JPH08503605A

JPH08503605A - 細胞に導入された遺伝子の発現を増大し及び／又は延長する方法

Info

Publication number: JPH08503605A
Application number: JP6508435A
Authority: JP
Inventors: ワイ．ウー，ジョージ; エイチ．ウー，キャサリン
Original assignee: ザユニバーシティオブコネティカット
Priority date: 1992-09-24
Filing date: 1993-09-23
Publication date: 1996-04-23
Also published as: CA2144659A1; US5656609A; WO1994006922A1; EP0662140A1

Abstract

(57)【要約】細胞特異的結合剤に結合されたポリヌクレオチドの標的を定めた複合体により細胞内に導入されたポリヌクレオチドの発現は、エンドソームの移動及びリソソームとの融合を阻止することによって増大され且つ延長され得る。

Description

【発明の詳細な説明】細胞に導入された遺伝子の発現を増大し及び／又は延長する方法発明の背景蛋白質の産生における欠陥を多少とも解消し又は矯正するための遺伝子治療の利点は、広く認識され、多くの遺伝子送達システムが開発された。１つの方法は、ウイルスを用いて外来遺伝子を細胞に送達することを含むが、この方法は新規な遺伝子と共にウイルス遺伝子を導入して望ましくないウイルス性の影響を生じ得る。他の方法は、イン・ビボで細胞をポリヌクレオチドの標的とし、次いでそこでそれを発現させることを含む。これは、２つの結合された成分１）ポリカチオン、例えば、強いがダメージを与えない相互作用でヌクレオチドに結合し得るポリＬリジン及び２）細胞にユニークな細胞表面分子を特異的に標的とし得るリガンドの可溶性複合体を用いて達成することが出来る。Wu，G．Y．及びWu，C．H．（ 1988）J．Biol．Chem． 263:14621-14624を参照されたい。この複合体は、標的細胞に特異的に結合し、エンドサイトーシスにより内在化されてポリヌクレオチドの取り込みを生じる。エンドサイトーシスの間に、受容されるべき巨大分子が、原形質膜の小部分により囲まれ、それは切り離されて細胞内小胞又はエドソームを形成する。ゴルジ装置からの新たに合成されたリソソームは移動してエンドソームと融合する。融合の後に、そのボディーはエンドリソソームと呼ばれ、それは次いで成熟リソソームへと発達する。リソソームは広範囲の分解酵素を含み、それ故、リソソーム内の物質は分解され得る。幾つかの遺伝子治療の適用については一過性の遺伝子発現が望ましいにもかかわらず、多くの他の適用においては、ポリヌクレオチドの持続的又は増大された発現が必要とされよう。発現が増大され且つ持続され得るようにＤＮＡをイン・ビボで細胞に導入する方法の必要性がある。持続的な遺伝子発現のための１つの方法は、標的細胞の複製を誘導することである（１９９０年９月２５日出願の米国特許出願第５８８，０１３号）。Zenke等は、最近、「トランスファーインフェクション」中にクロロキンを用いて標的細胞のリソソーム内のｐＨを上げ、それ故に、リソソーム内での外来性遺伝子の分解を阻止し且つ細胞により取り込まれる遺伝子の量を増すことが出来ることを報告した。Zenke，M．等（1990年５月）PNAS USA 87：365-3659を参照されたい。何人かの研究者は、トランスファーインフェクション中のポリヌクレオチドの取り込みを、キャリアー−ポリヌクレオチド複合体のある種のウイルスとの同時内在化によって増大させ得ることを示した。Curiel等（1991年10月）PNAS USA 88：8850-8854を参照されたい。発明の要約この発明は、細胞により内在化される標的の定められたポリヌクレオチドの量を増大させる方法及びその発現を長引かせる方法に関するものである。可溶性の分子複合体を用いて、イン・ビボ又はイン・ビトロで、特異的細胞をポリヌクレオチドの標的とする。エンドソームの移動又はリソソームとの融合を阻止することにより内在化されたポリヌクレオチドの量を増大させ及び／又は長くする。この分子複合体は、細胞特異的結合剤とポリヌクレオチド結合剤との結合体であるキャリアーと複合体化されたポリヌクレオチドを含む。細胞特異的結合剤は、エンドサイトーシスにより結合したリガンドの内在化を媒介する細胞表面構造、典型的には肝細胞のアシアロ糖蛋白質レセプター等のレセプター、に特異的である。細胞特異的結合剤は、天然若しくは合成のリガンド（例えば、蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質等）であってよく、又は、それは細胞表面構造に特異的に結合する抗体若しくはそのアナログであってよい（該構造は次いで結合した複合体の内在化を媒介する）。