JPH08503602A

JPH08503602A - 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現

Info

Publication number: JPH08503602A
Application number: JP6505102A
Authority: JP
Inventors: アンジャムカーン，モハメッド; エステニオホーメーシェ，カルロス; ビーラーリール‐ラモス，ベルナルド; ネビルチャットフィールド，スティーブン; ドゥーガン，ゴードン
Original assignee: メデファ、ホールディングス、ベー．ファー．
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1996-04-23
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: ES2127829T3; EP0652962A1; FI950396A0; NO950348L; DE69322645D1; US6680182B1; ATE174628T1; WO1994003615A1; GR3029498T3; EP0652962B1; KR950702635A; DK0652962T3; CA2141427C; NO318018B1; AU4719393A; JP3633933B2; FI950396A7; DE69322645T2; EP0863211A1; NO950348D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒンジ領域で結合された第一および第二タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなり、該プロモーター配列が周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有したものであり、該第一タンパク質が破傷風菌毒素Ｃ断片またはその１以上のエピトープである、ＤＮＡ構築物を提供する。本発明は、第一抗原配列およびヒンジ領域、並びにその３´末端またはその隣に第二抗原配列導入用の１以上の制限部位をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されているプロモーターを有した中間分子も提供する。加えて、本発明は融合タンパク質が発現されるＤＮＡを含んだ複製性発現ベクター、そのベクターで形質転換された細菌と、ワクチンにおけるその細菌の用途についても提供する。

Description

【発明の詳細な説明】弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現本発明はＤＮＡ構築物、その構築物を含有した複製性発現ベクター、その構築物を含有した弱毒化細菌、およびその細菌を含有したワクチンに関する。近年、細菌の芳香族生合成経路の遺伝子における不可逆変異の導入により弱毒化されたSalmonellaの株に基づく経口サルモネラ生ワクチンの新世代が現れた。このような株は例えばＥＰ - Ａ - ０３２２２３７で開示されている。上記経口サルモネラ生ワクチンはヒトおよび動物でサルモネラ症用のワクチンとして有望であり、それらは免疫系への異種抗原送達用のキャリアとしても有効に使用できる。混合サルモネラワクチンはウイルス、細菌および寄生虫からの抗原を送達して、組換え抗原に対する分泌、体液性および細胞性免疫応答を生じさせるために用いられてきた。混合サルモネラワクチンは、単一用量経口マルチワクチン送達系としての大きな可能性を示している（C.Hormaeche et al,FEMS Symposium,No. 63,Plenum,NewYork,pp.71-83,1992）。混合サルモネラワクチンの開発には克服すべき問題がある。主要な考慮事項は、免疫応答を誘発する上で十分であるような高レベルの組換え抗原の発現をサルモネラワクチンで得ることである。しかしながら、外来抗原の未調節の高レベル発現は毒性であって、細胞生存力に影響を与え（I.Charles and G.Dougan,TIBTECH,8,p p.117-21,1990）、ワクチンを無効にするか、または組換えＤＮＡの喪失を起こす。この問題についてのいくつかの可能な解決策、例えば必須遺伝子である“オン - オフ”（on-off）プロモーターを有したプラスミドからの発現、またはサルモネラ染色体中への外来遺伝子の組込みが記載されていた。上記問題を克服する別の手段は、インビボで誘導しうるプロモーターを用いることであり、このようなプロモーターの１つはE．coli亜硝酸レダクターゼプロモーターｎｉｒＢであり、これは嫌気生活下で誘導され、Clostridium tetaniの破傷風菌毒素断片Ｃ（ＴｅｔＣ）生産のためのバイオテクノロジーで用いられている（M.D.Oxer et al,Nucl.Ac.Res.,19,pp.2889-92,1991）。ｎｉｒＢプロモーターからＴｅｔＣを発現する構築物（ｐＴＥＴｎｉｒ１５）を保有したAro Salm onellaがマウスにおいて非常に高い抗破傷風菌抗体応答を示すことは、本出願の発明者らにより既に見い出されている（S.N.Chatfield et al,Bio/Technology,V ol.10,pp.888-92,1992）。このChatfield et al による論文は本出願の優先日後に公表された。しかしながら、我々はｎｉｒＢからSchistosoma mansoni単独のＰ２８抗原を発現させようと試みたとき、得られた構築物が免疫原性でないことも見い出した。破傷風菌トキソイドは、化学的にカップリングされたゲストエピトープ用のアジュバントとしてよく用いられている（D.A.Herrington et al,Nature,328,pp.2 57-9,1987）。SalmonellaにおけるＴｅｔＣの強い免疫原性は、ゲストペプチドまたはタンパク質の免疫応答を促進する上でこの特徴を活用できることを我々に示唆した。しかしながら、２つのタンパク質を一緒に融合させると、個別成分の性質をもはや留めていない、不正確に折りたたまれたキメラタンパク質がしばしば生ずる。例えば、Vlbrio cholerae（ＣＴ - Ｂ）およびE.coli（ＬＴ - Ｂ）腸毒素のＢサブユニットは強力な粘膜免疫原であるが、これらサブユニットとの遺伝子融合体はキャリアの構造および性質と、ひいてはそれらの免疫原性も変えることがある（M.Sandkvist et al,J.Bacteriol.,169,pp.4570-6,1987,Clements ,1990 and M.Lipscombe et al,Mol.Microbiol.,5,pp.1385,1990 参照）。更に、細菌で発現される多くの異種遺伝子は可溶性の、適正に折りたたまれた、または活性な形では生産されず、不溶性の凝集物として蓄積する傾向がある（C.Schein et al,Bio/Technology, 6,pp.291-4,1988 ;R.Halenbeck et al,Bio/Technology ,7,pp.710-5,1989）。上記問題を克服することが本発明の目的である。我々は、組換え抗原、特に融合タンパク質の効率的発現が、誘導性プロモーター（例えばｎｉｒＢ）を用いて、融合タンパク質の２つの抗原成分間に可動性ヒンジ領域を組込むことにより、細菌（例えばsalmonellae）で行えることをここに発見した。得られた組換え抗原は、良好な免疫原性を有することが示された。タンパク質の高発現は、また、そのタンパク質をコードする遺伝子が破傷風菌毒素Ｃ断片の遺伝子に結合されたときに得られることが、意外にもわかった。したがって、第一の態様において、本発明は、ヒンジ領域で結合された第一および第二タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなるＤＮＡ構築物であって、プロモーター配列が周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有することを特徴とする構築物を提供する。もう１つの態様において、本発明は、結合された第一および第二タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなり、その第一異種タンパク質が破傷風菌毒素断片Ｃまたはその１以上のエピトープを含んだ抗原配列である、ＤＮＡ構築物を提供する。別の態様において、本発明は前記のようなＤＮＡ構築物を含有する、細菌での使用に適する、複製性発現ベクターを提供する。もう１つの面において、本発明は好ましくは実質上純粋な形をした融合タンパク質、（例えば、ヒンジ領域により）結合された第一および第二タンパク質を含んでなる融合タンパク質を提供し、その融合タンパク質は前記のような複製性発現ベクターで発現される。別の態様において、本発明は弱毒化された細菌を前記のようなＤＮＡ構築物で形質転換することからなる、弱毒化細菌の生産法を提供する。本発明は、前記のような弱毒化細菌または融合タンパク質と薬学上許容されるキャリアを含んでなるワクチン組成物も提供する。第一および第二タンパク質は好ましくは異種タンパク質であり、特にポリペプチド免疫原であって、例えばそれらはウイルス、細菌、真菌、酵素または寄生虫から誘導される抗原配列である。特に、第一の上記タンパク質は破傷風菌毒素断片Ｃまたはそのエピトープを含んだ抗原配列であることが好ましい。第二タンパク質は病原生物の抗原決定基であることが好ましい。例えば、抗原決定基はウイルス、細菌、真菌、酵素または寄生虫から誘導される抗原配列である。第一および／または第二異種タンパク質に関するウイルス抗原配列の例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のタイプ、例えばＨＩＶ - １またはＨＩＶ - ２、ＨＩＶ、例えばＨＩＶ - １または - ２からのＣＤ４レセプター結合部位、肝炎ＡまたはＢウイルス、ヒトライノウイルス、例えば２型または１４型、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス２型または３型、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、例えば１６型パピローマウイルス、そのＥ７タンパク質、Ｅ７タンパク質またはそのエピトープを含む断片、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から誘導される配列である。