JPH08503618A

JPH08503618A - イチイ種の胚培養からタキソールおよびタキサン類を生産する方法

Info

Publication number: JPH08503618A
Application number: JP7503966A
Authority: JP
Inventors: ボーシクリー，; スン−ホソン，
Original assignee: REPUBLIC OF KOREA
Current assignee: REPUBLIC OF KOREA
Priority date: 1993-07-06
Filing date: 1994-07-06
Publication date: 1996-04-23
Anticipated expiration: 2013-09-10
Also published as: RU95109640A; KR950002782A; CA2143455A1; EP0662144A1; CA2143455C; JP2795542B2; WO1995002063A1; RU2120740C1; CN1111911A; CN1047795C; KR950005081B1; AU675147B2; AU7085994A

Abstract

(57)【要約】本発明において開示されるのは、イチイ種の組織の抽出によるタキソールおよびタキサンの生産法ならびにその細胞培養物である。イチイ種の組織および／または培養培地の抽出によるタキソールおよびその誘導体の生産法は、該組織が接合体胚であることを特徴とする。イチイ種の接合体胚の細胞培養は、体細胞胚または胚発生カルスを誘導することによって行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】「イチイ種の胚培養からタキソールおよびタキサン類を生産する方法」発明の背景１．発明の分野本発明は、体細胞胚および／または培養培地からのタキソール（taxol）およびその誘導体の生産法に関し、詳しくは、接合体胚（zygote embryo）または体細胞胚（somatic embryo）を培養して体細胞多胚（somatic poly-embryo）または胚発生カリ（embryogenic calli）を得る方法に関する。２．先行技術の記載タキソールはイチイ属（genus Taxus）に属する植物から単離されたアルカロイドであって、Ｂ16黒色腫を含む種々の癌細胞系において有用な抗腫瘍活性を呈する。タキソールは主としてタクスブレビフォリア（Taxus brevifolia）の樹皮に、グラム乾燥重量当たりおよそ0．02％含まれることが知られている。タキソールの全合成は成功裡に行われているものの、この方法は高コストとなるためタキソールの産業的規模の生産には好適ではないと思われる。加えて、タキソール様化合物（たとえばタキソテレ（taxorete））の半合成もまた、バッカチン（baccatin）IIIまたは10-デアセチルバッカチンIIIを用いることにより成功した。しかしながら、このやり方もまさしく前記したと同じ問題点に直面している。それゆえに、タキソールはたとえば伐採したイチイ（yew）の原材料のような乏しい天然資源から得られるのみである。イチイの木の中のタキソール含量は非常に低いので、1ｋｇのタキソールを採取するために2000〜4000の木が切り出されなければならず、需要に足るように天然資源からタキソールを生産することは森林の生態系の重大な破壊を助長するであろう。したがって、イチイ種（Taxus species）の細胞および組織培養からタキソールおよび関連化合物を生産する試みがなされてきている。たとえば、アメリカ特許第5，109，504号は、栄養培地中でイチイ種の樹皮、形成層、葉、および根組織を培養してカルスまたは懸濁細胞培養を生産し、ついでそれらからタキソールまたはタキソール様アルカロイドを回収することによりタキソールまたはタキソール様アルカロイドを生産する方法を開示する。しかしながら、前記の方法は、１リットルの細胞懸濁培養培地からわずか1．0〜3．0mgのタキソールを生産しうるのみである。この特許はイチイの木の樹皮が至適な収量のタキソールを直接的に生産することができることを教示し、またこれらの組織を培養して未分化細胞塊（カルス）を誘導することにより、および／または増殖したカルスから細胞懸濁培養を樹立することによりタキソールを生産する。今なお、イチイの組織の種々の部分を用いる前記方法は、関係する細胞の低いタキソール生産能のため、または目的とする２次代謝産物の大規模な生産のために開発された手法が不充分であるためもあって、市場には供されていない。ＷＯ92-13961は、イチイ属に属する植物の組織、特にその雌性配偶体（gameto phyte）を培養し、それを起源とするカリまたは懸濁培養細胞からタキソールを回収することによってタキソールを生産する方法を開示する。