JPH08503963A

JPH08503963A - α‐ＭＳＨのペプチド誘導体及びそれらの適用

Info

Publication number: JPH08503963A
Application number: JP7509608A
Authority: JP
Inventors: デュスール，ダンテルラン、リュシアン; ピネル，アンヌ‐マリー
Original assignee: Institut Europeen de Biologie Cellulaire
Current assignee: Institut Europeen de Biologie Cellulaire
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 1994-09-22
Publication date: 1996-04-30
Also published as: CA2149925C; DE69417868T2; AU7785994A; US5830994A; FR2710340B1; FR2710340A1; CA2149925A1; EP0669938A1; WO1995008564A1; DE69417868D1; ATE178904T1; EP0669938B1

Abstract

(57)【要約】 α-ＭＳＨからの４つのアミノ酸の配列を少くとも１つ有し、アミノ酸が天然又は非天然形であり、上記配列がチオクト酸又はその誘導体と対応塩、エステル又はアミドの形で接合されているペプチド配列を含んだ化合物。

Description

【発明の詳細な説明】 α-ＭＳＨのペプチド誘導体及びそれらの適用本発明は、特にα-ＭＳＨ（“メラニン細胞刺激ホルモン”）のペプチド誘導体をリポイル-ペプチド形で提供する。 α-ＭＳＨ及びそのホモログは多数の公開文献又は治療試験の対象であったが、これは薬効のある生成物を生じなかった。主要な理由は投与量及び投与経路に応じたα-ＭＳＨの極端な遍在性である。更に、用量-効果関係の不在（多数のペプチドホルモンにあるケースである）はその治療上の使用をかなり複雑にしている。 α-ＭＳＨ及びそのホモログの細胞レセプターはＧ型に属し、細胞内導入は環状ＡＭＰサイクルに従い起きる。これら細胞レセプターの活性化は、膜レセプターの構造により許容されるペプチドホルモン用量と本質的に反比例している。本発明は、特に中枢神経系と末梢神経系のレベルで、いかなる他の薬理効果も排除して、一方では抗アレルギー及び抗炎症活性に、他方ではメラニン生産活性化活性に特異的に向けたペプチド構造に関する研究に基づいている。更に具体的には、本発明はα-ＭＳＨから得られる４つのアミノ酸の配列を少くとも１つ有し、そのアミノ酸が天然又は非天然形であって、上記配列がチオクト酸又はこの酸の誘導体と対応塩、エステル又はアミドの形で接合されているペプチド配列を含んだ化合物に関する。 α-ＭＳＨの配列は以下である：Ｎ-アセチル-Ｓｅｒ-Ｔｙｒ-Ｓｅｒ-Ｍｅｔ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏ-Ｖａｌ-ＮＨ₂- この式において、下記明細書のように、アミノ酸はＤ、Ｌ又はＤＬ形であり、非天然形のアミノ酸は誘導体、特に置換誘導体に相当する。チオクト酸又はα-リポ酸は酸化形：でも又はジヒドロリポ酸誘導体：の形であってもよい。この酸の誘導体の中では、酸化又はジヒドロ形のＮ-リジン誘導体が挙げられねばならない。本発明の主要目的の１つは、前記誘導体の局所（皮膚）経路による治療適用である。これらの化合物は、皮膚バリアを通り、細胞レセプターにペプチドフラクションを供給して、用量／効果関係タイプの生物学的応答を誘導することができる分子である。アミノ酸配列が修正されたこれらの低分子量ペプチドは活性な生化学基と塩、エステル又はアミドの形で結合されており、（特に、ミトコンドリアのレベルで）トリカルボン酸回路で生命維持上の役割を果たす。これらの補因子は酸化又は還元形のリポ酸又はチオクト酸とそれらのリポイル−リジン誘導体であって、これは細胞酵素系のポリペプチド鎖と共有結合で自然に結合される。更に具体的には、本発明は、抗アレルギー、抗炎症及びメラニン生産活性化活性を有した、リポイル-ペプチド及びリポイル-リシル-ペプチドの形で結合された４〜６つのアミノ酸のペプチドに関する。