細菌から誘導される抗原の例はBordetella pertussis（例えば、Ｐ６９タンパク質および繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原）、Vibrio cholerae、Bacillus anthraci sおよびE.coli抗原、例えばE.coli熱不安定毒素Ｂサブユニット（ＬＴ - Ｂ）、 E.coliＫ８８抗原および腸毒性E.coli抗原から誘導されるものである。抗原の他の例には、細胞表面抗原ＣＤ４、Schistosoma mansoniＰ２８グルタチオンＳ - トランスフェラーゼ抗原（Ｐ２８抗原）、ならびに吸虫類、マイコプラズマ、回虫、条虫類、Chlamydia trachomatisおよびマラリア寄生虫、例えばplasmodium またはbabesia属の寄生虫（例えばplasmodium falciparum）の抗原、ならびに上記抗原由来の免疫原性エピトープをコードするペプチドが挙げられる。具体的な抗原には全鎖長Schistosoma mansoni Ｐ２８、（ＢおよびＴ細胞エピトープを双方とも含有した）免疫原性Ｐ２８ａａ１１５ - １３１ぺプチドのオリゴマー（例えば、２、４および８マー）、ヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質、単純ヘルペス抗原、口蹄疫ウイルス抗原およびサル免疫不全ウイルス抗原がある。プロモーター配列は周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有したものであり、このようなプロモーター配列の例は嫌気性条件により誘導される活性を有したものである。このようなプロモーター配列の具体例は、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／００３８７で記載されたｎｉｒＢプロモーターである。ｎｉｒＢプロモーターはE.coliから単離されたが、それは亜硝酸レダクターゼ遺伝子ｎｉｒＢ（Jayaraman et al,J.Mol.Biol.,196,781-788,1987）およびｎｉｒＤ、ＮｎｉｒＣ、ｃｙｓＧ（Peakman et al,Eur.J.Biochem.,191,315-323,1990）を含めたオペロンの発現を指示する。それは亜硝酸と環境の酸素圧の変化の双方により調節され、酸素を除去したとき活性になる（Cole,Biochem.Biophys.Acta.,1 62,356-368,1968）。嫌気生活への応答は、多くの嫌気性呼吸遺伝子に共通したメカニズムで、転写アクチベーターとして作用するタンパク質ＦＮＲを介して媒介される。欠失および変異分析により、嫌気生活に唯一応答するプロモーターの一部が単離され、他の嫌気性調節プロモーターとの比較により共通ＦＮＲ結合部位が確認されている（Bell et al,Nucl.Aclds Res.,17,3865-3874, 1989；jayaraman et al,Nucl.Acids Res.,17,135-145,1989）。推定ＦＮＲ結合部位と−１０相同領域との距離は重要であることも示された（Bell et al,Molec .Microbiol.,4, 1753-1763,1990）。したがって、嫌気生活に唯一応答するｎｉｒＢプロモーターのその部分だけを用いることが好ましい。ここで用いられるｎｉｒＢプロモーターについて言及するときは、嫌気性条件下でコード配列の発現を促進できるそのプロモーター自体あるいはその一部または誘導体を言うものとする。ｎｉｒＢプロモーターを含有した好ましい配列は AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCC（配列NO:1）である。ヒンジ領域は、ドメイン間で空間および時間の双方を分離して、第一および第二タンパク質双方の独立した折りたたみを促進しうるように設計された領域である。ヒンジ領域とは、典型的には高割合のプロリンおよび／またはグリシンアミノ酸をコードする配列である。ヒンジ領域は完全にプロリンおよび／またはグリシンアミノ酸から構成してもよい。ヒンジ領域は１以上のグリシン - プロリンジペプチド単位を含んでいてもよい。ヒンジ領域は、例えば約１５以内のアミノ酸、例えば少くとも４つ、好ましくは６〜１４のアミノ酸を含み、アミノ酸の数は第一および第二タンパク質間に可動性を付与しうるような数である。一態様において、ヒンジ領域は抗体免疫グロブリンのヒンジドメインに実質上相当しうる。ＩｇＧ抗体のヒンジ領域は特にプロリンに富み（T.E.Mlchaelson e t a1,J.Biol.Chem.,252,883-9,1977）、これは抗原結合および尾部ドメイン間に可動性接合を与えると考えられる。以下の理論に拘束されるわけではないが、プロリンは、このアミノ酸に特徴的な環構造がプロリン残基を隣接アミノ酸と連結しているペプチド結合周囲で回転を妨げることから、ヒンジの堅い部分を形成すると考えられる。この性質はプロリンおよび隣接残基がα - ヘリックスまたはβ鎖の定序構造をとらないようにしていると考えられる。可動性は、非常に限定された立体的要求しかしない最も簡単なアミノ酸、すなわちグリシンにより付与されると考えられる。グリシンはヒンジにおいて可動性のひじ部分（elbow）として機能すると考えられる。他のアミノ酸、特にかさ高い（bulky）鎖がないもの、例えばアラニン、セリン、アスパラギンおよびトレオニンもグリシンの代わりに用いてよい。１つの好ましい態様において、ヒンジ領域は下記配列を有した４以上のアミノ酸の鎖である： - 〔Ｘ〕ｐ - Ｐｒｏ - 〔Ｙ〕ｑ - Ｐｒｏ - 〔Ｚ〕ｒ - （上記式中、Ｐｒｏはプロリンであり、ＸおよびＹは各々グリシンまたはかさ高くない（non-bulky）側鎖を有したアミノ酸であり、Ｚはいずれかのアミノ酸であり、ｐは正の整数であり、ｑは０〜１０の正の整数であり、ｒは０または０より大きい正の整数である）。ヒンジ領域は第一および第二タンパク質双方にとり異種の別な領域であっても、あるいは第一タンパク質のカルボキシ末端部分または第二タンパク質のアミノ末端部分により規定してもよい。 E.coli（H.Grosjean et al,Gene,18,199-209,1982）およびSalmonellaで稀にしか利用されないコドンもヒンジをコードするために選択され、稀なコドン自体はメッセンジャーＲＮＡの翻訳時にリボソームの停止を起こして、ボリペプチドドメインの正確な折りたたみを行わせると考えられる（I.J.Purvis et al,J.Mol .Biol.,193,413-7,1987）。更に、可能であるならば、得られた融合体で翻訳されるときに、かさ高いまたは荷電した側基をコードしないクローニング領域について制限酵素が選択される。最も好ましい面において、本発明はヒンジ領域で結合された第一および第二ポリペプチド免疫原をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたｎｉｒＢプロモーターを含んでなり、第一ポリペプチド免疫原が破傷風菌毒素断片Ｃまたはそのエピトープを含んでいるＤＮＡ分子を提供する。本発明のもう１つの好ましい面では、ヒンジ領域で結合された第一および第二ポリペプチド免疫原をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたｎｉｒＢプロモーター配列を含む、細菌での使用に適する、複製性発現ベクターであって、第一ポリペプチド免疫原が破傷風菌毒素断片Ｃまたはそのエピトープを含んでいるもの、が提供される。抗原をコードする第二配列にヒンジ領域を介して結合された破傷風菌毒素断片Ｃ（ＴｅｔＣ）をコードするＤＮＡ配列を提供することにより、細菌細胞中におけるその配列の発現は断片Ｃおよびヒンジ領域が存在しない構築物と比較して高められることがわかった。例えば、S.mansoniの全鎖長Ｐ２８タンパク質の発現レベルは、ＴｅｔＣとの融合体として発現されたときに、Ｐ２８タンパク質がｎｉｒＢプロモーターから単独で発現されるときよりも大きかった。S.mansoniの全鎖長Ｐ２８タンパク質およびそのタンデムエピトープとのＴｅｔＣ融合体はすべて可溶性であり、E.coliおよびS.typhimuriumの双方で発現された。加えて、ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合タンパク質はグルタチオンアガロースマトリックスでアフィニティ精製することができ、このことはＰ２８がその天然基質となおも結合しうるコンホメーションをとるように正確に折りたたまれたことを示唆している。ヒンジ領域で結合された第一および第二異種タンパク質の適切な発現はインビボで得ることができる。異種タンパク質は弱毒化細菌で発現させることができ、そのためこれはワクチンとして使用できる。弱毒化細菌はSalmonella、 Bordetella、 Vibrio、Haemophilus、NeisseriaおよびYersinia属から選択される。一方、弱毒化細菌は腸毒性Escherichia coliの弱毒株であってもよい。特に、下記種、即ちS.typhi-ヒトチフス菌の原因；S.ty phimurium-いくつかの動物種でサルモネラ症の原因；S.enteritidis-ヒトで食中毒の原因；S.choleraesuis - ブタでサルモネラ症の原因；Bordetella pertussi s - 百日咳の原因； Haemophilus influenzae - 髄膜炎の原因； Neisseria gon orrhoeae-淋病の原因； Yersinia - 食中毒の原因が挙げられる。細菌の弱毒化は、細菌の芳香族アミノ酸生合成経路における遺伝子の非復帰変異に関するものでもよい。芳香族アミノ酸生合成経路の分岐点化合物であるコリスミン酸の合成に関与する遺伝子が少くとも存在している。これらのうちいくつか、例えばａｒｏＡ（５ - エノールピルビルシキミ酸 - ３ - リン酸シンターゼ）、ａｒｏＣ（コリスミン酸シンターゼ）、ａｒｏＤ（３ - ジヒドロキナ酸デヒドラターゼ）およびａｒｏＥ（シキミ酸デヒドロゲナーゼ）は、細菌ゲノム上の広い異なる位置に存在している。したがって、変異はａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤまたはａｒｏＥ遺伝子にあってもよい。しかしながら、好ましくは、弱毒化細菌はその芳香族アミノ酸生合成経路における２つの異なる遺伝子の各々で非復帰変異を有している。このような細菌はＥＰ - Ａ - ０３２２２３７で開示されている。適切な二重ａｒｏ変異体はａｒｏＡａｒｏＣ、ａｒｏＡａｒｏＤおよびａｒｏＡａｒｏＥである。