この手法は懸濁培養細胞の乾燥重量に基づくと0．05％のタキソールを与えうる。これらの方法は産業的規模で充分量のタキソールを生産するに至らず、現在までタキソール生産能を向上させるために開発途上にある。これらの事実は細胞および／または培養培地中のタキソール含量を増大させるため、ならびに産業的規模の生産の最終目的に合致すべく高タキソール生産細胞をスクリーニングするための改良された方法を提供する必要性があることを示唆している。これらの情況に鑑みて、本発明者らは産業的規模でタキソールを生産するための方法を開発するべく鋭意研究を重ね、その結果、我々はまず最初に、意外にもこれまでにタキソールを含有すると報告された他の組織よりも接合体胚が乾燥重量に基づいてより多くの量のタキソールを含有することを見出した。タキソールを生産するための産業的規模の手法を開発するには胚そのもののサイズが小さすぎるので、胚の分量を増大させるための方法を提供すべく、本発明者らはさらなる研究を行った。その結果、我々は驚くべきことに、胚が体細胞胚または胚発生カルスを誘導する栄養培地で培養されると元のサイズより数十万倍にまで増大されうることを見出した。本発明は前記発見に基づいて成し遂げられる。発明の要約このように、本発明の目的はイチイ種の組織を抽出することによるタキソールの生産法を提供することであり、該組織が接合体胚であることを特徴とする。本発明の他の目的は、イチイ種の組織を培養すること、およびカルスまたは培養培地からタキソールまたはその誘導体を回収することによるタキソールまたはその誘導体の生産法を提供することであり、該組織が接合体胚であることを特徴とする。本発明のさらに別の目的は、タキソールまたはその誘導体の生産法を提供することであってその方法は以下の工程からなる：（ａ）イチイ種から生接合体胚を準備しそれを消毒する；（ｂ）胚からカルスを生産すべく、該消毒された胚を培養培地で培養する；（ｃ）該カルスから体細胞胚を生産すべく、（ｂ）において得られたカルスを培養する；（ｄ）胚発生カルスを生産すべく、（ａ）における消毒された胚または（ｃ）において得られた体細胞胚を培養する；（ｅ）（ｃ）における体細胞胚または（ｄ）における胚発生カルスを液体培養する；および（ｆ）培養培地および細胞からタキソールまたはタキソール誘導体を回収する。本発明は、接合体胚が意外にも大量のタキソールを含有しさらに体細胞胚または胚発生カルスの誘導を通じて数十万倍にまで胚の分量を増大させることを見出したことに基づいているという点で、上で参照した先行技術とは区別され、また本発明が体細胞胚または胚発生カルスを液体培養することにより産業的規模でタキソールを生産することを可能ならしめるので、本発明は先行技術よりも有益である。本発明の他の特徴および適用は、以下の記載により当業者には容易に明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図１（Ａ）は標準タキサン類のＨＰＬＣクロマトグラフである。図１（Ｂ）は実施例７から得られた、精製された培養培地のＨＰＬＣクロマトグラフである。図２（Ａ）は実験例１における処置を行わないラット癌細胞を示す写真である。図２（Ｂ）は実施例７の抽出物で処理した実験例１におけるラット癌細胞を示す写真である。図３（Ａ）はＥＬＩＳＡデータによる標準曲線である。図３（Ｂ）は実験例２において行われたＥＬＩＳＡデータによる曲線である。図４は実施例８におけるタキソール生産に対する生産培地の効果を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明者らは大韓民国の国有林地に植えられている24，000のタクスカスピダタ（Taxus cuspidata）の木のタキソール含量を分析した。量は個々の木によって有意に変化したが、優れた木から集めた乾燥胚100ｇ中に５ｇのタキソールが含まれることが見出された。一方、同じ量の乾燥樹皮および葉からはそれぞれ 4．5mgおよび2．0mgのタキソールが得られた。それゆえに、本発明の第１の目的はタキソールの生産法を提供することであって、タキソールがイチイ種の胚から抽出される。イチイ種の種類は限定されず、イチイ属に属する限りいかなる木を用いることもできる。やはり、Taxus cuspid ataが有利に用いられる。胚からタキソールを生産するための抽出法は、特に限定されない。しかしながら、一般的には胚からのタキソールの抽出はアルコール、特にメタノール中に胚の凍結乾燥粉末を浸漬することにより行われうる。不幸なことに、接合体胚のサイズは非常に小さく、また胚は90％を超える水を含有する。ごく少量にすぎないタキソールを生産するために莫大な量の胚が必要とされ、胚から直接タキソールを抽出することは経済的観点において不利である。