本発明による化合物は、少くとも下記配列を含んだペプチド配列を有することが好ましい： -Ｈｉｓ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ- 上記式中Ｐｈｅはフェニルアラニン又はフェニルアラニンのハロゲン化誘導体を表し、アミノ酸はＤ、Ｌ又はＤＬ形をとることができ、特にそれらは下記式を有する化合物である：〔Ｌｉｐ〕Ｘ-Ｈｉｓ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-Ｙ上記式中Ｌｉｐはチオクト酸又はその誘導体の１つである；ＸはＧｌｕ、ＯＨ又はＮＨ₂である；ＹはＴｒｐ-Ｇｌｙ-ＯＨＴｒｐ-Ｇｌｙ-ＮＨ₂ Ｔｒｐ-ＮＨ₂ Ｔｒｐ-ＯＨである；ＰｈｅはホモＰｈｅ又はｐ-フルオロＰｈｅである；アミノ酸はＤ、Ｌ又はＤＬ形である。本発明は更に具体的には下記化合物：Ｉ〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ II 〔ＤＨＬｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ III 〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…パラフルオロＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ …Ｇｌｙ…ＮＨ₂ IV 〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…ＮＨ₂ Ｖ〔Ｎ．リポイル−リジン〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ VI 〔Ｎ．リポイル−リジン〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ …Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ VII 〔Ｎ．リポイル-リジン〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…ＮＨ₂ と、塩、エステル又はアミドの形をしたこれら分子の誘導体に関する。式中、チオクト酸の位置はエステル又はアミド誘導体に対応し、チオクト酸の酸部分は結合を確実にする。上記アミノ酸配列は天然アミノ酸配列でも又は非天然アミノ酸配列であってもよい。同様に、一部の場合において、これらアミノ酸の一部は機能性基を有することができ、例えばそれらはグリコシル化及び／又は硫酸化される。これら形のすべてが本記載により包含されていると理解されるべきである。本発明は前記のような化合物を含有した医薬又は皮膚化粧品組成物にも関する。医薬組成物は経口、非経口、腹腔内で又は特に注射により投与できる形態でもよいが、好ましくは外部局所経路により投与できる形態をとる。これらの組成物は特に例えばクリーム、スプレー又はローションの形態をとってもよく、公知の賦形剤及び場合により他の活性成分を含有することができる。本発明による化合物は、アレルギー及び炎症の予防及び治療で特に有用である。配列が３位にアミノ酸パラフルオロフェニルを有するペプチドIIIは、モノカイン（ＩＬ１、ＩＬ６、ＴＮＦ-α）の免疫抑制による抗アレルギー及び抗炎症活性に特に向けられている。皮膚化粧品組成物は、紫外線への暴露なしに皮膚を日焼け色にするための促進剤として特に使用できる、溶液、ローション、エマルジョン又はクリームの形態をとることが好ましい。配列が３及び２位にアミノ酸Ｄ．ホモフェニルを有するペプチドII及びIVは、メラニン生産及びチロシナーゼ活性化のプロセスの刺激に特に向けられている。本発明によるペプチド配列は、当業者に知られているいずれかのプロセスにより、特にチオクト酸が付加できる化学合成のプロセスにより得ることができる。いずれの場合においても、ペプチドの大きさが小さければ、化学合成は完全に可能であり、非常に純粋な生成物を得ることを可能にする。例１化合物１の合成１-〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ 合成はＭＢＨＡ樹脂と保護基としてＦＭＯＣ（フルオレニルメトキシカルボニル）を用いて固相メリフィールド（Merrifield）法により行う。