しかしながら、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤまたはａｒｏＥ遺伝子の他の組合せで変異を有する他の細菌も有用である。Salmonella二重ａｒｏ変異体、例えばS.typhiまたはS.t yphimuriumの二重ａｒｏ変異体、特にａｒｏＡａｒｏＣ、ａｒｏＡａｒｏＤおよびａｒｏＡａｒｏＥ変異体が特に好ましい。一方、弱毒化細菌は１以上の他の遺伝子の調節に係わる遺伝子に不可逆変異を有していてもよい（ＥＰ - Ａ - ０４００９５８）。好ましくは、変異は調節に係わるｏｍｐＲ遺伝子または他の遺伝子に存在する。調節に係わり、しかも環境刺激に応答することが知られた他の遺伝子も多数ある（Ronson et al,Cell,49,579-581）。このタイプの弱毒化細菌は、第二遺伝子に第二の変異を有していてもよい。好ましくは、第二遺伝子は必須生合成経路に係わる酵素をコードする遺伝子、特に芳香族化合物の生合成経路に係わる前コリスミン酸経路に係わる遺伝子である。したがって、第二の変異はａｒｏＡ、ａｒｏＣまたはａｒｏＤ遺伝子にあることが好ましい。他のタイプの弱毒化細菌は、環境ストレスに応答して生産されるタンパク質をコードする、またはそれをコードするＤＮＡの発現を調節する細菌のＤＮＡで非復帰変異の存在により弱毒化が起きた細菌である。このような細菌はＷＯ９１／１５５７２で開示されている。非復帰変異には欠失、挿入、逆位または置換がある。欠失変異はトランスポゾンを用いて行えばよい。本発明によるＤＮＡ構築物を含んだ弱毒化細菌は、ワクチンとして用いることができる。細菌により発現された（好ましくは実質上純粋形の）融合タンパク質もワクチンの製造に使用できる。例えば、精製ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合タンパク質はそれ自体で免疫原性であることがわかった。したがって、別の面において、本発明は薬学上許容されるキャリアまたは希釈剤と、活性成分として前記のような弱毒化細菌または融合タンパク質を含んでなるワクチン組成物を提供する。ワクチンは１種以上の適切なアジュバントを含んでいてもよい。ワクチンは凍結乾燥形、例えばカプセル形、で患者への経口投与用に提供されることが有利である。このようなカプセルは、例えばEudragit ″S″、Eudragit ″L″、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含んだ腸溶性コーティングで提供してもよい。これらのカプセルはそのままで用いてもよく、一方凍結乾燥物質は投与前に例えば懸濁液として再調製してもよい。再調製は、生物の生存を保証しうる適切なｐＨの緩衝液で行われることが有利である。弱毒化細菌およびワクチンを胃酸性から保護するためには、炭酸水素ナトリウム調製物がワクチンの各投与前に投与されることが有利である。一方、ワクチンは非経口投与、鼻内投与または乳内投与用に製造してもよい。本発明のＤＮＡ構築物を含んだ弱毒化細菌は宿主、特にヒト宿主の、おそらく動物宿主であっても、予防処置に用いてよい。したがって、微生物、特に病原体に起因する感染は、本発明による弱毒化細菌の有効量を投与することにより防止される。その後に、細菌は微生物に対する抗体を生じさせうる異種タンパク質を発現する。用いられる投与量は、宿主の大きさおよび重量、処方されるワクチンのタイプと、異種タンパク質の性質を含めた様々な因子に依存している。本発明による弱毒化細菌は、弱毒化される細菌を前記のようなＤＮＡ構築物で形質転換することにより生産してもよい。いずれかの適切な形質転換技術、例えばエレクトロポレーションが用いられる。こうして、細菌にとり異種のタンパク質を発現できる弱毒化細菌が得られる。弱毒化細菌の培養物も好気性条件下で増殖させてよい。こうして、十分量の細菌が、異種タンパク質の最少発現を行うワクチンとしての処方用に生産される。ＤＮＡ構築物は、ヒンジ領域により結合された破傷風菌毒素Ｃ断片またはそのエピトープおよび第二異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたｎｉｒＢプロモーターを含んでなる複製性発現ベクターであってもよい。ｎｉｒＢプロモーターは、タンパク質の発現をコントロールする現存プロモーターの代わりに、異種タンパク質（例えば、破傷風菌毒素Ｃ断片）の発現をコードする遺伝子を既に組み込んだ発現ベクターに挿入される。次いで、ヒンジ領域と、第二異種タンパク質（例えば、抗原配列）をコードする遺伝子が挿入される。発現ベクターは、勿論、そのベクターが挿入される弱毒化細菌と適合できねばならない。発現ベクターには、ｎｉｒＢプロモーターの他に転写終結部位と翻訳開始および停止コドンを含んだ、適切な転写および翻訳コントロール要素も設定される。適切なリボソーム結合部位も設定される。ベクターは典型的には複製起点と、所望であれば選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、を含む。ベクターはプラスミドであってもよい。本発明は下記例と添付図面を参照して説明され、それらによっては制限されるものではない：図１は、本発明の一態様による、中間プラスミドｐＴＥＣＨ１の構築の概略図である。図２は第二中間プラスミドｐＴＥＣＨ２の構築の概略図である。図３は、出発物質として図２の中間プラスミドを用いた本発明のプラスミドの構築の概略図である。図３において、Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＶ、Ｈ＝ＨｉｎｄIII、Ｘ＝ＸｂａＩ、Ｓ＝ＳｐｅＩ図４は反復エピトープ（レピトープ）を含んだプラスミドの構築の概略図である。図５は、ＳＬ３２６１、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＴｎｉｒ１５）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - モノマー）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - ダイマー）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - テトラマー）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - オクタマー）およびＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８）で静脈内接種されたマウスにおいて、ＥＬＩＳＡにより検出されるような組換え S.mansoniタンパク質Ｐ２８に対する抗体応答について示している。図５において、結果は免疫後に間隔をおいた個々のマウスのＯＤとして表示されている。図６は、図５のように接種されたマウスでＥＬＩＳＡにより検出されるようなＴｅｔＣに対する抗体応答について示している。図７は、ＳＬ３２６１、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - モノマー）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - ダイマー）、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - テトラマー）およびＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ２ - オクタマー）で静脈内接種されたマウスにおいて、ＥＬＩＳＡにより検出されるようなオボアルブミンとカップリングされたＰ２８タンパク質のペプチド１１５ - １３１に対する抗体応答について示している。図８は、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８）で経口接種されたマウスからＥＬＩＳＡにより検出されるようなＴｅｔＣに対する抗体応答について示している。図９は、図８のように接種されたマウスでＥＬＩＳＡにより検出されるような組換えＰ２８に対する抗体応答について示している。図１０は、ｐＴＥＣＨ２中間プラスミドからの様々な構築物の作製について概略している。図１１は、ｐＴＥＣＨ２を用いて作製された三部分（tripartite）タンパク質構造体（“ヘテロマー”）の構造について概略している。図１２は、ベクターｐＴＥＣＨ１（配列NO:17）のＤＮＡ配列について示している。図１３は、ベクターｐＴＥＣＨ２（配列NO:18）のＤＮＡ配列について示している。図１４は、ベクターｐＴＥＣＨ２上の制限部位について概略している。例１ｐＴＥＣＨ１の作製ｎｉｒＢプロモーターおよびＴｅｔＣ遺伝子、並びにヒンジ領域をコードし、かつ、第二またはゲストタンパク質をコードする遺伝子の挿入を行える制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだＤＮＡ配列を組み込んだプラスミド、ｐＴＥＣＨ１の作製法が図１で示されている。図１で示された出発物質、発現プラスミドｐＴＥＴｎｉｒ１５は、ｌａｃＩ遺伝子およびｔａｃプロモーターを含むＥｃｏＲＩ - ＡｐａＩ領域（１３５４bp）を下記対のオリゴ１および２：で置き換えることにより、ｐＴＥＴｔａｃ１１５（Makoff et al,Nucl.Acids Re s.,17,10191-10202,1989）から構築した。そのオリゴヌクレオチドはPharmacia Gene Assemblerで合成し、得られたプラスミドを配列決定により確認した（Makoff et al,Bio/Technology,7,1043-1046, 1989）。次いでｐＴＥＴｎｉｒ１５プラスミドは、断片Ｃ融合タンパク質の発現を指示するように、異種ＤＮＡの挿入部位として適したポリリンカー領域を組み込んだ新規ｐＴＥＣＨ１プラスミドの構築に用いた。ｐＴＥＴｎｉｒ１５は断片Ｃの発現を指示する既知ｐＡＴ１５３ベースのプラスミドである。しかしながら、ＴｅｔＣ遺伝子の３´末端に存在する天然の好都合な制限部位はない。したがって、ヒンジ領域により先行される標的部位は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、“アド - オン”（add -on）アダプター配列（表１）で調製されたプライマーによりＴｅｔＣコード領域の３´末端に導入した（K.Mullis et al,Cold Spring Harbor Sym.Quant.Biol .,51,263-273,1986）。