したがって、本発明者らは前記した問題点なしに経済的にタキソールを生産する方法を提供するために鋭意研究を重ね、その結果、組織培養技術を用いることによって、特に体細胞胚および胚発生カルスの誘導を介して胚の分量を十万倍に増大させることができた。それゆえに本発明の第２の目的は、イチイ種の接合体胚から体細胞胚または胚発生カルスを誘導し、該体細胞胚または胚発生カルスを液体培地中でシェーカーまたはバイオ−リアクターを用いることにより培養し、そしてその培養培地および細胞からタキソールを回収することによってタキソールまたはタキソール誘導体を生産するための方法を提供することである。本発明の１つの特徴は、体細胞胚または胚発生カルスの誘導を通じて本発明が一万から十万倍まで胚の分量を増大させることができることであり、しかるに、おそらくは用いた分裂組織の細胞分裂の能力が異なるために胚以外の種々の組織からの単純なカルス誘導がこのような増幅に達することは困難である。特に、胚発生カルスの誘導が胚の分量が十万倍にまで増大することを可能ならしめ、よって非常に重要である。接合体胚からの体細胞または胚発生カルスの誘導およびタキソールまたはその誘導体の生産を以下に記載する。胚を無菌的に培養するために８月から１１月までの期間のあいだにイチイ種から集めた成熟または未成熟の種子は、消毒または表面滅菌されるべきである。消毒または表面滅菌は、通常の技術を用いることにより行われる。たとえば、種子は70％エタノール中に30〜60秒間浸漬され、滅菌水で２または３回洗浄され、次亜塩素酸ナトリウムの１〜３％（v/v）溶液で24時間表面滅菌される。表面滅菌された種子は滅菌水で少なくとも５回すすがれ、胚がそれより分離される。胚は前記した抽出技術にしたがうことによりタキソールを抽出するために用いられてもよい。胚はまた、それよりカルスを誘導するために固形栄養培地上に載置される。体細胞胚の誘導は、ＰＥＤＣ（前胚発生決定細胞（Pre-Embryogenic Determined C ell））またはＩＥＤＣ（誘導胚発生決定細胞（Induced Embryogenic Determine d Cell））法によって行ってもよい。ＰＥＤＣパターンを用いる体細胞胚の誘導は以下の通りである。カルス誘導のため１-ナフタレン酢酸（以下「ＮＡＡ」）、カイネチンおよび2 ，4-Ｄが補われた固形栄養培地上で、胚が培養される。いったんカルスが誘導されれば、適切な濃度の多量養素、微量養素、およびビタミンを含有する培地上にて培養することによりカリの小片を増殖させることができよう。カルスの誘導および増殖の目的で、通例の植物組織培養培地を限定なしに用いることができる。たとえば、ｍＢ₅（変法ガンボーグＢ₅培地（modified Gamborg ’sB₅ medium））、Durzan、ＭＳ（Murashihge & Skoog medium）、ＷＰＭ（Llo yd & McCown）、ＤＫＷ（Driver-Kuniyuk-Walnut）、ＧＤ（Gresshoff & Doy）、ＳＨ（Schenk & Hildebrandt medium）またはＬＰ（Quoirin & Lepiover）を用いてもよい。これらの培地に種々の成分の添加もしくは削除、または割合の変更などの修飾をなしてもよいことは理解される。他の培地の中で、ｍＢ₅またはDurzan培地が好ましい。体細胞胚発生のための中間工程として、カルスの迅速な成長用の培地と同じまたは異なる誘導用の培地を用いてもよい。最大数の体細胞胚を得ることができるという観点から、ｍＢ₅培地が有利に用いられる。前記した培地のほとんどが市販されているかまたは汎用されているので、何人も容易にそれを入手しえよう。それゆえに、カルスの誘導および迅速な成長のための好適な培養培地の決定および／または至適化は、当業者の能力の範囲内にある。たとえば、本発明において有利に用いられるｍＢ₅培地はガンボーグＢ₅培地をわずかに変更した培地であり、その組成を表１に示す。さらにまた、体細胞胚の生産のため二者択一的に異なる植物成長ホルモンが添加された前掲の培地の中で胚を培養することによりＩＥＤＣパターンを行ってもよい。初発の培養に対しては、2〜4ppmの2，4-Ｄが添加される。胚の表面からカルスが形成され細胞の分量が10〜20倍増大すると、用いられるオーキシンの半分の濃度を有する同じ培地を使用することによって、継代培養を通常引き続き行った。おそらくは非増殖性細胞から分泌されたフェノール性化合物のためにほんどのカルスはその成長能を失うので、0．5％（w/v）の活性炭または1〜2％（w/v）のポリビニルポリピロリジンを補充した。カルスは、カルスの分裂組織から体細胞胚を形成すべく成長調節剤を含まない培地上に2〜4カ月間継代培養される。このようにして形成された体細胞胚は大量のタキソールまたはタキソール誘導体（以下、「タキサン類」）を含み、それ自体でタキサン類を抽出するのに用いられうる。