JPH08503770A - 抗ｈｐａ抗体の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト血清における抗ＨＰＡ１ａ及び抗ＨＰＡ３ａ抗体の免疫分析（例えばＥＬＩＳＡ）は、マイクロタイタープレートのような基質に被覆した遺伝子型ヒト血小板抗原糖タンパク質ＧＰＩＩｂ及び／又はＧＰＩＩＩａを使用する。糖タンパク質は、溶解及び結合した配列ＲＧＤを含むペプチドを有する親和性基質によるバッチアフィニティークロマトグラフィーにより、遺伝子型血小板から調製される。糖タンパク質は糖タンパク質−ペプチド複合体として溶離し、存在するペプチド及び金属イオンを除去するために透析される。ＥＬＩＳＡインキュベーションは、室温で行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ＨＰＡ抗体の検出 技術分野 本発明は、特定の遺伝子型のヒト血小板抗原１又は３（ＨＰＡ１又はＨＰＡ３ ）に対する抗体の免疫学的検出用免疫分析法及び免疫分析系、及び特にその検出 用酵素結合免疫分析（ＥＬＩＳＡ）に関する。背景 ＨＰＡ１は、ＧＰＩＩＩａのＮ末端領域に位置する血小板膜糖タンパク質（Ｇ Ｐ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体についての多型決定基である。この複合体は、非共 有結合で結合した２つのサブユニットＧＰＩＩｂ及びＧＰＩＩＩａからなる。サ ブユニット結合にはＣａ²⁺及びＭｇ²⁺のような２価のカチオンが必要である。Ｈ ＰＡ１の免疫原性は、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）及び新生児同種免疫血小板減少症 （ＮＡＩＴＰ）を含む種々の免疫性血小板減少症を引き起こす（参考文献１、２ ）。ＨＰＡはＨＰＡ１ａ及びＨＰＡ１ｂ型として存在するものである。白色人種 の人口の約７２％は、ＨＰＡ１ａ（血小板抗原１、即ちＰＬＡ１）の同型接合で あり、ＨＰＡ１ｂ（血小板抗原２、即ちＰＬＡ２）は２％であり、２６％は異型 接合である（参考文献２）。ＰＴＰは稀な症状（世界で約２００の報告例）であ るが、ＮＡＩＴＰは２０００の生存出産中１人の割合で比較的頻繁に現れ、その 症例の約５０％が最初の妊娠である（参考文献２、３）。これらの症状において は、抗ＨＰＡ１ａ抗体（即ち、１ａ型抗体）がＨＰＡ１ａ抗原をもつ血小板を攻 撃して患者の血液中の血小板の破壊を生じる。これは、ＮＡＩＴＰの場合、血小 板計数の減少又は血小板活性の低下及びその結果としての血液凝固系の損傷のた めに出血傾向の増加した乳児として現れる。 抗ＨＰＡ１ａ抗体の初期の検出は、迅速な診断が患者の治療、特に妊婦の型別 を助けることができるので極めて重要なものである。抗ＨＰＡ１ａ抗体の検出に は、血小板懸濁免疫蛍光試験（ＰＳＩＦＴ）、血小板抗原のモノクローナル抗体 固定化（ＭＡＩＰＡ）、フローサイトメトリー及び免疫吸着分析を含む数種の方 法がある（参考文献４、５、６、７）。そういった方法は十分に確立されている が、非常に感受性のあるＭＡＩＰＡの場合には、時間を要し、自動化及び広範囲 な適用で処理することができない。 Pytelaら（参考文献８）は、アミノ酸配列Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）を含むペプ チドに対する血小板膜糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの結合特性を記載して いる。糖タンパク質は、セファロースに結合したヘプタペプチドＧＲＧＤＳＰＫ を用いて血小板抽出液のアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたも のである。 Kirchhofferら（参考文献９）は、同様の精製手順を用いて純粋なＧＰＩＩｂ ／ＩＩＩａを生成した。ニトロセルロースフィルターに移した純粋な糖タンパク 質は、モノクローナル抗ＩＩｂ抗体と反応して酵素標識第２抗体を用いて明らか にされる免疫複合体を形成した。アフィニティークロマトグラフィーからの溶出 液は、糖タンパク質に結合したヘキサペプチドを含み、更にＭｇ²⁺及びＭｎ²⁺イ オンを含むものである。ペプチド及び金属イオンが存在すると、抗ＨＰＡ抗体の 試験において糖タンパク質の使用を妨害することがある。更に、Kirchhofferは 、遺伝子型血小板の使用を示唆していない。 R．Kekomakiら(J．Clin．Invest.