したがって、ｐＴＥＴｎｉｒ１５はＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ部位をカバーする領域に相当するプライマーを用いたＰＣＲ反応で鋳型として用いた。この増幅におけるアンチセンスプライマーは３８塩基の５´アダプター配列で調製した。そのアンチセンスプライマーは、新たなＸｂａＩ、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位をコードする配列をＰＣＲ産物中に組み込めるように設計した。加えて、プロリンを含めた追加の余分なアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を組み込み（ヒンジ領域）、翻訳停止コドンシグナルを断片Ｃオープン読取枠と同枠で組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩで切断し、ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩで既に切断された残留２．８kbベクターｐＴＥＴｎｉｒ１５中に組み込んでクローニングした。形質転換コロニーから精製されたｐＴＥＣＨ１と呼ばれるプラスミドは図１で示されている。異種配列、例えばSchistosoma manson iＰ２８グルタチオンＳ - トランスフェラーゼ（Ｐ２８）をコードする配列を既知方法に従いＸｂａＩ、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に組み込んでクローニングした。例２ｐＴＥＣＨ２の構築ｐＴＥＣＨ１の有用性を更に改善するために、短いリンカー配列がｐＴＥＣＨ１のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位間に導入され、オリゴヌクレオチドの方向性クローニングを行わせ、かつ、多重タンデムエピトープ（“レピトープ”）の構築を促進させた（図２）。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＮＳｐｅＩの制限酵素標的部位とその後に翻訳停止コドンを有した２つの相補性オリゴヌクレオチドを合成した（表１）。そのオリゴヌクレオチドをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ付着末端で調製した。しかしながら、ＢａｍＨＩ標的配列は誤対合を含めて設計されており、クローニング時にｐＴＥＣＨ１におけるこの制限部位は壊される。このバージョンのベクターはｐＴＥＣＨ２と命名した。例３ｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８の構築Ｐ２８遺伝子発現カセットは、鋳型としてｐＵＣ１９ - Ｐ２８ＤＮＡ（Dr.R. Pierce,Pasteur Institute,Lilleの好意による）を用いて、ＰＣＲにより作製した。オリゴヌクレオチドプライマーは、開始コドンで始まり停止コドンで終わる全鎖長Ｐ２８遺伝子を増幅させるように設計した。加えて、センスおよびアンチセンスプライマーを各々ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩの制限部位で調製した。生成物をゲル精製し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、次いで既にこれらの酵素で切断され、ゲル精製されたｐＴＥＣＨ１中に組み込んでクローニングした。ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合タンパク質の発現ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合タンパク質の発現は、その構築物を有する細菌細胞のＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより評価した。融合タンパク質は可溶性のままであり、ＴｅｔＣおよびＰ２８双方に対する抗血清と交差反応し、そして全鎖長融合体について予想分子量８０kDalであることがわかった。融合タンパク質は、ＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより判断したところ、E.coli（ＴＧ２）およびS.typhimurium（ＳＬ５３３８、ＳＬ３２６１）を含めたいくつかの異なる遺伝的バックグラウンドで安定的に発現された。ＴｅｔＣ - ヒンジタンパク質だけと同時移動し、かつ、抗ＴｅｔＣ血清ともっぱら交差反応する５０kDalの小さなバンドがウエスタンブロットで視認できることに興味がもたれた。ヒンジ領域でのコドン選択は準最適であるように設計されているため、まれなコドンは翻訳中に停止を起こして、時々翻訳の不完全終結を導き、こうしてこのバンドの説明がつけられる。ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合体のアフィニティ精製グルタチオンはＰ２８、グルタチオンＳ - トランスフェラーゼの天然基質である。グルタチオンを結合させる上で関与するアミノ酸残基は、ポリペプチドの一次構造で空間的に離れており、三次構造でグルタチオン結合ポケットを形成するために一つにまとめられると考えられる（P.Reinemer et al,EMBO J.,8,1997- 2005,1991）。融合体のＰ２８成分がグルタチオンを結合できるコンホメーションをとるように正確に折りたたまれているかどうかを判断するために、グルタチオン - アガロースマトリックスでアフィニティ精製されうるその能力について試験した。得られた結果（示さず）は、ＴｅｔＣ - Ｐ２８が実際にマトリックスと結合できること、および融合体が遊離グルタチオンと競合的に溶出されることから、結合が可逆性であることを明らかにした。例４ｐＴＥＣＨ２ - Ｐ２８（ａａ１１５ - １３１）ペプチド融合体の構築ａａ１１５ - １３１ペプチドをコードする相補性オリゴヌクレオチドはE.col iで最適な発現のためにコドン選択して設計した（H.Grosjean et al,ldem）。そのオリゴヌクレオチドをアニーリングで形成されたＢｇｌIIおよびＳｐｅＩ付着末端で調製し、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで既に切断されたｐＴＥＣＨ２中に組み込んでクローニングした（図３）。エピトープの反復タンデムコピー（レピトープ）を下記手段によりｐＴＥＣＨ２で構築した。組換え融合ベクターをＸｂａＩおよびＳｐｅＩで切断し、各切断物に、ベクター内の他の箇所で唯一切断する第二の制限酵素、例えばアンピシリン耐性遺伝子内でもっぱら切断を行うＰｓｔＩを加えた（図４）。エピトープ配列を含むＤＮＡ断片は二重切断物の各々から精製して、混合し、その後に結合させることができる。ＸｂａＩはその標的配列を開裂させて、ＳｐｅＩ突出部と適合する５´ - ＣＴＡＧ突出部を形成する。結合により、これら双方の酵素の認識配列は壊れる。こうすると、ＸｂａＩ - ＳｐｅＩ制限部位は唯一のままであり、操作はエピトープの４または８タンデムコピーを発現する組換え融合ベクターを構築するために簡単かつ有効に繰返すことができる（図４）。類似方法は神経ペプチド生産用のマルチマー融合タンパク質の形成で他者により用いられていた（T.Kempe et al,Gene,39,239-45,1985）。ＴｅｔＣ - ぺプチド融合タンパク質の発現モノマー、ダイマー、テトラマーおよびオクタマータンデムペプチド反復体としてのＴｅｔＣ - ペプチド融合体の発現は、その構築物を有する細菌株のＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより評価した。融合タンパク質は可溶性のままであり、ＴｅｔＣおよびＰ２８に対する双方の抗血清と交差反応し、しかも予想分子量を示す（図５）。更に、融合タンパク質は、ＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより判断したところ、E.coli（ＴＧ２）およびS.typhimurium（ＳＬ５３３８、ＳＬ３２６１）を含めたいくつかの異なる遺伝的バックグラウンドで発現される。抗Ｐ２８抗体でプローブ処理したウエスタンブロットでみられるもっと低い分子量の弱いバンドの出現で示されるように、もっと多数のコピーからなるレピトープの分解もいくらか存在することがわかった。バンドの大きさは、それらがＴｅｔＣに対して少ないコピー数の融合体からなることを示唆していた。上記ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合体の場合のように、ＴｅｔＣ - ペプチド融合体の発現レベルはｐＴＥＣＨ２からＴｅｔＣ単独の場合よりも少なく、発現レベルはコピー数増加に従い次第に減少した。例５免疫学的研究インビボにおけるプラスミド構築物の安定性およびマウスの免疫処置ＢＡＬＢ／ｃマウスに、S.typhimurium ＳＬ３２６１および異なる構築物を有するＳＬ３２６１を約１０^６cfu静脈内または５×１０^９経口で与えた。１〜８日目（エピトープ融合体）および１〜１１日目（ベクター、オクタマーおよびＰ２８融合体）に行われた肝臓、脾臓および（経口接種マウスでは）リンパ節のホモジネートにおける生存カウント数はアンピシリン含有および非含有培地で類似していたが、これはプラスミドが組織で増殖中に失われなかったことを示している。静脈内免疫されたマウスの抗体応答ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合体に対する抗体応答尾採血を各群マウス８匹の動物から３〜６週目に毎週行った。図５は、ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合体を発現するサルモネラで免疫されたマウスにおいて、組換えＰ２８に対する抗体応答が３週目までに現れて、４週目以後６／６マウスで陽性であったことを示している。抗Ｐ２８抗体は、ＳＬ３２６１、ＳＬ３２６１ - ｐＴＥＴｎｉｒ１５またはｐＴＥＣＨ２で免疫されたマウスの血清で検出されなかった。ＴｅｔＣを単独でまたはＴｅｔＣ - Ｐ２８融合体として発現するサルモネラで（サルモネラ単独ではなく）免疫されたすべてのマウスは、ＴｅｔＣに対する抗体を早くも３週目には出現させた（図６）。ＴｅｔＣ - ぺプチド融合体に対する抗体応答ａａ１１５ - １３１ペプチドの多重コピーに融合されたＴｅｔＣを発現するサルモネラで免疫されたマウスから上記のように採血し、血清をオボアルブミンに化学的に結合された合成１１５ - １３１ペプチドおよび組換えＰ２８に対するＥＬＩＳＡにより試験した。