この結合体のポリヌクレオチド結合性成分は、細胞外条件下でポリヌクレオチドと安定に複合体化し、細胞内条件下でそれを細胞内で機能的であり得るように放出するポリカチオン等の化合物である。好ましくは、このポリヌクレオチド及びキャリアーの複合体は、生理的液体中で安定且つ可溶性である。それは、表面構造媒介エンドサイトーシス経路を介して標的細胞により選択的に取り込まれるイン・ビボで投与することが出来る。エンドソームのリソソームへの移動及び融合を、微小管形成を阻止する薬物若しくは分子等の薬剤によって阻止することが出来る。微小管形成を阻止するための好適薬剤は、コルヒチンである。この発明の方法は、細胞に導入されたポリヌクレオチドの増大された発現が望ましい遺伝子治療及び他の応用において有用である。図面の簡単な説明図１は、キャリアー−ＤＮＡ複合体を、０．７５ｍｇ／ｋｇのコルヒチンの腹腔内注射の３０分後（−●−）又は、６６％肝切除の２０分前（−・◆−・）に静脈から注入した場合を示している。対照用ラットには、ＤＮＡ投与の３０分前にこのビヒクル（ジメチルスルホキシド）の腹腔内注射を与えた（−・○−・）。ラットを横座標で示した時点で殺した。図２は、ビリルビン−ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼの発現ベクターであるｐＳＶ３−ｈＢＵＧＴ₁を受けたラットにおける血清ビリルビンレベルを示している。Gunnラットにコルヒチン（０．７５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）を、キャリアー−ＤＮＡ複合体の注入の３０分前に注射した。３つの群の結果を示す：（ａ）対照用ラット：未処理（−○−）；（ｂ）コルヒチンのみ（・・・ ◆ ・・・）；及び（ｃ）コルヒチン投与後のＤＮＡターゲッティング（−●−）。血液を横座標に示した時点で尾の静脈から採取して血清ビリルビンレベルを実施例に記載したようにして測定した。発明の詳細な説明可溶性の、標的を定め得る分子複合体を用いて、遺伝子を標的細胞又は組織に選択的に送達する。薬剤をこの分子複合体と共に投与してエンドソームの移動及びリソソームとの融合を阻止して、この分子複合体の分解を減らす。この分子複合体は、送達されるべき遺伝子を含み、それは、標的細胞に特異的な結合剤及び遺伝子結合剤から成るキャリアーと複合体化されている。この複合体は、標的細胞によって選択的に取り込まれ、ポリヌクレオチドが細胞により取り込まれる。遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらのアナログであってよい。典型的に、それは、標的細胞によりプロセッシングを受けるのに適した形態の所望の蛋白質をコードする構造遺伝子を含む。例えば、その遺伝子は、細胞内目的地又は生成物の細胞分泌への通行を与える適当なシグナル配列をコードする。シグナル配列は、蛋白質の天然の配列又は外来性配列であってよい。構造遺伝子は、標的細胞による遺伝子産物の発現に必要な適当な遺伝子制御要素に結合される。これらは、標的細胞内の操作可能なプロモーター及び適宜エンハンサー要素を含む。遺伝子を、遺伝子の発現及び遺伝子にコードされた産物の分泌に必要な遺伝子制御要素を有するプラスミッド又は転移遺伝因子等の発現ベクター中に含ませることが出来る。この複合体のキャリアー成分は、細胞特異的な結合剤とポリヌクレオチド結合剤との結合体である。この細胞特異的な結合剤は、それの例えばエンドサイトーシス過程による細胞性エンドソーム内への内在化を媒介する細胞表面構造に特異的に結合する。この表面構造は、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物、脂質又はそれらの組合せであってよい。それは、典型的に、リガンドのエンドサイトーシスを媒介する表面レセプターである。従って、この結合剤は、レセプターと結合する天然若しくは合成のリガンドであってよい。このリガンドは、細胞表面構造により認識されるのに十分なだけ露出された官能基を有する蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、糖ペプチド又は糖脂質であってよい。それは又、ウイルス、細胞（例えば、哺乳動物、細菌、プロトゾア）等の生物の成分又はリポソーム等の人工的キャリアーであってもよい。この結合剤は又、細胞表面構造に結合する抗体又は抗体のアナログ例えば一本鎖抗体であってもよい。キャリアーを形成するのに有用なリガンドは、標的とされる特定の細胞により変化する。肝細胞を標的とするために、ポリペプチドホルモン等のリガンドを採用することも出来るが、露出した末端炭水化物基例えばアシアロ糖蛋白質（ガラクトース末端）を有する糖蛋白質を用いることが出来る。アシアロ糖蛋白質の例は、アシアロオロソムコイド、アシアロフェチュイン及び脱シアル化した水疱性口内炎ウイルスを含む。かかるリガンドは、末端シアル酸及び終わりから２番目のガラクトース残基を有する糖蛋白質の化学的（例えば、硫酸）若しくは酵素的（例えば、ノイラミニダーゼ）脱シアル化によって形成することが出来る。