体細胞胚からのタキサン類の抽出は通例の方法、特に以下に記載する方法を用いて行われるとよい。しかしながら、体細胞胚はさらに細胞の分量を増大させるため胚発生カルスを誘導するのに有利に用いられる。本発明にしたがって、前記のようにして生産された体細胞胚のみならず胚発生カリの抽出によって比較的高率のタキサン類を得ることができる。前記したＰＥＤＣまたはＩＥＤＣ法により得られた体細胞胚または接合体胚を培養することによって、胚発生カルスは生産されうる。胚発生カルスの生産法は以下のとおりである。1．0〜4．0ppmのＮＡＡおよび0．5〜2．0ppmのカイネチン、好ましくは2 ．0ppmのＮＡＡおよび1．0ppmのカイネチンを補った、カルスを誘導するのに好適な固形培地で、消毒した胚または体細胞胚を2〜4カ月間培養する。ＮＡＡプラスカイネチンの代わりに1〜4ppmの2，4-Ｄを培地に添加してもよい。ついで誘導されたカルスはベンジルアミンプリン、Ｎ−イソペンテニルアミノプリン、カイネチンまたはゼアチン（zeatin）などのサイトカイニン1〜5ppmを補った同じ培地で1〜2カ月間培養し、カルスの表面上に胚様体を形成せしめ、そして胚様体は 2〜10ppmの2，4-Ｄを補った同じ培地で約26℃にて2〜３カ月間、16/8時間（明／暗）条件下で培養される。この培養により元の胚の分量の十万倍も大量に胚発生カルスを得ることが可能となる。胚発生カルスはたとえば黄色、茶色から緑色まで、広範な色彩を示した。胚発生カルスの誘導および増殖のため、ありふれた植物細胞および組織培養のために用いられることができるいかなる培地であっても限定なく用いられてよい。前記のようにして生産された胚発生カルスは大量のタキソールを含有し、タキソールおよびタキサン類の抽出のために直接用いられうる。胚発生カルスの抽出は通例の技術、特に以下に記載する方法によって行われるとよい。産業的規模で胚発生カルスの分量を増幅するために、胚発生カルスは単一細胞または小細胞集塊をつくるべく無菌的にスライスされる。細胞懸濁培養を樹立するために、これらの細胞10％（v/v）を、2ppmの2，4-Ｄを補った液体培養培地50 mlを入れた250ml円錐形フラスコ中に播種した。エアーリフト（air-lift）またはインペラー（impeller）型バイオリアクターが、継続的な培養の点でこの目的のために有利に用いられる。バイオリアクター培養は２つの異なる培養培地：ひとつは細胞の成長用（生育培地）およびいまひとつはタキサン類の生産用（生産培地）を用いて行われうる。生育培地は好ましくは2〜4ppmの2，4-Ｄを補ったｍＢ₅培地であり、生産培地は好ましくは2〜10ppmのＮＡＡを補ったＭＳ培地である。特に、生産培地はタキソール生産を増大させるために好ましくはエリシター（ elicitor）を含有する。エリシターは菌エリシター、雌性配偶体抽出物（1〜5ml /l）、フェニルアラニン（50〜300mM）およびＧＡ３（0．5〜1．0ppm）から選択されるとよい。菌エリシターの例にはCytospora abietis ATCC No．38688およびPenicillium minioluteu m（Dierckx）、NRRL 18467が含まれ、これらは粉砕され、抽出物を与えるために一連の抽出に付される。それに代わって、pestalotiopsis属の培養菌を集菌しその抽出物を0．5〜1．0ml/lの量で培養培地中に添加することもまた好ましい。タキソールは細胞内に存在するだけでなく、培養培地中に分泌される。したがって、液体培養プロセスの後、タキソールおよびタキサン類は培養すなわち培地からよく知られた技術を用いることによって回収できる。培養培地からの細胞の分離は、遠心分離（たとえば1000×ｇ、5〜10分）またはデカンテーションにより行われうる。分離のためにデカンテーションの技術が用いられる場合、培養肉汁を24時間静置し細胞を沈殿せしめ、そして培養培地をデカントする。集めた細胞になお残存する培養培地はパスツールピペットを用いて真空吸引により除去される。タキサン類は培養培地のみならず体細胞胚または胚発生カルス細胞からもアルコールまたは、メタノールと塩化メチレンとの1：1の混合物で抽出することにより回収することができよう。遠心分離の際に形成される沈殿を、ソニケーター（ブランソン（Branson）250）を用いて粉砕し、そしてこれを抽出に付してもよい。本発明によれば、タキソールそれ自身のみならず、種々のタキソール誘導体も回収される。タキソール誘導体には10-デアセチルバッカチンIII、バッカチンII I、10-デアセチルタキソール、セファノルマニンおよび7-エピ-10-デアセチルタキソールが含まれる（図１（Ｂ）参照のこと）。タキソール誘導体はそのまま用いてもよいし、または必要であれば半合成によりタキソールに変換されてもよい。