用いられるアミノ酸誘導体は以下である：ＦＭＯＣ…Ｇｌｙ…ＯＨＦＭＯＣ…Ａｒｇ（Ｔｏｓ）…ＯＨＦＭＯＣ…Ｔｒｐ…ＯＨＦＭＯＣ…Ｄ．ホモＰｈｅ…ＯＨＦＭＯＣ…Ｈｉｓ……（Ｔｒｔ）…ＯＨＦＭＯＣ…Ｇｌｕ……ｃｈｅｘ）…ＯＨこれらはカップリング剤としてＢＯＰを用いてカップリングさせる。各アミノ酸とＢＯＰ（×２）を過剰（×２）に用い、各カップリングを２回繰返す。リポ酸を同様にカップリングさせ、ＦＭＯＣ基を各段階においてピペリジン（ジメチルホルムアミド中２０％）で除去する。最終脱保護は２段階：ａ）トリフルオロ酢酸（５分間×２）ｂ）無水フッ化水素酸／ｐ-クレゾール９５．５（４５分間）で行う。収率７８％で得られた粗製化合物を水／９５．５％酢酸混合液に溶解し、その後凍結乾燥する。得られた化合物１は８２％の純度（ＨＰＬＣ）を有する。この化合物１００mgをＣ１８カラムを用いたＨＰＬＣにより精製する。純粋生成物６５mgを得る。保持時間＝下記条件下で１７．０４分間 -Ｃ８カラム（２５０×５mm）、ＵＶ検出２１０nm -溶媒リン酸緩衝液トリエチルアミン-アセトニトリル１０〜６０％で１５分間− 流速１．４ml/min アミノ酸の分析：Ｇｌｕ１．０２-Ｇｌｙ１．０１-Ｈｉｓ１．００-Ａｒｇ０．９４-Ｄ．ホモＰｈｅ１．０３- トリプトファンは、それが酸加水分解時に分解されることから、測定しなかった。質量スペクトル（ＦＡＢ＋）1018.4/1126.5例２及び３ＤＬ-リポ酸をＤＨ-リポ酸で置換することにより、化合物２を得る：〔ＤＨＬｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ… ＮＨ₂ ＦＭＯＣＤ．ホモＰｈｅ−ＯＨをＦＭＯＣパラフルオロＰｈｅ-ＯＨで置換することにより、化合物３を得る：〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…パラフルオロＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ 例４化合物４の合成その操作では：〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…ＮＨ₂ を製造するために例１のように行う：物理定数： m.p.１３０℃-保持時間１９．７２分間 “ヌクレオシル”（Nucleosil）Ｃ１８カラム-ＵＶ-２７９ｎｍ溶媒ＴＦＡ-０．１％アセトニトリル７５／２０流速-１．２ml/min アミノ酸の分析：Ｈｉｓ０．８０-ＤｈＰｈｅ１．１１-Ａｒｇ０．９６Ｔｒｐ分析せず化学質量８８７．１８例５〜７上記のように操作を行うことにより、以下を得る：化合物５〔Ｎ．リポイル-リジン〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ… Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ 化合物６〔Ｎ．リポイル-リジン〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ… Ｇｌｙ…ＮＨ₂ 化合物７〔Ｎ．リポイル-リジン〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ… ＮＨ₂ 例８マウスでインターロイキン１“ＩＬ１”の合成の阻害に関する誘導体化合物４の免疫抑制活性の研究ＩＬ１の分泌をＢＡＬＢ／Ｃマウスへのリポ多糖“ＬＰＳ”の非経口投与により誘導する。微生物感染時における細菌リポ多糖の放出は、敗血症性ショックを含めた激烈な炎症反応に関与するモノカインのインターロイキン１“ＩＬ１”、インターロイキン６“ＩＬ６”及び“腫瘍壊死因子”ＴＮＦ−αの体内における合成及び放出を強く誘導する。物質化合物４（Ｐ-IV）を生理塩水に溶解する。それを−２５℃で貯蔵された溶液で“Ｐ-IV”の正確なアッセイを行える分光測定アッセイにより２８０nm（トリプトファンのアッセイ）で定量分析する。リポ多糖“ＬＰＳ” 大腸菌血清型０１２７-Ｂ８-“Ref.SIGMA-L3137”の抽出物を生理塩水中６mg/ mlの濃度で用いる。動物ＩＦＦＡ-ＣＲＥＤＯから得たＢＡＬＢ／Ｃマウス-雌性-５週齢を２４時間のうち１２時間の光の明期に付し、水及び飼料を自由に与える。