，88，847-854，1991)（参考文献１０）は、 セファロースに吸着させることによりＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを精製して粗分離物 を得、次いで、ヘパリン−セファロースカラムに通過させて残存する汚染物を除 去し、セファクリルＳ−３００とゲルろ過し、コムギ胚芽凝集素アフィニティー クロマトグラフィーにより微量のフィブリノーゲンを除去した。 しかしながら、これらの文献は、特定の遺伝子型のＨＰＡ抗体の検出に適切な 免疫分析を開示していない。発明の要約 本発明は、１態様においては、遺伝子型糖タンパク質抗原ＧＰＩＩｂ及び／又 はＧＰＩＩＩａを被覆した基質を含む、ヒト血小板抗原１又は３（ＨＰＡ１又は ＨＰＡ３）に対する抗体の免疫学的検出用免疫分析系を提供するものである。 即ち、抗ＨＰＡ１及び抗ＨＰＡ３抗体は、特にＮＡＩＴＰにおいて重要な役割 を果たすことが判明した。 血小板の遺伝子型は、Williamsonら(1992)に記載されている手法を用いて型別 された（参考文献１１）。以前には、抗原の対立遺伝子の相違（ＨＰＡ−１−４ ）は血小板糖タンパク質をコードするＤＮＡに含まれる多型性によることが判明 している。 供血者又は患者の血小板を分子手法を用いて型別することは可能である。これ は、抽出したゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、 次いで、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析にかけることにより達成される。この ようにして、ＨＰＡ１又はＨＰＡ３抗原を含む血小板を同定及び単離することが できる。 本発明は、もう１つの態様においては、下記の工程を含む、ヒト血小板抗原１ 又は３（ＨＰＡ１又はＨＰＡ３）に対する抗体の試験管内検出用免疫分析法を提 供するものである。 −マイクロタイタープレートを遺伝子型糖タンパク質抗原ＧＰＩＩｂ及び／又 はＧＰＩＩＩａで被覆する工程； −非特異的に遮断する工程； −試験されるべき血清と接触させる工程； −固定化糖タンパク質抗原と血清中に存在する抗ＨＰＡ１又は抗ＨＰＡ３抗体 との間に形成された免疫複合体の存在を検出する工程。 一般に、免疫複合体は、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダ ーゼＨＲＰ）、放射能標識、蛍光標識又は当該技術において既知の他の標識系の ような適切な標識で標識された抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭによって評価される。酵 素標識を用いる酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）が提供され、これは感受性 があって、特異的で、安価で、迅速でかつ抗ＨＰＡ１抗体の大量スクリーニング に用いることが可能である。有利なことには、インキュベーションが免疫複合体 の生産に関与し、標識抗体によるその評価を室温で行うことができかつインキュ ベーターの使用を必要としないことが判明した。 本発明は、問題の要求したＨＰＡ遺伝子型を検出するために遺伝子型糖タンパ ク質抗原の使用に基づくものである。ＨＰＡ１の抗原決定基はＧＰＩＩＩａサブ ユニット上に存在するので、抗ＨＰＡ１抗体の免疫分析は糖タンパク質ＧＰＩＩ Ｉａサブユニットを含まねばならない。抗ＨＰＡ１抗体は１ａ及び１ｂ型として 存在するので、抗ＨＰＡ１ａ抗体を検出するために、糖タンパク質ＧＰＩＩＩａ サブユニットの遺伝子型１ａが選ばれねばならない。ＮＡＩＴＰの出現率の約９ ８％が抗ＨＰＡ１ａ又は抗ＨＰＡ３ａ抗体の存在によるものであり、前者は後者 の約４倍頻繁であることがわかっている。即ち、ＮＡＩＴＰ用の明確な試験には 、抗ＨＰＡ３ａ抗体（ＨＰＡ３は同じように遺伝子型３ａ及び３ｂとして存在す る）も含めねばならない。ＨＰＡ３の抗原決定基はＧＰＩＩｂサブユニット上に あり、そのためこれを抗ＨＰＡ３ａ抗体の免疫分析において含めねばならない。 抗体がＨＰＡ１ａあるいはＨＰＡ１ｂ（又はＨＰＡ３ａあるいはＨＰＡ３ｂ） に対するものであるかを評価するために、適切な糖タンパク質又は糖タンパク質 混合液がマイクロタイタープレートの分離ウェルに供給される、例えば、ＨＰＡ １ａ１ａ／３ａ３ａ、ＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ｂ３ｂ、ＨＰＡ１ａ１ａ／３ｂ３ｂ又 はＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ａ３ａ（いずれも各遺伝子型血液成分分離血小板から精製 した）。 