接合体胚より由来した体細胞胚および胚発生カルスからのタキサン類の同定は、ＨＰＬＣ、細胞毒性試験およびＥＬＩＳＡによりタキソールおよび標準としてＮＣＩから供給された６のタキソール誘導体を用いて完遂した。本発明を、実施例によってさらに詳細に記載するが、実施例の開示によって限定的に解釈されるべきではない。実施例１タキソールはイチイ種の接合体胚から回収した。 Taxus cuspidataの優れた木から種子を採取した。胚を約40℃の真空オーブン中で約３日間、10％より少ない水分含量にまで乾燥し、計量した。ついで、胚を液体チッ素で凍結し、粉砕した。粉砕した胚を、約100重量倍のメタノールを含む約28℃のインキュベーター中に約７日間浸漬した。得られた抽出物はメンブレンフィルター（孔サイズ、0．2μm）を通して濾過し、ＨＰＬＣを用いてタキソールの含量について分析した。同じ木から集めた樹皮および葉を前記したと同じ方法にしたがって処理しタキソールの含量について分析した。結果を表２に示す。実施例２ＰＥＤＣパターンを用いることにより胚から体細胞胚を生産した。 Taxus cuspidataの選択された遺伝子型からの種子を70％エタノールおよび2％次亜塩素酸ナトリウムにそれぞれ50秒および24時間浸漬し、各工程が終了した後に3〜5回滅菌蒸留水ですすぐことにより表面滅菌した。培養培地として、2．0ppmのＮＡＡ、0．5ppmのカイネチンおよび0．5ppmの2， 4-Ｄを補ったｍＢ₅培地（前の表１に示した成分および組成を有する）を用いた。invitro培養は、26℃に調整された生育室内で８週間行った。培養の最初の８週間のあいだに胚は大きくなり、ほとんどの胚の表面からカルスが誘導された。カルス中の緑色スポットを切除し、体細胞胚を誘導すべく約３カ月間植物成長調節剤を何も入れないｍＢ₅培地中で培養した。実施例３ＩＥＤＣパターンを用いることにより接合体胚から体細胞胚を生産した。 Taxus cuspidataの種子は、実施例２の方法にしたがって滅菌し、ついでそれより胚を単離した。胚は2ppmの2，4-Ｄを補ったDurzan培地中で23〜28℃にて２週間培養した。２週間の培養の後、すべての胚は全体的にそれより誘導されたカリで覆われていた。４週間の培養の後、カリの分量はもとの分量の数十倍に達した。カルス自身によって分泌されるフェノール類に起因するカルスの成長阻害または死を回避するために、カルスの継代培養は約1％のポリビニルポリピロリドンを補った同じ培地を用いることにより行った。８週間の培養の後、カリの平均直径が1〜1．5 cmに達したとき、植物成長調節剤を含有しないｍＢ₅培地にカルスを移し、ここでカルスが体細胞胚を誘導するよう生育した。いくつかの胚において根の分化が観察された。実施例４胚発生カルス培養を誘導するために、実施例２における滅菌した接合体胚ならびに実施例３および実施例４における体細胞胚を出発材料として用いた。前記材料はカルスを誘導すべく2．0ppmのＮＡＡおよび1．0ppmのカイネチンを補ったｍＢ₅培地中で23〜28℃にて約2．5カ月間培養した。カルス誘導を完了した後、3ppmのゼアチンを含む同じ培地を用いて約６週間継代培養を行い、緑色から黄色がかった胚様体を得た。 3ppmの2，4-Ｄを含有する同じ培地で26℃にて約２カ月間、16/8（明／暗）時間の条件下で胚様体を培養し、元の胚の分量の十万倍に当たる胚発生カルスを生産した。得られた胚発生カルスは種々の型のイチイ（Yew）の組織から由来する正常のカルスと比べて形態学的に異なっており、また時として接合体胚と類似の外見をなした。しかしながら、胚発生カルスの表面は赤色、黄色、暗緑色、淡茶色、暗茶色および黒色にわたる種々の色からなっていた。各着色細胞塊は小細胞塊をつくるために刃でスライスし、ついでそれを液体培地中で２〜４週間継代培養した。液体培養から大きな細胞凝集塊（cell clump）を除去した後、単一細胞および／または小細胞塊を20mlの培養培地を入れたプラスチックペトリ皿に播種した。採用した方法は液体プレーティング（liquid plating）であり、異なる色に着色した細胞系の選択は培養の４週間後に行った。異なる着色細胞系を得る、これらの視覚的な選択を行った。実施例５実施例２もしくは３で得た体細胞胚、または実施例４で得た胚発生カリは、25 ℃にて乾燥し、1μｌの塩化メチレンに溶かした。1μｌの蒸留水を添加し、混合物を10秒間攪拌して、引き続き遠心分離（25，000×ｇ）を行った。沈殿は25℃ にて乾燥し、50 μｌのメタノールに溶かして0．2μmのフィルターを通して瀘過して抽出物を得た。抽出物は逆相ミクロポアカラムを使用したＨＰＬＣにより外部標準の標準曲線（相関係数0．999）を用いて分析した。ＨＰＬＣの結果は、標準タキサン類のピークと前記抽出物中に含まれるタキサンのピークが同じ保持時間（14．3分）で出現することを示した。