図７は、ペプチドに対する抗体応答が早くも３週目に検出され、その後増加し、応答が多くのペプチドコピー数を含む融合体ほど強かったことを示している。オクタマー融合体が陽性のマウス４〜５匹で最良の応答を示した。抗体応答はＳＬ３２６１、ｐＴＥＣＨ２またはモノマーエピトープ融合体で免疫されたマウスでオボアルブミンーモノマーまたは組換えＰ２８に対して検出されなかった。抗エピトープ血清の一部はＥＬＩＳＡで全鎖長Ｐ２８タンパク質を認識した（図５）。ダイマー融合体で注射されたマウス１匹は５週目に陽性であり、テトラマー融合体で注射されたもう１匹のマウスは３週目に陽性であった。その後オクタマー融合体で注射された少くとも２匹のマウスの血清は、４〜６週目に一貫してＰ２８を認識した。要約すると、レピトープに対する抗体応答は、コピー数増加で劇的に改善され、テトラマーおよびオクタマーレピトープ融合体が最も強力であった。モノマー融合体に対する抗体応答は検出されなかった。異なる融合体で免疫されたマウスのＴｅｔＣに対する抗体応答ＴｅｔＣに対する抗体応答はすべてのグループで同一というわけではなく、ＴｅｔＣへのＣ末端融合体の付加は明らかに応答を変えた。図６は、ベクターｐＴＥＣＨ２（ＴｅｔＣ - ヒンジ単独）で示されたＴｅｔＣに対する抗体応答が親ベクターｐＴＥＴｎｉｒ１５に対するＴｅｔＣ応答よりも有意に低かったことを示している。意外にも、大きさを増した融合体のＴｅｔＣへの付加はＴｅｔＣに対する応答を劇的に回復させる。最大融合体、ｐＴＥＣＨ１の全鎖長Ｐ２８に対する抗ＴｅｔＣ応答は、（試験条件下で）親プラスミドから得られたＴｅｔＣに対する応答と類似していた。非組換えＳＬ３２６１で注射されたマウスの血清は、試験期間中いかなるときもＴｅｔＣと反応しなかった。経口免疫されたマウスの抗体応答マウス１０匹の群を、ＳＬ３２６１単独あるいはｐＴＥＣＨＩまたはｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８を有するＳＬ３２６１約５×１０⁹cfuで、胃管栄養チューブから０．２ml胃内に与えて、経口免疫した。３〜１０週目に採取した血液は、組換えサルモネラを受容したほとんどのマウスが早くも３週目にＴｅｔＣに対する抗体を生産することを示した（図８）。ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合体で免疫されたマウスはＰ２８に対する抗体を生産し、これは８週目までに約半数のマウスで検出できたが、その後減少した（図９）。精製融合タンパク質で免疫されたマウスの抗体応答マウスを水酸化アルミニウムに吸着されたアフィニティ精製ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合タンパク質で皮下免疫した。コントロールは市販の破傷風菌トキソイドのみを受容した。予備結果では、融合タンパク質を受容した動物がＴｅｔＣおよびＰ２８双方に対する抗体応答を起こすことを示している（データ示さず）。抗Ｐ２８抗体は破傷風菌トキソイドを与えたマウスで検出されなかった。ＴｅｔＣおよびＰ２８に対するＴ細胞応答マウスをＳＬ３２６１、ＳＬ３２６１（ｐＴＥＴｎｉｒ１５）およびＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８）約１０⁶cfuで静脈内免疫した。６月後に、ＩＬ - ２／ＩＬ - ４生産としてのＴ細胞応答を、下記の物質および方法と題されたセクションで記載されるように、サルモネラ全細胞可溶性抽出物、ＴｅｔＣ、組換えＰ２８および全成虫抗原に対して測定した。表２は、双方のグループからの細胞が水酸化ナトリウム処理サルモネラ抽出物およびＴｅｔＣに対するＩＬ - ２／ＩＬ - ４応答を生じたことを示している。しかしながら、ＴｅｔＣ - Ｐ２８融合体を発現するサルモネラで免疫されたマウスからの細胞も、組換えＰ２８および全虫抽出物の双方に応答した。このように、サルモネラ送達系はＰ２８に対する体液性および細胞性（Ｔ細胞）双方の免疫応答を引き出した。組換え抗原を発現するサルモネラはすべてマウス組織と親株で生き残っていて、プラスミドはインビボで失われていなかった。より高分子量の融合体（全鎖長Ｐ２８およびオクタマー）を発現する構築物が最も免疫原性であるとわかった。免疫応答は、更なるＴ細胞ヘルパーエピトープを提供するキャリアＴｅｔＣにより促進されたことがある（Francis et al,Natu re,330,168-170,1987）。４週目までに、ｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８を有する細胞で免疫されたすべてのマウスは、静脈内免疫後に、ＴｅｔＣと更に全鎖長Ｐ２８タンパク質との双方に対して応答した。経口で免疫されたマウスもＴｅｔＣおよびＰ２８に応答したが、すべてのマウスがＰ２８に応答したわけではない。Ｐ２８に対する応答は追加免疫により改善するのが好ましい。コドン最適化ヒンジ領域、コドン最適化Ｐ２８および全鎖長Ｐ２８の多重コピーからなる改良構築物は現在作製中である。エピトープに対する抗体応答はコピー数を増加させると劇的に改善し、テトラマーおよびオクタマー“レピトープ”融合体が最大の効力を示した。例６ｐＴＥＣＨ２中ＨＰＶＥ７タンパク質のクローニング全鎖長ＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質遺伝子を、ベクターヒンジ領域のＢａｍＨＩ部位でその遺伝子の枠内挿入（frame insertion）によりプラスミドｐＴＥＣＨ２中に組み込んでクローニングした。Ｅ７遺伝子はプラスミドｐＧＥＸ１６Ｅ７（S.A.Comerford et al,J.Virology,65,4681-90,1991）から得た。その遺伝子はこのプラスミドにおいて２つの制限部位、即ち３´ＢａｍＨＩ部位および５´ＥｃｏＲＩ部位と隣接している。ｐＧＥＸ１６Ｅ７ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、Sequenase（ＵＳＢからのＤＮＡポリメラーゼ）を用いた補充反応により平滑末端化した。次いでそれをＢａｍＨＩで切断して、０．３kbp全鎖長Ｅ７遺伝子を放出させた。ゲル精製遺伝子をＢａｍＨＩ - ＥｃｏＲＶ二重切断ｐＴＥＣＨ２に結合させ、この結合混合物を用いてコンピテントE.coliＨＢ１０１細菌を形質転換した。組換えコロニーは、プローブとしてＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質に対する２種のモノクローナル抗体、即ち６Ｄおよび４Ｆ（R.W.Tindle et al,J.Gen.Vlr.,71 ,1347-54,1990）を用いて、コロニーブロッティングにより選択した。これらコロニーのうち一方、即ちｐＴＥ７９は次の分析のために選択した。好気性および嫌気性双方の条件下で増殖させたｐＴＥ７９形質転換E.coliからタンパク質抽出物を調製し、ＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッテイングにより分析した。嫌気性条件下の増殖で約６０kDalの組換え分子を発現させたが、これはモノクローナル抗体６Ｄおよび４Ｆと、破傷風菌断片Ｃに対するウサギポリクローナル血清と反応した。例７ｐＴＥＣＨ２ - ｇＤの構築単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶＩ）からの免疫学上重要な抗原は、ｇＤ１と呼ばれる糖タンパク質Ｄである（R.J.Watson et al,Science,218,381-383,198 2）。トランスメンブランおよび細胞質ドメインａａ２６ - ３４０を欠く末端が切り取られた（truncated）ｇＤ１遺伝子カセットをＰＣＲにより合成した。用いられたＰＣＲプライマーは表３で示されている。フォワードプライマーは成熟タンパク質のＮ末端をコードするように設計し、リバースプライマーはトランスメンブランドメインのすぐ５´側のアミノ酸をコードしていた。加えて、プライマーを各々ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ制限部位で調製した。ＰＣＲ反応用の鋳型はプラスミドｐＲＷＦＧ（ｐＢＲ３２２中におけるPatton株からのＨＳＶ１ｇＤＢａｍＨＩ - Ｊクローン；Dr.T.Minson,Cambridge Universityの好意による）であった。増幅産物をＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで切断し、各酵素で既に切断されたｐＴＥＣＨ２中に組み込んでクローニングした。ＴｅｔＣ - ｇＤ１融合タンパク質の発現は、構築物を有した細菌株のＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッテイングにより評価した。ウエスタンブロットでは、抗ＴｅｔＣポリクローナル血清または成熟ｇＤのアミノ酸１１ - １９に対するモノクローナル抗体（ＬＰ１６と呼ぶ、Dr.T.Minson,Cambridgeから入手）でプローブ処理した。融合タンパク質は、大きさが５０kDalまで下がる低分子量バンドと一緒に、ウエスタンブロットで視認しうる８５kDalバンドとして発現される。低分子量バンドはｇＤのタンパク質開裂産物に相当するか、またはリボソーム中止によるｇＤのコード領域内における未成熟翻訳終結の産物を表す。融合タンパク質は、サルモネラ株ＳＬ５３３８およびＳＬ３２６１で発現される。例８ｐＴＥＣＨ２−ＦＭＤＶ／ＳＩＶレピトープの構築口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ；血清型Ａ１２）ウイルスタンパク質１（ＶＰ１；ａａ１３６ - １５９）からのペプチド、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０；ａａ１７１ - １９０）からのＶ２ループをｐＴＥＣＨ２中に組み込んでクローニングした（M.P.Broekhuijsen et al ,J.Gen.Virol.,68,3137-45,1987;K.A.Kent et al,AIDS Res.and Human Retro.,8 ,1147-1151,1992）。そのペプチドをコードする相補性オリゴヌクレオチドは、E.coliで最適発現のためにコドン選択して設計した（H.Grosjean et al,Gene,18,199-209,1982）。そのオリゴヌクレオチドは表３で示されている。