JPH08503698A

JPH08503698A - アミノ酸模倣物を溶出試薬として用いる親和精製方法

Info

Publication number: JPH08503698A
Application number: JP6509231A
Authority: JP
Inventors: ブライアンシード
Original assignee: ザゼネラルホスピタルコーポレーション
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-09-27
Publication date: 1996-04-23
Also published as: CA2146162A1; AU5292693A; EP0663925A1; EP0663925A4; WO1994007912A1; MX9306174A

Abstract

(57)【要約】（ｉ）前記タンパク質との親和性複合体を形成することのできる第１分子を供給するステップと、（ｉｉ）親和性複合体の形成が可能な条件下で、前記試料を前記第１分子を接触させるステップと、（ｉｉｉ）複合体を単離するステップと、（ｉｖ）前記タンパク質、もしくは前記第１分子のいずれかの前記複合体形成に不可欠なアミノ酸残基を模倣した第２分子によって前記複合体を処理し、前記第２分子に複合体を破壊させ、前記タンパク質を前記複合体から分離させるステップと、（ｖ）前記タンパク質を単離するステップと、を含む試料からタンパク質を分離する方法。１実施例によれば、アミノ酸模倣物のイミダゾールが非常に穏やかな溶出試薬として用いられ、プロテインＡと抗体融合タンパク質の複合体を分離する。この技術は、抗体もしくは組換え抗体融合タンパク質の分離に広く適用される。

Description

【発明の詳細な説明】アミノ酸模倣物を溶出試薬として用いる親和精製方法本発明は、タンパク質の分離及び精製技術に関する。今日では、生物学の試料中の特定タンパク質を他の成分から分離するための多種多様な方法、物質、及びアプローチが存在する。一般的なアプローチの１例として、基質に対するタンパク質の非特異的親和がある。例えば、タンパク質は、分子の電荷に基づき、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。すなわち、タンパク質混合物が反対の電荷のクロマトグラフィーマトリックスに添加され、可逆的な静電気的相互作用によりさまざまなタンパク質がマトリックスに結合する。マトリックスに吸着したタンパク質は、イオン強度を高めることにより、もしくは溶出緩衡液のｐＨを変化させることによって、結合の弱いものから強いものの順に溶出される。また別の一般的なアプローチとしては、分離手段としてタンパク質の物理的特性を利用するものが挙げられる。例えば、ゲル濾過を用いて、タンパク質の大きさに基づきタンパク質を分離することができる。この方法の場合、所定の大きさの孔を有するクロマトグラフィーのマトリックスを詰めたゲル濾過カラムにタンパク質混合物を添加する。その後、タンパク質は、通常、緩衡剤水溶液を用いて溶出され、個々のクロマトグラフィーフラクションとして収集されて分析される。最後に、第３の一般的なアプローチとしては、精製試薬（purifying reagent ）に対するタンパク質の特異的親和性を利用するものがある。例えば、そのタンパク質に対して特異的な抗体を用いてタンパク質を精製することもできるし、または、逆に、抗体をそれに特異的な抗原によって精製してもよい。通常、抗体もしくは抗原はカラム基材に結合され、その特定の抗原もしくは抗体を含んだ溶液がそのカラムに添加されて、免疫複合体を形成することができる。続いて、結合された免疫複合体の要素は、例えば非常にイオン強度が高い又はｐＨの高い若しくは低い緩衡剤にさらすことにより、この抗原抗体複合体を不安定化させて溶出される。あるいは、免疫複合体を形成して、免疫沈降によりこの抗原または抗体を精製してもよい。この場合、抗原抗体複合体を凝集した後に沈澱させてもよいし、あるいは、結合要素のうちの１つを固体粒子（セファロースすなわちアガロース、など）と共有結合させ、免疫親和性複合体を遠心分離により分離してもよい。いずれの方法の場合も、分離対象のタンパク質は、その後、前述の場合と同様にイオン強度の高い、またはｐＨの高いもしくは低い緩衡剤にさらすことにより複合体から分離される。分子生物学者に特に興味深いのは、抗体もしくは組換え抗体融合タンパク質の分離及び精製方法である。