実施例６実施例２および３における体細胞胚、ならびに実施例４における胚発生カルスを、タキサン類を生産するために以下のとおりに抽出した。実施例２および３における体細胞胚各0．5ｇ、ならびに実施例４における胚発生カルスを遠心チューブに入れ、2μｌのヘキサンを加えた。混合物をガラス棒を用いてよく混合し、−20℃にて12時間保存して、つぎに25℃、25，000×ｇにて20分間遠心分離した。沈殿にメタノール：塩化エチレンの混合溶液を添加し、ソニケーター（ブランソン250）を用いて超音波処理に付した。得られた溶液は25，000×ｇで遠心分離し、沈殿を乾燥するまで60℃にて乾燥して抽出物を得た。抽出物はタキソール含量について分析し、その結果は以下のとおりであった。実施例２の体細胞胚の抽出物は乾燥細胞ｇあたり0．21〜0．27mgを含有し（総タキソール含量は0．5〜1．2mgであった）、実施例３の体細胞胚の抽出物は0．20〜0．27mgを含有し（総タキソール含量は0．5 5〜1．1mgであった）、さらに実施例４の胚発生カルスの抽出物は0．23〜0．28m gを含有していた（総タキソール含量は0．6〜1．4mgであった）。実施例７胚発生カルスの大量生産のために、実施例４の胚発生カルスをインペラー型バイオリアクターを用いて培養した。実施例４の胚発生カルスを、2ppmの2，4-Ｄを含む液体ｍＢ₅培地50mlを入れた 250mlの三角フラスコに10％ＰＣＶ（パックされた細胞容量）で播種した。25〜2 8℃にて18日間、無菌条件下で培養すると、定常期（stationary phase）に達した。培養物を2ppmのＮＡＡを補ったＭＳ培地（生産培地）を含む5リットルのインペラー型バイオリアクターに入れた。好気的条件下で25〜28℃にて30日間培養を維持した。30日の培養の後、培養肉汁を24時間静置し、細胞を沈澱せしめて、ついで細胞を培養培地から分離した。細胞から培養培地を徹底的に除去するのにパスツールピペットを用いた。このようにして分離された細胞および培養培地は、タキソールおよびその誘導体を生産するため実施例５に記載したと同様に抽出した。ＨＰＬＣの結果、標準タキソールおよびその誘導体のピーク（図１（Ａ））と、前記抽出物中に含まれるタキソールおよびその誘導体のピークは、同じ保持時間に現れることが示され、これはこれらの化合物が同じであることを示唆している。細胞は乾燥細胞ｇ当たり0．09mgのタキソールを含有し、一方培養培地は約8mg タキソール/lを含有すると計算された。実施例８タキソール生産に対する培養培地の型の効果を調べるために、実施例７の培養物をＭＳ、ｍＢ₅、ＷＰＭ、ＤＫＷ、Durzan、White、ＬＰ、ＧＤ、Ｂ５、ＤＣＲまたはＳＨ培地などの種々の培養培地に播種した。試験した培地にはすべて2．0 ppmのＮＡＡを補い、微環境条件（microenvironmental condition）を含む他の因子は同等に調整した。培養の期間は20日に減じた。結果を図４に示す。図４からわかるように、タキソールの生産は培養培地の型により有意に影響され、ＭＳおよびｍＢ₅培地が最も高いタキソール生産を与えた。実施例９タキソールおよびタキサンの生産を増大させるために生産培地に種々のエリシターを添加してもよい。タキソール生産に対するエリシターの効果を以下のように評価した。（１）本発明の場合、タキソール生産のためのエリシターとして生産培地に、イチイ種に生じる菌であるPestalotiopsis sp．の抽出物を添加した。種子および内側樹皮などの植物組織は、70％エタノール中に浸漬し、15％Ｈ₂ Ｏ₂を15分間用いて表面滅菌し、その後70％エタノール中に再び浸漬した。残存する試薬を除去するために滅菌水で４回かそれより多く組織をすすいだ。このようにして表面滅菌した組織を培地：モルト抽出物寒天培地（モルト抽出物20．0 ｇ、ペプトン5．0ｇ、寒天15．0ｇおよび蒸留水1リットル）、生育寒天培地（グルコース40ｇ、バクトソイトン（bacto soyton）10ｇ、酢酸ナトリウム1ｇ、安息香酸ナトリウム50mg、寒天20．0ｇおよび蒸留水1リットル）ならびに水培地（寒天20．0ｇおよび蒸留水１リットル）上に置き、そしてサーモスタットで調温した生育チャンバー内で12/12（暗／明）時間の照射に維持した。 Pestalotiopsis sp．菌が培養３日以内に出現したら、さらに菌をモルト抽出物および生育寒天培地（酵母抽出物3ｇ、バクトソイトン5ｇ、ＭｇＳＯ₄ 0．5ｇ、グルコース5ｇ、シュクロース10g/L）上で４日間栽培した。採取の際には、培養培地から細胞を分離すべく培養肉汁を遠心分離した。細胞を乾燥し、粉砕してメタノールで抽出し、炭水化物画分を得た。このようにして得たPestalotiopsis sp．の炭水化物抽出物を、1ppmの濃度となるよう生産培地に添加し、実施例７におけると同じ方法にしたがって培養および分析を行った。結果を表３に示す。（２）雌生配偶体抽出物2ml/L、フェニルアラニン100mMまたはジベレリン酸1p pmをエリシターとして生産培地に添加したことを除いては、実施例７の方法を繰り返した。結果を表３に示す。実験例１イチイの木の胚培養からのタキソールの証明を、ラット癌細胞を用いた細胞毒性試験によって行った。ラット癌細胞を用いた細胞毒性試験は通常、タキソールが細胞分裂の中期に癌細胞を選択的に殺すことができるという事実に基づいて行われる。大韓民国、京畿道、シンガルの太平洋株式会社中央研究所により提供されたラット癌細胞を、動物細胞培養培地を含むプラスチック培養器中で培養した。培養初期に細胞分裂が起こった時に、実施例７からの抽出物１滴を１つの培養器（処置）に添加し、一方別の培養器（コントロール）には抽出物を添加しなかった。その後、細胞分裂および各癌細胞の生存率を調べた。結果を図２（Ａ）および図２（Ｂ）に示す。図２（Ａ）および図２（Ｂ）からわかるように、コントロール群は癌細胞の盛んな成長を示し（図２（Ａ））、一方処置群は癌細胞の死を示した（図２（Ｂ））。癌細胞の死は処置から３時間後に現れ、約24時間後には完結した。それゆえに、細胞分裂または生存率の測定は必要ではなかった。実験例２イチイの木の胚培養からのタキサン類の同定はまた、以下のようにモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ（酵素系免疫吸収分析）によって成し遂げた。タキソールに特異的に反応するＴＡ01キットおよびタキサン類に特異的に反応するＴＡ03キットをこの実験に用い、これらキットはすべてHawaii Biotechnolo gy Groupから購入した。タキソールおよびタキサン抗原はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で1/100倍に希釈し、そして希釈液100lをＥＬＩＳＡプレートに分配した。25℃にて１時間インキュベートした後、プレートを少なくとも４回、ＴＢＳ−Ｔ（洗浄緩衝液）で洗浄し、さらにそれに50μｌのＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水トゥイーン）を添加した。タキソール標準物質、タキサン標準物質または実施例７の抽出物を連続的な３倍希釈を行ってウェル中に分配した。タキソール抗体およびタキサン抗体はＰＢＳＴでそれぞれ1/100および1/1000 倍に希釈し、各希釈液50μｌを分配した。25℃にて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。ＰＢＳＴで1/2000倍に希釈したＨＲＰ（ホースラディシュペルオキシダーゼ）100μｌをウェル中に分配し25℃にて１時間インキュベートして、引き続き洗浄緩衝液で４回洗浄した。200μｌのＯＰＤ（ｏ-フェニレンジアミン）を添加し、さらに25℃にて１時間インキュベートして発色させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いることにより490nmでの吸光度を測定した。タキソール標準物質については図３（Ａ）に、また実施例７の培養培地については図３（Ｂ）に結果を示し、これによりイチイ種の胚培養物のタキソール活性が立証された。前記した詳細な説明は単に例示目的のものであり、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく修飾および変更できることも理解すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年１１月１６日【補正内容】補正された請求の範囲１．（削除）２．イチイ種の組織を培養し、タキソールまたはその誘導体をカルスまたは培養培地から回収することによるタキソールまたはその誘導体の生産法であって、該組織が接合体胚であることを特徴とする方法。３．方法が、（ａ）イチイ種の種子から生接合体胚を準備しそれを消毒する；（ｂ）胚からカルスを生産するため、該消毒された胚の播種物を培養培地上で培養する；（ｃ）該カルスから体細胞胚を生産するため、（ｂ）において得られたカルスを培養する；（ｄ）胚発生カルスを生産するため、（ａ）における消毒された胚または（ｃ）において得られる体細胞胚を培養する；（ｅ）（ｃ）における体細胞胚または（ｄ）における胚発生カルスを液体培養する；ならびに（ｆ）培養培地からおよび細胞からタキソールまたはタキソール誘導体を回収する工程からなる請求の範囲第２項に記載の方法。４．工程（ｃ）がＰＥＤＣ（前胚発生決定細胞）またはＩＥＤＣ（誘導胚発生決定細胞）法を用いることにより体細胞胚を誘導することによって行われる請求の範囲第３項に記載の方法。５．液体培養（ｅ）が、生育培地を用いる生育段階および生産培地を用いるタキソール生産段階で構成される請求の範囲第３項に記載の方法。６．