或は、アシアロ糖蛋白質リガンドを、ガラクトース末端炭水化物例えばラクトース又はアラビノガラクタンを非ガラクトースを有する蛋白質に還元的ラクトサミネーションにより結合することにより形成することが出来る。他の細胞表面レセプターをこの分子複合体の標的とするために、マクロファージについてのマンノース（リンパ腫）、繊維芽細胞についてのマンノース６リン酸糖蛋白質（繊維肉腫）、腸細胞についての内在性因子−ビタミンＢ１２及び胆汁酸（Kramer等、（1992）J．Biol．Chem． 267:18598-18604を参照されたい）並びに脂肪細胞についてのインシュリン等の他の型のリガンドを用いることが出来る。或は、細胞特異的結合剤は、細胞表面のリガンド（例えば、抗原）と結合する抗体等のレセプター又はレセプター様分子であってよい。かかる抗体は、標準的手順によって生成することが出来る。このポリヌクレオチド結合剤は、送達すべき遺伝子と複合体を形成する。遺伝子との複合体化は、標的細胞による内在化の前の細胞外でのポリヌクレオチドの有意の解離を阻止するだけ十分に安定でなければならない。しかしながら、この複合体は、細胞内の適当な条件下で開裂してポリヌクレオチドを機能的形態で放出することが出来る。ポリヌクレオチド結合剤と遺伝子との間の静電引力に基づく非共有結合は、細胞外安定性を与え且つ細胞内条件下では遊離可能である。好適なポリヌクレオチド結合剤は、ポリカチオンである。これらの正に帯電した物質は、負に帯電したポリヌクレオチドに非共有結合で結合して、細胞外では安定であるが細胞内では遊離可能な、可溶性の標的を定め得る分子複合体を形成することが出来る。適当なポリカチオンは、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、塩基性蛋白質例えばヒストン、アビジン、プロタミン等である。好適なポリカチオンは、ポリリジン（例えば、３，８００〜６０，０００ダルトン）である。ポリヌクレオチドを遊離可能に結合するために使用し得る他の非共有結合は、水素結合、疎水結合、静電結合を単独で又は組合せて含む（例えば、ポリヌクレオチドに結合した抗ポリヌクレオチド抗体及びビオチン化ヌクレオチドを含むストレプトアビジン若しくはアビジン結合性ポリヌクレオチド）。キャリアーは、細胞特異的結合剤とポリヌクレオチド結合剤とを化学結合させることによって形成することが出来る。この結合は典型的に共有結合である。好適結合はペプチド結合である。これは、Jung，G．等、（1981）Biochem．Biophys．Res．Commun． 101:599-606により記載されたように水溶性カルボジイミドを用いて形成され得る。別の結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、又はアビジン−ビオチン結合におけるような強力な非共有結合である。この結合反応は、キャリアーを形成するために用いる特定の細胞特異的結合剤及びポリヌクレオチド結合剤に対して最適化することが出来る。結合形成を最大にするがキャリアー成分の凝集体形成を最小にするように反応条件をデザインすることが出来る。細胞特異的結合剤のポリヌクレオチド結合剤に対する最適比は、経験的に決定することが出来る。ポリカチオンを使用する場合には、これらの成分のモル比は、ポリカチオンの寸法及びポリヌクレオチド結合剤の寸法により変化する。一般に、この比は、約１０：１〜１：１に及ぶ。未結合成分及び凝集物は、分子ふるい又はイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Aquapore（商標）カチオン交換、Rainin）によりキャリアーから分離することが出来る。１つの具体例においては、アシアロオロソムコイド−ポリリジン結合体を、架橋剤１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを用いて形成する。透析の後に、結合体を、調製用酸尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐＨ４〜５）により未結合の成分から分離する。この結合体を、カルボキシメチル官能化カラムにて更に精製することが出来る。「レセプター特異的リガンド及びポリカチオン性ポリペプチドの結合体の製造方法」と題する、１９９３年４月５日出願の米国特許出願第０８／０４３，００８号を参照されたい（その教示を本明細書中に参考として援用する）。段階的透析手順により、遺伝子をキャリアーに複合体化することが出来る。１つの具体例において、ポリリジン等のポリカチオンで作成したキャリアーと共に用いるために、透析手順を２ＭＮａＣｌ透析物で始めて０．１５Ｍ溶液で終了する。徐々に減少するＮａＣｌ濃度は、このキャリアーに対するポリヌクレオチドの結合を生じる。ある場合、特にポリヌクレオチド及びキャリアーの濃度が低いときには、透析は必要ないであろう（ポリヌクレオチド及びキャリアーを単に混合してインキュベートする）。