方法２つの技術をこのアッセイを行うために開発した： -１つはＰIVの抗炎症活性を証明するために用いられる５日間処理に基づく（ “シーハン”（SHEEHAN）技術と呼ばれる） -単一処理に基づく他方は、結果的にかなり迅速であり、Ｐ IV活性のコントロールに役立つ（“デイネス0141”（DAYNES）技術）。１-シーハン技術ａ）投与量３つの投与量を調べる： -生理塩水０．２ml中ＰIV１ng（即ち、５ng/ml） -生理塩水０．２ml中ＰIV０．５ng（即ち、２．５ng/ml） -生理塩水０．２ml中ＰIV０．１ng（即ち、０．５ng/ml）ｂ）動物の処理マウスを動物５匹の５群に分けて行った： -１つの陰性コントロール群 -１つの陽性コントロール群 -３つのＰIV群（投与量毎に１群）コントロール群の動物は生理塩水０．２mlの皮下注射をうけ、ＰIV群の動物は様々な投与量で生成物の皮下注射をうける。この処理には５日間かかる。ｃ）ＩＬ１αの誘導Ｐ IV処理から４８時間後に、致死量以下のＬＰＳ（生理塩水０．２ml中１．２mg）をＰIV群及び陽性コントロール群の各動物に腹腔内注射する。ｄ）血清の生産１８０分間後、すべてのマウスを後眼窩洞から乾燥チューブで穿刺した。血液凝固すると直ちに、血餅を分離させる。血液を１０℃の温度において１８００ｇで１０分間遠心する。血清を集めて、−２５℃で凍結させる。２-デイネス技術ａ）投与量３つの投与量を調べる： -生理塩水０．２ml中ＰIV４０μｇ-即ち、２００μg/ml -生理塩水０．２ml中ＰIV２５μｇ−即ち、１２５μg/ml -生理塩水０．２ml中ＰIV１０μｇ-即ち、５０μg/ml ｂ）動物の処理マウスを動物５匹の５群に分けて行った： -１つの陰性コントロール群 -１つの陽性コントロール群 -３つのＰIV群（投与量毎に１群）コントロール群の動物は生理塩水０．２mlの静脈内注射をうける。ＰIV群の動物は様々な投与量で生成物の静脈内注射をうける（尾静脈）。ｃ）ＩＬ１αの誘導直後に、致死量以下のＬＰＳ（生理塩水０．２ml中１．２mg）をＰIV群及び陽性コントロール群の各動物に腹腔内注射する。ｄ）血清の生産１８０分間後、すべてのマウスを後眼窩洞から乾燥チューブで穿刺する。血液凝固すると直ちに、血餅を分離させる。血液を１０℃の温度において１８００ｇで１０分間遠心する。血清を集めて、−２５℃で凍結させる。３-ＩＬ１αのアッセイこれらの血清中に含有されるインターロイキン-１αをネズミＩＬ１α ＥＬＩＳＡアッセイキット（ref.1900 00ゲンザイム（GENZYME））でサンプリング後２４時間調べる。 -キットの簡単な説明：このアッセイに用いられた方法はサンドイッチタイプである。第一抗ネズミＩＬ１αモノクローナル抗体を用いる。次いでサンプルをいれて、第二ビオチニル化抗ＩＬ１α抗体を反応させる。発現はペルオキシダーゼにカップリングされたアビジンで起こす。発色反応ではテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いる。読取りはマルチスキャン（MULTISKAN）ＭＣＣ３４０ＭＫＩＩ〔タイターテック（TITERTEK）〕プレートリーダーにおいて４５０nmで行う。シーハン法により得られた結果は下記表１で示されている：投与量毎に得られたＩＬ１αの平均減少率は５つすべての研究において５５％程度である（２００μg/mlで６０％、１２５μg/mlで５０％及び５０μg/mlで５０％）。得られたすべての結果は、ＩＬ１α合成阻害作用を介したＰIVの抗炎症活性について示している。実際に、用いられた２つの方法において、コントロールと比較して少くとも５０％のインターロイキン-１αの合成減少が観察される。この抗炎症活性は腫瘍壊死因子-αに対するＰIVの免疫抑制活性の研究で追認された。得られた結果（−４０％）はインターロイキンＩＬ１及びＴＮＦ-αの合成に関するＰIVの抑制活性を示している。致死量のＬＰＳをうけた処理動物の防御も観察された：この防御のためにかなり有意の死亡速度遅延化が起きる。例９ペプチドＰIVによるＴＮＦ-αの活性の阻害物質及び方法例８で記載されたデイネス技術を用いる。デイネス技術ａ）投与量３つの投与量を調べる： -生理塩水０．２ml中ＰIV４０μｇ-即ち、２００μg/ml -生理塩水０．２ml中ＰIV２５μｇ-即ち、１２５μg/ml -生理塩水０．２ml中ＰIV１０μｇ−即ち、５０μg/ml ｂ）動物の処理マウスを動物５匹の５群に分けて行った： -１つの陰性コントロール群 -１つの陽性コントロール群 -３つのＰIV群（投与量毎に１群）コントロール群の動物は生理塩水０．