本発明の実用的実施態様は、ＨＰＡ１ａ１ａ／３ｂ３ｂ糖タンパク質を含むウ ェル（抗ＨＰＡ１ａ抗体を検出するため）及びＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ａ３ａ糖タン パク質を別個に含むウェル（抗ＨＰＡ３ａ抗体を検出するため）；及び任意に対 照として働く糖タンパク質を含まないウェルを有する酵素結合免疫分析（ＥＬＩ ＳＡ）の多ウェルマイクロタイタープレートを含む。典型的には、各ウェルは１ ウェル当たり０．０５〜０．５マイクログラム；好ましくは０．１マイクログラ ムの糖タンパク質を含有する。 ウェルは、一般に、血清と接触させる前にウシ血清アルブミンのような非特異 的タンパク質混合液で遮断される。 更に、本発明の態様は、下記工程を含む、ヒト血小板抗原糖タンパク質ＧＰＩ Ｉｂ及び／又はＧＰＩＩＩａの精製方法を提供するものである： （ａ）遺伝子型ヒト血小板を供給する工程； （ｂ）その血小板を溶解して溶解物を形成する工程； （ｃ）その溶解物を配列Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）を含むペプチドを結合したア フィニティークロマトグラフィー基質に加える工程；及び （ｄ）遺伝子型糖タンパク質を溶離する工程。好ましい実施態様の詳細な説明 ここで、本発明の実施例は、下記に示す図面に関する実施例によってのみ記載 される。 図１は、種々の量の被覆ＨＰＡに対する抗ＧＰＩＩＩａ、ＩＩｂ及びＩｂモノ クローナル抗体（ＭＡｂ）(各々５０、２５０及び１，０００ng/ml)の結合を示 すものである。 図２は、２つの抗ＨＰＡ１ａ血清を用いてＨＰＡ１ａＥＬＩＳＡの感受性を示 すものである。 図３は診断試験としてＨＰＡ１ａＥＬＩＳＡの実用例を示すものである。実施例１ （ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの抽出） 試薬は、Analarグレードに属し、BDH Chemicals社（英国）又はAldrich Chemi cals社（英国）から購入した。抗ＧＰＩＩｂ及びＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナ ル抗体（ＭＡｂ）は、the Institute for Clinical Immunology and Transfusio n Medicine，Justus Liebeg University，Giessenによって供給された。抗ＧＰ Ｉｂ及びＩＩＩａＭＡｂは、Dakopatts（デンマーク）から購入した。ＨＲＰ結 合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ及びＩｇＭは、Scottish Antibody Production Unitから 入手し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ及びＩｇＭはBio-Rad（英国）から購入 した。抗ＨＰＡ１ａ及び正常血清は、各々ＮＡＩＴＰのある乳児の母親及び我々 のセンターの篤志供血者から入手した。 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの抽出及び精製は、Pytelaら及びKirchhofferらの方法 を少し変更した（参考文献８、９）。簡単に述べると、遺伝子型血液成分分離血 小板（Cambridge Transfusion Centreから入手）を洗浄し、血小板を５０mMトリ ス／ＨＣｌ及び１５０mMＮａＣｌ、ｐＨ7.5（ＴＢＳ）を含むバッファー中１０m lの１００mMオクチルグルコピラノシド（ＯＧ）及び２mMフェニルメチルスルホ ニルフルオリド（Sigma、英国）で抽出した。次いで、この抽出液を遠心し、上 清をカチオンで補足し（参考文献９）、２ｇの配列ＧＲＧＤＳＰＫの固定化ヘプ タペプチド（Novabiochem、英国製のペプチド；及びPharmacia製のＣＮＢｒ活性 化セファロース４Ｂ）の１２mgペプチド／ｇセファロース４Ｂと４℃で一晩回転 混 合した。次に、ビーズを１０００rpm、室温のベンチ遠心機（ＭＳＥ、英国）で ５分間遠心し、上清を除去した。ビーズを、２８０nmの吸光度が非特異的結合タ ンパク質不純物が洗い落とされたことを示す＜０．０５（Pye Unicam，Philips 、英国）に下がるまで遠心により洗浄した。糖タンパク質は、セファロースビー ズに固定化されたヘプタペプチドに結合する。次いで、ビーズを１mg/mlＧＲＧ ＤＳＰヘキサペプチド（Novabiochem、英国）を含有する最初の混合バッファー とともにＴＢＳ中５mlの１mMＭｇＣｌ₂及び１mMＭｎＣｌ₂と３回室温で１５分間 回転混合することにより、結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを溶離した。溶離バッファ ー中にヘキサペプチドを用いると、固定化ペプチドと競合し、ヘキサペプチド− 糖タンパク質複合体を遊離する。溶離を３回繰り返した。上記のように遠心によ り回収した３溶出上清をプールし、１回以上遠心して残留ビーズ粒子を除去した 。溶出液の吸光度を記録した後、１リットルの１０mMトリス／ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ7.4に対して４℃で２回透析した。透析は、ペプチド及び残留金 属イオンを除去するとともに遊離糖タンパク質を残すのに有効である。ペプチド 分子は透析膜を通過し、遊離ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの解離のために複合体の形 成／解離の平衡を妨害する。即ち、糖タンパク質は、実質的にペプチドを含まず 、金属イオンを含まない。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体に対するモノクローナル 抗体は、Binding Site社、英国、バーミンガムから購入し、透析糖タンパク質よ り非透析ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに親和性が大きく結合した。これは、糖タンパク 質が実質的にペプチド及び金属イオンを含まないこと、即ち全く複合体を形成し なかったことを示す。最後に、透析溶出液の吸光度を記し、−４０℃で分割して 貯蔵した。固定化ＲＧＤペプチドを洗浄し、再使用のために４℃で貯蔵した。Ｇ ＰＩＩｂ／ＩＩＩａのタンパク質濃度及び純度を、以前のように（１０）各々二 シンコニン分析（Pierce、英国）及びＳＤＡ−ＰＡＧＥ（銀染色）により評価し た。1.4mgまでのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、１単位の純度９０％以上の血液成分 分離血小板濃縮物から得ることができた。実施例２ （モデルＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡは、下記工程から構成された： マイクロタイタープレート（Greiner、ドイツ）を、１、２又は３μg/ml（１ウ ェ ル当たり１００μｌ）の次の表現型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ糖タンパク質の１種： ＨＰＡ１ａ１ａ／３ａ３ａ、ＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ｂ３ｂ、ＨＰＡ１ａ１ａ／３ｂ ３ｂ又はＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ａ３ａ（コーティングバッファーのみバックグラウ ンドとして含んだ）で３７℃において一晩被覆した（ＥＬＩＳＡコーティングバ ッファー、洗浄バッファー及び発色バッファー並びに洗浄手順は参考文献１２の 通りである）。ウェルを洗浄し、コーティングバッファー（３００μl/ウェル） 中５％ウシ血清アルブミン（Boseral；Organon Technika）で３７℃において１ 時間遮断した。洗浄後、プレートを１００μl/ウェルのヒト血清又はマウスＭＡ ｂの希釈液と３７℃で１時間３回繰り返してインキュベートした。ウェルを再び 洗浄し、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧもしくはＩｇＭ又は抗マウスＩｇＧもしくはＩ ｇＭと各々３７℃で１時間インキュベートした。また、インキュベーションはす べて室温で行うことができる。最後に、プレートを洗浄し、比色基質としてテト ラメチルベンジジンを用いて発色した（発色は３７℃で高められる）。４５０nm の比吸光度は、ＧＰ被覆ウェルの吸光度からコーティングバッファーのみ含むウ ェルの吸光度を引いたものと等しかった。ヒト試験及び対照試料を５個中１個の 血清希釈液を用いてスクリーンした。 ＧＰＩＩＩａ及びＧＰＩＩｂの存在を示す、被覆ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの対応 ＭＡｂに対する特異的かつ用量依存結合があった（図１）。比較として、比較的 高濃度の抗ＧＰＩｂは最高量の被覆ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合しなかった。特 異的結合は、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａＭＡｂでも認められた（データは示されて いない）。