この分子複合体は、同じポリヌクレオチドの２コピー以上又は１種以上の異なるポリヌクレオチドを含んでよい。ポリヌクレオチドのキャリアー結合体に対するモル比は、キャリアー及びポリヌクレオチドの型及び寸法によって、約１：１００〜１：２００に及び得る。この比は、特定のキャリアー及びポリヌクレオチドについて、米国特許第５，１６６，３２０号に記載されたゲル遅延アッセイにより決定することが出来る。イン・ビトロ利用のために、培養細胞を適当な培地中でこの発明の分子複合体と共にインキュベートすることが出来る。それは又、生体外でも同様に用いて生体から取り出された細胞のトランスフェクションを増大させることが出来る（それは、次いで、生体に戻される）。イン・ビボ利用のために、この発明の分子複合体を非経口投与することが出来る。好ましくは、それを静脈注射する。この複合体を、滅菌塩溶液等の生理的に許容し得るビヒクル中の溶液にて投与する。標的細胞を、エンドソームのリソソームへの移動及び融合を阻止するに足りる量の薬剤で処理する。この薬剤は、細胞の微小管の形成をブロックする薬物又は分子であってよい。かかる薬物又は分子は、チューブリン分子が重合して微小管を形成することを阻止することによって（例えば、コルヒチン）又は細胞内の殆どの遊離チューブリンを取り込んで微小管を形成し且つそれらを安定化させることによって（例えば、タキソール）、これを達成することが出来る。他の薬剤は、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビンデシンを含む。イン・ビボ遺伝子治療のために、この薬剤を、好ましくは、この複合体の静脈投与の前に静脈投与する。イン・ビボでのこの薬剤の投与のタイミングは、内在化の阻害を阻止するために重要である（これも又微小管の機能に依存する）。この薬剤は、複合体より前に（好ましくは、約３０分〜１時間前に）投与すべきである。この発明の方法を遺伝子治療において用いて、増大された及び／又は延長された発現のために、イン・ビボで、遺伝子を標的細胞に特異的に送達することが出来る。例えば、特定の細胞を正常遺伝子の標的として、対応する内在性遺伝子における遺伝性の若しくは獲得した欠陥により引き起こされる代謝若しくは遺伝的異常を軽減することが出来る。この方法を用いて、治療用蛋白質をコードする遺伝子又は内在性若しくは外来性遺伝子の発現に向けられたアンチセンス構築物をコードする遺伝子の発現を増大させ若しくは延長させることも出来る。外来性遺伝子の発現の増大は、遺伝子の周期的（但し、頻繁過ぎない）投与を実現する。この発明を、下記の実施例により、更に説明する。実施例実施例１ポリ−Ｌ−リジンに結合したアシアロオロソムコイドからなるアシアロ糖蛋白質−ポリカチオン結合体を用いて、肝細胞表面に存在するアシアロ糖蛋白質レセプターを介して肝細胞を特異的に標的とすることの出来る可溶性ＤＮＡ複合体を形成した。このＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対する遺伝子を含むプラスミッドを含んだ。コルヒチンを用いて、標的細胞における遺伝子発現を増大し及び延長させた。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクタープラスミッドｐＳＶＨＢＶｓｕｒｆをT．Jake Liang博士（マサチューセッツ、 Boston 在、 Massachusetts General Hospital；Liang，T．J．等、（1993）J．Clin．I nvest ．91：1241-1246）から得た。このプラスミッド（約３．６ｋｂｐ）は、ＳＶ４０の複製オリジン及びＢ型肝炎表面抗原のオープンリーディングフレーム（１９８４ｂｐの部分として）を含むｐＵＣ誘導体である（ＳＶ４０プロモーターにより駆動）。このプラスミッドを大腸菌にクローン化し、前に記載された（Bi rnboim，H．C．及びDoly，J．（1979）Nucleic Acids Res． 7：1513-1518）ようにして精製した。純度は、アガロースゲル中での電気泳動によりエチジウムブロミド染色してチェックした（Maniatis，T.，Fritsch，E．F．及びSambrook，G ． Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Fritsch, E．G．及びManiatis， T．編、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY 150-161頁（ 1982）中）。アシアロオロソムコイドプールしたヒト血清からＯＲを調製し（Wu, G．Y．及びWu，C．H．（1988） J ．Biol．Chem． 263：14621-14624；Whitehead, D．H．及びSammons，H．G．（1 966）Biochem．Biophys．Acta 124：209-211）、水に溶解させた。等容積の０．