２mlの静脈内注射をうける。ＰIV群の動物は様々な投与量で生成物の静脈内注射をうける（尾静脈）。ｃ）ＴＮＦ-αの誘導マウスの処理直後に、致死量以下のＬＰＳ（生理塩水０．２ml中１．２mg）を処理群及び陽性コントロール群の各動物に腹腔内注射する。ｄ）血清の生産９０分間後、すべてのマウスを後眼窩洞から乾燥チューブで穿刺する。血液凝固すると直ちに、血餅を分離させる。血液を１０℃において１８００ｇで１０分間遠心する。血清を集めて、−２５℃で凍結させる。ＴＮＦ-αのアッセイこれらの血清中に含有されるＴＮＦ-αをネズミＴＮＦ-α ＥＬＩＳＡアッセイキット（ref.1509-00ゲンザイム）でサンプリング後２４時間調べる。 -キットの簡単な説明：このアッセイに用いられた方法はサンドイッチタイプである。第一抗ネズミＴＮＦ-αモノクローナル抗体を用いる。次いでサンプルをいれて、第二抗ＴＮＦ-αヤギ抗体を反応させる。発現はペルオキシダーゼ標識抗ヤギ免疫グロブリンロバ抗体で起こす。発色反応ではｏ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いる。読取りはプレートリーダー（タイターテックＭＫＩＩＭＣＣ３４０）において４９２nmで行う。得られた結果は下記表２で示されている：この方法では上記で得られた平均結果を示す。実際に、投与量毎に得られたＴＮＦ-αの平均減少率は５つすべての研究において４０％程度である（２００μg/mlで４６％、１２５μg/mlで４０％及び５０ μg/mlで３７％）。例１０ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）接触過敏症試験によるペプチド化合物の抗アレルギー活性の研究物質及び方法化合物３“ＰIII”１-２-３群化合物４“ＰIV”４-５-６群５週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＪＩＣＯマウスを動物１０匹の１０群に分け（５匹／ケージ）、水及び飼料に自由に近付けるようにして、２４時間のうち１２時間の光の明期に付す。１〜６群の動物は、背面の剃毛皮膚に、局所塗布当たり、プロピレングリコールに溶解された被験生成物を、５０μｌの一定用量で、連続５日間にわたり毎日与える。投与量／マウス及び／日ＰIII-１-２-３群-２．５μg-０．５μg-０．１μg-マウス／日ＰIV-４-５-６群-２．５μg-０．５μg-０．１μg-マウス／日Ｘ群の動物をコントロールとして使う（５日間にわたり局所塗布当たりプロピレングリコール５０μｌのみを与える）。５日目、最終塗布の３０分間後に、すべてのマウスを剃毛皮膚の背面領域においてアセトン（ＳＤＳ ref.0510）及びトリオレイン（フルカ）の４：１混合液中２％でＤＮＦＢ〔２，４-ジニトロ-１-フルオロベンゼン（フルカ・ケミカ・プルム）（FLUKA CHEMIKA PURUM），９７％バッチ No.33820890〕２５μｌで局所塗布して感作する。６日目に、新たな感作をＤＮＦＢの塗布により行う。１１日目に、マウスの耳の厚さをマイクロメーター〔ロッチ（ROCH）、０〜２５mmで１／１００mm単位〕の助けで測定して基本値を得、その後耳を０．８％ＤＮＦＢ２０μｌの局所塗布により刺激する。１２日目に、耳の厚さを再度測定する。耳の厚さの平均値を被験生成物を与えた群のマウスと、コントロール群のマウスについて確定する。抑制率は適宜に下記計算で表示する：結果は下記表３〜６で示されている：ＰIII及びＰIVは上記実験条件下でジニトロフルオロベンゼンの投与により誘導される皮膚過敏症反応をかなり有意に“６７．９０％及び６８．１１％”で抑制する。例１１ＰIII及びＰIVの抗炎症活性の研究１）研究の目的ＩＬ１により刺激された繊維芽細胞によるアラキドン酸の代謝産物ＰＧＥ２の生産に関するペプチドＰIII及びＰIVの阻害効果の証明２）方法２-１ヒト起源の胚肺性繊維芽細胞の培養：我々は研究所で継続的に維持されて、Cannonら（J.Immunol.，1986）で既に試験された、ＡＴＣＣＭＲＣ５株を選択して用いた。継代培養後、繊維芽細胞をマイクロウェル〔２cm²の２４ウェルプレート、ファルコン（Falcon）〕で培養する。接種物は３００００細胞／ウェルである。