生育培地が2〜4ppmの2，4-Ｄを含む変法ガンボーグＢ₅（ｍＢ₅）培地であり、生産培地が1〜2ppmのＮＡＡを補ったＭＳまたはｍＢ₅培地である請求の範囲第５項に記載の方法。７．生産培地が、タキソール生産能を増大せしめるためにエリシターとしてイチイ種に生じる菌からの炭水化物画分抽出物、イチイ種の雌生配偶体の抽出物、フェニルアラニンまたはジベレリンを含有する請求の範囲第５項に記載の方法。８．菌がPestalotiopsis sp．である請求の範囲第７項に記載の方法。９．工程（ｄ）が、工程（ｂ）における胚または工程（ｃ）における体細胞胚をそれよりカルスを誘導するために1．0〜4．0ppmのＮＡＡおよび0．5〜2．0ppm のカイネチンを含有する固形培地で培養し、カルスの表面上に胚様体を形成するために1〜5ppmのサイトカイニン、ベンジルアミンプリン、Ｎ−イソペンテニルアミノプリン、カイネチンまたはゼアチンを含有する同じ培地でカルスを培養しさらに胚発生カルスを生産するために2〜10ppmの2，4-Ｄを含有する同じ培地で胚様体を培養することにより行われる請求の範囲第３項に記載の方法。１０．工程（ｃ）における体細胞胚が、タキソールまたはその誘導体を生産するために抽出される請求の範囲第３項に記載の方法。１１．工程（ｄ）における胚発生カルスが、タキソールまたはその誘導体を生産するために抽出される請求の範囲第３項に記載の方法。１２．イチイ種がTaxus cuspidataである請求の範囲第２項に記載の方法。１３．（削除）１４．（削除）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ソン，スン−ホ大韓民国 441−090 キュンギ−ドウスウォン−シティクウォンスン−クコデウン−ドン 38−１

Claims

【特許請求の範囲】１．イチイ種の組織を抽出することによるタキソールの生産法であって、該組織が接合体胚であることを特徴とする方法。２．イチイ種の組織を培養し、タキソールまたはその誘導体をカルスまたは培養培地から回収することによるタキソールまたはその誘導体の生産法であって、該組織が接合体胚であることを特徴とする方法。３．方法が、（ａ）イチイ種の種子から生接合体胚を準備しそれを消毒する；（ｂ）胚からカルスを生産するため、該消毒された胚の播種物を培養培地上で培養する；（ｃ）該カルスから体細胞胚を生産するため、（ｂ）において得られたカルスを培養する；（ｄ）胚発生カルスを生産するため、（ａ）における消毒された胚または（ｃ）において得られる体細胞胚を培養する；（ｅ）（ｃ）における体細胞胚または（ｄ）における胚発生カルスを液体培養する；ならびに（ｆ）培養培地からおよび細胞からタキソールまたはタキソール誘導体を回収する工程からなる請求の範囲第２項に記載の方法。４．工程（ｃ）がＰＥＤＣ（前胚発生決定細胞）またはＩＥＤＣ（誘導胚発生決定細胞）法を用いることにより体細胞胚を誘導することによって行われる請求の範囲第３項に記載の方法。５．液体培養（ｅ）が、生育培地を用いる生育段階および生産培地を用いるタキソール生産段階で構成される請求の範囲第３項に記載の方法。６．生育培地が2〜4ppmの2，4-Ｄを含む変法ガンボーグＢ₅（ｍＢ₅）培地であり、生産培地が1〜2ppmのＮＡＡを補ったＭＳまたはｍＢ₅培地である請求の範囲第５項に記載の方法。７．生産培地が、タキソール生産能を増大せしめるためにエリシターとしてイチイ種に生じる菌からの炭水化物画分抽出物、イチイ種の雌生配偶体の抽出物、フェニルアラニンまたはジベレリンを含有する請求の範囲第５項に記載の方法。８．菌がPestalotiopsis sp．である請求の範囲第７項に記載の方法。９．工程（ｄ）が、工程（ｂ）における胚または工程（ｃ）における体細胞胚をそれよりカルスを誘導するために1．0〜4．0ppmのＮＡＡおよび0．5〜2．0ppm のカイネチンを含有する固形培地で培養し、カルスの表面上に胚様体を形成するために1〜5ppmのサイトカイニン、ベンジルアミンプリン、Ｎ−イソペンテニルアミノプリン、カイネチンまたはゼアチンを含有する同じ培地でカルスを培養しさらに胚発生カルスを生産するために2〜10ppmの2，4-Ｄを含有する同じ培地で胚様体を培養することにより行われる請求の範囲第３項に記載の方法。１０．工程（ｃ）における体細胞胚が、タキソールまたはその誘導体を生産するために抽出される請求の範囲第３項に記載の方法。１１．工程（ｄ）における胚発生カルスが、タキソールまたはその誘導体を生産するために抽出される請求の範囲第３項に記載の方法。１２．イチイ種がTaxus cuspidataである請求の範囲第２項に記載の方法。１３．請求の範囲第３項の工程（ｃ）において得られるイチイ種の接合体胚外植体からの体細胞胚培養物。１４．請求の範囲第３項の工程（ｄ）において得られるイチイ種の接合体胚外植体からの胚発生カルス培養物。