個々の抗体分子は、構造的に、２本の同一の重鎖（Ｈ鎖）、及び２本の同一の軽鎖（Ｌ鎖）を有し、各Ｌ鎖がＨ鎖にジスルフィド結合され、Ｈ鎖どうしがジスルフィド結合されて、分子の基本的二量体構造を形成している。それぞれの鎖内部には、約１１０個のアミノ酸から成る単位が折り重なって、単一の内部ジスフィルド結合によって互いに一体的に結合して小型ドメインを形成している。Ｌ鎖は２つのドメインを有し、Ｈ鎖は４もしくは５つのドメインを有する。Ｈ鎖の初めの２本のＮ末端側ドメインは、２つのＬ鎖ドメインと相互反応して「Ｆａｂドメイン」、すなわち特異的な抗原の認識及び結合を行う分子部分を形成する。分子のもう一方の末端側においては、Ｈ鎖のＣ末端側ドメイン（Ｃ_H２ドメイン及びＣ_H３ドメイン）により「Ｆｃドメイン」を形成する。「Ｆｃドメイン」は、細胞の結合、補体結合、胎盤のトラバースなどを含む多数の免疫グロブリン機能を行う分子部分である。さらに、ＦａｂドメインとＦｃドメインの間に形成されるのが、ヒンジ領域を構成する小数のアミノ酸である。ヒンジ領域は、固定されない領域で、分子の抗原結合部分の自由な動きを可能にする。発明の概要本発明の目的は、アフィニティクロマトグラフィーカラムに吸着したタンパク質を溶出するための安価で一般的な方法を供給することである。上記の一般的な説明のように、アフィニティクロマトグラフィーは、精製したいタンパク質と固相に固定化されたリガンドとの間の特異的な相互作用を利用する、非常に効果的なタンパク質精製方法である。通常、固相リガンドはいくつかの固有の化学的特性を有し、それにより分離対象のタンパク質を選択的に吸着する。他の混入タンパク質（contaminant proteins）は、固相リガンドに結合しないか、もしくは適切な溶液で固相リガンドを洗浄することで除去される。これまで、アフィニティカラムの溶出は次の２つの方法のうちのいずれかにより行われてきた：（ｉ）マトリックスを、固定化されたリガンドに類似する特異的なリガンドの溶液によって洗浄する方法、または（ｉｉ）マトリックスを、イオン強度の極めて高い、またはｐＨの非常に高い（１１より大きい）もしくは非常に低い（３未満）の溶液で洗浄する方法。一般的には、方法（ｉｉ）よりも方法（ｉ）の方が効果的とされるが、これは、非常にイオン強度の高い溶液は、タンパク質に害を及ぼさない限りにおいては通常、アフィニティマトリックスにしっかりと結合したタンパク質を分離させるのに効果がないのが普通だからであり、多くのタンパク質は、分離対象のタンパク質を溶出するのに十分な酸性もしくは塩基性を有する緩衡剤に対して不安定であるためである。しかしながら、特異的な溶出リガンドが手に入らない場合や、特異的な溶出リガンドが実用上の理由により不適切である場合、例えばその特異的リガンドが不安定であったり、高価であったりする場合には、（ｉ）の方法も適用ができない。リガンド自体がタンパク質である場合、特異的リガンドを含む溶出溶液を用いて、固定化されたリガンドからタンパク質を溶出できることはまれである。これは、特異的リガンドがタンパク質もしくはペプチドのフラグメントである必要があるため、上述した実用上の理由により溶出が実行不可能となる。本発明は、特異的なアミノ酸の側鎖を模倣した安価な低分子量化合物の使用に基づき、アフィニティマトリックスを溶出する新規な方法を開示する。非タンパク質アフィニティリガンドに結合したタンパク質を分離するためには、リガンドの認識に関連する特異的アミノ酸の側鎖を模倣した溶出化合物が選択される。一方、タンパク質のアフィニティリガンドに結合したタンパク質を分離する場合には、溶出化合物は、精製対象のタンパク質もしくは固定化されたリガンドのタンパク質のいずれの側鎖を模倣してもよい。適切な側鎖模倣化合物は、その水溶性及び分離するべきタンパク質との融和性（compatibility）によって選択される。タンパク質どうしの相互作用は、疎水的相互作用、特に芳香族の疎水的相互作用によって安定化されることが多いので、最も好ましい溶出試薬は、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニンの側鎖模倣からなるグループから選択するのがよい。特定の実施例においては、ヒスチジンの残基に結合することにより促進された相互作用を不安定化するためには、イミダゾールを選択するのが適切である。チロシン側鎖の適当な模倣物は、アミノフェノールもしくはヒドロキシベンゼンスルホン酸塩などの置換基によって水溶性が促進されたフェノール及びフェノール化合物などのヒドロキシル化された芳香族化合物である。トリプトファンの適当な模倣物は、インドール−３−硫酸塩またはインドール−３−酢酸などの置換されたインドール、もしくはベンジミダゾール塩がよい。フェニルアラニンの適当な模倣物は、ベンゾアート塩、フェニルスルホン酸塩、及びニコチン酸塩もしくはニコチンアミドなどの水溶性の複素環がよい。また、有益なアミノ酸模倣物は、荷電残基相互作用（charged residue intera ctions）を破壊する分子から選択してもよい。このような荷電残基相互作用に干渉する有用な化合物の例としては、アルギニンを模倣するグアニジン塩、リシンを模倣するアルキルアミン、及びグルタミン酸塩（glutamate）もしくはアスパラギン酸塩（aspartate）を模倣するアルカン酸（alkanoic acids）が挙げられる。さらに、本発明において溶出試薬として有益なその他の化合物としては、脂肪族の疎水性残基相互作用を干渉する化合物、例えば、脂肪族アルコール、水溶性ポリアルキレングリコールの脂肪族エーテル、脂肪族アルコールの硫酸塩エステル、及び脂肪族アミンがある。また、脂肪族に置換されたフェノールなど、二元的（dual）疎水作用を有する化合物も、側鎖残基を模倣するのに有益であるといえる。以上のように、本発明は以下のステップから成る、試料からタンパク質を分離する方法により特徴づけられる。（ｉ）タンパク質と結合して親和複合体を形成することができる第１分子を供給する。（ｉｉ）親和複合体の形成が可能な状況の下で、試料を第１分子と接触させる。（ｉｉｉ）複合体を取り出す。（ｉｖ）第２分子によって複合体を処理する。この第２分子は、タンパク質もしくは複合体の形成に不可欠な第１分子のいずれかのアミノ酸残基を模倣したものであるので、第２分子によりこの複合体は破壊され、タンパク質が複合体から放出される。（ｖ）分離されたタンパク質を取り出す。好適な実施例においては、第２分子の全体もしくは一部は、アミノ酸側鎖を模倣する。別の好適な実施例においては、第１分子はプロテインＡであり、分離するタンパク質は、プロテインＡ結合ドメインを有する抗体もしくは抗原融合タンパク質である。この実施例によれば、第２分子はヒスチジン残基を模倣するのが好ましく、例えばイミダゾールが好ましい。その他の２つの好適な実施例においては、第１分子は抗体であり、分離するタンパク質は組換えタンパク質である。あるいは、第１分子は抗原性タンパク質であり、分離するタンパク質はこの抗原性タンパク質に特異的に結合する抗体である。ここで、「アミノ酸残基を模倣する」ということは、アミノ酸残基そのもの、もしくはタンパク質または非タンパク質の親和リガンド（すなわち「第１分子」）と相互作用するその残基の能力に不可欠なアミノ酸残基の１部のいずれかと同一のもしくはそれに類似する化学的組成を有する、という意味である。好ましくは、模倣されたアミノ酸の部分は、その残基の側鎖である。このような模倣分子は溶出試薬として用いられるので、この分子は水溶性で、精製されるタンパク質の安定性と融合するのが好ましい。本発明では、いかなるアミノ酸模倣物でも有益であるが、疎水性タンパク質−タンパク質相互作用を妨害するものが好ましい。なお、このような相互作用には、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、及びフェニールアラニンのアミノ酸を含む相互作用が含まれる。これらのアミノ酸に対する好ましい模倣物は、上述の通りである。「抗体融合タンパク質」とは、非免疫グロブリンポリペプチドに直接もしくは間接的に共有結合する免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも１部分を有するタンパク質を意味する。「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸の識別を決定する分子の中心炭素原子に結合する部分を意味する。本発明に係る好ましい側鎖には、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、及びフェニールアラニンを特徴づける、疎水性の側鎖が含まれる。「プロテインＡ結合ドメイン」とは、プロテインＡと呼ばれる黄色ブドウ球菌細胞壁成分と相互作用する免疫グロブリン分子の部分を意味する。結晶学上の研究により、このドメインはＣ_H２／Ｃ_H３の部分に最もよく配置されることが判明した。出願人は、親和精製技術を修正することにより、精製の最終ステップにおいてアミノ酸模倣物を溶出試薬として使用し、分離対象のタンパク質を親和複合体から分離できることを認識していた。このアプローチは、従来からの溶出技術（例えば溶液のｐＨにおける急激な変化に基づく溶出ステップなど）に比べてかなり穏やかである（gentler）ので、出願人によるこの方法によって、標準的な溶出手順では活性が破壊（例えば不可逆的に変性）もしくは減少されたタンパク質の分離及び精製を促進することができる。さらに、アミノ酸模倣物は便利で安価な溶出試薬なので、これらの模倣物は、より安定したタンパク質の精製の溶出試薬として利用することもできる。本発明のその他の特徴及び効果は、以下に示す好適な実施例の記載及び請求の範囲から明らかである。図面の簡単な説明図１は、免疫グロブリン融合タンパク質ＣＤ６２Ｒｇを概略的に示した図である。図２Ａは、好中球の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイトメトリーの測定結果を示す。図２Ｂは、Ｈ３６３０細胞の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイトメトリーの測定結果を示す。図２Ｃは、ＨＳＢ２細胞の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイトメトリーの測定結果を示す。図２Ｄは、Ｋ５６２細胞の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイトメトリーの測定結果を示す。詳細な説明本発明に係るタンパク質の分離及び精製手順、及び１つの特定免疫グロブリン融合タンパク質の分離におけるその使用について、以下に説明する。組換えタンパク質の非常に穏やかな溶出により、本来の結合反応を著しく損なうことなく精製を行うことができる。本発明を限定するためでなく、説明するための例を以下に示す。ヒスチジンの模倣物イミダゾールを用いた溶出による免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の親和精製ヒスチジンの模倣物であるイミダゾールを用いた溶出を含む親和性クロマトグラフィーによって、ヒトのＩｇＧ１を以下のように精製した。ヒトのＩｇＧ１をプロテインＡトリスアクリル担体（ピアス、イリノイ州、ロックフォード）上に添加し、リン酸緩衡溶液で洗浄する。担体を数本の小型カラムに分配する。これらのカラムを、濃度が１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、または５Ｍで、最終的なｐＨを６、７、８、または９に調整されたイミダゾールを含む溶液で溶出した。この結果が、いずれのｐＨ値に対して得られた最大溶出のパーセントとして表１に示される。いずれのｐＨ値でも、イミダゾールの濃度が最も高い場合には、カラムにわずかなＩｇＧ１が残留した。ｐＨ値は概してイミダゾールの溶出力を媒介するのに重要な役割を果たさなかったが、イミダゾールのｐＫ値は７．１であり、ｐＨ６では分子の約９０％が荷電しているのに対してｐＨ８では約９０％が荷電されていないだろうということからは、この結果は予想外のものであった。この方法を用いて、ＩｇＧ１単独の場合と同様に、免疫グロブリン融合タンパク質を、免疫グロブリンの不変領域に融合されたタンパク質部分の生物的活性を損なうことなくプロテインＡカラムから精製した。（詳しくは、以下のＣＤ６２Ｒｇの精製を参照のこと。）このような方法で精製された融合タンパク質のいくつかに対しては、酸性溶出条件が、免疫グロブリンのドメインに融合されたタンパク質部分にあるとされる活性（すなわちリガンドの結合活性）を破壊することが知られていた。一般的に、これらの免疫グロブリン融合タンパク質の精製には、適当なｃＤＮＡ構造体を用いたＣＯＳ細胞のトランスフェクションによって準備された、融合タンパク質の粗製準備（crude preparation）（ある表面抗原の細胞外ドメインに結合されたヒトのＩｇＧ１のヒンジ、Ｃ_H２、及びＣ_H３ドメインを含む）に関する初期分離が含まれる。培養上清が、さらに５日から１０日の間培養された導入細胞から集められ、遠心分離によって不純物が取り除かれ、プロテインＡトリスアクリルもしくはプロテインＡアガロース担体に吸着される。これらの担体を収集し、１％の非イオン性界面活性剤（Nonidet P40もしくはTri ton X-100）を含むリン酸緩衡溶液（ＰＢＳ）、続いて緩衡剤だけにより入念に洗浄して、さらに酢酸もしくは塩酸によりｐＨ８に調整された４Ｍのイミダゾールで溶出する。このようにして溶出された融合タンパク質を緩衡液で透析する。もしくはイミダゾールを２周期の遠心分離限外濾過によって除去する（Centrico n 30）アミコン社、マサチューセッツ州、ビバリー）。このような抗体融合タンパク質の精製の１つの特定例を以下に示す。溶性ＣＤ６２：免疫グロブリン融合タンパク質の分離以下のように、ＣＤ６２の最初の４つのＮ末端側細胞外ドメインをヒトのＩｇＧ１のヒンジドメインに遺伝的に融合することによりＣＤ６２タンパク質キメラを準備した。ヒトのＩｇＧ１人工スプライスドナーシーケンスとの融合を可能にするよう設計された合成オリゴヌクレオチドを用いて、レクチン（Ｌ）（lectin ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び最初の２つの補体調節タンパク質繰り返し要素（ＣＲ）をコードするＣＤ６２ｃＤＮＡシークエンスを、複製連鎖反応（ＰＣＲ）において増幅した（Aruffo et al．Cell 61，1303-1313，1990 参照）（図１）。前進プライマーは、ＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＴＡＧＣＣＡＴＣＴＴＧの配列（配列番号：１）を有し、逆向きのプライマーはＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧの配列（配列番号：２）を有した。この配列は、ＣＤ６２フラグメントがＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩＩのフラグメントとして、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化されたベクターに挿入されることを可能にした。ＤＮＡを増幅するために、酵素販売会社（ＵＳバイオケミカル、オハイオ州、クリーブランド）の薦める反応緩衡剤、及び内皮細胞発現ライブラリー（Bevilacqua et al.，Science 243，11 60-1165ページ、１９８９年出版）から準備されたＭｌｕＩ消化されたＤＮＡを用いて、９４℃で３０秒間、４５℃で２分間、７２℃で３分間の２０周期のＰＣＲを行った。この結果得られたＣＤ６２Ｒｇと称される融合タンパク質が、図１に概略的に示される。ＤＥＡＥデキストランを用いて、ＣＤ６２Ｒｇ発現プラスミドをＣＯＳ細胞に導入した（Seed and Aruffo，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：3365-3369，1 987参照のこと）。すなわち、１０枚の１００ｍｍのプレートに半ば込み合った状態のＣＯＳ細胞はそれぞれの構築物で形質導入された。トランスフェクションの１２時間後、細胞をトリプシン処理し、１００ｍｍの新しいプレートにまき直し、７日から１０日の間培養した。４日目、それぞれのプレートに１０％のウシ胎児血清を含む新しい培地５ｍｌが付加された。上清を採集し、遠心分離によってこれから非粘着細胞と屑を取り除いた後、１つに集めて４℃で保存した。このような上清のゲル電気泳動により、発現プラスミドが組換えグロブリンをコードすること、及びこれらのグロブリンは形質導入されたＣＯＳ細胞の上清中に溶性の形で存在することが示された。プロテインＡカラムを用いたクロマトグラフィーによってＣＤ６２Ｒｇ融合タンパク質を精製しようという初めの試みは、通常免疫グロブリンの溶出に用いられる酸性の緩衡剤に対して融合タンパク質が不安定であるため成功しなかった。この問題を回避するため、出願人は代わりにイミダゾールの溶液を用いて溶出を行った。これは、（結晶構造の研究から仮定して、）この分子を過度に供給すれば、抗体融合タンパク質のＣ_H２／Ｃ_H３断片におけるプロテインＡとヒスチジン残基により複合体の相互作用が破壊されるだろうと判断したためである。この結果、４Ｍイミダゾールが、炭水化物（糖質）及び組織反応性を保持することのできる、穏やかで効果的な溶出剤であることが証明された（以下を参照のこと）。上記のイミダゾールによる精製手順は次のようにして行われた。トランスフェクションの１２時間後、それぞれの構築物によって形質導入されたＣＯＳ細胞のフラクションをフラスコにまいた。トランスフェクションの３６時間後、細胞をリン酸緩衡溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、システイン−メチオニンを含まない培地を３０分間添加した。最終濃度が１５０μＣｉ／ｍｌとなるように［³⁵Ｓ］メチオニンと［³⁵Ｓ］システイン（TransLabel，ICN，カリフォルニア州、ＣＯＳタメサ）を添加して、細胞にこの標識を１晩取り込ませた。上清を採集し、２００μ ｌのプロテインＡトリスアクリル（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）と１２時間、４℃で培養した。遠心分離により担体を収集し、ＰＢＳ／１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０で洗浄した。分析のために、担体を１％のドデシル硫酸ナトリウム２００μｌで溶出した。あらかじめメルカプトエタノールにさらした後、またはさらさずに、各溶出液１０μｌに６％の不連続ポリアクリルアミドゲルを添加した。予備的な溶出として、カラム体積に対し５倍量の（酢酸で中和された）４Ｍイミダゾール（ｐＨ８）でカラムを洗浄した。溶出されたタンパク質は、４ ℃または８℃のイミダゾール中にに短時間保存するか、もしくは遠心分離限外濾過によって溶媒をＰＢＳに交換し、より長い時間保存した。ＣＤ６２Ｒｇ組織反応性精製されたタンパク質がＣＤ６２に特徴的な方法で細胞及び組織に反応できるかどうかを検査するために、骨髄細胞株及び腫瘍細胞株、すなわち、通常天然ＣＤ６２が結合する細胞における結合能解析が行われた。１０％ウサギ血清存在下で、未希釈Ｒｇ上清を用いて、１０⁶個の細胞を３０分間氷上で反応させた。細胞は、ＰＢＳで一度洗浄し、１から５μｇ／ｍｌの濃度の、ヒトのＩｇＧもしくはＩｇＭに対する蛍光ヤギ抗体（キャッペル、マルバー、ペンシルヴァニア州）に３０分間氷上でさらし、続いて４％のホルムアルデビドを含むＰＢＳ内で固定化した。蛍光の値は、ＦＡＣＳｃａｎ分析装置を用いて標準的な技術によって決定された。その結果を図２に示す。図において、実線はＣＤ６２Ｒｇとの反応性を示し、点線は対照のＣＤ７Ｒｇタンパク質との反応度を示している。このようなフローサイトメトリー及び蛍光顕微法により、ＣＤ６２Ｒｇが、新しく分離されたヒトの顆粒球、胸部がん腫株Ｈ３６３０及びＨ３３９６、及び骨髄細胞株ＨＬ６０、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７の細胞表面リガンドに反応することが示された。一方、白血病性Ｔ細胞株ＨＳＢ−２、ジャーカット細胞、もしくはＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ５６２（赤白血病）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＤ（横紋筋肉腫）細胞、Ｈ３６０６及びＨ３６２０黒色腫細胞、またはＬｔｋ− 及びＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞株には、細胞表面反応が見られなかった（図２参照）。また、コントロールの免疫グロブリン融合タンパク質ＣＤ７ＲｇとＣＤ８Ｒｇ、及び天然ＩｇＧはこれらの条件のもとで目に見える反応を示さなかった。多くの場合、浸透可能にされた細胞に結合したＣＤ６２Ｒｇの量は、浸透不可能な細胞に結合したＣＤ６２Ｒｇの量を大きく上回ることにより、実質的な内部保存が存在することが示唆された。ＣＤ６２Ｒｇ炭水化物反応糖脂質は、株限定発達パターン（lineage-restricted developmental pattern ）で複合炭水化物決定子を発現することがしばしばあるので、我々は、ＨＬ６０細胞（前骨髄球白血球株）の脂質抽出が、溶解もしくは吸着された形状のいずれかでＣＤ６２Ｒｇに結合するかどうかを調べた。フォルチ分配したＨＬ６０細胞の上層及び下層にシリカゲルを塗布したプレートを用いて薄層クロマトグラフィーを行い、クロマトグラムを放射性同位元素を使って識別されたＣＤ６２もしくはコントロールの融合タンパク質とで反応させ、洗浄した後、以下のように蛍光間接撮影を行った。２０倍量のクロロフォルム：メタノール溶液２：１を用いた均質化により、細胞（１×１０⁸から５×１０⁸）が抽出された。粗抽出物を脂質を含まないフィルタペーパーで濾過し、フォルチ分配を繰り返した（Hakomori and siddiqui，Meth．Enzymol．32：345-367，1974参照）。上層と下層をともに脱水した後、２００μｌのメタノール中に溶かした。培養上清からの脂質が、１ＭのＮａＣｌで飽和されたブタノールと共に抽出された（１：１ｖ／ｖ）。脱水によってブタノール層を乾燥させ、残基をメタノールに懸濁させた。アルミニウムを後面に塗布した（aluminum-backed）シリカゲルＨＰＴＬＣプレート（５ｃｍ×７．５ｃｍ）がクロマトグラフィーに用いられ、糖脂質は、クロロフィルム／メタノール／水（１２０／７０／１４）で分離された。クロマトグラフィーの後、プレートを乾燥し、０．１％のポリソブチルメタクリレートを含むヘキサンに浸水させて固定し（Magnani et al.，Meth．Enzymol．83：235-2 41，1982）、阻止溶液（１５０ｍＭＮａＣｌ，３ｍＭＣａＣｌ₂，２％ＢＳＡ）中に２２℃で１時間反応させた。３５Ｓ−識別Ｒｇ（１×１０⁵から２×１０⁵ｃｐｍ／ｍｌ）、すなわちＣＤ６２Ｒｇもしくはコントロールの融合タンパク質ＥＬＡＭ−１Ｒｇのいずれかを加えて、プレートともに１晩反応させた。次に、クロマトグラムを１５０ｍＭＮａＣｌと３ｍＭＣａＣｌ₂中で３０分２回洗浄し、乾燥させ、Ｅｎ３Ｈａｎｃｅをスプレーし、フルオグラフィーを行った。単一バンドとして、あるいは異なる溶媒システムにおいては密接に配置された二本のバンドとして移動する糖脂質が、ＣＤ６２Ｒｇと強く反応することがわかった。これらの溶出条件もしくはより強い溶出条件のもとでは、ガングリオシド分画には何の反応も見られなかった。精製された異なる糖脂質のクロマトグラフィーパターンの平行評価により次のことが示された。ＨＬ６０脂質は、ウシの脳のスルファチド（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニア州）、スフィンゴシン部分の２−アミノ位置に不均一脂肪アキル置換を有する３−スルフェイトガラクトシルセラミド（3-sulfated galactosyl ceramides）の商業的な準備と共に、３つの異なる溶媒システム［具体的には、クロロフォルム／メタノール／水（１２０／７０／１４、クロロフォルム／メタノール／水（７３／２１／４）、クロロフォルム／メタノール／アセトン／酢酸／水（１０／２／４／２／１（ Ishizuka et al.，J．Biol，Chem．253：898-907，1978）］において移動した。同じ条件下での精製糖脂質のクロマトグラフィー及び分析を行った。すなわち、それぞれの脂質標準品（ウシの脳のガングリオシド（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニア州）、スルファチド（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニア州））、トリシアリルガングリオシド（trisialyl ganglioside）ＧＴ１ｂ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、ヒドロキシル置換を有するガラクトシルセラミド（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、もしくはリソスルファチド（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニア州））（乾燥質量で）２マイクログラムをＣＤ６２ＲｇまたはＥＬＡＭ−１Ｒｇと反応させ、クロロフォルム／メタノール／水（７３／２１／４）とで展開した。これより、スルファチドがＣＤ６２と強く反応すること、及びよりイオン化した形状がこれらの条件のもとで優先的に認識されたことが確認された。脂肪アシル置換のないリソスルファチドは認識されなかった。また、硫酸残基のないガラクトシルセラミドは、脂肪酸鎖にヒドロキシル置換のあるものもないものも認識されなかった。ＣＤ１５を有する糖脂質は、スルファチドの検出を可能にする条件の下では、認識できるような反応をＣＤ６２Ｒｇとの間に示さなかった。さらに、ＣＤ７Ｒｇ、ＣＤ８Ｒｇ（Aruffo et al.，Cell 61，1303-1313 ，1990）、ＥＬＡＭ−１Ｒｇ（Walz et al.，Science 250：1132-1135，1990 ）、完全な（Intact）ＩｇＧ１、ＣＤ６２Ｒｇに存在するＦｃフラグメントに対応するＩｇＧ１のＣＯＳ細胞準備品のいずれもスルファチドと反応しなかった。その他の実験例出願人は、親和性精製技術を修正して、最終精製段階においてアミノ酸模倣物を溶出試薬として使い、分離対象のタンパク質を親和性複合体から放出することができることを認識した。このようなアミノ酸模倣物による溶出ステップは、例えば、カラムに結合した複合体からもしくは免疫沈降に含まれた複合体からタンパク質を分離するなど、いかなる標準的な親和性精製手順においても用いることができる。多くのアミノ酸模倣物（例えば、上述の模倣物など）は混合物に簡単に組み入れられるので、ここで説明した一般的な溶出技術は、相互作用接触点またはアミノ酸配列が知られていないタンパク質を含む、いかなるタンパク質の精製にも利用することができる。１つの特定例においては、上述の例示的なアミノ酸模倣物のほとんどもしくはすべてが、（溶解性を考慮して）疎水性相互作用、脂肪族の疎水性相互作用、及び／または荷電性相互作用に基づく多くの親和性複合相互作用のいずれをも破壊する、一般的目的の溶出試薬に混合することができる。このような一般的目的の溶出試薬の場合、特異的親和性接触点のアミノ酸配列、もしくは分離するタンパク質のアミノ酸配列さえも決定せずにすむ。しかしながら、これらのアミノ酸配列の説明を、対象タンパク質を最も効果的に溶出する模倣物の選択をガイドするものとして利用してもよい。例えば、一般的に有益な親和性相互作用点は、いずれのタンパク質でも抗体複合物形成に係わる所定の領域である。この領域の識別は、技術によって、または実験的に（例えば、タンパク質の連続的欠失もしくは点変異解析を行った後に、例えば免疫沈降もしくは抗体カラム結合による変異タンパク質の抗体結合能力の定量を行って）決定することができた。この領域のアミノ酸配列の検索が、溶出試料として用いることのできる模倣物の選択に利用される。相互作用に係わるいかなる領域には、１つ以上のアミノ酸接触点の候補が存在することもある。したがって、１つ以上の模倣物を、単独であるいは組み合わせて検査することにより、どの模倣物が最も効果的に複合体を破壊し、最も効果的なタンパク質溶出を可能にするかを決定することができる。配列リスト（1）一般情報：（i）出願人：シードブライアン（ii）発明の名称：アミノ酸模倣物を溶出試薬として用いる新和精製方法（iii）配列の数：２（iv）対応アドレス：（A）名宛人：フィッシュアンドリチャードソン（B）通り： 225フランクリンストリート（C）市：ボストン（D）州：マサチューセッツ（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号： 02110-2804 （v）コンピュータ読み出し形態：（A）媒体形式： 3．5”ディスク，1．44Mb （B）コンピュータ： IBM PS/2モデル50Z または55SX （C）作動システム： MS-DOS（バージョン5．0）（D）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン5．1）（vi）現出願データ：（A）出願番号： 07/956,660 （B）出願日：１９９２年１０月２日（C）分類：（vii）優先出願データ：（A）出願番号：（B）出願日：（viii）代理人情報：（A）氏名：クラークポールティー（B）登録番号： 30,162 （C）整理番号： 00786/153001 （ix）遠隔通信情報：（A）電話番号：（617）542-5070 （B）ファックス番号：（617）542-8906 （C）テレックス番号： 200154 （2）配列番号１の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 42 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：鎖状（xi）配列番号１の記載：（2）配列番号２の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 39 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号２の記載：

Claims

【特許請求の範囲】１．試料からタンパク質を分離する方法であり、以下のステップを含む：前記タンパク質との親和性複合体を形成することのできる第１分子を供給するステップと、親和性複合体の形成が可能な条件下で、前記試料を前記第１分子を接触させるステップと、複合体を単離するステップと、前記タンパク質、もしくは前記第１分子のいずれかの前記複合体形成に不可欠なアミノ酸残基を模倣した第２分子によって前記複合体を処理し、前記第２分子に複合体を破壊させ、前記タンパク質を前記複合体から分離させるステップと、前記タンパク質を単離するステップ。２．請求項１記載の方法において、前記第２分子は前記アミノ酸残基の側鎖を模倣する。３．請求項１記載の方法において、前記第１分子はプロテインＡであり、前記タンパク質は、プロテインＡ結合ドメインを有する抗体もしくは抗原融合タンパク質である。４．請求項３記載の方法において、前記第２分子はヒスチジン残基を模倣する。５．請求項４記載の方法において、前記第２分子はイミダゾールである。６．請求項１記載の方法において、前記第１分子は抗体である。７．請求項６記載の方法において、前記タンパク質は組換えタンパク質である。８．請求項１記載の方法において、前記第１分子は抗原性タンパク質であり、前記タンパク質は前記抗原性タンパク質と特異的に結合する抗体である。