用いられた栄養培地はＲＰＭＩ１６４０（９０％）及び無補体牛胎児血清（ＦＣＳ、１０％）から構成される。培地は細胞が密集するようになるまで２日毎に変える。２-２実験の準備：こうして得られた単細胞層を洗浄し、１％ＦＣＳのみ含有の新鮮培地中で２４時間プレインキュベートする。被験物質を１０^-6〜１０^-4Ｍの様々な濃度で培地に加える。これら化合物の存在下で２０分間のインキュベート後、ヒト組換えＩＬ１〔テブ（Tebu）、フランス〕を５、２．５又は０．５ng/ml培地の濃度で細胞と１８時間接触させておく。このインキュベート後、上澄を集め、分析を行うまで−８０℃で凍結する。単細胞層をメタノールで固定する。２-３ＰＧＥ２のアッセイ：ＲＩＡアッセイをDrayら（Europ.J.Invest.,1975）により記載された方法に従い行う。３組の実験を重複して各濃度の被験生成物及びコントロールについて行った。結果はpg/μgＤＮＡで表示する。阻害効果はコントロールに対する％で表示する。光学顕微鏡検査によるカウントのせいで起こりうるエラーを避けるために、ＤＮＡはBrunkら（Analytical Biochem.，1979）により記載された操作に従い蛍光測定法で調べた。下記表７はＭＲＣ５株に関する１組目の試験を示している。ＰIIIの良好な阻害作用が用量-効果関係で観察された。この作用はＩＬ１濃度に依存していない。作用は双方の場合において１０^-7Ｍ以下で観察されなかった。ＰIII及びＰIVはＩＬ１及びＰＧＥ２の作用に対して阻害力を有する。この非常に有意な作用はレセプターの遮断と関連しているかもしれない。例１２皮膚クリームの形態で局所塗布後のマウスメラニン生産に関するＰIII及びＰIV の作用の研究（ワレン技術）物質及び方法１）物質 -化合物３ＰIII 〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-パラＦＰｈｅ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ｇｌｙ-ＮＨ₂ -化合物６ＰVI 〔Ｎ．リポイル-リジン〕-Ｈｉｓ-Ｄ．ホモＰｈｅ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ｇｌｙ-ＮＨ₂ -皮膚賦形剤No.６６ラノ（Lano）-石油ゼリー-Ａｃ流動パラフィン蜜ロウエトキシル精製ラノリンＰＥＧ-２００皮膚処方皮膚賦形剤No.６６中に５％の量で配合されたペプチドＰIII及びＰVI動物ＤＢＡ／２マウスＩＦＦＡ-ＣＲＥＤＯ５週齢２）方法・背面剃毛領域を脱毛後に各動物で画定する。・被験生成物を５日間にわたり各調製物５０μｌの１日２回塗布の割合で擦り込む。・最終塗布の２日後、動物を屠殺して、処理皮膚の約５０mg分画を集める。・各サンプルを凍結乾燥により乾燥して、秤量する。・次いで皮膚分画を４５℃で７２時間にわたりプロテアーゼＫによる酵素加水分解に付す〔プロテアーゼＫメルク（Merck）-24.568〕。・Ｎａ₂ＣＯ₃５００μｌ及びＨ₂Ｏ₂２０μｌを３５％で得られた加水分解産物に加える。・インキュベートを８０℃で３０分間行う。・冷却後、クロロホルム／メタノール（２vol/１vol）２００μｌを各サンプルに加える。・混合液を１００００ｇで遠心する。・水相（２００μｌ）を“ヌンク”（NUNC）マイクロプレートのウェル中に分配する。メラニンのアッセイ・メラニンのアッセイは、シグマ（Sigma）M.8631メラニンからなる検量系と比較して、マルチスキャン-タイターテック-ＭＣＣ-３４０の助けにより４０５n mで行う。結果それらはコントロールとみなされる賦形剤と比較したメラニンの％で表示する。Ｉ-クリームＰIII-クリーム５０μｌ当たり５×１０^-5ＭのＰIII IIクリームＰVI-クリーム５０μｌ当たり５×１０^-5ＭのＰVI III-賦形剤６６-コントロールＣ刺激の％ＱＳ＝メラニンの平均量／mg皮膚-サンプルＱＣ＝メラニンの平均量／mg皮膚-コントロール局所投与されたＰVI含有の皮膚クリームは、表皮でのメラニン合成をかなり有意に誘導する（＋７１％）。本発明の対象と一致するこの活性は、Ｎ．リポイル-リジン及びＤ．ホモフェニル基を有するＰVIの化学構造と関連している。処方剤がＰIIIを含有している、局所投与される皮膚クリームは、表皮メラニン生産の刺激について活性を有さず、活性のこの不在は本発明の対象と一致する “パラフルオロフェニル”基のＰIIIの構造中における存在と関連している。