オリゴヌクレオチドをアニーリングで形成されたＢｇ１IIおよびＳｐｅＩ付着末端で調製し、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで既に切断されたｐＴＥＣＨ２中に組み込んでクローニングした（図３）。これらペプチドのダイマー、テトラマーおよびオクタマー融合体を既に記載されたように構築した。ＴｅｔＣ - 融合体の発現は、ＴｅｔＣに対するポリクローナル血清とＦＭＤＶまたはＳＩＶエピトープに対するモノクローナル抗体でＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッテイングにより評価した。ＦＭＤＶおよびＳＩＶレピトープ構築物は、ＳＬ５３３８およびＳＬ３２６１双方でＴｅｔＣ融合タンパク質を発現した。例９ｐＴＥＣＨ２−ｇｐ１２０−Ｐ２８ペプチドヘテロマーの構築ＴｅｔＣの単一分子から２タイプ以上のエピトープを送達する可能性を探るために、融合体をＰ２８およびＳＩＶレピトープで作成し、三部分タンパク質を作製した。この形の構築は、異なるレピトープを含んだベクターモジュールの集合を許容するベクターのモジュラー（Modular）性質により促進された。これらの “ヘテロマー”はＰ２８およびＳＩＶレピトープのタンデムダイマーまたはテトラマーを発現する。ＴｅｔＣ - レピトープＡ - レピトープＢ融合体におけるその発現レベル、安定性および免疫原性についての特定レピトープの位置効果を調べるために、逆の組合せ、即ちＴｅｔＣ - レピトープＢ - レピトープＡも、図１１で示されたように構築した。こうして構築された“ヘテロマー”はＴｅｔC - Ｐ２８ダイマー - ＳＩＶダイマー、ＴｅｔＣ - ＳＩＶダイマー - Ｐ２８ダイマー、ＴｅｔＣ - Ｐ２８テトラマー - ＳＩＶテトラマーおよびＴｅｔＣ - ＳＩＶテトラマー - Ｐ２８テトラマーである。三部分融合体の発現は、上記のような抗体試薬を用いて、ＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッテイングにより評価した。これらのヘテロマー構築物はすべてSalmonella株ＳＬ５３３８およびＳＬ３２６１で発現されたが、興味あることには、発現レベルおよび安定性は逆になったものよりも一方のダイマー - ダイマーおよびテトラマー - テトラマー組合せ（ＴｅｔＣ - ｇｐ１２０ - Ｐ２８）の方が大きい。例１０物質および方法プラスミド、オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ鎖反応プラスミドｐＴＥＴｎｉｒ１５はｎｉｒＢプロモーーのコントロール下で破傷風菌毒素からの断片Ｃの発現を指示する（Chatfield et al,idem;Oxer et al,id em）。ＴｅｔＣ - ヒンジ融合ベクターｐＴＥＣＨ１はMullis et al,1986で記載されたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によりｐＴＥＴｎｉｒ１５から構築した。ＰＣＲはPyrococcus furiosusからの高正確性（fidelity）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行ったが、これは関連３´ - ５´エキソヌクレアーゼ校正活性を有している（K.S.Lundberg et al,Gene,108,1-6,1991）。増幅反応は製造業者（Stratagene）の指示に従い行った。細菌株用いられた細菌株はE.coliＴＧ２（ｒｅｃＡ）（J.Sambrook et al,Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor,NewYork,1989）、S.typhim urium ＳＬ５３３８（ｇａｌＥｒ⁻ｍ^＋）（A Brown et al,J.Infect.Dls.,15 5,86-92,1987）およびＳＬ３２６１（ａｒｏＡ）（S.K.Hoiseth et al,Nature,2 91,238-9,1981）であった。細菌は、適切ならばアンピシリン（５０μg/ml）を含有させて、ＬまたはＹＴブロスとＬ寒天で培養させた。E.coliで生産されたプラスミドＤＮＡは、ＳＬ３２６１ａｒｏＡ（ｒ^＋ｍ）ワクチン中へのエレクトロポレーション効力を増加させるために、ＳＬ５３３８中への形質転換によって最初に修正した。エレクトロポレーションの場合、中間対数期に増殖した細胞を回収し、初期培養容量の半分の氷冷水、１／１０容量の氷冷グリセロール（１０％）で洗浄し、最後に細胞を氷冷グリセロール（１０％）中１０¹⁰細胞／mlの濃度まで再懸濁させた。前冷却キュベットに細胞６０μｌおよびプラスミドＤＮＡ１００ngの混合物を加えた。細胞はInvitrogenからのPoratorを用いてパルス処理した（セッティング：電圧＝１７５０μＶ、静電容量＝４０μＦ、抵抗＝５００）。２０mMグルコースで補充された前加温Ｌブロスを直ちに加え、細胞を静かに振盪しながら３７℃で１〜１．５時間増殖させた。次いで細胞をアンピシリン含有Ｌ寒天プレート上におき、３７℃で１６時間インキュベートした。ＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッテイングＴｅｔＣ融合体の発現はＳＤＳ - ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッテイングにより試験した。中間対数期に増殖して抗生物質選択された細胞を遠心により回収し、タンパク質を１０％ＳＤＳ - ＰＡＧＥにより分別した。タンパク質をエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に移し、ＴｅｔＣまたは全鎖長Ｐ２８タンパク質に対するポリクローナルウサギ抗血清と反応させた。次いでブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギＩｇ（Dako,U K）でプローブ処理し、４ - クロロ - １ - ナフトールで発色させた。グルタチオン - アガロースアフィニティ精製ＴｅｔＣ全鎖長Ｐ２８遺伝子融合体を発現する細菌細胞を対数期まで増殖させ、氷冷し、２５００ｘｇで１５分間、４℃で遠心により回収した。細胞を原容量の１／１５の氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁し、ＭＳＥSoniprepで超音波処理により溶解させた。不溶性物質を遠心除去し、上澄に前膨脹グルタチオン - アガロースビーズ（Sigma,UK）の５０％スラリーを１／６容量で加えた。静かに室温で１時間混合した後、ビーズを１０００ｘｇで１０秒間の遠心により集めた。上澄を捨て、ビーズを２０倍容量の冷ＰＢＳ - ０．５％トリトンＸ - １００に再懸濁し、ビーズを再び遠心により集めた。洗浄工程を更に３回繰り返した。融合タンパク質は、ｐＨ８．０の５．０mM還元グルタチオン（Sigma）含有５０mMトリス - ＨＣｌを１倍容量で加えることにより溶出させた。静かに１０分間混合した後、ビーズを前のようにペレット化し、上澄を除去した。溶出工程を更に５回繰返し、上澄分画をＳＤＳ - ＰＡＧＥで分析した。動物雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスはHarlan Olac UK Blackthorn,Bicester,UKから購入し、少くとも８週齢のときに用いた。接種および器官ホモジネートの生存数カウント細菌を必要とされる１００μg/mlアンピシリンで補充されたトリプシン大豆ブロス（Oxoid）中で増殖させた。静脈内接種の場合は、静置培養物をＰＢＳで希釈し、動物に側尾血管から０．２mlで約１０⁶cfu与えた。経口接種の場合には、細菌を振盪一夜培養物中で増殖させ、遠心により濃縮し、動物に０．２mlで約５ ×１０⁹cfuを胃管栄養チューブから胃内に与えた。接種物の用量はトリプシン大豆寒天上の生存数カウントによりチェックした。器官ホモゲネートの生存数カウントのために、マウス３匹の群を時間をおいて殺し、肝臓および脾臓と（経口接種マウスの場合には）腸間膜リンパ節のプールをColworth stomacher(C.E.Hormaeche,Immunology,37,311-318,1979)において蒸留水１０ml中で別々にホモゲナイズし、生存数カウントを１００μg/mlアンピシリンで補充されたトリプシン大豆寒天上で行った。抗体応答の測定抗体を固相免疫アッセイで測定した。９６ウェル平底プレートをｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸緩衝液１００μｌ中ＴｅｔＣ０．１μｇ（Dr.N.Fairweather,the W ellcome Foundation,Beckenham,UKの好意による）または組換えＰ２８１μｇ（Dr.R.Pierce,Pasteur Institute,Litte,Franceの好意による）でコーティングした。４℃で一晩インキュベート後、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。非特異的結合部位の遮断は、ｐＨ７．０のＰＢＳ中２％カゼイン（BDH,Po ole,UK）２００μｌと３７℃で１時間インキュベートすることにより行った。プレートを半自動式ＥＬＩＳＡ洗浄機（Titertek,Flow/ICN, Herts,UK）によりＰＢＳ中０．０５％Tween 20（Sigma）で３回洗浄した。２％カゼインで１：２０希釈された接種マウスの血清１００μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、製造業者の指示に従いＰＢＳ中２％カゼインで希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Dako,Bucks,UK）１００μｎを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、更に３回の洗浄をＰＢＳ単独で行った。プレートは、ｐＨ５．０のリン酸／クエン酸緩衝液および０．０２％過酸化水素を用い、製造業者の指示に従い３，３´，３，３´ - テトラメチルベンジジン二塩酸塩（Sigma）を用いて発色させた。プレートを３７℃で１０〜１５分間インキュベートし、その後反応を３ＭＨ₂ＳＯ₄（BDH）２５μｌで停止させた。プレートをＥＬＩＳＡリーダーにより４５０nmで読み取った。Ｔ細胞応答の測定６月前に予防接種されたマウスから脾臓を無菌的に摘出し、単一細胞懸濁物をプラスチックプランジャーによりステンレススチールシーブに通して脾臓をすりつぶすことにより調製した。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（Flow/ICN）中３００ ×ｇで１回洗浄し、Gey´s溶液中でインキュベートして、赤血球を溶解させた。白血球を上記のように更に２回洗浄し、完全培地、即ち１００U/mlペニシリンＧ（Flow/ICN）、１００μg/mlストレプトマイシン（Flow/ICN）、２×１０^-5Ｍ β - メルカプトエタノール（Sigma）、１mM Ｎ - （２ - ヒドロキシエチルピペラジン - Ｎ´ - （２ - エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（Flow/ICN）および１０％熱不活化新生牛血清（Northumbria Biolabs,Northumb erland,UK）で補充されたＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。Ｔ細胞の単離のためには、脾臓細胞を上記のように処理し、赤血球の溶解後に白血球を加温（３７℃ ）ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、Wigzellガラスビーズカラムに通した（H.Wlgze ll et al,Scand.J.Immunol.,1,75-87,1972）。細胞を関連抗原の存在下で９６ウェルプレートに最終容量２００μｌの完全培地中２×１０⁶/mlでいれた。これらは２０μg/ml最終濃度でVillarreal et al （Microbial Pathogenesis,13,305-315,1992）に記載されたように調製されたS. typhimurium Ｃ５のアルカリ処理全細胞可溶性抽出物；１０μg/mlのＴｅｔＣ；５０μg/mlの組換えSchistosoma mansoni Ｐ２８；２０μg/mlのS.mansoni全成虫抽出物（Dr.D.Dunne,Cambridge Universityの好意による）であった。細胞を湿度９５％、５％ＣＯ₂、３７℃雰囲気でインキュベートした。ＳＬ３２６１（ｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８）で免疫された動物のＴ細胞用のフィーダー細胞は、上記のように調製された同系ＢＡＬＢ／ｃナイーブ（naive）脾臓から得た。ｐＴＥＴｎｉｒ１５で免疫されたマウスの場合、フィーダー細胞は同様に免疫された動物から得た。赤血球溶解とＲＰＭＩ１６４０で２回の洗浄後に、細胞を２０００radでＸ線照射し、更に２回洗浄した。これらの抗原供与細胞を完全培地に再懸濁して、Ｔ細胞と最終比率１：１にした。ＩＬ - ２生産およびアッセイＴ細胞懸濁物を上記のようにプレート培養した。２日後に、上澄５０μｌを回収し、培地５０μｌ中１×１０⁴細胞／ウェルのＣＴＬＬ - ２（ＩＬ - ２依存性）に加えた。ＣＴＬＬ - ２細胞をDr.J.Ellis,University College,London,UK から得て、上記のように補充されたＲＰＭＩ１６４０で維持し、牛胎児血清の代わりに新生牛血清を用いた。２０時間後、ＰＢＳ中濃度５mg/mlのＭＴＴ２０μ ｌを加えた。ＭＴＴ形質転換を他で示されたように測定した（Tada et al,J.Imm unol.Method,93,157-165,1986）。結果は、６３０nmの参照フィルターを用いて、５７０nmで３回の光学密度読取りの平均として表示した。有意性は学生用（St udent's）ｔ検定により調べた。細菌サンプル寄託 Salmonella typhimurium株ＳＬ３２６１ - ｐＴＥＣＨ１、ＳＬ３２６１ - ｐＴＥＣＨ１ - Ｐ２８、ＳＬ３２６１ - ｐＴＥＣＨ２、ＳＬ３２６１ - ｐＴＥＣＨ2 - Ｐ２８オクタマーおよびＰＴＥ７９は、the National Collection of T ype Cultures,61 Colindale Avenue,London,NW9 5HT,UKに、１９９３年７月１５日付で、各々寄託番号NCTC 12831、NCTC12833、12832、12834および12837として寄託した。（１）一般的情報（ｉ）出願人（Ａ）名称：メデファホールディングスＢＶ（Ｂ）通り：チャーチルラーン２２３（Ｃ）市：アムステルダム（Ｄ）国：オランダ国（Ｅ）郵便番号（ＺＩＰ）：１０７８ＥＤ（ii）発明の名称：ワクチン（iii）配列の数：２０（iv）コンピューターの読み取り可能な形式（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release ＃１．０ Verslon ＃１．２５（EPO）（vi）先の出願のデータ（Ａ）出願番号：ＧＢ９２１６３１７．９（Ｂ）出願日：１９９２年７月３１日（vi）先の出願のデータ（Ａ）出願番号：ＧＢ９３０６３９８．０（Ｂ）出願日：１９９３年３月２６日（２）配列情報Ｎｏ：１：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（vi）起源：（Ａ）生物名：大腸菌（ix）配列の特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：プロモーター（Ｂ）存在位置：１．．６１（xi）配列：Ｎｏ：１：（２）配列情報Ｎｏ：２：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：２：（２）配列情報Ｎｏ：３：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：３：（２）配列情報Ｎｏ：４：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ．２１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：４：（２）配列情報Ｎｏ：５：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomic）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＹＥＳ（xi）配列：Ｎｏ：５：（２）配列情報Ｎｏ：６：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：６：（２）配列情報Ｎｏ：７：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：７：（２）配列情報Ｎｏ：８：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：８：（２）配列情報Ｎｏ：９：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：９：（２）配列情報Ｎｏ：１０：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１０：（２）配列情報Ｎｏ：１１：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６６塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomic）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１１：（２）配列情報Ｎｏ：１２：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６６塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１２：（２）配列情報Ｎｏ：１３：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomic）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１３：（２）配列情報Ｎｏ：１４：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１４：（２）配列情報Ｎｏ：１５：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１５：（２）配列情報Ｎｏ：１６：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１６：（２）配列情報Ｎｏ：１７：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３７５４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１７：（２）配列情報Ｎｏ：１８：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３７６９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：Ｎｏ：１８：（２）配列情報Ｎｏ：１９：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Genomlc）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（v）フラグメント型：中間部フラグメント（xi）配列：Ｎｏ：１９：（２）配列情報Ｎｏ：２０：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１４アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：環状（ii）配列の種類：ペブチド（v）フラグメント型：中間フラグメント（xi）配列：Ｎｏ：２０：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年７月２５日【補正内容】請求の範囲１．結合された第一および第二タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなるＤＮＡ構築物であって、第一タンパク質が破傷風菌毒素Ｃ断片またはその１以上のエピトーブを含んだ抗原配列であることを特徴とするＤＮＡ構築物。２．融合タンパク質が、第一および第二タンパク質を分離し、かつ、その独立した折りたたみを行えるヒンジ領域を有しており、そのヒンジ領域がプロリンおよび／またはグリシンアミノ酸から形成されている、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。３．ヒンジ領域が１５以内のアミノ酸の鎖であり、そのアミノ酸の数が第一および第二タンパク質間に可動性を付与しうるような数である、請求項２に記載のＤＮＡ構築物。４．ヒンジ領域が少くとも４つのアミノ酸を含んでいる、請求項３に記載のＤＮＡ構築物。５．ヒンジ領域が６〜１４のアミノ酸を含んでいる、請求項４に記載のＤＮＡ構築物。６．融合タンパク質が、第一および第二タンパク質を分離し、かつその独立した折りたたみを行えるヒンジ領域を有しており、そのヒンジ領域が抗体免疫グロブリンのヒンジ領域に実質上相当する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。７．ヒンジ領域が下記配列： -〔Ｘ〕 _p - Ｐｒｏ - 〔Ｙ〕 _q - Ｐｒｏ - 〔Ｚ〕 r - （上記式中、Ｐｒｏはプロリン、ＸおよびＹは各々グリシン、Ｚはいずれかのアミノ酸であり、ｐは正の整数、ｑは０〜１０の正の整数であり、ｒは０または０より大きい正の整数である）を有する４以上のアミノ酸の鎖である、請求項４に記載のＤＮＡ構築物。８．第二タンパク質がポリペプチド免疫原である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。９．プロモーター配列が周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。１０．プロモーター配列が嫌気性条件により誘導される活性を有するものである、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。１１．プロモーター配列が嫌気性条件下でコード配列の発現を促進しうるｎｉｒＢプロモーターまたはその一部もしくは誘導体である、請求項１０に記載のＤＮＡ構築物。１２．第二タンパク質がウイルス、細菌、真菌、酵母または寄生虫から誘導される抗原配列である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。１３．抗原配列がSchlstosoma mansonlのＰ２８抗原もしくはそのエピトープ、またはヒトパピローマウイルス、単純ヘルペス、ロ蹄疫ウイルスもしくはサル免疫不全ウイルスから誘導される抗原配列を含んでなる、請求項１２に記載のＤＮＡ構築物。１４．活性が周辺環境の変化に応答して誘導されるプロモーター配列を含んでなるＤＮＡ構築物であって、前記プロモーター配列が、破傷風菌毒素Ｃ断片またはその１以上のエピトープを含んだ抗原配列、ヒンジ領域（ヒンジ領域は請求項２〜７のいずれか一項に記載のとおりである）、およびその３´末端またはその隣における第二抗原配列導入用の１以上の制限部位をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されている、ＤＮＡ構築物。１５．プロモーターが周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有するものである、請求項１４に記載のＤＮＡ構築物。１６．プロモーター配列が嫌気性条件により誘導される活性を有するものである、請求項１４または１５に記載のＤＮＡ構築物。１７．プロモーターが嫌気性条件下で配列の発現を促進しうるｎｉｒＢプロモーターまたはその一部もしくは誘導体である、請求項１６に記載のＤＮＡ構築物。１８．請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む、例えば細菌での使用に適する、複製性発現ベクター。１９．請求項１８に記載の発現ベクターで形質転換された細菌。２０．弱毒化された、請求項１９に記載の細菌。２１．弱毒化された細菌を請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物で形質転換することからなる、請求項２０に記載の弱毒化細菌の生産法。２２．第一および第二タンパク質を含んでなる融合タンパク質であって、請求項１１に記載の複製性発現ベクターで発現されうる請求項１〜７、１２または１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。２３．実質上純粋な形をした、請求項２２に記載の融合タンパク質。２４．請求項２０に記載の弱毒化細菌または請求項２２もしくは２３に記載の融合タンパク質と、薬学上許容されるキャリアとを含んでなるワクチン組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ホーメーシェ，カルロスエステニオイギリス国ケンブリッジ、テニス、コート、ロード（番地なし）、ケンブリッジ、ユニバーシティー、デパートメント、オブ、パソロジー内 (72)発明者ビーラーリール‐ラモス，ベルナルドイギリス国ケンブリッジ、テニス、コート、ロード（番地なし）、ケンブリッジ、ユニバーシティー、デパートメント、オブ、パソロジー内 (72)発明者チャットフィールド，スティーブンネビルイギリス国ロンドン（番地なし）、インペリアル、カレッジ、オブ、サイエンス、アンド、テクノロジー、デパートメント、オブ、バイオケミストリー、メデファ、ベクシーン、リサーチ、ユニット内 (72)発明者ドゥーガン，ゴードンイギリス国ロンドン（番地なし）、インペリアル、カレッジ、オブ、サイエンス、アンド、テクノロジー、デパートメント、オブ、バイオケミストリー内

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒンジ領域で結合された第一および第二タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなるＤＮＡ構築物であって、プロモーター配列が周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有するものであることを特徴とするＤＮＡ構築物。２．タンパク質がポリペプチド免疫原である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。３．第一異種タンパク質が破傷風菌毒素断片Ｃまたはそのエピトープを含んだ抗原配列である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。４．結合された第一および第二異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなるＤＮＡ構築物であって、第一異種タンパク質が破傷風菌毒素断片Ｃまたはその１以上のエピトープを含んだ抗原配列である、ＤＮＡ構築物。５．プロモーター配列が周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有するものである、請求項４に記載のＤＮＡ構築物。６．第一および第二タンパク質が異種である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。７．第一および第二タンパク質がそれらタンパク質の各々にとり異種の別の領域であるヒンジ領域により結合されている、請求項４または５に記載のＤＮＡ構築物。８．プロモーター配列が嫌気性条件により誘導される活性を有するものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。９．プロモーター配列が嫌気性条件下でコード配列の発現を促進しうるｎｉｒＢプロモーターまたはその一部もしくは誘導体である、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。１０．第二タンパク質がウイルス、細菌、真菌、酵素または寄生虫から誘導される抗原配列である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。１１．抗原配列がSchistosoma mansoniのＰ２８もしくはそのエピトープ、またはヒトパピローマウイルス、単純ヘルペス、口蹄疫ウイルスまたはサル免疫不全ウイルスから誘導される抗原配列を含んでなる、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。１２．その活性が周辺環境の変化に応答して誘導されるプロモーター配列を含んでなるＤＮＡ構築物であって、前記プロモーター配列が、第一抗原配列およびヒンジ領域、並びにその３´末端またはその隣に第二抗原配列導入用の１以上の制限部位をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されているＤＮＡ構築物。１３．破傷風菌毒素Ｃ断片またはその１以上のエピトープおよびヒンジ領域をコードする第一ＤＮＡ配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなる、請求項１２に記載のＤＮＡ構築物。１４．プロモーターが周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有するものである、請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。１５．プロモーター配列が嫌気性条件により誘導される活性を有するものである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。１６．プロモーターが嫌気性条件下で配列の発現を促進しうるｎｉｒＢプロモーターまたはその一部もしくは誘導体である、請求項１５に記載のＤＮＡ構築物。１７．請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む、例えば細菌での使用に適する、複製性発現ベクター。１８．請求項１７に記載の発現ベクターで形質転換された細菌。１９．弱毒化された、請求項１８に記載の細菌。２０．弱毒化された細菌を請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物で形質転換することからなる、請求項１９に記載の弱毒化細菌の生産法。２１．ヒンジ領域で結合された第一および第二タンパク質を含んでなる融合タンパク質であって、請求項１７に記載の複製性発現ベクターで発現されうる融合タンパク質。２２．第二異種タンパク質に結合された破傷風菌毒素断片Ｃまたはその１以上のエピトープを含んでなる融合タンパク質。２３．実質上純粋な形をした、請求項２２に記載の融合タンパク質。２４．請求項１９に記載の弱毒化細菌または請求項２２もしくは２３に記載の融合タンパク質と、薬学上許容されるキャリアとを含んでなるワクチン組成物。