２ＮＨ₂ＳＯ₄をＯＲ溶液に加えて生成した混合物を水浴中で８０℃に１時間加熱して蛋白質からシアル酸を加水分解した。酸分解混合物を水浴から取り出し、ＮａＯＨで中和し、水に対して２日間透析し、次いで、凍結乾燥した。Warrenのチオバルビツール酸アッセイを用いてＯＲの脱シアル化を確認した（Warren，L．（1959）J．Biol． Chem． 234：1971-1975）。一般に、Warren，L．（1959）J．Clin．Invest． 3 8 ：755-761及びSchmid， K．等（1967）Biochem．J． 104：361-368を参照されたい。標的を定め得るＤＮＡキャリアーＡＳＯＲを、ポリ−Ｌ−リジン（ミズーリ、St．Louis在、Sigma Chemical Co．）Ｍｒ＝４１，０００にｐＨ７．４（モル比１：１）で、１−エチル−３−（３− ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（イリノイ、Rockford在、Pierce Chemi cal Co．）を用いて結合した。これらの結合体を、Aquapore C-300カラム（Rain in）及び１Ｍ尿素、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０、２．５、２．２５及び２．０）での段階的溶出を使用する高圧液体クロマトグラフィーシステム（Ra inin）を用いて、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。カラムから溶出した第２のピークを、２３０ｎｍでのＵ．Ｖ．吸収により、最適結合体として測定した（Jung，G．等、（1981）Biochem．Biophys．Res．Commun． 101：59 9-606）。可溶性複合体を形成するために結合体と混合するＤＮＡの最適割合は、前に記載されたようにしてゲル遅延アッセイを用いて決定した（Wu，G．Y．及びWu，C．H．（1987）J．Biol．Chem． 262 ：4429-4432）。簡単には、等量のＤＮＡを０．１５ＭＮａＣｌ中に含む試料を、０．１５ＭＮａＣｌ中の結合体の増加する量と混合して、０．４５ミクロン膜を通しての濾過の後にゲル中でのＤＮＡ移動を完全に遅らせる結合体対ＤＮＡモル比を決定した。この複合体の溶解度を確実にするために、ＤＮＡの５０〜７５％に結合するのに必要な結合体の量を計算して分子複合体を形成するのに使用した。可溶性分子複合体を形成するために、この結合体溶液を、０．１ｍｌ／分の速度で、定速で混合しながら、蠕動ポンプによって非常にゆっくりとＤＮＡに加えた。アリコートを取って２６０ｎｍで吸光度を測定してＤＮＡ量を監視した。他のアリコートを取ってアガロースゲル上で泳動して複合体の形成を確認した。この複合体を含む溶液を０．４５μ膜フィルターを通して濾過した。アリコートを、上記のようにアガロース電気泳動により試験するために採取した。コルヒチン投与のタイミング１５０ｇの雌ラット（Sprague-Dawley）の群（各２匹）をケタミン−キシラジンで麻酔した。群のラットに滅菌リン酸緩衝塩溶液中のコルヒチン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）を、２ｍｇのＤＮＡを含む複合体の（尾静脈へのゆっくりとした）静脈注射の１時間前、静脈注射時、及び静脈注射の１時間後に腹腔内注射した。第４群のラットには複合体のみを与えた。２４時間後に、ラットから採血して、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアッセイ用に血清を得た。（Auzyme Monoclonal ，EIA kit for detection of HBV - Abbott）生成した溶液の色変化のＵ．Ｖ．吸光度を４９２ｎｍで２００μｌの血清について測定した。結果対照用ラットにおいて、ＥＬＩＳＡによって検出されたＨＢｓＡｇの平均は、注射の後で０．４２±０．７２ｎｇ／ｍｌであった。ＤＮＡ複合体の注射の１時間前、注射時、又は１時間後のコルヒチン処理は、それぞれ、２．０６±３．５５ｎｇ／ｍｌ、１．２６±１．５３ｎｇ／ｍｌ及び０．３０±０．３０ｎｇ／ｍｌのレベルの平均ＨＢｓＡｇを生じた。これらのデータは、ＤＮＡ複合体の注射の１時間前のコルヒチン処理が、２４時間時点で最高レベルの遺伝子発現を生じたことを示している。標的遺伝子の発現のタイムコースを測定するために、コルヒチン処理をしてない対照用ラットを１日目の時点に４匹と１６日目の時点に２匹用いた。発現の遅延に対するコルヒチンの影響のタイムコースのために、ラットを１日目の時点に８匹と４日目及び２０日目の時点に各３匹を用いた。これらの結果は、複合体化ＤＮＡのみを受けたラットが１日目に０．４５±．４１の表面抗原レベルを有したが１６日目には０．０６±０．００ｎｇ／ｍｌに低下したことを示した。対照的に、コルヒチンで予備処理した動物は、１日目に２．２９±１．２０、４日目に０．８９±０．１２及び２０日目に０．