これらの結果は、ラットでクロードマン（CLOUDMAN）のメラノーマ細胞を用いたメラニン細胞のインビトロ培養により、“クロードマン”技術に従いメラニン生産の研究で確認した。得られたすべての結果は、目的が局所経路で活性なペプチド誘導体の製造である本発明の対象と一致し、その抗アレルギー及び抗炎症活性は考えられる適用に応じてメラニン生産の活性から分離できる。例１３ＤＮＦＢ接触過敏症に関するリポイル-ペプチド及びそれらのペプチド構造の活性の比較研究物質及び方法用いられた方法は、例１０で前記された方法である。ジニトロフルオロベンゼン“ＤＮＦＢ”によりマウスで誘導された接触過敏症被験生成物Ｉ群：（ＤＬ）-Ｌｉｐ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｄ．ホモＰｈｅ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ｇｌｙ- ＮＨ₂ II群：Ｈ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｄ．ホモＰｈｅ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ｇｌｙ-ＮＨ₂ III群：コントロール＝（ＤＬ）-リポ酸溶媒：例１０でコントロールとして既に用いられたプロピレングリコールコントロールの活性の測定は各実験について行う。実験及び用量Ｉ群：用量１＝１μg/マウス／日２＝１０μg/マウス／日３＝１００μg/マウス／日 II群：用量４＝１ng／マウス／日５＝１０ng／マウス／日６＝１００ng／マウス／日コントロール：用量“ＤＬ-リポ酸”＝１０ng／マウス及び／日５日目、最終塗布の３０分間後に、すべてのマウスを剃毛皮膚の背面領域においてアセトン（ＳＤＳ ref.05510）及びトリオレイン（フルカ）の４：１混合液中２％でＤＮＦＢ〔２，４-ジニトロ-１-フルオロベンゼン（フルカ・ケミカ・プルム）、９７％バッチNo.33820890〕２５μｌで局所塗布して感作する。６日目に、新たな感作をＤＮＦＢの塗布により行う。１１日目に、マウスの耳の厚さをマイクロメーター（ロッチ、０〜２５ｍｍで１／１００mm単位）の助けで測定して基本値を得、その後耳を０．８％ＤＮＦＢ２０μｌの局所塗布により刺激する。１２日目に、耳の厚さを再度測定する。耳の厚さの平均値を被験生成物を与えた群のマウスと、コントロール群のマウスについて確定する。抑制率は適宜に下記計算で表示する：結果Ｉ群-リポイル-ペプチド-Ｉ皮膚過敏症の抑制率７９％が１００ng／マウス／日の用量で観察される。明白な用量／効果関係も１〜１０ngと１００ngの用量で観察される。II群-ペプチド単独皮膚過敏症の抑制率４０％が１０ng／マウス／日の用量で観察される。１ng及び１００ngの用量では、抑制応答率は３７．０８及び２７．１５％程度であり、用量／効果タイプ関係を観察できない。コントロール群-リポ酸単独皮膚過敏症の抑制効果は、プロピレングリコール溶液でリポ酸の投与により観察されない。前記実験条件下で局所投与すると、“リポイルペプチド”構造はマウスで皮膚過敏症の抑制をかなり有意に誘導する。例１４胚-毒性インビトロ培養でのメラニン細胞分化に関するＰIVの効果の定性及び定量分析被験サンプル-化合物４＝ＰIV生物物質規定された純粋な塩水培地中インビトロ培養で単離された胚細胞（標準培養条件：２ml培地／培養）胚領域を、メラニン細胞誘導直後に、第一段階のメラニン生産から〔トリトン（Trlton）胚及びアキソロトル（Axolotl）胚から〕集める。この初期段階の胚成長時に、個体化するようになった神経隆起はすべてのメラニン芽細胞前駆体を含有している。神経隆起及び下層中胚葉の細胞の培養によれば、メラニン芽細胞を様々なカテゴリーに属する様々な他の細胞前駆体、即ち神経芽細胞、筋芽細胞、表皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞と一緒に（完全同一条件下で）共培養することができる。これによりメラニン細胞及び様々な他の細胞タイプに対するＰIVの効果について生体物質で比較動態研究を行える。培養期間（一次培養）：２０℃で２〜３週間細胞分化は形態学上３日目から現れ、実際上８〜１０日間の培養で完了する。処理１用量／応答試験一連のＰIV濃度を分析した：０．０１μg/ml、０．１μg/ml、１μg/ml及び１０μg/ml ０．０１μg/ml：無効果１μg/ml：メラニン細胞分化で最良の効果（“結果”のところで示された基準に従う）したがって、下記２用量をこの研究のために選択した：０．１及び１μg/ml ２処理培養細胞の接種時に１回の処理。それらの付着後（２０℃で３日間）、培地をペプチドＰIVのない新鮮培地と交換する。接種時の処理及び培地の交換時に２回目の処理結果質的性質の効果１）メラニン生産に関するＰIVの刺激効果２）この効果は細胞毒性現象を伴わない。３）他のカテゴリーの培養細胞は影響されない；それらの形態及びそれらの分化は正常に進行するが、但しコントロールの場合よりも短くて密な網状組織をした神経突起伸長を有するニューロンの場合を除く。これらのニューロンは神経堤（神経隆起）に由来し、したがって末梢神経系の起源のニューロンであることに留意すべきである。４）毒性作用は観察されない；メラニン芽細胞以外のすべての細胞は未処理コントロール細胞のように分化及び成長する。定量分析メラニン生産に関するＰIVの下記効果は、メラニン細胞の大きさの増加だけではなく（cf.プレートＩ及びII）：５）それらの数の増加６）生合成メラニンの量に関する増加によっても示される。Ａ-メラニン生産に関するＰIVの刺激効果１）上記刺激効果は２回処理及び１回処理後に同様に現れることを強調することが重要である（この場合、細胞はそれらがまだ形態的に未分化のメラニン芽細胞である最初の２日間の培養時のみＰIVの存在下で維持される。したがって、最適な刺激を有するためには、それら分化の全期間にわたりＰIVの存在下でこれらの細胞を維持することは不要である）。ＰIVの刺激効果はトリトン及びアキソロトルの胚細胞で完全に同様に現れた。２）メラニン細胞の表現型分化はコントロール培養物よりも（接種後２日目からの）処理培養物で迅速にみられる。３）メラニン生産の刺激はメラニン細胞の大きさに影響を与え、１μg/mlで処理すると８日間の培養後には４倍まで、更には５倍までも増加させる。４）ＰIVの刺激効果は生合成メラニンの量にも影響を与える。処理されたメラニン細胞の生体物質での唯一の観察から、それらがそれらの大きなサイズにもかかわらずコントロールメラニン細胞よりもかなり黒ずんでいると観察することができる。我々は： -電気化学検出でＨＰＬＣ -４７０nmで分光測定（TOMITAら、1990の方法の塗布）による２つのメラニンアッセイを開発した。これらアッセイの開発は、検出の比較感度及び最少レベルをいずれの方法でも調べるために、メラニン（シグマ、ref.M8631）の標準溶液を用いて行った。μ ｇは分光測定により検査できる最少レベルである；ｎｇはＨＰＬＣにより検査できる最少レベルである。しかしながら、これら２つの技術、特に分光測定アッセイは、我々の細胞培養にとり、培養に関係する１５の胚外植片が（分光測定による）定量を行う上で十分にあるため、使用できることが観察される。処理メラニン細胞は細胞毒性の明白な徴候を示さないことに留意すべきである。更に、それらはインビトロでコントロールメラニン細胞の場合に匹敵する寿命を有している。Ｂ-他の共培養細胞カテゴリーに対するＰIVの効果繊毛及び無繊毛表皮細胞、間葉細胞、繊維芽細胞： -特異的細胞増殖なし -それらの大きさ、それらの拡散等に刺激効果なし -細胞毒性作用なし -それらの分化、それらのインビトロ挙動に遅延又は促進なし繊維芽細胞（ＰＮＳの胚起源）： -ニューロンの数又は細胞体の大きさに特異的刺激効果なし（プレートII、Ａ）神経突起網状組織の形態に関する効果：全体として、処理培養物の神経突起網状組織はコントロール神経突起よりも短くて分散している神経突起からなる。この観察はもっと細かく分析すべきである。すべての観察及び定量は、記載された現象の再現性を完全にコントロールするために、数種類の実験系で行った。例１５インビトロ培養胚細胞に対するペプチドＰＩ及びＰIVの効果…“メラニン細胞- ニューロン-筋肉細胞及び繊維芽細胞…” 物質及び方法開発された実験条件は以下である： -用量１μg/ml（用量／応答試験により決定） -細胞の接種時に１回処理又は数回の連続処理（４８時間毎に培地の交換） -培養期間：６〜８日間 -定量１）メラニン細胞のカウント２）ＨