JPH1135600A - Ｈｔｌｖ−ｉｉを特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
Ｈｔｌｖ−ｉｉを特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマInfo
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- JPH1135600A JPH1135600A JP9212669A JP21266997A JPH1135600A JP H1135600 A JPH1135600 A JP H1135600A JP 9212669 A JP9212669 A JP 9212669A JP 21266997 A JP21266997 A JP 21266997A JP H1135600 A JPH1135600 A JP H1135600A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ。 【効果】 本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体は、天然のＨＴ
ＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができる。そのた
め、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞を直接認識すること及びＨ
ＴＬＶ−ＩＩの精製に用いることができる。本発明のモ
ノクロナール抗体及び精製により得られた抗原は共に測
定試薬に用いることができる。そのため、本発明により
ＨＴＬＶ−ＩＩ感染診断において高感度で信頼性の高い
試薬を提供することができる。
ーナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ。 【効果】 本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体は、天然のＨＴ
ＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができる。そのた
め、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞を直接認識すること及びＨ
ＴＬＶ−ＩＩの精製に用いることができる。本発明のモ
ノクロナール抗体及び精製により得られた抗原は共に測
定試薬に用いることができる。そのため、本発明により
ＨＴＬＶ−ＩＩ感染診断において高感度で信頼性の高い
試薬を提供することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトＴ細胞白血病
ウイルス−ＩＩ型（以下、ＨＴＬＶ−ＩＩと称する）を
特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉは実質的に認識しないこ
とを特徴とするモノクローナル抗体及び該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
ウイルス−ＩＩ型（以下、ＨＴＬＶ−ＩＩと称する）を
特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉは実質的に認識しないこ
とを特徴とするモノクローナル抗体及び該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】毛様細胞性白血病から分離されたウイル
スであるヒトＴ細胞白血病ウイルス−ＩＩ型（以下、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩと称する）に関しては、これまでにいくつ
かの疾患に関与することが示唆されており、最近では慢
性疲労免疫機能障害症候群に関与すること（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，２９２
２−２９２６（１９９１））及びヒトＴ細胞白血病ウイ
ルス−Ｉ型（以下、ＨＴＬＶ−Ｉと称する）様の痙性麻
痺を伴う脊椎症に関与すること（Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．，４０，７１４−７２３（１９９６））が報告され
ている。ＨＴＬＶ−ＩＩはＨＴＬＶ−Ｉと近縁のウイル
スであり、ＨＴＬＶ−Ｉは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴ
Ｌ）、ＨＴＬＶ−Ｉによって引き起こされる痙性麻痺を
伴う脊椎症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）等の疾患に関与すること
が明らかになっている。しかし、現状においてはＨＴＬ
Ｖ−ＩＩ及びＨＴＬＶ−Ｉの関与する疾患に関して、有
効な治療方法が確立されてはいないため、現段階におい
ては感染拡大を防ぐことが最善の策であり、二次感染、
特に輸血感染による感染拡大を如何に防ぐかに多大な努
力が払われている。
スであるヒトＴ細胞白血病ウイルス−ＩＩ型（以下、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩと称する）に関しては、これまでにいくつ
かの疾患に関与することが示唆されており、最近では慢
性疲労免疫機能障害症候群に関与すること（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，２９２
２−２９２６（１９９１））及びヒトＴ細胞白血病ウイ
ルス−Ｉ型（以下、ＨＴＬＶ−Ｉと称する）様の痙性麻
痺を伴う脊椎症に関与すること（Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．，４０，７１４−７２３（１９９６））が報告され
ている。ＨＴＬＶ−ＩＩはＨＴＬＶ−Ｉと近縁のウイル
スであり、ＨＴＬＶ−Ｉは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴ
Ｌ）、ＨＴＬＶ−Ｉによって引き起こされる痙性麻痺を
伴う脊椎症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）等の疾患に関与すること
が明らかになっている。しかし、現状においてはＨＴＬ
Ｖ−ＩＩ及びＨＴＬＶ−Ｉの関与する疾患に関して、有
効な治療方法が確立されてはいないため、現段階におい
ては感染拡大を防ぐことが最善の策であり、二次感染、
特に輸血感染による感染拡大を如何に防ぐかに多大な努
力が払われている。
【０００３】二次感染を防ぐ手段は、感染者を特定する
ことが挙げられ、その方法は、免疫学的な測定方法によ
り被検者が陰性であるか陽性であるかを判断することに
より達成されるものである。より具体的に述べると、検
体中の抗原を測定する場合と検体中の抗体を測定する場
合の２つのパターンを用いることが可能である。例え
ば、抗原を測定する場合には、抗体を用いた測定試薬と
検体中の抗原とを接触させ、その後免疫反応の有無を判
断することにより判定を行い、抗体を測定する場合に
は、前記とは逆に抗原を用いた測定試薬と検体中の抗体
とを接触させ、同様に免疫反応の有無を判断することに
より判定を行うことができる。よって、抗原、抗体のい
ずれも特異的に反応を行えるものであれば測定試薬に用
いることが可能である。
ことが挙げられ、その方法は、免疫学的な測定方法によ
り被検者が陰性であるか陽性であるかを判断することに
より達成されるものである。より具体的に述べると、検
体中の抗原を測定する場合と検体中の抗体を測定する場
合の２つのパターンを用いることが可能である。例え
ば、抗原を測定する場合には、抗体を用いた測定試薬と
検体中の抗原とを接触させ、その後免疫反応の有無を判
断することにより判定を行い、抗体を測定する場合に
は、前記とは逆に抗原を用いた測定試薬と検体中の抗体
とを接触させ、同様に免疫反応の有無を判断することに
より判定を行うことができる。よって、抗原、抗体のい
ずれも特異的に反応を行えるものであれば測定試薬に用
いることが可能である。
【０００４】本発明の課題としているＨＴＬＶ−ＩＩに
関しては前記したようにＨＴＬＶ−Ｉと近縁のウイルス
であり、二者の間に非常に高いホモロジーが存在するこ
とが既に報告されており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，３１０１−３１０５（１
９８５）及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．，８１，６２０７−６２１１（１９８４））、
このホモロジーの高さのためにＨＴＬＶ−ＩＩ抗原は精
製が難しく、その取得が困難であった。さらに、それに
伴いＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体（以下、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と称する。）の取
得も困難であった。
関しては前記したようにＨＴＬＶ−Ｉと近縁のウイルス
であり、二者の間に非常に高いホモロジーが存在するこ
とが既に報告されており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，３１０１−３１０５（１
９８５）及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．，８１，６２０７−６２１１（１９８４））、
このホモロジーの高さのためにＨＴＬＶ−ＩＩ抗原は精
製が難しく、その取得が困難であった。さらに、それに
伴いＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体（以下、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と称する。）の取
得も困難であった。
【０００５】現在、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を用いた試薬は
存在するものの、用いられている抗原は合成ペプチドで
あるか又はリコンビナントであり、いわゆる変性状態の
抗原であるため天然抗原と比べると反応性が低く、これ
は試薬としての感度にも影響を及ぼすものである。
存在するものの、用いられている抗原は合成ペプチドで
あるか又はリコンビナントであり、いわゆる変性状態の
抗原であるため天然抗原と比べると反応性が低く、これ
は試薬としての感度にも影響を及ぼすものである。
【０００６】
【発明が解決する課題】前記のようにＨＴＬＶ−ＩＩと
ＨＴＬＶ−Ｉとの間には高いホモロジーが存在している
ため、これまでのＨＴＬＶ−ＩＩ抗体はＨＴＬＶ−Ｉ抗
原との交差反応性が強く、ＨＴＬＶ−ＩＩを特定するこ
とが困難でその感染の診断も信頼性が高いとはとても言
うことはできないものであった。
ＨＴＬＶ−Ｉとの間には高いホモロジーが存在している
ため、これまでのＨＴＬＶ−ＩＩ抗体はＨＴＬＶ−Ｉ抗
原との交差反応性が強く、ＨＴＬＶ−ＩＩを特定するこ
とが困難でその感染の診断も信頼性が高いとはとても言
うことはできないものであった。
【０００７】そこで、抗原として天然のＨＴＬＶ−ＩＩ
を特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉを認識しないことを特
徴とするＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を得ることができれば、直
接、感染細胞を検出することができるため、より正確な
診断を行うことができる試薬を提供することができ、本
発明者らはそのような感度の高い試薬を提供することを
課題としたものである。
を特異的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉを認識しないことを特
徴とするＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を得ることができれば、直
接、感染細胞を検出することができるため、より正確な
診断を行うことができる試薬を提供することができ、本
発明者らはそのような感度の高い試薬を提供することを
課題としたものである。
【０００８】また、抗原に関しては、既存の試薬につい
てその試薬に用いる抗原を遺伝子組み換え技術により得
ているが、多量の抗原を効率良く得るためにはコストの
面から大腸菌を用いる系が多用されている。そのため、
天然抗原と比べると、「糖が結合していない。」、「不
溶性である。」等の性質があり、取扱いが困難であっ
た。そこで、取扱いが容易で、さらに高い抗原性を持つ
抗原（例えば天然抗原等）を使用した測定試薬の提供が
強く望まれていた。
てその試薬に用いる抗原を遺伝子組み換え技術により得
ているが、多量の抗原を効率良く得るためにはコストの
面から大腸菌を用いる系が多用されている。そのため、
天然抗原と比べると、「糖が結合していない。」、「不
溶性である。」等の性質があり、取扱いが困難であっ
た。そこで、取扱いが容易で、さらに高い抗原性を持つ
抗原（例えば天然抗原等）を使用した測定試薬の提供が
強く望まれていた。
【０００９】しかし、一般的に用いられているレクチン
カラムを利用する精製方法では、レクチンカラムが糖鎖
による特異性に依存し、抗原特異的ではないことに由来
して天然のＨＴＬＶ−ＩＩを分離することは困難であっ
た。
カラムを利用する精製方法では、レクチンカラムが糖鎖
による特異性に依存し、抗原特異的ではないことに由来
して天然のＨＴＬＶ−ＩＩを分離することは困難であっ
た。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意検
討した結果、天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識し、
ＨＴＬＶ−Ｉは実質的に認識しないモノクローナル抗体
（以下、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と称する。）を見
出し、本発明を完成するに至った。
討した結果、天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識し、
ＨＴＬＶ−Ｉは実質的に認識しないモノクローナル抗体
（以下、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体と称する。）を見
出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体は、天然のＨ
ＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができ、ＨＴＬＶ
−Ｉは実質的に認識しない抗体である。よって、例えば
該抗体を免疫測定試薬に用いれば、検体中のＨＴＬＶ−
ＩＩ抗原と該抗体とが免疫反応を行い、これを定量する
ことにより被検者がＨＴＬＶ−ＩＩに感染しているか否
かを正確に判定することができるものである。
ＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができ、ＨＴＬＶ
−Ｉは実質的に認識しない抗体である。よって、例えば
該抗体を免疫測定試薬に用いれば、検体中のＨＴＬＶ−
ＩＩ抗原と該抗体とが免疫反応を行い、これを定量する
ことにより被検者がＨＴＬＶ−ＩＩに感染しているか否
かを正確に判定することができるものである。
【００１２】さらに、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体は天
然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができるの
で、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞を直接測定することも可能
である。
然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異的に認識することができるの
で、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞を直接測定することも可能
である。
【００１３】また、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体が天然
の抗原を特異的に認識することを利用し、本発明のＨＴ
ＬＶ−ＩＩ抗体をアフィニティークロマトグラフィー等
の精製手段に用いれば、ＨＴＬＶ−ＩＩ天然抗原を単離
することが可能となる。よって、ＨＴＬＶ−ＩＩ持続感
染株の培養によって得られた蛋白質は、種々細胞由来の
非特異抗原を含むことが多いが、そこからでもＨＴＬＶ
−ＩＩを単離することができ、技術的、設備的にも高度
な技術を用いることなく、安価で、容易に、精製された
ＨＴＬＶ−ＩＩが取得可能である。
の抗原を特異的に認識することを利用し、本発明のＨＴ
ＬＶ−ＩＩ抗体をアフィニティークロマトグラフィー等
の精製手段に用いれば、ＨＴＬＶ−ＩＩ天然抗原を単離
することが可能となる。よって、ＨＴＬＶ−ＩＩ持続感
染株の培養によって得られた蛋白質は、種々細胞由来の
非特異抗原を含むことが多いが、そこからでもＨＴＬＶ
−ＩＩを単離することができ、技術的、設備的にも高度
な技術を用いることなく、安価で、容易に、精製された
ＨＴＬＶ−ＩＩが取得可能である。
【００１４】該精製方法により得られた天然のＨＴＬＶ
−ＩＩを測定試薬に用いれば、抗原性が高いため高感度
にＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の検出を行うことができる。よっ
て、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を使用して得られた天
然のＨＴＬＶ−ＩＩを抗原として用いることで、従来よ
りも信頼性の高い試薬を提供することが可能となる。
−ＩＩを測定試薬に用いれば、抗原性が高いため高感度
にＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の検出を行うことができる。よっ
て、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を使用して得られた天
然のＨＴＬＶ−ＩＩを抗原として用いることで、従来よ
りも信頼性の高い試薬を提供することが可能となる。
【００１５】本発明のモノクローナル抗体はＨＴＬＶ−
ＩＩ由来のペプチドを免疫原として常法に従って免疫す
ることにより得ることができるものである。免疫原とし
ては、ＨＴＬＶ−ＩＩを産生するウイルス株から得られ
たＨＴＬＶ−ＩＩを精製した膜蛋白質の膜貫通部分又は
ＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質の膜貫通部分由来のペプチド
を用いることができる。
ＩＩ由来のペプチドを免疫原として常法に従って免疫す
ることにより得ることができるものである。免疫原とし
ては、ＨＴＬＶ−ＩＩを産生するウイルス株から得られ
たＨＴＬＶ−ＩＩを精製した膜蛋白質の膜貫通部分又は
ＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質の膜貫通部分由来のペプチド
を用いることができる。
【００１６】上記のように作製した抗原を、免疫動物に
免疫する。このとき抗原は単独又はアジュバンドと共に
免疫動物に投与することができる。免疫後は、抗体価の
上昇を確認して血清を採取するが、必要に応じて追加免
疫を行うとよい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等の