２２±０．１３ｎｇ／ｍｌのレベルを生じた。これらのデータは、コルヒチンが、タイムコースの初期における発現のレベルを増加させるだけでなく一層長く且つ高レベルの発現をも生じることを示している。実施例２ＡＳＯＲ−ＰＬ結合体を用いて、Gunnラットの肝細胞をビリルビン−ＵＤＰ− グルクロノシルトランスフェラーゼの遺伝子を含むプラスミッドの標的とした。コルヒチンを用いて発現を延長した。動物雄のＳprague-Dawleyラット（１５０〜２００ｇ）及びビリルビン−ＵＤＰ− グルクロノシルトランスフェラーゼ（Ｂ−ＵＧＴ）欠乏性Gunnラット（１５０〜２２５ｇ）を、Albert Einstein College of Medicineのコロニーから得た。これらのラットを標準実験室ラット食事にて、１２時間明暗サイクルで維持した。コルヒチン投与肝細胞の微小管に対するコルヒチンの影響を測定するための実験において、１ｋｇ当り０．２５〜１．０ｍｇの投与量のコルヒチン（０．５ｍｇ／ｍｌのジメチルスルホキシド）をSprarue-Dawleyラットに腹腔内注射した。遺伝子ターゲッティング実験のために、０．７５ｍｇ／ｋｇのコルヒチンをキャリアー−ＤＮＡ複合体の投与の３０分前に用いた（下記参照）。プラスミッドアルブミンプロモーター／エンハンサーにより駆動される細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の遺伝子を含むプラスミッドｐ（９−１２）ａｌｂＣＡＴをJames M．Wilson（Philadelphia在、ペンシルベニア大学）から提供された。このプラスミッドは、以前に、イン・ビボでの肝臓への標的を定めた送達の後でＣＡＴ活性を発現することが示された（Wu，G．Y．等、（1991）J，Biol．Chem． 266：14338-14342）が、それを、この研究におけるエンドサイトーシスを受けたＤＮＡの細胞内運命を測定するために用いた。Ｂ− ＵＧＴ活性のGunnラット肝への移動について、プラスミッドｐＳＶＫ３−ｈＢＵＧＴ₁を用いた。この構築物は、ヒト肝Ｂ−ＵＧＴ₁の完全長コード領域をｐＳＶＫ３主鎖のＳＶ４Ｏプロモーター領域（スウェーデン、Uppsala在、Pharmacia）の下流にクローニングすることによって生成した（Ritter，J．K．等、（1991）J．Bio l．Chem． 226：1043-1047）。この挿入物の後方には、ＳＶ４０スプライス部位及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が続いた。ＡＳＧＰ−ポリリジン結合体の合成及びＤＮＡキャリアー蛋白質複合体の形成ＡＳＯＲを上述のようにして調製した。ＡＳＯＲをポリリジン（Sigma、平均分子量５９０００）を用いて、前に記載された（Wu，G ．Y．等（1991）J．Biol．Chem． 226：14338-14342及びJ．Biol．Chem． 267： 11483-11489）ようにして共有結合した。標的を定め得るキャリアー−ＤＮＡ複合体を形成するために、１ｍｌの２ＭＮａＣｌ中のプラスミッドＤＮＡ０．５ｍｇを、０．６ｍｌの２ＭＮａＣｌ中のＡＳＯＲ−ポリリジン結合体（０．１５ｍｇのＡＳＯＲを含む）（２５℃）に加えた。この混合物を１２０００〜１４０００ダルトンの排除限界を有する透析チューブに入れ、１．５Ｍ、１．０Ｍ、０．５Ｍ、０．２５Ｍ及び０．１５Ｍの濃度のＮａＣｌの各１０００ｍｌに対して４℃で３０分間連続的に透析した。最後の透析の後に、この複合体を、ラットへの注射のために０．４５μ膜を通して瀘過した。ＤＮＡ−キャリアー複合体の投与及び部分的肝切除ラットをエーテルで麻酔し及び右外側頚静脈を露出させた。２２ｐモルのＤＮＡを含む可溶性複合体を右外側頚静脈に注入し、その静脈を結紮して切開を閉じた。１群においては、ＤＮＡ−ポリリジン複合体の注入の２０分後に、エーテル麻酔下で、正中線切開により６６％肝切除を行なった（Seglen，P．O．（1976）Methods Cell Biol． 13：29-83）。予備研究において、注入されたＤＮＡ−キャリアー複合体の肝による最大の内在化に２０分を要することが測定された。対照及び部分的肝切除の両群のラットを、ＤＮＡ−キャリアー複合体の注入の２０分後、１時間後、４時間後、２４時間後及び７日後に殺し、肝臓を取り出してＤＮＡ分析にかけた。ＣＡＴ活性のアッセイ肝ホモジェネート中のＣＡＴ活性を、基質としての¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール及び薄層クロマトグラフィー分析を用いて、前に記載した（Gorman，C．M．等、（1982）Mol．CellBiol． 2：1044-1051）ようにして、三重にアッセイした。このアッセイを三重に実施した。Ｂ−ＵＧＴ活性のアッセイ肝ミクロソーム画分中のＢ−ＵＧＴ活性を、ＵＤＰ−［¹⁴Ｃ］グルクロン酸を基質として用いて（５ｍＭ、０．２μＣｉ／μモル）測定した（Jansen，P．L． M．等、（1977）J．Biol．Chem． 252：2710-2716）。ブランクはビリルビンを含まなかった。ビリルビン及びそのグルクロニドを抽出して薄層クロマトグラフィー（Chowdhury，R．等（1979）J．Biol．Chem． 254：8336-8339）により分離し、確実なビリルビンモノグルクロニド及びジグルクロニドを標準として用いてオートラジオグラフィーにより検出した。これらのビリルビンモノグルクロニド及びジグルクロニドのバンドを含むシリカゲルをかき取ることにより集め、これらの色素をメタノール中で抽出して放射能を適当な消光補正後に測定した。血清ビリルビン及び胆汁中で抽出された色素の分析血清ビリルビンレベルを前に記載されたようにして測定した（Trotman，B．W ．等（1982）Anal．Biochem． 121 ：175-180）。胆汁色素分析のために、ラットをエーテル麻酔下に置き、胆汁管にＰＥ−１０カニューレを挿入した。これらのラットを制限ケージに入れ、胆汁を採取する前に意識及び正常体温を回復させた。胆汁を高圧液体クロマトグラフィー（Spivak，W．及びCarey，M．C．（1985）Biochem．J． 225：787-795）によって分析した。ＣＡＴ活性部分的肝切除及び疑似手術を受けた群においては、プラスミッド投与の２０分又は４時間後に、肝試料中に検出可能なＣＡＴ活性はなかった。２４時間において、疑似手術及び６６％肝切除を受けたラットの両者において約１．０マイクロ単位／ｍｇ蛋白質のＣＡＴ活性が検出された。ＤＮＡ投与の７日後に、ＣＡＴ活性は疑似手術を受けたラットにおいては検出不能であったが、６６％肝切除を受けた群においては約１．０マイクロ単位／ｍｇ蛋白質にて検出された。長期の実験においては、ＣＡＴ活性は、少なくとも６０日間（実験の継続期間）にわたって存続した（図１）。キャリアー−ｐ（９−１２）−ａ１ｂＣＡＴ複合体の投与の３０分前に０．７５ｍｇ／ｋｇのコルヒチンを受けたラットにおいては、ＣＡＴ活性は、肝臓において、１．２５〜１．５マイクロ単位／ｍｇ蛋白質のレベルを少なくとも６０日間（この研究の継続期間）にわたって維持した（図１）。Ｂ−ＵＧＴ活性対照用Gunnラット肝はＢ−ＵＧＴ活性を有しなかった。コルヒチンの注射の３０分後にキャリアー−ｐＳＫ３−ｈＢＵＧＴ複合体を受けたGunnラットでは、Ｂ −ＵＧＴ活性が肝臓において６週目（測定の最終点）まで検出された。この酵素活性は、正常Wisterラット肝における活性の３〜５％にわたった。キャリアー− ＤＮＡ複合体を受けたがコルヒチンを受けなかったGunｎラットにおいては、肝Ｂ−ＵＧＴ活性は、ＤＮＡの投与後２４時間検出可能であっただけである。胆汁中のビリルビングルクロニドの排泄対照用Gunnラットの胆汁は、検出可能なビリルビンモノグルクロニド又はジグルクロニドを含まなかった。コルヒチンを受けてからキャリアー−ＤＮＡ複台体を受けた３匹のラットにおいては、胆汁色素を、ＤＮＡ投与の５日、１４日及び６０日後に分析した。すべての場合において、ビリルビンモノグルクロニド及びジグルクロニドを胆汁中に検出した。ビリルビングルクロニドは、胆汁中の全色素排泄の９〜１５％を説明した。血清ビリルビンレベル未処理のGunnラット及びコルヒチンのみを受けたGunnラットにおいては、血清ビリルビンレベルの有意の減少はなかった（図２）。対照的に、コルヒチン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）の注射の３０分後にキャリアー−ＤＮＡ複合体を投与した場合には、血清ビリルビン濃度は、少なくとも５週間、予備処理レベルの４５％まで漸進的に減少した。この期間の後６０日間に、ビリルビンレベルは、予備処理レベルの７０％まで徐々に増加した。他のラットにおいて、血清ビリルビンレベルは、３５日で、予備処理レベルの３０％まで減少し、そのレベルに少なくとも６０日間（この実験の継続期間）維持された。等価物当業者は、ここに記載した特定の手順の多くの等価物を認識し又は、常例的実験を用いて確認することが出来るであろう。かかる等価物は、この発明の範囲内にあり且つ後述の請求の範囲によりカバーされるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞をその細胞への特異的取り込みについて標的を定めたポリヌクレオチド複合体並びにエンドソームの移動及び／又はリソソームとの融合を阻止する薬剤と接触させることを含む、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法であって、そのポリヌクレオチド複合体がその細胞の表面分子に結合してその細胞のエンドソーム中に内在化される細胞特異的結合剤に結合されたポリヌクレオチドを含む、上記の方法。２．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求の範囲第１項に記載の方法。３．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチドが遺伝子を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。４．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチド複合体が更に、ポリヌクレオチドを細胞特異的結合剤に結合するポリヌクレオチド結合剤を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。５．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチド結合成分がポリカチオンである、請求の範囲第１項に記載の方法。６．投与ステップにおいて、ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第５項に記載の方法。７．投与ステップにおいて、細胞特異的結合剤が、複合体のエンドサイトーシスによる取り込みを媒介する細胞の表面レセプターに結合する、請求の範囲第１項に記載の方法。８．投与ステップにおいて、細胞特異的結合剤が肝細胞のアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドである、請求の範囲第７項に記載の方法。９．投与ステップにおいて、リガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．投与ステップにおいて、薬剤が、標的細胞における微小管形成を阻止する薬物又は分子である、請求の範囲第１項に記載の方法。１１．投与ステップにおいて、薬剤がコルヒチンである、請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．細胞への特異的取り込みについて標的を定めたポリヌクレオチド複合体並びにエンドソームの移動及び／又はリソソームとの融合を阻止する薬剤を生物に投与することを含む、ポリヌクレオチドを生物の細胞中に導入する方法であって、そのポリヌクレオチド複合体が、その細胞の表面分子に結合して細胞のエンドソーム中に内在化される細胞特異的結合剤に結合したポリヌクレオチドを含む、上記の方法。１３．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチドが遺伝子を含む、請求の範囲第１２項に記載の方法。１５．投与ステップにおいて、生物がヒトである、請求の範囲第１２項に記載の方法。１６．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチド複合体が更に、ポリヌクレオチドを細胞特異的結合剤に結合するポリヌクレオチド結合剤を含む、請求の範囲第１２項に記載の方法。１７．投与ステップにおいて、ポリヌクレオチド結合成分がポリカチオンである、請求の範囲第１２項に記載の方法。１８．投与ステップにおいて、ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．投与ステップにおいて、細胞特異的結合剤が、複合体のエンドサイトーシスによる取り込みを媒介する細胞の表面レセプターに結合する、請求の範囲第１２項に記載の方法。２０．投与ステップにおいて、細胞特異的結合剤が、肝細胞のアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドである、請求の範囲第１９項に記載の方法。２１．投与ステップにおいて、リガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求の範囲第２０項に記載の方法。２２．投与ステップにおいて、薬剤が、標的細胞における微小管の形成を阻止する薬物又は分子である、請求の範囲第１２項に記載の方法。２３．投与ステップにおいて、薬剤がコルヒチンである、請求の範囲第２２項に記載の方法。２４．肝細胞中への特異的取り込みについて標的を定めたＤＮＡ複合体並びにエンドソームの移動及び／又はリソソームとの融合を阻止する薬剤を生物に投与することを含む、ＤＮＡを生物の肝細胞中に導入する方法であって、その複合体が、ＤＮＡを複合体化し及び肝細胞内でそれを放出することの出来るアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドとポリカチオンとの結合体に結合したＤＮＡを含む、上記の方法。２５．投与ステップにおいて、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求の範囲第２４項に記載の方法。２６．投与ステップにおいて、ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第２４項に記載の方法。２７．投与ステップにおいて、薬剤が、微小管の形成を阻止する薬物又は分子である、請求の範囲第２４項に記載の方法。２８．投与ステップにおいて、薬剤がコルヒチンである、請求の範囲第２７項に記載の方法。