サンプルは陽性の結果を示した。尿サンプルの１つはＭＯＭＰ領域中の汚れによって中間の結果を示した（Ｕ−０４２４０）。ｃ．薬剤リハビリテーション集団由来の１８／２１の尿サンプルは陽性の結果を示した。ｄ．保険申請者集団由来の１１／２０の尿サンプルは陽性の結果を示した。実施例２：この実施例は本発明のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）がヒト尿中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出する能力を示す。材料および方法：（１）１０¹⁰基本小体／ｍｌを含むＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＬＧＶ２株４３４（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．製、カタログ番号Ｒ１２１０１、ロット１９１）をクラミジア緩衝液（ＳＤＳ１％；トリス−ＨＣ１０．１Ｍ；２−メルカプトエタノール２．５％）を用いて０．７５ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００℃ で１０分間加熱した。最終クラミジア緩衝液濃度：ＳＤＳ０．５％；トリス−ＨＣ１０．０５Ｍ；２−メルカプトエタノール１．２５％。（２）Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓでコートしたストリップを以下の通り調製した：ａ．８Ｉｍｍｕｌｏｎ２Ｄｉｖｉｄａｓｔｒｉｐｓ２×８（Ｄｙｎａｔｅｃｈ製、カタログ番号０１１−０１０−６２０２）をマイクロプレートフレーム（Ｄｙｎａｔｅｃｈ０１１−０１０−６６０３）中に確実に入れた。ｂ．処理をしたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（上記１参照）をｐＨ９．６の重炭酸ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈した。最終クラミジア緩衝液濃度：ＳＤＳ０．００７％；トリス−ＨＣ１０．６７ｍＭ；２−メルカプトエタノール０．０１７％。ｃ．１０μｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ／ウエルでストリップウェルに、処理したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ１μｇ／ウエルに対して加えた。処理したストリップを室温で１晩インキュベートした（２０〜２５℃；１６〜１８時間）。ｄ．コートしたストリップをその後、５％ヤギ血清（ナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中）を用いて室温（２０〜２５℃）で１時間ブロックした。抗原溶液は５％ヤギ血清ブロックを添加する前に吸引していないことに注意。ｅ．マイクロプレートフレームをひっくり返してブロックおよび抗原溶液を除き、その後ストリップウエルをペーパータオルを使用して吸い取って乾かした。（３）選択した尿サンプル集団を以下に概説する：ａ．ＨＩＶ−１陰性尿プール：０２１５−１７−１。ｂ．ＡＲＣ／ＡＩＤＳ；ＨＩＶ−１陽性集団：Ｕ−０４３０８；Ｕ−０４３１１；Ｕ−０４２３６；Ｕ−０４２４０。ｃ．薬剤リハビリテーション集団：ＤＲ１〜２１。ｄ．保険申請者集団：１Ａ１〜２０。（４）あらかじめＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに感染した個体から採取した血清サンプルを尿Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＥＩＡスクリーンでインキュベートした。（５）Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＥＩＡ：ａ．サンプルインキュベーション法：１．陽性血清サンプルをポリプロピレンチューブ中で１／１０ＥＩＡサンプル緩衝液（ナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中、ウシ、ウマおよびヤギ血清各３％プラス、ウシＩ_gＧをコートしたビーズ、ウマＩ_gＧをコートしたビーズおよびヤギＩ_gＧをコートしたビーズ各０．００１％）で１／２００に希釈した。希釈した血清サンプルを室温（２０〜２５℃）で５分間プレ−インキュベートし、その後２つのウエルに、２００μｌ／ウエル移した。２．ＥＩＡサンプル緩衝液２５μｌ（ナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中、ウシ、ウマおよびヤギ血清各３０％プラス、ウシＩ_gＧをコートしたビーズ、ウマＩ_gＧをコートしたビーズおよびヤギＩ_gＧをコートしたビーズ各０．０１％）をテスト尿サンプル用に設計された各ウエルおよび試薬ブランク用に設計された２個のウエルに加えた。３．ナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ２００μｌを試薬ブランクとして設計された２個のウエルそれぞれに加えた。４．各尿サンプル２００μｌをＥＩＡサンプル緩衝液を含む複数のウエルに加えた。５．ウエルをサンプルと共に３７℃で２時間インキュベートした。ｂ．ウエルを自動マイクロプレート洗浄器（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）モデルＥＬ４０３Ｈ）を使用して洗浄溶液（ナトリウムアジド０．１％プラスＮＰ− ４００．１％を含むＴＢＳ）で６回洗浄した。ｃ．アルカリホスファターゼを結合したアフィニティー精製ヤギ抗−ヒト（ＧＡＨ）Ｉ_gＧ／Ｉ_gＭ（Ｈ＋Ｌ）［ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製カタログ番号１０９−０５５−１２８９］を５％ヤギ血清（ナトリウムアジド０．１％を含むＴＢＳ中）を使用して１／２０００に希釈した。ｄ．１／２０００ＧＡＨ結合体を各ウエルに１００μｌ／ウエルで加えた。ウエルを結合体と３７℃で１時間インキュベートした。ｅ．ウエルを５ｂに記載した通り洗浄した。ｆ．１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）基質をＰＮＰＰタブレット（Ｓｉｇｍａ製カタログ番号Ｎ−９３８９）５ｍｇおよび基質希釈剤［ナトリウムアジド０．１％を含む超純水中ジエタノールアミン（ＤＥＡ）１０％］を使用して調製した。ｇ．基質１００μｌを各ウエルに加えた。ウエルを基質と３７℃で６０分間未満インキュベートした。ｈ．６０分後、ストップ溶液５０μｌ［エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）４００ｍＭ］を各ウエルに添加した。ｉ．マイクロプレートはＢｉｏ−ＴｅｋＥＬ３１２ＥＫｉｎｅｔｉｃＲｅａｄｅｒを使用して４０５ｎｍ（テスト波長）／６３０ｎｍ（参照波長）２重波長セッティングでおよび振とうせずに読み取った。ＥＩＡの結果を図２に示す。各サンプルに対するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓイムノブロット結果（実施例１）を同じく示す。上記の記載は説明のためであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。上記の記載を検討すれば多くの実施態様が当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲は、上記の記述によって決定されるべきではなく、添付の請求の範囲およびこの請求の範囲の均等物の全てに従って決定されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ロビンソン，デイビツド・ジエイアメリカ合衆国、カリフオルニア・94596、ウオルナツト・クリーク、オーク・ノウル・ループ・27

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的サンプル中の性行為感染症に関連する微生物に対する抗体の存在を検出する方法であって、生物学的サンプルを微生物由来の抗原と接触させて、抗原−抗体複合体の形成を検出することを含む方法。２．微生物がクラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）である請求項１記載の方法。３．抗原がクラミジアの表面糖タンパク質である請求項２記載の方法。４．表面糖タンパク質がＭＯＭＰである請求項３記載の方法。５．生物学的サンプルが尿である請求項１記載の方法。６．尿がヒト尿である請求項５記載の方法。７．抗原を固体表面に結合させる請求項１記載の方法。８．抗原を固体表面に非共有的に結合させる請求項７記載の方法。９．固体表面が、マイクロタイタープレートのウエルである請求項７記載の方法。１０．固体表面がニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオライドである請求項７記載の方法。１１．抗原−抗体複合体を標識抗ヒト抗体を使用して検出する請求項１記載の方法。１２．ラベルが放射性ラベルである請求項１１記載の方法。１３．ラベルが検出可能な酵素である請求項１１記載の方法。１４．検出可能な酵素がアルカリホスファターゼである請求項１３記載の方法。１５．抗体または抗原−抗体複合体を固体表面に結合させるステップをさらに含む請求項１記載の方法。１６．抗体を抗ヒト抗体を介して固体表面に結合させる請求項１５記載の方法。１７．抗原を標識しかつ抗原−抗体複合体を固体表面上のラベルを測定することにより検出する請求項１５記載の方法。１８．ラベルが放射性ラベルである請求項１７記載の方法。１９．ラベルが検出可能な酵素である請求項１７記載の方法。２０．検出可能な酵素がアルカリホスファターゼである請求項１９記載の方法。２１．固体表面がマイクロタイタープレートのウエルである請求項１５記載の方法。２２．抗原−抗体複合体を該複合体の凝集によって検出する請求項１記載の方法。２３．尿中の性行為感染症に関連する微生物に対する抗体の存在を検出するためのキットであって、抗体と複合体を形成し得る抗原、抗原−抗体複合体の存在を検出するための標識系、および尿サンプルを調製するための緩衝溶液を含むキット。２４．抗原がクラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）由来である請求項２３記載のキット。２５．抗原がＭＯＭＰである請求項２４記載のキット。