更に、２つのヒト抗ＨＰＡ１ａ陽性血清（陰性対照として正常血清と ともに）用いる分析により、１：８０〜１：１６０の希釈度で非常に感受性があ ることがわかった（図２）。実際に、分析により１：１０００〜１：３０００の 陽性血清希釈度で行うことが可能であることがわかった。更に、分析の特異性は 、抗ＨＰＡ１ａ抗血清がＨＰＡ１ａ１ａ／３ａ３ａ及びＨＰＡ１ａ１ａ／３ｂ３ ｂにのみ結合し、ＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ａ３ａ及びＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ｂ３ｂに結 合しない場合に証明された（データは示されていない）。実施例３ （貯蔵寿命） ＨＰＡ１ａ１ａ／３ａ３ａ又はＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ｂ３ｂで一晩被覆し、洗浄 し、風乾し、密封したマイクロタイタープレートを４℃で放置した。その後１２ 週まで毎週行った分析は、２つの抗ＨＰＡ１ａ血清の一致したかつ特異的結合を 示したが、正常血清には示さなかった（データは示されていない）。更に、現在 までの結果は、−２０℃で１１ヵ月まで貯蔵したプレートは同様に働くことを示 し、４℃及び−２０℃で貯蔵した被覆プレートの評価は継続している。実施例４ （ヒト血清中の抗ＨＰＡ−１の検出） ヒト抗ＨＰＡ１ａ血清のスクリーニングに対するＥＬＩＳＡの適合性を、ＮＡ ＩＴＰをもつ乳児の母親の血清を用いて評価した。抗ＨＰＡ１ａ抗体に陽性の３ １の血清、抗ＨＰＡ１ａに陰性及び弱い陽性の各々２及び８血清及び抗体状態が 未知の４血清（すべてＰＳＩＦＴ及びＭＡＩＰＡで求めた）はCLB、アムステル ダムにより供給され、ＥＬＩＳＡで盲検試験した。引き続いて解析により次の結 果が示された：陽性血清の一致２９／３１；弱い陽性血清の一致６／８、他の２ つはＥＬＩＳＡに陰性であった；２つの陰性血清はＥＬＩＳＡに陽性であった； 及び４つの未知血清のうち２つは弱い陽性であり２つは被覆されないウェルと反 応した（被覆プレートをＥＬＩＳＡのＣＬＢに送ると同様の相関が認められた） 。引き続いて結果は、ＥＬＩＳＡと処理赤血球細胞を用いる凝集反応分析である Capture-P分析（Immucor社、米国）との間に完全な相関を示した。 更に、ＥＬＩＳＡの利点を図３に示す。冠動脈バイパスを行った後、血小板を 輸注した６０歳の女性患者が１週間後重篤な血小板減少症に罹った。彼女はヘパ リンを受けていたので、血小板減少症の原因を決定することは重要であった。我 々は、ＥＬＩＳＡを用いて強力抗ＨＰＡ１ａ抗体を含む彼女の血清試料を受け取 った３．５時間以内に決定することができた。 我々の結果は、新たに開発されたＥＬＩＳＡが簡便で、安価で、迅速で、特異 的でかつ感受性のある分析であることを示すものである。非特異的な高反応性が 被覆されないウェルで生じる例外的場合には、高度希釈液が用いられるか又は別 の分析を用いて確認が探索される。しかしながら、被覆プレートの安定性、他の ＨＰＡ抗体用ＥＬＩＳＡを開発する可能性及び自動化の従順性は、ＥＬＩＳＡを ＮＡＩＴＰの大規模な集団の実験を含む抗血小板抗体のスクリーニングに広く用 いられることを可能にしなければならない。更に、ＰＳＩＦＴ／ＭＡＩＰＡとＥ ＬＩＳＡとの間の相関が高いことを見ると、ＥＬＩＳＡが診断試験として開発す ることができることが示される。最後に、ＥＬＩＳＡは、その感受性及び接触性 が高いために他の分析で見落とした抗体を検出することが可能である。 参考文献 １．PUIG，N.，SAYAS，M.J.，MONTORO，J.A.，VILLALBA，J.V．＆PLA，A．ステ ロイドに応答する輸血反応の主要発現としての輸血後紫斑病：顆粒球と血小板抗 体のフローサイトメトリー研究。Ann Hemat.，62．232-234(1991)。 ２．NEWMAN，P．血小板ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ：分子変化とアロ抗原。Thromb．H aem. ，66，111-118(1991)。 ３．KAPLAN，C.，DAFFOS，F.，FORESTIER，F.，MOREL，M.C.，CHESNEL，N．& TC HERNIA，G．新生児同種免疫血小板減少症の現在の傾向：診断と治療。血小板免 疫学の基礎と臨床。Eds．Kaplan-Gouet，C.，Schlegel，N.，Salmon，Ch.，McGr egor，J.，Inserm/John Libbey Eurotext Ltd.，206，267-278(1991)。 ４．BORNE，D.E.G．KR VON DEM，VER HEUGHT，F.W.A.，OOSTERHOF，F.，RIESZ， E．VON，BRUTEL DE LA RIVIERE，A．＆ENGELFRIET，C.P．血小板抗体検出用の簡 便な免疫蛍光試験。Br．J．Haem.，39，195-207(1978)。 ５．KIEFEL，V．血液学におけるＭＡＩＰＡ分析とその応用。Transfusion Med. ，2，181-188(1992)。 ６．FREEDMAN，J．＆HORNSTEIN，A．フローサイトメトリーによりＨＬＡと血小 板特異的抗体とを区別する簡便な方法。Am．J．Haem.，38，314-320(1991)。 ７．BORZINI，P．血小板特異的抗体の確認のためのＥＬＩＳＡ手順。可変部の評 価。Haematologia，76，20-27(1991)。 ８．PYTELA，R.，PIERSCHBACHER，M.D.，GINSBERG，M.H.，PLOW，E.F．& RUOSLA HTI，E．血小板膜糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ：Arg-Gly-Asp特異的接着性レ 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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子型糖タンパク質抗原ＧＰＩＩｂ及び／又はＧＰＩＩＩａを被覆した基 質を含む、ヒト血小板抗原１又は３（ＨＰＡ１又はＨＰＡ３）に対する抗体の免 疫学的検出用免疫分析系。 ２．遺伝子型糖タンパク質抗原がＨＰＡ１型１ａ抗体の検出に特異的である請求 項１記載の免疫分析系。 ３．糖タンパク質抗原が、配列Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）を含むペプチドを結合し た親和性基質によるバッチアフィニティークロマトグラフィーによって精製され たものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫分析系。 ４．ペプチドが配列Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys（ＧＲＧＤＳＰＫ）を有する 請求項３記載の免疫分析系。 ５．糖タンパク質が、実質的にＲＧＤ配列を含むペプチドを含まない請求項３又 は４記載の免疫分析系。 ６．糖タンパク質が実質的にＭｇ²⁺及び／又はＭｎ²⁺イオンを含まない請求項１ 〜５のいずれか１項に記載の免疫分析系。 ７．基質が多ウェルマイクロタイタープレートである請求項１〜６のいずれか１ 項に記載の免疫分析系。 ８．下記成分を更に含む、酵素結合免疫分析を行うための請求項７記載の免疫分 析系： −非特異的阻止物質； −酵素標識で標識された抗ヒト免疫グロブリン；及び −前記酵素標識と比色反応を生じることができる基質。 ９．抗ＨＰＡ１ａ抗体を検出するためにＨＰＡ１ａ１ａ／３ｂ３ｂ糖タンパク質 で被覆したウェル；及び抗ＨＰＡ３ａ抗体を検出するためにＨＰＡ１ｂ１ｂ／３ ａ３ａ糖タンパク質で被覆したウェルを含む請求項８記載の免疫分析系。 10．下記工程を含む、ヒト血小板抗原糖タンパク質ＧＰＩＩｂ及び／又はＧＰＩ ＩＩａの精製方法： （ａ）遺伝子型ヒト血小板を供給する工程； （ｂ）その血小板を溶解して溶解物を形成する工程； （ｃ）その溶解物を配列Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）を含むペプチドを結合した アフィニティークロマトグラフィー基質に加える工程；及び （ｄ）遺伝子型糖タンパク質を溶離する工程。 11．親和性基質に結合したペプチドがGly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys（ＧＲＧＤ ＳＰＫ）である請求項10記載の精製方法。 12．糖タンパク質を、配列ＲＧＤを含むペプチドを含有する溶離媒体を用いて溶 離する請求項10又は11記載の精製方法。 13．結合ペプチドを含有する溶離した糖タンパク質を透析して、ペプチドを除去 しかつ結合ペプチドのない糖タンパク質を生成する請求項10〜12記載のいずれか １項に記載の精製方法。 14．下記の工程を含む、血清におけるヒト血小板抗原１又は３（ＨＰＡ１又はＨ ＰＡ３）に対する遺伝子型抗体の試験管内検出のための免疫分析法： −マイクロタイタープレートを遺伝子型糖タンパク質抗原ＧＰＩＩｂ及び／又 はＧＰＩＩＩａで被覆する工程； −非特異的に遮断する工程； −試験されるべき血清と接触させる工程；及び −固定化糖タンパク質抗原と血清中に存在する抗ＨＰＡ１又は抗ＨＰＡ３抗体 との間に形成された免疫複合体の存在を検出する工程。