抗体産生細胞と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞とを、融
合剤を用いて融合し、ハイブリドーマを作製することが
できる。免疫動物としてはウサギ、モルモット、マウ
ス、ラット等を用いることができ、アジュバンドとして
は完全フロインドアジュバンド、不完全フロインドアジ
ュバンド、ミョウバン、百日ぜき死菌体等を用いること
ができる。また、融合剤としてはポリエチレングリコー
ル、センダイウイルス等を用いることができる。
免疫する。このとき抗原は単独又はアジュバンドと共に
免疫動物に投与することができる。免疫後は、抗体価の
上昇を確認して血清を採取するが、必要に応じて追加免
疫を行うとよい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等の
抗体産生細胞と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞とを、融
合剤を用いて融合し、ハイブリドーマを作製することが
できる。免疫動物としてはウサギ、モルモット、マウ
ス、ラット等を用いることができ、アジュバンドとして
は完全フロインドアジュバンド、不完全フロインドアジ
ュバンド、ミョウバン、百日ぜき死菌体等を用いること
ができる。また、融合剤としてはポリエチレングリコー
ル、センダイウイルス等を用いることができる。
【００１７】次いで、ハイブリドーマをＨＡＴ培地等の
選択培地を用いて選択し、適当なクローニング方法で、
モノクローナル化して培養を行い、この培養上清を酵素
免疫測定法等の適当な免疫測定法で分析することによっ
て、目的とする抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を産生しているク
ローンを選択するものである。本発明のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを作製する手法は公知の
方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン (Nature 256
495 1975)、シェーラー (Nature 285 446 1980)等の方
法、により行うことができる。クローニング方法として
は限界希釈法、軟寒天法、フィブリノーゲンゲル法、Ｆ
ＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いる方法等を挙げる
ことができる。
選択培地を用いて選択し、適当なクローニング方法で、
モノクローナル化して培養を行い、この培養上清を酵素
免疫測定法等の適当な免疫測定法で分析することによっ
て、目的とする抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を産生しているク
ローンを選択するものである。本発明のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを作製する手法は公知の
方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン (Nature 256
495 1975)、シェーラー (Nature 285 446 1980)等の方
法、により行うことができる。クローニング方法として
は限界希釈法、軟寒天法、フィブリノーゲンゲル法、Ｆ
ＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いる方法等を挙げる
ことができる。
【００１８】前記のように得られたハイブリドーマから
モノクローナル抗体を産生することができるが、例え
ば、マウスに本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を産生するハ
イブリドーマを投与して得られた腹水から目的のモノク
ローナル抗体を分離・精製することによって、本発明の
ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を取得することができる。このと
き、用いるマウスによってはプリスタンをあらかじめ投
与しておくことが好ましい。また、分離精製の手段とし
ては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルロ過
クロマトグラフィ−等を用いることができる。
モノクローナル抗体を産生することができるが、例え
ば、マウスに本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を産生するハ
イブリドーマを投与して得られた腹水から目的のモノク
ローナル抗体を分離・精製することによって、本発明の
ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を取得することができる。このと
き、用いるマウスによってはプリスタンをあらかじめ投
与しておくことが好ましい。また、分離精製の手段とし
ては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルロ過
クロマトグラフィ−等を用いることができる。
【００１９】また、別の取得方法としては、例えば、前
記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養
した培養上清から分離・精製を行うことによって本発明
のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を取得することができる。分離・
精製の手段は前記と同様の手法により行うことができ
る。このように得られた本発明のモノクローナル抗体
は、前記した通りＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質の膜貫通部
分を免疫原とするため、膜貫通部分の蛋白質に由来する
ペプチドを含むものであれば、天然抗原に限らずリコン
ビナント抗原又は合成抗原であっても認識することがで
きるものである
記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養
した培養上清から分離・精製を行うことによって本発明
のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を取得することができる。分離・
精製の手段は前記と同様の手法により行うことができ
る。このように得られた本発明のモノクローナル抗体
は、前記した通りＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質の膜貫通部
分を免疫原とするため、膜貫通部分の蛋白質に由来する
ペプチドを含むものであれば、天然抗原に限らずリコン
ビナント抗原又は合成抗原であっても認識することがで
きるものである
【００２０】このように得られた本発明のＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ抗体又は該抗体により精製されたＨＴＬＶ−ＩＩ抗原
はＨＴＬＶ−ＩＩの感染診断のための測定試薬に用いる
ことができる。このときに行うことができる測定方法
は、試薬に用いたＨＴＬＶ−ＩＩ抗原又はＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ抗体と検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体又はＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ抗原とが免疫反応を行う測定方法であれば、公知であ
るどのような免疫測定方法でもよい。免疫測定方法とし
ては、例えば、凝集法、比濁法、サンドイッチ法、競合
法等を用いることができ、またこれらの免疫測定法にお
いて標識物を使用する場合にはその標識として酵素、蛍
光物質、発光物質、放射性物質等を用いることができる
が、これらに限定されるものではない。
Ｉ抗体又は該抗体により精製されたＨＴＬＶ−ＩＩ抗原
はＨＴＬＶ−ＩＩの感染診断のための測定試薬に用いる
ことができる。このときに行うことができる測定方法
は、試薬に用いたＨＴＬＶ−ＩＩ抗原又はＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ抗体と検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体又はＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ抗原とが免疫反応を行う測定方法であれば、公知であ
るどのような免疫測定方法でもよい。免疫測定方法とし
ては、例えば、凝集法、比濁法、サンドイッチ法、競合
法等を用いることができ、またこれらの免疫測定法にお
いて標識物を使用する場合にはその標識として酵素、蛍
光物質、発光物質、放射性物質等を用いることができる
が、これらに限定されるものではない。
【００２１】例えば、凝集法である間接凝集免疫測定法
を用いて検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を測定する場合
は、本発明により得られたＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を用いて
ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を取得し、得られた該抗原を適当な
不溶性担体に固定化する。これを検体中のＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ抗体と反応させ、凝集反応の有無によって検体中のＨ
ＴＬＶ−ＩＩ抗体が存在するか否かを判定する。不溶性
担体としては、赤血球、ラテックス、ビーズ、磁性粒子
等を用いることができる。
を用いて検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を測定する場合
は、本発明により得られたＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を用いて
ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を取得し、得られた該抗原を適当な
不溶性担体に固定化する。これを検体中のＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ抗体と反応させ、凝集反応の有無によって検体中のＨ
ＴＬＶ−ＩＩ抗体が存在するか否かを判定する。不溶性
担体としては、赤血球、ラテックス、ビーズ、磁性粒子
等を用いることができる。
【００２２】また、抗原又は抗体を不溶性担体に結合さ
せる方法としては、物理吸着法又は化学結合法を採用す
ることができる。物理吸着法は、適当な緩衝液中で前記
担体と抗原又は抗体とを反応させることにより行うもの
である。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸
緩衝液、炭酸緩衝液等を使用することができ、反応は両
者を混合させることにより容易に進行し、目的とする固
定化抗原又は抗体を得ることができる。また、化学結合
法は、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、
マレイミド法、ピリジル・スルフィド法、公知の各種架
橋剤を用いる方法等により行うものである（例えば、
「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８
７）参照）。この方法ではモノクローナル抗体に存在す
る官能基を利用することができるほか、抗体にチオール
基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を導
入した後、前記と同様の反応により抗体を不溶性担体に
固定化することも可能である。
せる方法としては、物理吸着法又は化学結合法を採用す
ることができる。物理吸着法は、適当な緩衝液中で前記
担体と抗原又は抗体とを反応させることにより行うもの
である。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸
緩衝液、炭酸緩衝液等を使用することができ、反応は両
者を混合させることにより容易に進行し、目的とする固
定化抗原又は抗体を得ることができる。また、化学結合
法は、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、
マレイミド法、ピリジル・スルフィド法、公知の各種架
橋剤を用いる方法等により行うものである（例えば、
「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８
７）参照）。この方法ではモノクローナル抗体に存在す
る官能基を利用することができるほか、抗体にチオール
基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を導
入した後、前記と同様の反応により抗体を不溶性担体に
固定化することも可能である。
【００２３】また、凝集反応の有無は、例えば、反応容
器内で検体中の抗体と固定化された抗原とを反応させ、
その容器底部への粒子の凝集パターンの違いにより判断
することができ、このとき、凝集反応が起こった場合に
は検体をＨＴＬＶ−ＩＩ陽性と判定し、起こらなかった
場合には陰性と判定するものである。
器内で検体中の抗体と固定化された抗原とを反応させ、
その容器底部への粒子の凝集パターンの違いにより判断
することができ、このとき、凝集反応が起こった場合に
は検体をＨＴＬＶ−ＩＩ陽性と判定し、起こらなかった
場合には陰性と判定するものである。
【００２４】
【実施例】以下、実施例及び参考例により本発明をより
詳細に説明する。
詳細に説明する。
【００２５】（参考例１） ｐＷＴＩＩＥ２０の作成及び発現 ＨＴＬＶ−ＩＩ持続感染株（Ｃ３−４４）から膜蛋白質
に相当する遺伝子（ｇｐ２１Ｅ）とＴＲＸ遺伝子との融
合遺伝子を宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地３７℃の条件
下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養にて波長
６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭ
ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。３時間培養後、遠
心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０ １％トライトンＸ１０
０ ０．５Ｍ塩化ナトリウム １０％ショ糖 ５％グリ
セロールを４００ｍｌ加え、氷冷下で１回目の超音波破
砕処理を行った。発現した融合蛋白質は、遠心後不溶性
成分（インクルージョンボディ）として沈殿物として回
収された。得られた不溶性成分に３Ｍ尿素 １０ｍＭジ
チオスレイトール ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
８．０ １％トライトンＸ１００ ０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム １０％ショ糖 ５％グリセロールを４００ｍｌ加
え、氷冷下で２回目の超音波破砕処理を行った。遠心後
２回目超音波処理沈殿物に２００ｍｌの５Ｍ塩酸グア
ニジン ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０ １０
ｍＭジチオスレイトールを加え、可溶化を行った。可溶
化物は、２０％アセトニトリル ２０ｍＭ水酸化ナトリ
ウムで平衡化したリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマ
シア社製）にて精製を行った。アセトニトリルで溶出し
たところ、約３５％〜４５％アセトニトリル溶出画分に
精製ＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩ ２０Ｅを回収した。回
収物は、３Ｍ尿素５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．
０に透析を行って、目的の抗原を取得し、免疫原とし
た。その反応性はＢＢＩ社由来のＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血
清パネルで確認した。
に相当する遺伝子（ｇｐ２１Ｅ）とＴＲＸ遺伝子との融
合遺伝子を宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地３７℃の条件
下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養にて波長
６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭ
ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。３時間培養後、遠
心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０ １％トライトンＸ１０
０ ０．５Ｍ塩化ナトリウム １０％ショ糖 ５％グリ
セロールを４００ｍｌ加え、氷冷下で１回目の超音波破
砕処理を行った。発現した融合蛋白質は、遠心後不溶性
成分（インクルージョンボディ）として沈殿物として回
収された。得られた不溶性成分に３Ｍ尿素 １０ｍＭジ
チオスレイトール ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
８．０ １％トライトンＸ１００ ０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム １０％ショ糖 ５％グリセロールを４００ｍｌ加
え、氷冷下で２回目の超音波破砕処理を行った。遠心後
２回目超音波処理沈殿物に２００ｍｌの５Ｍ塩酸グア
ニジン ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０ １０
ｍＭジチオスレイトールを加え、可溶化を行った。可溶
化物は、２０％アセトニトリル ２０ｍＭ水酸化ナトリ
ウムで平衡化したリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマ
シア社製）にて精製を行った。アセトニトリルで溶出し
たところ、約３５％〜４５％アセトニトリル溶出画分に
精製ＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩ ２０Ｅを回収した。回
収物は、３Ｍ尿素５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．
０に透析を行って、目的の抗原を取得し、免疫原とし
た。その反応性はＢＢＩ社由来のＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血
清パネルで確認した。
【００２６】（実施例１）ＴＲＸ−ｐ２１Ｅ（１００μ
ｇ／ｍＬ）をＢＡＬＢ／ｃマウスにβグルカンパウダー
（ＯＰＴＩＶＡＮＴ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ社製）と共に接種し、その脾臓細胞をミエロー
マ細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合させ、用いた抗原との反応性
及びＨＴＬＶ−ＩＩ持続感染株（Ｃ３−４４）破砕物の
反応性を指標に抗体産生株をスクリーニングし、ハイブ
リドーマ ｇｐ２１−３４を得た。該ハイブリドーマか
ら得られたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル
抗体ｇｐ２１−３４と称する）のサブクラスはＩｇＧ１
であった。本実施例により得られたハイブリドーマ ｇ
ｐ２１−３４は生命工学工業技術研究所に寄託され、そ
の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６０４７である。
ｇ／ｍＬ）をＢＡＬＢ／ｃマウスにβグルカンパウダー
（ＯＰＴＩＶＡＮＴ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ社製）と共に接種し、その脾臓細胞をミエロー
マ細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合させ、用いた抗原との反応性
及びＨＴＬＶ−ＩＩ持続感染株（Ｃ３−４４）破砕物の
反応性を指標に抗体産生株をスクリーニングし、ハイブ
リドーマ ｇｐ２１−３４を得た。該ハイブリドーマか
ら得られたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル
抗体ｇｐ２１−３４と称する）のサブクラスはＩｇＧ１
であった。本実施例により得られたハイブリドーマ ｇ
ｐ２１−３４は生命工学工業技術研究所に寄託され、そ
の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６０４７である。
【００２７】（実施例２）ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞とし
てＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４を、更にＨＴＬＶ−Ｉ感
染細胞としてＭＴ−２及びＴＣＬ−Ｋａｎを、対照ウィ
ルス非感染Ｔ細胞としてＭＯＬＴ−４を用いて間接免疫
蛍光抗体法によりモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４
の特異性を確認した。各細胞を免疫蛍光抗体法用のスラ
イドガラスに塗布し、メタノールで固定後、モノクロー
ナル抗体 ｇｐ２１−３４（×１０００倍希釈液）と反
応させた。洗浄後、フルオレッセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ、再
び洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。モノクローナル抗
体 ｇｐ２１−３４はＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４と反
応し、ＴＣＬ−Ｋａｎ、ＭＴ−２及びＭＯＬＴ−４とは
反応しなかった。この結果を図１に示す。よって、モノ
クローナル抗体 ｇｐ２１−３４はＨＴＬＶ−ＩＩ抗原
と特異的であることが確認された。
てＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４を、更にＨＴＬＶ−Ｉ感
染細胞としてＭＴ−２及びＴＣＬ−Ｋａｎを、対照ウィ
ルス非感染Ｔ細胞としてＭＯＬＴ−４を用いて間接免疫
蛍光抗体法によりモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４
の特異性を確認した。各細胞を免疫蛍光抗体法用のスラ
イドガラスに塗布し、メタノールで固定後、モノクロー
ナル抗体 ｇｐ２１−３４（×１０００倍希釈液）と反
応させた。洗浄後、フルオレッセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ、再
び洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。モノクローナル抗
体 ｇｐ２１−３４はＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４と反
応し、ＴＣＬ−Ｋａｎ、ＭＴ−２及びＭＯＬＴ−４とは
反応しなかった。この結果を図１に示す。よって、モノ
クローナル抗体 ｇｐ２１−３４はＨＴＬＶ−ＩＩ抗原
と特異的であることが確認された。
【００２８】（実施例３）ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞とし
てＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４並びにＨＴＬＶ−Ｉ感染
細胞としてＭＴ−２及びＴＣＬ−Ｋａｎの各細胞から、
０．１％−ＮＰ４０及び１ｍＭジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）を含むトリスＮａＣｌ ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）緩衝
液で抽出した細胞抽出液を用いて、ウェスタンブロット
法によりモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４の特異性
を確認した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動はゲル
濃度１２．５％で常法に従って実施した。泳動後ニトロ
セルロース膜に転写し、モノクローナル抗体 ｇｐ２１
−３４（×１０００倍希釈）と反応させ、洗浄後、アル
カリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ
た。再び洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質と反
応させた。モノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４はＳｉ
−ＩＩＡ及びＣ３−４４とのみ反応し、２０Ｋｄバンド
として確認された。この結果を図２に示す。本実施例の
結果より、モノクロ−ナル抗体 ｇｐ２１−３４はＨＴ
ＬＶ−ＩＩエンベロ−プ蛋白質の膜蛋白質部分を特異的
に認識していることが確認された。
てＳｉ−ＩＩＡ及びＣ３−４４並びにＨＴＬＶ−Ｉ感染
細胞としてＭＴ−２及びＴＣＬ−Ｋａｎの各細胞から、
０．１％−ＮＰ４０及び１ｍＭジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）を含むトリスＮａＣｌ ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）緩衝
液で抽出した細胞抽出液を用いて、ウェスタンブロット
法によりモノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４の特異性
を確認した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動はゲル
濃度１２．５％で常法に従って実施した。泳動後ニトロ
セルロース膜に転写し、モノクローナル抗体 ｇｐ２１
−３４（×１０００倍希釈）と反応させ、洗浄後、アル
カリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ
た。再び洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質と反
応させた。モノクローナル抗体 ｇｐ２１−３４はＳｉ
−ＩＩＡ及びＣ３−４４とのみ反応し、２０Ｋｄバンド
として確認された。この結果を図２に示す。本実施例の
結果より、モノクロ−ナル抗体 ｇｐ２１−３４はＨＴ
ＬＶ−ＩＩエンベロ−プ蛋白質の膜蛋白質部分を特異的
に認識していることが確認された。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を特
異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを提供することができ
る。本発明のモノクローナル抗体は、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗
原の測定試薬に用いることができ、さらに、ＨＴＬＶ−
ＩＩ天然抗原の精製に用いることができる。精製された
ＨＴＬＶ−ＩＩ天然抗原を、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の測定
試薬に用いれば、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染の診断において高
感度で信頼性の高い試薬を提供することができる。
異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを提供することができ
る。本発明のモノクローナル抗体は、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗
原の測定試薬に用いることができ、さらに、ＨＴＬＶ−
ＩＩ天然抗原の精製に用いることができる。精製された
ＨＴＬＶ−ＩＩ天然抗原を、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の測定
試薬に用いれば、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染の診断において高
感度で信頼性の高い試薬を提供することができる。
【図１】 間接蛍光抗体法によるモノクローナル抗体
ｇｐ２１−３４の反応特異性を示す図である。
ｇｐ２１−３４の反応特異性を示す図である。
【図２】 ウェスタンブロット法によるモノクローナル
抗体 ｇｐ２１−３４の反応特異性を示す図である。
抗体 ｇｐ２１−３４の反応特異性を示す図である。
【図３】 発現ベクター ｐＷＴＩＩＥ２０の制限酵素
切断地図である。
切断地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 上野 英一 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内 (72)発明者 本多 秀夫 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内 (72)発明者 伊藤 哲 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内
Claims (5)
- 【請求項１】 抗原として天然のＨＴＬＶ−ＩＩを特異
的に認識し、ＨＴＬＶ−Ｉを実質的に認識しないことを
特徴とするモノクローナル抗体 - 【請求項２】 免疫原がＨＴＬＶ−ＩＩの膜蛋白質の膜
貫通部分由来のペプチドである請求項１に記載のモノク
ローナル抗体 - 【請求項３】 モノクローナル抗体がモノクローナル抗
体 ｇｐ２１−３４である請求項１乃至２のいずれかに
記載のモノクローナル抗体 - 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれかに記載のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ - 【請求項５】 ハイブリドーマがハイブリドーマ ｇｐ
２１−３４である請求項４に記載のハイブリドーマ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21266997A JP3610736B2 (ja) | 1997-07-24 | 1997-07-24 | Ｈｔｌｖ−ｉｉを特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21266997A JP3610736B2 (ja) | 1997-07-24 | 1997-07-24 | Ｈｔｌｖ−ｉｉを特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1135600A true JPH1135600A (ja) | 1999-02-09 |
| JP3610736B2 JP3610736B2 (ja) | 2005-01-19 |
Family
ID=16626445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21266997A Expired - Fee Related JP3610736B2 (ja) | 1997-07-24 | 1997-07-24 | Ｈｔｌｖ−ｉｉを特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3610736B2 (ja) |
-
1997
- 1997-07-24 JP JP21266997A patent/JP3610736B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3610736B2 (ja) | 2005-01-19 |
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