JPH08503848A - 細胞分化のシンデカン刺激 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞内のシンデカンのレベルを変えるための方法が提供される。前記方法は成長因子の投与によるシンデカン発現を促進すること、抗ステロイド剤の投与によるシンデカン発現の抑制を妨げることおよび細胞内のシンデカンの生化学を変えることを含む。前記方法は細胞分化の誘導または維持および悪性細胞の増殖を減少させるために用いられる。ヒトを含む患者を処置する方法の適用が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞分化のシンデカン刺激 発明の分野 本発明は、癌の生物学および治療法の分野のものである。とくに、本発明はシ ンデカン（syndecan）の発現を変えることにより細胞の分化状態を変える方法で ある。本発明の方法は、悪性細胞の増殖速度および分化状態の正常化を可能にし 、前記方法は悪性癌細胞におけるシンデカン発現の刺激（stimulation）にもと づく。そのような悪性細胞におけるシンデカンの再発現はそれらを正常に分化し た表現型（phenotype）となるよう促進し、それらの腫瘍形成を妨げる。この方 法は正常な細胞に適用してそれらの分化を増進させてもよく、したがって、たと えば禿頭症を予防するためのケラチン産生のように細胞の維持をサポートする。

発明の背景 細胞の挙動の制御において細胞表面のプロテオグリカン類（proteoglycans） が重要な役割を果たすことがさらに明らかになってきている（ルオスラティ（Ru oslahti）ら、セル（Cell）、第６４巻、８６７〜８６９頁、１９９１年）。グ リコサミノグリカン側鎖との共有結合を通して、そのようなプロテオグリカン類 は種々の細胞外エフェクター分子と結合しうる（ジャルカネン（Jalkanen）ら、 イン レセプターズ フォー エクストラセルラー マトリックス（in Recepto rs for Extracellular Matrix）、ジェイ マクドナルド アンド アールメクハム（J.MacDonald & R .Mecham）、エディターズ（Editors）、アカデミック プレス（Academic Press ）、サンディエゴ（San Diego）、１〜３７頁、１９９１年）。

プロテオグリカンの生物学における主要な挑戦の１つには、細胞表面のプロテ オグリカン類を介して異なるエフェクター分子に結合することにより、細胞がど のような命令を受けるかということを理解することが必要とされる。そのような 結合によりどのような細胞内反応が活性化され、それにより細胞の変化した挙動 が導かれるのかということを研究することはさらに必要なことである。これらの 問題に取りかかるための方法は、与えられたあらゆるプロテオグリカン類の発現 に依存している生物学的モデルを創作することである。

シンデカンは最も特徴付けられた細胞表面のプロテオグリカンである（サンダ ース（Saunders）ら、ジェイ・セル・バイオル（J.Cell Biol.）、第１０８巻、 １５４７〜１５５６頁、１９８９年、マリ（Mali）ら、ジェイ・バイオル・ケム （J.Biol.Chem）、第２６５巻、６８８４〜６８８９頁、１９９０年）。シンデ カンは元来マウス乳房上皮（ＮＭｕＭＧ）細胞よりヘパリン硫酸とコンドロイチ ン硫酸のグリコサミノグリカン側鎖の両者を含有するハイブリッド（hybrid）プ ロテオグリカンとして単離された（ラプレージャー（Rapraeger）ら、ジェイ・ バイオル・ケム、第２６０巻、１１０４６〜１１０５２頁、１９８５年）。最近 の研究ではシンデカンは、上皮細胞のみならず発育中の歯において分化している 線 維芽細胞（テスレフ（Thesleff）ら、デブ・バイオル（Dev.Biol.）、第１２９ 巻、５６５〜５７２頁、１９８８年、バイニオ（Vainio）ら、ジェイ・セル・バ イオル、第１０８巻、１９４５〜１９６４頁、１９８９年）、伸び始めている毛 細血管（sprouting）の内皮細胞（エレニウス（Elenius）ら、ジェイ・セル・バ イオル、第１１４巻、５８５〜５９６頁、１９９１年）および異なる細胞の表面 において機能を変化させることができることが暗示されている、リンパ球のサブ ポピュレーションの表面（サンダーソン（Sanderson）ら、セル・レグル（Cell Regul）、第１巻、２７〜３５頁、１９８９年）においても発現することが明ら かになっている。シンデカンは構造が保たれている（conserved）原形質膜およ び細胞質領域のプロテオグリカン群に属し、類似していないエクトドメイン（di ssimilar ectodomains）に属するものではない（マリ（Mali）ら、ジェイ・バイ オル・ケム、第２６５巻、６８８４〜６８８９頁、１９９０年）。シンデカンの 保たれた構造は、原形質膜を介するシグナル伝達に関係することができるであろ うことを示唆している。

シンデカンは数種の細胞外エフェクター分子と結合するが、この結合は選択的 である。たとえば、シンデカンは間質のコラーゲンおよびフィブロネクチンと結 合するが、ビトロネクチンまたはラミニンとは結合しない（コダ（Koda）ら、ジ ェイ・バイオル・ケム、第２６０巻、８１５６〜８１６２頁、１９８５年、サン ダースら、ジェイ・セル・バイオル、第１０６巻、４２３〜４３０頁、１９８８ 年、エレニウス（Elenius）ら、ジェイ・ バイオル・ケム、第２６５巻、１７８３７〜１７８４３頁、１９９０年）。さら に歯の間充織から単離されたシンデカンはテネイシンとの選択的な結合を示すが 、ＮＭｕＭＧ細胞由来のシンデカンは示さなかった（サルミバータ（Salmivirta ）ら、ジェイ・バイオル・ケム、第２６６巻、７７３３〜７７３９頁、１９９１ 年）。これは、シンデカンに選択的結合特性をもたらすシンデカンのグリコシル 化の変化を示唆している。シンデカンのグリコシル化の多型現象もまた、単層上 皮と重層上皮の間で認められる（サンダーソン（Sanderson）ら、プロク・ナト ル・アカド・サイ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第８５巻、９５ ６２〜９５６６頁、１９８８年）。しかしながら、これらの変化がシンデカンの 変化したリガンドの認識をも反映しているかどうかについては未知のままである 。シンデカンは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような成長因子にも結 合する（キーファー（Kiefer）ら、プロク・ナトル・アカド・サイ・ユーエスエ イ、第８７巻、６９８５〜６９８９頁、１９９０年、エレニウスら、ジェイ・バ イオル・ケム、第２６７巻、６４３５〜６４４１頁、１９９２年）。つい最近、 ヤヨン（Yayon）と共同研究者（ヤヨンら、セル（Cell）、第６４巻、８４１〜 ８４８頁、１９９１年）およびラプレージャーと共同研究者（ラプレジャーら、 サイエンス（Science）、第２５２巻、１７０５〜１７０８頁、１９９１年）は ｂＦＧＦの高親和性レセプターへの結合にはヘパリン様分子が必要であることを 示した。このことは、シンデカン様分子も成長因子の反応を調節しうることを示 す。細胞表面のプロテオグ リカンが成長因子およびマトリックスの構成成分の両者に結合できるという事実 は、細胞−マトリックスの相互作用の前後（the vicinity of cell-matrix inte ractions）にこれらエフェクター分子を固定化することによる成長促進を、時間 的（発現のタイミング）および空間的（正確な局在化（localization））な両面 において調節する役割があることを理論的に意味することができるであろう。こ のことは、組織学的パターンよりはむしろ、形態学的パターンの発達におけるシ ンデカン発現の際の興味あるパターンによって支持されており（テスレフら、デ ブ・バイオル、第１２９巻、５６５〜５７２頁、１９８８年、バイニオら、ジェ イ・セル・バイオル、第１０８巻、１９４５〜１９５４頁、１９８９年、バイニ オら、デブ・バイオル、第１３４巻、３８２〜３９１頁、１９８９年）、さらに は、そのシンデカンの発現は活性増殖部位に局在化している（エレニウスら、ジ ェイ・セル バイオル、第１１４巻、５８５〜５９６頁、１９９１年、バイニオ ら、デブ・バイオル、第１４７巻、３２２〜３３３頁、１９９１年）。

単層上皮において、シンデカンはアクチンが豊富なサイトフィラメント（cyto filaments）とともに、基底外側表面（baso-lateral surfaces）へ分れて極在化 （polarized）する（ラプレージャーら、ジェイ・セル・バイオル、第１０３巻 、３６８３〜２６９６頁、１９８６年）。周辺においては、シンデカンは細胞表 面でコア蛋白質の蛋白分解性の開裂により細胞表面より落ち、その過程により膜 領域からマトリックス結合エクトドメイン（ectodomain）が分離される（ジャル カネン（Jalkane n）ら、ジェイ・セル・バイオル、第１０５巻、３０８７〜３０９６頁、１９８ ７年）。このように、シンデカンは上皮形態の維持に必要であることが提言され ている。マウス乳房腫瘍細胞（Ｓ１１５）は、それらの形態を上皮型からより線 維芽細胞型または紡錘状型へ変える（modulate）ようなステロイド誘導が行なわ れたばあい、シンデカンの発現を欠失し（レッパ（Leppa）ら、セル・レギュル 、第２巻、１〜１１頁、１９９１年）、数種の他の細胞に関しては、それらが形 質転換するばあいに（ルンキら、アム・ジェイ・パソル（Am.J.Pathol.）、第１ ３９巻、１３３３〜１３４０頁、１９９１年、ルンキら、ラブ・インベスト（La b.Invest.）、第６６巻、３１４〜３２３頁、１９９２年）、悪性の形質転換の あいだのシンデカンの発現が全般的に喪失することが示唆されている。

発明の開示 ゆえに、本発明の目的は宿主細胞におけるシンデカン発現を変えることにより 宿主細胞の分化状態を変える方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、とくに形質転換の由来にかかわらず悪性表現型を示 す細胞においてシンデカン発現を誘導および調節する方法を提供することである 。

本発明のさらなる目的は、腫瘍の増殖を軽減させるための処置が必要な患者に 、前記患者の腫瘍細胞におけるシンデカン合成を刺激する、１またはそれより多 くの薬物からなる有効量の組成物を投与することによる腫瘍の増殖を軽減させる ための処置法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、シンデカン遺伝子のＤＮＡ配列と、プロモーター、 サプレッサーおよびエンハンサーエレメント（element）の位置（localization ）を提供することである。

本発明のさらなる目的は、シンデカン遺伝子の転写を促進することによる、宿 主細胞におけるシンデカン発現の促進のための方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、シンデカン遺伝子の転写の抑制を妨げることによる 、悪性細胞におけるシンデカン発現の促進のための方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、悪性細胞におけるシンデカン遺伝子発現のサプレッ サーを不活性化するための生化学的方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、悪性細胞および正常細胞におけるシンデカンの発現 を促進することにより細胞分化を刺激する方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、シンデカンの発現を促進することにより細胞の増殖 および分化、とくには創傷の治癒のような過程における組織の再生を刺激する方 法を提供することである。

本発明のさらなる特徴、目的および利点は添付した図面とともに以下の主な発 明の説明を考慮することにより、より充分に明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１ 図１はマウスのシンデカン遺伝子およびそのプロモーター領域のアセン ブリー図（diagram of the assembly）である。

図２ 図２はマウスのシンデカン遺伝子の完全な配列（配列番号：１：（ＤＮ Ａ）および：２：（タンパク質））およびその近接したプロモーターの完全な配 列である。シンデカンの発現のための調節部位は１番目のエクソンに続く１番目 のイントロンに存在してもよい（図１参照）。

図３ 図３はマウスのシンデカンのプロモーター領域および３種類の異なる酵 素に対する制限部位をともなうエンハンサーおよびサプレッサーエレメントの位 置のアセンブリー図である。

図４ 図４はマウスのシンデカンのエンハンサーエレメントの完全配列（配列 番号：３：（ＤＮＡ））である。図３に示した転写開始部位から８〜１０ｋｂ上 流に位置している。

図５ 図５Ａ（パネルＡ〜Ｄ）は軟寒天上のシンデカン−形質転換細胞（synd ecan-transfected cells）の低下した増殖能力を写真表示したものである。パネ ルＡ（野生型Ｓ１１５細胞）およびパネルＢ（コントロールの形質転換細胞）は 、ホルモン−形質転換細胞（hormone-transformedcells）の典型的な特徴を示す 、テストステロン存在下の軟寒天上で形成されたコロニーの写真である。２種の 独立したシンデカン−形質転換細胞クローン（パネルＣおよびＤ）ではこの増殖 能力はみられなかった。このことはどの程度のシンデカンの再発現がホルモン− 誘導形質転換の影響に打ち勝つことができるのかということを説明している。図 ５Ｂはどの程度のシンデカン−転換細胞がヌードマウスにおいてそれらの腫瘍形 成能力を失ったかを示すグラフ表示である。野性型ま たはコントロールの形質転換細胞は、テストステロンを投与したヌードマウスで 腫瘍を生じたが、シンデカン転換細胞は非常に低い腫瘍生産傾向を示した。

図６は塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびトランスフォーミング（ transforming）成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を同時に投与することによる３Ｔ ３細胞における促進されたシンデカン発現をグラフ表示したものである。これは 分化過程にある正常細胞における成長因子の作用の効果としてどの程度のシンデ カン発現が促進されたかを示す一例である。

図７は抗エストロゲンであるトレミフェン（anti-estrogen toremifene）にさ らされたＭＣＦ−７細胞により促進されたシンデカン発現をグラフ表示したもの である。エストロゲンにさらしたとき、ＭＣＦ−７細胞におけるシンデカン発現 は低下し、細胞は形質転換した。続く抗エストロゲン（トレミフェン）を使用し た処理では、シンデカン発現はエストロゲンにさらしていない細胞で見られるレ ベル近くまで回復し、細胞の正常な増殖挙動を維持するように細胞を助けた。

図８はテストステロンで処理したＳ１１５細胞においてどの程度のサプレッサ ー（図３参照）が活性化されているかをグラフ表示したものである。示されたプ ロモーター配列のストレッチ（stretches）は、ホルモン処理したＳ１１５細胞 に遺伝子導入され、実施例６で述べる転写活性が分析された。図３で示したサプ レッサーの構築物（construct）によりドラマテイックドロップ（dramatic drop ）が認められ、それは３Ｔ３細胞（ｂ）よりも形質転換Ｓ１１５細胞（ａ）にお いてより明白であっ た。

図９は成長ホルモン処理した３Ｔ３細胞において、エンハンサーエレメントが どの程度活性化されているかをグラフ表示したものである。種々のプロモーター のストレッチが３Ｔ３細胞にトランスフェクトされ、それらの転写活性が分析さ れた。エンハンサーとして図３で示したものと同一であるｐＸｂ６フラグメント は、成長因子ｂＦＧＦおよびＴＧＦβにさらした３Ｔ３細胞において、未処理細 胞と比較したところ１０倍以上の刺激をすることが明らかになった。

定義 本出願の明細書および請求の範囲に用いられる用語について、より明瞭であり 、より矛盾のない理解を提供するために、以下に定義を提供する。

シンデカンの発現の「促進」または「刺激」。シンデカンの発現の「促進」ま たは「刺激」は、シンデカン遺伝子の転写およびまたは翻訳の誘導またはデ−サ プレッション（de-suppression）（抑制解除）のいずれかによりシンデカン合成 を増進する効果を意味する。

細胞増殖。「細胞増殖」は、制御された細胞および制御されていない細胞両者 の複製を意味する。

悪性の。「悪性の」は、制御されていない細胞増殖を意味する。

より分化した表現型。細胞が「より分化した表現型」を有すると述べることは 、本発明に従ってシンデカンの発現が促進される前では不完全（deficient）で ある細 胞よりもさらに分化した特定の細胞種か一般に有する表現型を細胞が有すること を意味する。この表現型は１またはそれより多くの表現型の特徴によって定義さ れてもよい。たとえば、上皮細胞は間充織様の形状がより分化した表現型であり 、したがって間充織様の形態よりもむしろ上皮細胞の形態の細胞を維持する本発 明の方法の可能性は、この定義の意味するより分化した表現型にある。連続した シンデカンの発現は上皮細胞の最終の（terminal）分化の維持に必要である。

シンデカンの発現は間充織細胞の正常な分化にも関連する。しかしながら、間 充織細胞における正常の分化にはシンデカンの発現の一時的な増加のみが必要と される。それゆえ、上皮細胞とは反対に、シンデカンの発現は間充織細胞におけ る最終分化の維持には必要とされない。適切な間充織前駆細胞集団（「凝集した （condensing）間充織」細胞集団のような）の分化を、完全に分化した間充織細 胞までを誘導するためには、シンデカンの発現の一時的発現のみが必要とされる 。それゆえ、最終分化した間充織細胞は凝集した間充織細胞よりも「より分化し た表現型」である。

シンデカンが不足する細胞（syndecan-deficient cells）では表われるが、充 分なシンデカンが発現している細胞では表われない他の有用な表現型は、広範に 下にそして重なって（under-and overlapping）長い糸状足状の伸長をともなっ た紡錘状の形態を含む（その結果細胞は付着性を欠く）。

別の具体例では、シンデカンが不足するＮＭｕＭＧ細胞は乳脂肪球抗原（およ びたとえば乳房様のようにみえ る）を分泌し続け、またサイトケラチン（たとえば上皮様のようにみえる）を発 現し続ける。しかしながら、アクチンを含有するそれらの細胞骨格は崩壊してお り、細胞表面におけるベータ₁インテグリンとＥ−カドヘリンの発現は著しく減 少する。充分なシンデカンが発現される際には、細胞表面におけるインテグリン またはＥ−カドヘリンが低下しないようにこれらの表現型は修整され、細胞は上 皮形態をうる。それゆえ、細胞表面のインテグリンまたはＥ−カドヘリン量は、 シンデカンの発現の有用なマーカーであり、本発明の方法により有効な効果をえ るにはどれだけの量の薬剤が必要であるかを監視するために用いられてもよい。

有効量。薬物の「有効量」とは、とくには動物または人間への投与において、 所望の効果を充分にもたらすのに充分な物質の量のことである。

投与。用語「投与」とは、シンデカンの発現を誘導する物質を、注射、経口、 腸溶および非経口（たとえば、静脈内）投与に限らず医療技術として知られてい るあらゆる適切な手段によって動物またはヒトに導入することを含むことを意味 する。

薬学的に許容しうる塩。用語「薬学的に許容しうる塩」とは、本発明のシンデ カン誘導物質の塩を含むことが意図されている。前記塩は薬学的に許容しうる酸 または塩基、たとえば、硫黄の、塩素の、窒素の、リン酸などの酸、またはアル カリまたはアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニウム水酸化物、アルキルアン モニウム水酸化物などのような塩基から形成されうる。

薬学的に許容しうるビヒクル。用語「薬学的に許容し うるビヒクル」とは、シンデカンを誘導する化合物の投与のためのキャリヤーま たはアジュバントを提供するために、本発明のシンデカン誘導物質の調製に添加 物として用いられる、溶媒、キャリヤー、希釈剤などを含むことが意図されてい る。

処理（treatment）。「処理」または「処理すること」は腫瘍の増殖、毛髪の 成長を含む医学的障害の予防、改善、防止または治療を含んでもよい目的で被験 者に有効量のシンデカン誘導物質からなる組成物を投与することを含むことが意 図されている。

発明を実施するための最良の形態 要するに、広い観点からみれば、本発明は、他の状態ではシンデカンの発現を 抑制するであろう正常の（悪性でない）細胞において、前記細胞のシンデカンの 発現を維持することにより、分化した表現型を維持する方法を含む。本発明は、 シンデカンの発現が欠けている（lack）（または不足している）悪性細胞におい てシンデカンの発現を刺激することにより、前記細胞におけるより分化した表現 型を誘導するための方法も含む。ここで用いられるように細胞がシンデカンの発 現を「欠く」と記載されるばあい、それはシンデカンタンパク質を完全に欠損し ているか、または所望の分化した表現型を維持もしくは獲得するためにはシンデ カンの生成が不充分であることを意味する。

本発明の方法は、形質転換された状態のプログレッション（悪化）と細胞の腫 瘍増殖を予防するのみならず、細胞の分化状態において分化した細胞を維持する ために 用いられ、その結果そのような細胞は分化した機能の特徴を示しつづける。悪性 でない細胞の分化した機能の具体例としては、細胞の分泌の特性（すなわち、特 異的なタンパク質およびまたは他の巨大分子の分泌）、および皮膚の表皮細胞に よる毛髪の形成を含む。このように、本発明による、頭皮の表皮の皮膚細胞にお けるシンデカンの発現誘導を可能とする物質の投与は、はげた（またははげが進 行している）人々の毛髪の成長を促進する。

主要な方法は、生化学、化学または分子生物学的な方法までも含む様々な方法 によって成し遂げられてもよい。この方法は様々な癌（悪性のおよび悪性でない 両者）および正常な細胞に応用できる方法である一方、形質転換された悪性細胞 の処置にとりわけ適応できる。これは体に対するホルモンの影響または環境の影 響、たとえば化学物質または放射線被曝、によって形質転換された細胞を含む。

とくに、腫瘍の種類、たとえば、神経膠腫、骨髄腫、癌腫、肉腫、リンパ腫また は腺腫は、シンデカンの欠如によって特徴づけられる。

一般的に、シンデカンの発現が遺伝学的に可能であるあらゆる細胞には、本発 明の方法により細胞を刺激してシンデカンを発現させることができる。シンデカ ンは広い種類の成熟した上皮細胞と胚組織において、上皮との誘導的相互作用を 受けている様々な胚の間充織の組織によって自然に発現される。加えて、シンデ カンはライジッヒ細胞（Leydig cells）および発達段階のＢ−リンパ球および形 質細胞に自然に発現する。

促進されるシンデカンの発現は、生化学的および／または化学的および／また は分子生物学的活性成分を含む 組成物を個体に対して投与することにより達成されてもよい。組成物は、経口的 に、静脈内的に、皮下的にまたは局所的に投与されるか、または正常のまたは悪 性の細胞をシンデカンの発現を促進する成分にさらすほかのいくつかの方法によ って投与されてもよい。

「生化学的に」または「化学的に」活性な成分とは、シンデカン遺伝子の発現 自体を変えることなしに、目標の細胞の内因性のシンデカンを生化学的または化 学的に変える成分を意味する。たとえば、そのような変化は細胞のシンデカンタ ンパク質のレベルを増加するように、シンデカンタンパク質の半減期かまたはｍ ＲＮＡを変えることを含んでいてもよく、たとえば、細胞の内因性シンデカンの 外部領域または一般的には細胞表面膜の特徴を変えることにより、細胞表面のシ ンデカンのより高いレベルを維持するようになり、シンデカンタンパク質の（複 数の）活性部位を変えることにより、シンデカンの反応の効率を促進する。

「分子生物学的に」活性な成分とは、細胞のシンデカンを増加させる方法、た とえば、転写を刺激すること、転写の抑制を防ぐこと（または減らすこと）、転 写の抑制解除およびｍＲＮＡレベル（level）および／または翻訳効率のレベル を一般的に向上させることにより、内因性シンデカンの発現を変える成分を意味 する。

細胞の形質転換は、いくつかの細胞増殖刺激遺伝子（癌遺伝子のような）の活 性化および細胞増殖を抑制するように働くいくつかの他の遺伝子の不活性化を伴 うことが知られている。シンデカン発現の欠如が細胞の形質転換によって認めら れ、この抑制はシンデカン遺伝子の 不活性化によるものであることが最近示されている（レッパら、セル・レグル、 第２巻、１〜１１頁、１９９１年、インキら、アム・ジェイ・パソル（Am.J.Pat hol.）、第１３９巻、１３３３〜１３４０頁、１９９１年、インキら、ラボ・イ ンベスト、第６６巻、３１４〜３２３頁、１９９２年）。これは様々な既知の発 癌システム（発癌遺伝子、化学的発癌性物質、ＵＶ光、ホルモンにさらすなど） の種々の生物学的モデルにおいて示された。それゆえ、シンデカン遺伝子の抑制 は細胞の形質転換の発達と関係がある。

さらに、本発明によれば、悪性細胞におけるシンデカンの発現を誘導すること ができる、前記細胞のすべての取り扱いもまた、より分化した表現型がえられる ようにこれらの細胞を誘導し、続いて、それらの潜在的な腫瘍形成作用および転 移を減少させる。

より好ましい具体例は、シンデカンを発現するよう刺激された細胞がステロイ ドに反応する細胞である。そのようなステロイドに反応する細胞の具体例は、と りわけ悪性状態の、乳房の細胞、子宮内膜の細胞および前立腺の細胞を含む。さ らにより好ましい具体例は、エストロゲンおよび／またはアンドロゲンに対して 反応性を有する細胞である。

本発明の処置に反応するであろう他の細胞の種類の具体例としては、悪性およ び悪性でない間充織の細胞を含む。

提示された遺伝子の制御因子は通常、転写開始部位から（５′まで）上流に位 置している。しかしながら、シンデカンはきわめて特有な遺伝子構造を有してお り、そ の遺伝子の１番目と２番目のエクソンはきわめて大きなイントロンによって分離 されている（図１）。このことは、転写部位から上流の塩基配列に加えて、１番 目と２番目のエクソンの間に位置している塩基配列（図２）、すなわち１番目の イントロンによる制御に対してシンデカンの発現は感受性を有してもよいという ことを意味することができるであろう。

今や驚くべきことに、シンデカン遺伝子は転写開始部位から８〜１０ｋｂ上流 に位置している強いエンハンサーエレメントを有していることが見出だされてい る。エンハンサーエレメントの配列は同定され、図４（配列番号３）に提示され ている。

シンデカン遺伝子の上流領域の遺伝子操作は、悪性の形質転換の際のシンデカ ン遺伝子の不活性化を阻止することができる。たとえば、マウス乳房腫瘍ウイル ス（ＭＭＴＶ）の糖質コルチコイド誘発性エレメントと、シンデカン遺伝子の１ 番目のエクソンの前の領域を交換すると、悪性の形質転換の際のシンデカンの抑 制が阻止されるのみならず、形質転換して腫瘍化する能力または潜在性をも阻害 される（図３）。これらの発見は、正常な上皮形態の維持におけるシンデカンの きわめて重要な役割を示唆している（レッパら、プロク・ナトル・アカド・サイ ・ユーエスエイ、第８９巻、９３２〜９３６頁、１９９２年）。

器官形成または組織再生の間に分化するよう定められている細胞は、促進され たシンデカン発現も示す（バイニオら、デブ・バイオル、第１４７巻、３２２〜 ３３３頁、１９９１年、エレニアスら、ジェイ・セル・バイオ ル、第１１４巻、５８５〜５９５頁、１９９１年）。シンデカン発現の制御（直 接的かまたは間接的のいずれか）に関与する１または複数の成分は、未だ同定さ れていない。初期の発生および細胞の分化の制御に、成長因子が、影響を及ぼす ことが知られているので、成長因子はこの役割の候補となっている（ヒース（He ath）ら、カル・オピン・セル・バイオル（Curr.Opin.Cell Biol.）、第３巻、 ９３５〜９３８頁、１９９１年）。成長因子の関与は、胚に重要な２つの成長因 子（ＴＧＦ−βとＦＧＦ）の発現が、発育中の歯の中のシンデカンと一致すると 示される事実によって間接的にも支持される（バアトカリ（Vaahtokari）ら、デ ベロープメント（Development）、第１１３巻、９８５〜９９４頁、１９９１年 、ウィルキンソン（Wilkinson）ら、デベロープメント、第１０５巻、１３１〜 １３６頁、１９８９年）。

これらの発見にもとづいて、シンデカンの発現に対する成長因子の考えうる効 果が試験されている。ｂＦＧＦおよびＴＧＦ−βは単独で、しかしながらとくに 組み合わせて投与されるばあい、３Ｔ３細胞によるシンデカンの発現を促進させ ることが示された（図４）。この刺激は、シンデカンを発現している上皮細胞の 悪性化（malignization）（レッパら、プロク・ナトル・アカド・サイ・ユーエ スエイ、第８９巻、９３２〜９３６頁、１９９２年）よりも優先して、前記細胞 において観察されるレベル（level）（エレニウスら、ジェイ・バイオル・ケム 、第２６７巻、６４３５〜６４４１頁、１９２２年）に類似している。これらの 発見は、成長因子とそれらに由来するフラグメントおよびドメインが、シンデカ ンの発現の制御に有効な手段の開発に役立つことが証明される可能性を示唆して いる。

好ましくは、ヒトおよび動物の処置のために、組織の変性状態における細胞分 化を促進するために充分なレベルにまで、シンデカンの発現を促進させる結果を もたらす薬物を投与する。そのような薬物を、ここでは「シンデカン誘導剤」と 称する。シンデカン誘導剤は、成長因子および成長因子活性を保持するそれらの 誘導体を含む。そのような成長因子の具体例は、個々にまたは共に投与されるｂ ＦＧＦとＴＧＦ−βを含む。

さらにより好ましいシンデカン誘導剤は、細胞の核内のシンデカン発現のサプ レッサー（類）に直接干渉することができるように、組織と細胞への良好な浸透 性を有する。そのようなシンデカン誘導剤は既知の抗腫瘍剤トレミフェン（tore mifene）である。良好な原形質膜浸透性を有することが知られているトレミフェ ンを、ホルモンにより形質転換された、シンデカン発現が減少した上皮細胞に投 与したばあい、細胞はそれらの減少したシンデカンの発現を逆転させ（reverse ）、正常の形質転換されていない細胞に認められるレベル近くまでシンデカンの 発現を誘導する（図５）。このことは、本発明の方法で有用なシンデカン誘導剤 は既知であり、利用可能であることを示しており、またそのような薬剤はシンデ カン発現の抑制を阻止することにより細胞の悪性化を特異的に妨げることが可能 であることを示している。この点についてほかの有用な薬物はタモキシフェン（ tamoxifen）である。

そのようなシンデカン誘導剤は、一般に利用できる製 剤を用いて、またはあらゆる薬学的に許容しうるビヒクルによって投与されても よい。その投与経路は、所望の活性部位に対して有効なレベルの薬剤を伝達する いかなる経路、たとえば注射による、であってもよい。

非経口投与のために、１またはそれより多くのシンデカン誘導剤を含む製剤を 、薬学的に許容しうる滅菌水または非水溶性溶媒、懸濁剤および乳剤と組合わせ て、そのような処置を必要とする患者に対して投与してもよい。非水溶性溶媒の 具体例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、魚油お よび注入可能な有機エステル類である。水溶性のキャリヤーは、水、水−アルコ ール溶液、生理的食塩水を含む乳剤もしくは懸濁剤、ならびに塩化ナトリウム溶 液、リンゲルのデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラ クトースを含むリンゲル液または不揮発性油を含む緩衝化された医療用浸透性ビ ヒクルを含む。静脈注射のビヒクルは、リンゲルのデキストロース溶液などにも とづくような流動体および栄養補充物、電解質補充物を含む。

シンデカン誘導剤の生物学的活性が、消化の過程によって破壊されることがな く、化合物の特性が腸管組織を通過して吸収されるならば、本発明のシンデカン 誘導剤は錠剤、カプセル、粉末小包、または経口投与用の液体溶液のような投薬 形態で用いられることができる。

シンデカン誘導剤は、ポンプかまたは徐放性の剤形によって投与されてもよい 。本発明の方法で用いられるシンデカン誘導剤は、適切に挿入されたカテーテル によるか、または目標の特定の器官に対して設計されたキメラ 分子（または複合体）の一部分と同様な分子の供給により、高濃度で特定の器官 へ送達されてもよい。

徐放性剤形による投与は、時間間隔を長くするために繰り返しの注射が必要で あると示されるばあいには、患者にとってより便利である。

シンデカン誘導剤を含有する組成物は、それ自体は知られている方法、たとえ ば、通常の混合すること、顆粒化すること、糖衣形成すること（dragee-making ）、溶解すること、凍結乾燥することまたは同様の工程によって製造できる。組 成物中のおよび組成物としてのシンデカン誘導剤を供給する本発明の組成物は、 腫瘍の増殖または腫瘍の再発を遅らせるかまたは防ぐことができる、それらの能 力において有用性が見出だされる。本発明のシンデカン誘導組成物は、特定の細 胞の種類の分化をその最大の可能性まで促進するために、身体自体の機構を利用 する。

静脈注射用剤形において、本発明の組成物は、腫瘍の増殖を鋭敏に制御する（ acute management）点において有用である充分に迅速な作用開始を示す。

加えて、低い有効性の変形型（low potency version）は、腫瘍が効果的に治 療され、患者は小康状態であるようにみえる疾患の処置に有用であるが、身体が 腫瘍の再発を防ぐことを助けるように患者のシンデカン誘導剤の充分なレベルを 維持することが望まれる。

ヒトまたはほかの動物を処理するために本発明の方法で用いるトレミフェンま たはタモキシフェンおよびほかのシンデカン誘導剤の典型的な投与量は、１日あ たり２０〜６００ｍｇ）および好ましくは１日あたり２０〜６ ０ｍｇである。

以下の実施例は実例を示す目的のみで、本発明の範囲を制限するものではない 。

実施例１ ホルモンの誘導−形質転換の外因性のシンデカン発現による逆転 前述（レッパら、セル・レギュレイション、第２巻、１〜１１頁、１９９１年 ）のように、Ｓ１１５マウス乳房腫瘍細胞をＤＭＥＭ中で一定した手順で培養し た。ホルモン処理を含む実験研究のために、不活性化された牛胎児血清（i-FCS ）を、４％デキストラン活性炭処理済牛胎児血清（dextran charcoal-treated f etal calf serum（DCC-FCS））と交換し、血清からの内因性ステロイド類を除き 、テストステロン（１０ｎＭ）を含むかまたは含まないで、およびデキサメタゾ ンを含むかまたは含まないで用いた。細胞を１０，０００細胞／ｃｍ²の密度で プレートに播き、培地を３日毎に交換した。

ヒト シンデカンのｃＤＮＡを含むプラスミドpUC19-hsynpr７（マリら、ジェ イ・バイオル・ケム、第２６５巻、６８８４〜６８８９頁、１９９０年）をNae Ｉ制限エンドヌクレアーゼで切断し、えられた３３６ｂｐの長いフラグメントを 分離し、低融点のアガロースゲルから溶出した。プラスミド pUC19-hsyn4（マ リら、ジェイ・バイオル・ケム、第２６５巻、６８８４〜６８８９頁、１９９０ 年）をNaeＩおよびHindII（ポリリンカー部位）で切断し、４８７番目の塩基か ら始まるフラグメ ントを含むプラスミドを単離した。hsynpr７由来のNaeＩフラグメントをpUC-hsy n NaeＩ／HindIIで切断されたベクター（pUC-hsyn NaeＩ／HindII digested vec tor）に結合した。挿入（フラグメント）の配向は制限酵素分析および配列決め により、確認された。ヒト シンデカンのコアタンパク質の全てをコードしてい る領域を含む、えられたプラスミドをpUC19-hsynfullと命名した。このプラスミ ドをBamＨＩおよびSphＩでさらに切断した（ポリリンカー部位）。シンデカンを コードしている１５０〜１４６１番の塩基領域を含むフラグメントは、クレノウ およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて単離され、平滑末端化された。最終的 に、このフラグメントをSalＩで直鎖状にし、平滑末端化されたｐＭＡＭneoベク ター（クローンテック（Clontech）、パロ アルト（Palo Alto）、カリフォル ニア州（CA））とライゲーション（ligation）し、結果としてヒト シンデカン をコードする領域とＳＶ−４０ポリアデニル化シグナルとを連結したＲＳＶ−Ｍ ＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターを含むキメラ遺伝子に至る。その配向は制限酵素の 消化により確認された。そのプラスミドをｐＭＡＭneo-hsynと命名した。

コントロールのトランスフェクションのために、ヒト成長ホルモン遺伝子（エ クソン４および５からなる。ボーンステイン（Bornstein）ら、ジェイ・バイオ ル・ケム、第２６３巻、１６０３〜１６０６頁、１９８８年）の６４２ｂｐの長 いHindIII／PvuIIフラグメントを前記のように平滑末端化し、同一のｐＭＡＭne oベクターへクローン化した。コントロールの構築物をｐＭＡＭneo-ｈＧＨと命 名した。

すべてのプラスミドは、Ｃｓｃｌ密度勾配法を用いて単離した。トランスフェ クションの前に、プラスミドをMluＩを用いて糸状にし、クロロホルム／フェノ ール系を用いて抽出し、エタノールを用いて沈殿した。

トランスフェクションはリポフェクチン（商標、Lipofectin^TMビーアールエル （ＢＲＬ））を用いて製造者の指示にしたがって行われた。２週間の選択（Ｇ４ １８、７５０μｇ／ｍｌ、シグマ（Sigma））ののち、生き残ったクローンをク ローニングシリンダーを用いて増殖プレートから単離した。そののち、ヒト シ ンデカンまたは成長ホルモン（エクソン４および５から成る）ｍＲＮＡの発現を 、ＲＮＡの単離およびノーザンブロット解析によって確認した。トランスフェク トされた遺伝子を高レベルで表現しているクローンを、さらなる研究および特徴 づけのために選択した。

これらの保存細胞をＧ４１８（３００μｇ／ｍｌ）の存在下ルーチンで培養し た。

外因性シンデカンの発現を測定するために、全ＲＮＡを野生型Ｓ１１５細胞な らびにヒト シンデカンもしくは成長ホルモン遺伝子でトランスフェクトされた 細胞から単離した。ＲＮＡは４ＭグアニジンイソチオシアネートとＣｓＣｌペレ ットを用いて、前述のチアーグウィン（chirgwin）ら、バイオケミストリー第１ ８巻、５２９４〜５２９９頁（１９７９年）のように抽出した。正常のマウス乳 房ＮＭｕＭＧおよび正常ヒト乳房ＨＢＬ−１００細胞からのＲＮＡを比較のため に用いた。１５μｇのＲＮＡアリコットを１％ホルムアルデヒド アガロースゲ ル電気泳動で分離し、ジーンスクリーンプラス（商 標）ハイブリダイゼーション膜（Gene Screen Plus^TMhybridization membrane） （ニュー イングランド ヌクレアー（New England Nuclear））に移した。マ ウス（PM-4）シンデカン（サンダースら、ジェイ・セル バイオル、第１０８巻 、１５４７〜１５５６頁、１９８９年）、またはヒト シンデカン（pUC19-hsyn 4 BamHI１.１ｋｂフラグメント）（マリら、ジェイ・バイオル・ケム、第２６５ 巻、６８８４〜６８８９頁、１９９０年）のどちらかの挿入配列を標識したマル チプライム（multiprime）（アマシャム（Amersham））を用いるか、またはヒト 成長ホルモンのエクソン４および５（hGH）（レッパら、プロク・ナチュル・ア カド・サイ・ユーエスエイ、第８９巻、９３２〜９３６頁、１９９２年）のｃＤ ＮＡを用いて、膜の製造者（ニュー イングランド ヌクレアー）により提示さ れている高いストリンジェンシー条件で、ブロットをハイブリダイズした。

現代の分子生物学に基づくすべての技法は、カレント・プロトコルズ・イン・ モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）と表 題をつけられた実験手引きのような著述中に充分に説明されている。

足場非依存性（Anchorage independent）細胞の増殖は軟寒天コロニーアッセ イによって測定した。まず、６穴プレートを２ｍｌのＤＭＥＭ、０．５％寒天お よび４％ＤＣＣ−ＦＣＳからなる寒天層でおおった。中間層は０．３３％寒天お よび４％ＤＣＣ−ＦＣＳを追加した、１０ｎＭのテストステロンを追加するかま たは追加しない０．５ｍｌのＤＭＥＭ中の１０⁴個の細胞を含有して いた。アガロースゲルの乾燥を防ぐために、培地（２ｍｌ）からなる最上層を加 えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂で１２日間インキュベートし、そののち培 養を評価して写真に撮った。

Ｓ１１５野生型細胞、トランスフェクトされたコントロールのクローンｈＧＨ の１つおよびヒトのシンデカン−１を発現している２つのクローンの腫瘍形成性 を、ヌードマウスにおいて測定した。

５％ＦＣＳおよび１０ｎＭテストステロンを含むＤＭＥＭ中でこの細胞を培養 した。４日間の培養ののち、細胞をトリプシンで採取し、洗浄して、そして０． ２ｍｌのＤＭＥＭに懸濁された１０⁷個の細胞を胸腺欠損の雄のヌードマウス（b alb-C）の背中に皮下注射した。Ｓ１１５細胞の増殖速度を増進させることが知 られている（キング（king）ら、ジェイ・ステロイド・バイオケム（J.Steroid. Biochem.）、第７巻、８６９〜８７３頁、１９７６年）、シラスティックテスト ステロンカプセル（Silastic testosterone capusule）を同時に移植した。ヌー ドマウスの腫瘍の発育について定期的に試験し、触知できる腫瘍の大きさを間隔 をおいて測定した。

実施例２ 成長因子はシンデカン発現を促進する ＮＭｕＭＧマウス乳房上皮細胞および３Ｔ３（ＮＩＨ）マウス線維芽細胞を、 前述（エレニウスら、ジェイ・バイオル・ケム、第２６５巻、１７８３７〜１７ ８４３頁、１９９０年）のように、１０％ＦＣＳ（ギブコ （GIBCO））および抗生物質を含む炭酸水素塩で緩衝化されたダルベッコ改変イ ーグル培地（ＤＭＥＭ）ギブコ）中でルーチンで培養した。実験のために、細胞 を培養皿（ヌンク（Nunc））上で等濃度に播き、６０〜７０％のコンフルエント まで増殖させた。培地に成長因子（類）を追加する２４時間前に、２％ＣＭＳ− ＦＣＳを含む新鮮な培地（ボーゲル（Vogel）ら、プロク・ナチュル・アカド・ サイ・ユーエスエイ、第７５巻、２８１０〜２８１４頁、１９７８年）に交換し た。成長因子の追加をせずに同様の処理をした培養液を負のコントロールとして 保存した。ブタＴＧＦβ１（アール アンド デー（Ｒ＆Ｄ））、リコンビナン ト ヒトｂＦＧＦ（ベーリンガー（Boehringer））、およびマウスＥＧＦ（シグ マ（Sigma））は、すべての実験において、それぞれ最終濃度２．５ｎｇ／ｍｌ （１００ｐＭ）、１０ｎｇ／ｍｌ（５７０ｐＭ）および１．２ｎｇ／ｍｌ（２０ ０ｐＭ）で用いられた。細胞表面のシンデカンの定量および単離のために、テキ ストに示されている時間段階で培地を捨て、細胞の層を氷冷されたリン酸塩緩衝 生理食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄した。細胞を０．５ｍＭＥＤＴＡを追加した氷 冷ＰＢＳ中にラバー・ポリースマンでこすり落とし、遠心分離した。つづいて、 再懸濁によって洗浄し、遠心分離したのち、細胞数をコールター・カウンター（ コールター・エレクトロニクス（Coulter Electronics））で核を数えることに より測定した。

細胞膜に挿入されたシンデカンの定量のために、１０分間、２０ｐｇ／ｍｌの ウシ膵臓トリプシン（タイプIII（TypeIII）、シグマ）を含むＰＢＳで洗浄され た細胞を、 氷冷容器にて１０分間インキュベートすることにより、シンデカンのエクトドメ インを遊離した。インキュベーションののち、細胞を遠心分離し、エクトドメイ ンを上清中に遊離させる（ラプレージャーら、ジェイ・バイオル・ケム、第２６ ０巻、１１０４６〜１１０５２頁、１９８５年）。前述のように（ジャルカネン （Jalkanen）ら、ジェイ・セル・バイオル、第１０５巻、３０８７〜３０９６頁 、１９８７年）、３Ｔ３細胞またはＮＭｕＭＧ細胞の、それぞれ４００，０００ 細胞または２００，０００細胞に相当するサンプル量を、ミニホールドスロット （minifold slot）器具の陽イオン性ナイロン膜上に供した。非特異的結合は、 １０％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で１時間、室温でインキュベートすることにより阻 害された。膜に付着したシンデカンはクロラミン−Ｔ酸化法（ステーリ（Staehl i）ら、メス・エンザイモル（Meth.Enzymol.）、第９２巻、２４２〜２５３頁、 １９８３年）により放射性ヨウ素化された、マウス シンデカン コアタンパク 質（ｍＡＢ ２８１−２）（ジャルカネンら、ジェイ・セル・バイオル、第１０ １巻、９７６〜９８４頁、１９８５年）に対するモノクローナル抗体を用いて検 出した。膜を¹²⁵Ｉ−標識２８１−２含有ＰＢＳ＋１０％ＦＣＳ（１０，０００ ＣＰＭ／ｍｌ）中４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄したのち、 オートラジオグラフィーによって結合した抗体を視覚化した。

シンデカン エクトドメインの培養液中への蓄積は、選択された時点で残って いる培養液の総容量の１／５０（３Ｔ３細胞）または１／１００（ＮＭｕＭＧ細 胞）に 相当するサンプルを採取して評価した。サンプルは前述のようにナイロン膜に供 することにより解析された。オートラジオグラフィーのシグナルを、ゲルスキャ ン ＸＬ ２４００ ソフトウェア（GelScan XL 2400 software）（エルケイビ ー（ＬＫＢ））を用いて、ゲルスキャン ＸＬ ウルトラスキャン デンシトメ ーター（GelScanXL ultroscan densitometer）（ＬＫＢ）を用いて定量した。

シンデカン精製のために、成長因子（類）の存在下または非存在下において、 １００ｐＣｉ／ｍｌ ³⁵ＳＯ₄（ニュー・イングランド・ヌクレアー）を用いて低 硫酸塩ＤＭＥＭ（ＭｇＣｌ₂はＭｇＳＯ₄に置換、２％ＣＭＳ−ＦＣＳ）中で２４ 時間、細胞を放射能標識した。細胞表面のトリプシン処理で遊離しうる物質を、 前述のように集め、トリス緩衝生理食塩水（Tris-buffered saline）（ＴＢＳ） に対して透析したのち、サンプルを２８１−２−セファロースＣＬ−４Ｂイムノ アフィニティーカラム（281-2-SepharoseCL-4B immunoaffinity column）（ジャ ルカネンら、ジェイ・セル・バイオル、第１０５巻、３０８７〜３０９６頁、１ ９８７年）に供した。結合した物質を５０ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）（ pH１１.５）を用いて溶出し、それぞれの画分の放射性ＰＧの量をセチルピリジ ウムクロライド（cetylpyridiumchloride）を含浸させたワットマン３ＭＭフィ ルターディスク（Whatman 3MM filter discs）を用いて解析した（ラプレージャ ーら、ジェイ・バイオル・ケム、第２６０巻、１１０４６〜１１０５２頁、１９ ８５年）。相互作用の実験のために、標識されたＰＧの大部分を含む画 分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。

相互作用の検定法（以下参照）用の未標識のシンデカン エクトドメインをえ るためには、非放射性硫酸塩を培地に加えるほかは同様の手順を用いて、イムノ アフィニティ カラムから溶出した画分に含まれているシンデカンをｍＡＢ ２ ８１−２を用いるイムノドット検定法により検出した。シンデカンのモル濃度の 評価は、全アミノ酸解析（ジャルカネンら、ジェイ・セル・バイオル、第１０６ 巻、９５３〜９６２頁、１９８８年）によって前もって決定されたシンデカンの 濃度にもとづく。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット。ウエスタンブロットの実験のた めに、細胞を成長因子（類）を用いるかまたは用いずに２４時間培養した。トリ プシン処理により細胞表面より放出された物質（material）を含有するシンデカ ン エクトドメインは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配（２〜１５％）ゲル上で分画され た（オフェレル（O′Farrel）、ジェイ・バイオル・ケム、第２５０巻、４００ ７〜４０２１頁、１９７５年）。電気泳動後、サンプルをエレクトロブロッティ ング ２００５ トランスファー装置（electroblotting 2005 Transphor appar atus）（ＬＫＢ）を用いるゼータ−プローブ メンブレン（Zeta-Probe membran e）へ移した。フィルター上のシンデカン抗体を、スロットブロット解析につい て前述したように、放射性ヨウ素化されたｍＡＢ ２８１−２により検出し、フ ィルターは洗浄した。

ノーザンブロット。４Ｍグアニジン イソチオシアネートおよびＣｓＣｌ密度 遠心分離を用いて、ＲＮＡを３Ｔ３およびＮＭｕＭＧ細胞より単離した（チャー グウィ ン（Chirgwin）ら、バイオケミストリー、第１８巻、５２９４〜５２９９頁、１ ９７９年）。ＲＮＡサンプルを１％アガロース ホルムアルデヒド ゲル上でサ イズにより分離（size-separated）し、ジーンスクリーンプラス（商標）メンブ レン（Gene Screen Plus ^TMmembrane、ニュー イングランド ヌクレアー）へ移 し、マウスのシンデカン（ＰＭ−４）のために部分的なｃＤＮＡクローンを標識 したマルチープライム（アマシャム）とハイブリダイズさせた（サンダースら、 ジェイ・セルバイオル、第１０８巻、１５４７〜１５５６頁、１９８９年）。ハ イブリダイゼーション後、膜を２×ＳＳＣおよび１．０％ＳＤＳ中、６５℃で洗 浄した（高いストリンジェンシー条件）。グリセロアルデヒド３−リン酸デヒド ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）との再ハイブリダイゼーションのために（フォート（ Fort）ら、ヌクレイック・アシッド・レス（Nucleic Acid Res.）、第１３巻、 １４３１〜１４４２頁、１９８５年）、結合したＰＭ−４プローブはフィルター の製造者（ＮＥＮ）の勧めにより取り除いた。

実施例３ トレミフェンにより増殖が阻害されたヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）におけるシン デカンｍＲＮＡ発現の誘導 ステロイド反応性のヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７は、エストロゲンおよび抗エス トロゲンにより調節された異なる増殖条件下においてヒト シンデカンの発現を 研究するために用いられた。実験のために、細胞を濃度１．２ ×１０⁶細胞／１００ｍｍφプラスチック培養皿に播き、５％デキストラン／活 性炭ストリップド ウシ胎児血清（５％dextran/charcoal stripped fetal calf serum）（ＤＳ−ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび３μｇ／ｍｌインス リンを含有するフェノールレッドを含有しないＤＭＥＭ培地皿当り１０ｍｌ中に 、単層培養として増殖した。ホルモン処理のために、１ｎＭ１７β−Ｏ−エスト ラジオール（Ｅ₂）を単独または１〜６．２５μＭトレミフェンとともに７０％ エタノールに溶解させ、細胞を播いたのちに培養培地に添加した。細胞を６日間 培養し、培地は２日毎に交換した。ＲＮＡ抽出のために、細胞をＰＢＳを用いin situで洗浄し、４Ｍグアニジン イソチオシアネート中でプレートからかき取 られた。

実施例４ 患者におけるステロイド反応性の腫瘍の処置 乳の腫瘍（breast tumor）、子宮内膜の腫瘍、前立腺の腫瘍または間充織組織 腫瘍より選ばれるステロイド反応性の腫瘍を有すると診断された患者に、有効量 の、抗ステロイド物質であるトレミフェンまたはタモキシフェン、または有効量 の、成長因子であるｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βもしくは、ＴＧＦ−βおよびｂＦＧＦ を含有する組成物を、腫瘍の程度、患者の年齢、患者の性別および化学療法のプ ロトコルの考案において考慮されるような他の処置にしたがって、１日当り２０ 〜６００ｍｇの範囲の量で投与する。腫瘍細胞がより分化した表現型を呈 し、処置により腫瘍の増殖が阻止またはかなり減速化されるように、腫瘍細胞に シンデカンを誘導するのに充分な期間シンデカン誘導剤を投与する。

実施例５ 表皮の皮膚細胞における毛髪の成長刺激 頭皮部の毛髪の成長を増進させる必要があると診断された患者に、有効量の、 抗ステロイド物質であるトレミフェンまたはタモキシフェン、または有効量の、 成長因子であるｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βもしくはＴＧＦ−βとｂＦＧＦを含有する 組成物を、必要とされる毛髪の成長の程度、患者の年齢、患者の性別およびプロ トコルの考案において考慮されるような他の処置にしたがって１日当り２０〜６ ００ｍｇの範囲の量で投与する。シンデカン誘導剤は、処置によって毛髪の成長 が相当増進されるように、上皮細胞にシンデカンを誘導するのに充分な期間投与 される。

実施例６ マウス シンデカンのプロモーターおよびエンハンサー活性の測定 マウスのシンデカン遺伝子はクローン化されており、転写開始部位より−１０ ｋｂ上流までが特徴付けされている。近接する異なるプロモーター領域（開始部 位から−２ｋｂまで）およびエンハンサー領域（−２ｋｂから−１０ｋｂまで） の特異的な活性を測定するために、我 々は、これらの領域がＣＡＴレポーター（reporter）遺伝子を含むｐＣＡＴ基本 ベクター（pCAT basic vectors）またはｐＣＡＴプロモーターベクターにクロー ン化されているプラスミド構築物を作製している。レポーターＣＡＴ遺伝子は、 ｎ−ブチリル ＣｏＡのｎ−ブチリル分子をクロラムフェニコールへ転移するク ロラムフェニコール アセチル トランスフェラーゼ酵素を産生する。ｎ−ブチ リル クロラムフェニコールはキシレンにより天然のクロラムフェニコールと分 離することができる。

近接したシンデカンのプロモーターのさらなる特徴付けのために、一連の制限 酵素処理が上流領域になされ（HindIII、HindII、BglII、StuＩ、DraＩ、ClaＩ 、BamＨＩおよびPstＩ−XhoＩ）、えられたフラグメントをｐＣＡＴ基本ベクタ ーへクローン化した。エンハンサー領域（areas）に対しては、３つのXbaＩフラ グメントが、ＳＶ４０プロモーターがシンデカンプロモーターのＢｇｌII−Xho Ｉフラグメントと取り代えられたｐＣＡＴプロモーターベクターへクローン化さ れた。

プラスミド構築物は、トランスフェクションの効率を測定するために、β−ガ ラクトシダーゼ発現ベクターを用いると同時にリン酸カルシウム沈殿により真核 細胞へ一時的にトランスフェクトされた。４時間のインキュベーションののち、 細胞を１５％グリセロールで処理し、細胞培養培地中で約４８時間増殖させた。

細胞をＴＥＮ緩衝液中、皿からかき取り、細胞質の抽出物を繰り返しの凍結およ び解凍によりえた。β−ガラクトシダーゼ活性は、０．１Ｍリン酸ナトリウム、 ４５ｍＭメルカプトエタノールおよび０．２ｍｇＯＮＰＧの添加により細胞 質の抽出物においてえられた。これを２時間から一晩インキュベートし、呈色反 応を４２０ｎｍにおいて分光光度的に測定した。

ＣＡＴ活性は、０．２５Ｍトリス緩衝液、２５ｎｇｎ−ブチル ＣｏＡおよび¹⁴ Ｃ−クロラムフェニコール０．０６２６μＣｉを細胞質の抽出物へ添加するこ とにより測定された。これらを一晩インキュベートし、キシレンを用いて逆抽出 （backextract）し、シンチレーション計数により放射能を測定した。ＣＡＴ活 性は、β−ガラクトシダーゼ活性によるトランスフェクションの効率に対して修 正された。

近接したプロモーター構築物に使用された細胞は、３Ｔ３ ＮＩＨ、Ｓ１１５ （ホルモン処理または未処理のどちらか一方）およびｎＭｕＭＧ細胞であった。

エンハンサー構築物には、２％ＣＭＳ培地上で増殖した３Ｔ３ ＮＩＨ細胞を使 用し、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２および２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ−１を含む２ ％ＣＭＳ培地中で成長因子の影響を試験した。

ここに引用された全ての参考文献は参照によってここに充分に組み込まれてい る。本発明をここに充分に記載したので、本発明または本発明のあらゆる具体例 の精神または範囲に影響することなしに、条件、パラメーターなどの広いおよび 同等の範囲内で、本発明の範囲が実施されてもよいということは当業者によって 理解されるだろう。

配列表 （１）一般的な情報： （ｉ）出願人： （Ａ）氏名：アラーネンークルキ、レーナ （Ｂ）通り：ピースパンカツ6エー31 （Ｃ）市：ツルク （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）郵便番号：フィン−20500 （Ａ）氏名：アウビネン、ペトリ （Ｂ）通り：キルシュガルテンシュトラーセ5 （Ｃ）市：ハイデルベルヒ （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号：デー−69126 （Ａ）氏名：ヤーコラ、パヌ （Ｂ）通り：ケロンソイタヤンカツ13ベー20 （Ｃ）市：ツルク （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）郵便番号：フィン−20500 （Ａ）氏名：ヤルカーネン、マルク （Ｂ）通り：ラウボランチエ （Ｃ）市：ピースパンリスチ （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）郵便番号：フィン−20760 （Ａ）氏名：レペー、シルパ （Ｂ）通り：バルキンチエ14アスント6 （Ｃ）市：リトイネン （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）郵便番号：フィン−20660 （Ａ）氏名：マリ、マルク （Ｂ）通り：インケレーンチエ176 （Ｃ）市：サロ （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）郵便番号：フィン−24280 （Ａ）氏名：ビヒネン、タパニ （Ｂ）通り：カスケンカツ11セー54 （Ｃ）市：ツルク （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）郵便番号：フィン−20700 （Ａ）氏名：ヴェリ アニ （Ｂ）通り：ユハニンクヤ2アスント2 （Ｃ）市：リエト （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）郵便番号：フィン−21420 （ii）発明の名称：細胞分化のシンデカン刺激 （iii）配列の数：3 （iv）コンピュータ リーダブル フォーム： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：IBM PCコンパチブル （Ｃ）オペレーティング システム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース(Patent In Release)#1.0 、バージョン＃1.25（EPO） （ｖ）本出願のデータ： 出願番号：アサインされる国際公開番号 （vi）先願のデータ： （Ａ）出願番号：US 07/988427 （Ｂ）出願日：1992年12月1日 （２）配列番号1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：26700塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：両形態 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：join（4378..4443，22026..22106，23001..23483， 23905..24039，24251..24418） （xi）配列：配列番号：1： （２）配列番号2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：311アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号：2： （２）配列番号3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2196塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：両形態 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iii）アンチセンス：ＮＯ （xi）配列：配列番号：3：

【手続補正書】特許法第１８４条の８

【提出日】１９９４年１２月９日

【補正内容】 請求の範囲 １．シンデカン遺伝子のエンハンサーエレメントからなる核酸分子。 ２．シンデカンのエンハンサーエレメントが、ヒトのシンデカン遺伝子由来であ ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の核酸分子。 ３．エンハンスメントエレメントが図４のヌクレオチド配列（配列番号３）から なることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の核酸分子。 ４．患者の悪性腫瘍の増殖を低下させる組成物であって、該組成物が請求の範囲 第１〜３項記載の核酸分子を含有することを特徴とする組成物。 ５．前記核酸分子が図４のヌクレオチド配列（配列番号３）からなることを特徴 とする請求の範囲第４項記載の組成物。 ６．患者の悪性腫瘍の増殖を低下させる処置を必要とする該患者を処置する方法 であって、該方法が、該腫瘍細胞においてシンデカンの発現を誘導する、有効な レベルの組成物を該患者に投与することからなる方法。 ７．前記組成物がシンデカン遺伝子のエンハンサーエレメントに影響を及ぼす組 成物である請求の範囲第６項記載の方法。 ８．前記組成物がシンデカン遺伝子のサプレッサーエレメントに影響を及ぼす組 成物である請求の範囲第６項記載の方法。 ９．前記腫瘍が、ステロイドによって増殖が刺激される腫瘍である請求の範囲第 ６項、第７項または第８項記 載の方法。 10．前記ステロイドがエストロゲンまたはアンドロゲンである請求の範囲第９項 記載の方法。 11．前記腫瘍が、乳、子宮内膜、前立腺または間充織組織よりなる群から選ばれ た腫瘍である請求の範囲第１０項記載の方法。 12．皮膚の上皮細胞における毛髪の成長を刺激する方法であって、該細胞におけ るシンデカンの発現を刺激することからなる方法。 13．前記刺激された発現が、シンデカン遺伝子のエンハンサーエレメントに影響 を及ぼすことにより達成される請求の範囲第１２項記載の方法。 14．前記エンハンサ一エレメントが、図４のヌクレオチド配列（配列番号３）か らなる請求の範囲第１３項記載の方法。 15．前記刺激された発現が、シンデカン遺伝子のサプレッサーエレメントに影響 を及ぼすことにより達成される請求の範囲第１２項記載の方法。 16．前記細胞が間充織細胞である請求の範囲第１２項〜１５項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 8415−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ａ６１Ｋ 31/135 9455−4Ｃ 38/22 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/24 (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＲ，ＬＵ，ＬＶ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＵ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (71)出願人 ヤーコラ、パヌ ミコ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20500 ツルク、ケロンソイタヤンカツ 13 ベー 20 (71)出願人 ヤルカーネン、マルク タパニ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20760 ピースパンリスチ、ラウボランチ エ (71)出願人 レペー、シルパ マリアンネ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20660 リトイネン、バルキンチエ 14 アスント ６ (71)出願人 マリ、マルク サカリ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 24280 サロ、インケレーンチエ 176 (71)出願人 ビヒネン、タパニ アンテロ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20700 ツルク、カスケンカツ 11 セー 54 (72)発明者 ヴェリ、アニ マイヤ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 21420 リエト、ユハニンクヤ ２ アス ント ２ (72)発明者 アラーネン−クルキ、レーナ マリア フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20500 ツルク、ピースパンカツ ６ エ ー 31 (72)発明者 アウビネン、ペトリ オリ ビルヤミ ドイツ連邦共和国、デー―69126 ハイデ ルベルヒ、ロールバッハ、キルシュガルテ ン シュトラーセ ５ (72)発明者 ヤーコラ、パヌ ミコ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20500 ツルク、ケロンソイタヤンカツ 13 ベー 20 (72)発明者 ヤルカーネン、マルク タパニ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20760 ピースパンリスチ、ラウボランチ エ (72)発明者 レペー、シルパ マリアンネ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20660 リトイネン、バルキンチエ 14 アスント ６ (72)発明者 マリ、マルク サカリ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 24280 サロ、インケレーンチエ 176 (72)発明者 ビヒネン、タパニ アンテロ フィンランド共和国、エフイーエヌ― 20700 ツルク、カスケンカツ 11 セー 54

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．悪性細胞においてシンデカンの発現を誘導する、有悪性細胞の増殖を減少さ せる方法。
2. ２．前記誘導された発現が、シンデカン遺伝子のエンハンサーエレメント（配列 番号３）に影響を及ぼすことによってえられる請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記誘導された発現が、シンデカン遺伝子のサプレッサーエレメントに影響 を及ぼすことによってえられる請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記細胞がステロイド反応性である請求の範囲第１項、第２項または第３項 記載の方法。
5. ５．前記ステロイドがエストロゲンまたはアンドロゲンである請求の範囲第４項 記載の方法。
6. ６．前記細胞が、悪性乳細胞、子宮内膜細胞および前立腺細胞よりなる群から選 ばれた細胞である請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．前記方法がさらに、前記細胞を抗ステロイド物質にさらすことからなる請求 の範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記物質がトレミフェンまたはタモキシフェンである請求の範囲第７項記載 の方法。
9. ９．前記細胞が間充織細胞である請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の 方法。
10. 10．前記細胞がヒトの細胞である請求の範囲第６項または第９項記載の方法。
11. 11．前記細胞が、該細胞の成長因子を含有する、有効なレベルの組成物にさらさ れる請求の範囲第１項記載の 方法。
12. 12．前記成長因子が、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βならびにｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β からなる群より選ばれた因子である請求の範囲第１１項記載の方法。
13. 13．患者の悪性腫瘍の増殖を低下させる処置を必要とする該患者を処置する方法 であって、該方法が、該腫瘍細胞においてシンデカンの発現を誘導する、有効な レベルの組成物を該患者に投与することからなる方法。
14. 14．前記組成物がシンデカン遺伝子のエンハンサーエレメントに影響を及ぼす組 成物である請求の範囲第１３項記載の方法。
15. 15．前記組成物がシンデカン遺伝子のサプレッサーエレメントに影響を及ぼす組 成物である請求の範囲第１３項記載の方法。
16. 16．前記腫瘍が、ステロイドによって増殖が刺激される腫瘍である請求の範囲第 １３項、第１４項または第１５項記載の方法。
17. 17．前記ステロイドがエストロゲンまたはアンドロゲンである請求の範囲第１６ 項記載の方法。
18. 18．前記腫瘍が、乳、子宮内膜、前立腺または間充織組織よりなる群から選ばれ た腫瘍である請求の範囲第１７項記載の方法。
19. 19．前記組成物が抗ステロイド物質からなる組成物である請求の範囲第１３項記 載の方法。
20. 20．前記物質がトレミフェンまたはタモキシフェンである請求の範囲第１９項記 載の方法。
21. 21．組成物中の有効物質が成長因子からなる物質である請求の範囲第１３項記載 の方法。
22. 22．前記成長因子が、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βならびにｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β からなる群より選ばれた因子である請求の範囲第２１項記載の方法。
23. 23．前記患者がヒトである請求の範囲第１３項記載の方法。
24. 24．細胞分化をより分化した表現型へ誘導する方法であって、該細胞におけるシ ンデカンの発現を誘導する、有効なレベルの組成物に該細胞をさらすことからな る方法。
25. 25．組成物がシンデカン遺伝子のエンハンサーエレメントに影響を及ぼす組成物 である請求の範囲第２４項記載の方法。
26. 26．組成物がシンデカン遺伝子のサプレッサーエレメントに影響を及ぼす組成物 である請求の範囲第２４項記載の方法。
27. 27．前記細胞の増殖がステロイドによって刺激される請求の範囲第２４項記載の 方法。
28. 28．前記ステロイドがエストロゲンまたはアンドロゲンである請求の範囲第２７ 項記載の方法。
29. 29．前記細胞が上皮細胞である請求の範囲第２４項記載の方法。
30. 30．前記上皮細胞が表皮の皮膚細胞である請求の範囲第２９項記載の方法。
31. 31．前記細胞がヒトの細胞である請求の範囲第２４項記載の方法。
32. 32．前記組成物が抗ステロイド物質からなる請求の範囲第２４項記載の方法。
33. 33．前記組成物中の有効物質がトレミフェンまたはタモ キシフェンである請求の範囲第２４項記載の方法。
34. 34．前記組成物中の有効物質が成長因子である請求の範囲第２４項記載の方法。
35. 35．前記成長因子が、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βならびにｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β からなる群より選ばれた因子である請求の範囲第３４項記載の方法。
36. 36．皮膚の上皮細胞における毛髪の成長を刺激する方法であって、該細胞におけ るシンデカンの発現を刺激することからなる方法。
37. 37．前記刺激された発現が、シンデカン遺伝子のエンハンサーエレメントに影響 を及ぼすことにより達成される請求の範囲第３６項記載の方法。
38. 38．前記刺激された発現が、シンデカン遺伝子のサプレッサーエレメントに影響 を及ぼすことにより達成される請求の範囲第３６項記載の方法。
39. 39．前記細胞が間充織細胞である請求の範囲第３６項記載の方法。
40. 40．前記方法が有効レベルの成長因子を含有する組成物を投与することからなる 請求の範囲第３６項記載の方法。
41. 41．前記成長因子が、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βならびにｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β からなる群より選ばれた因子である請求の範囲第４０項記載の方法。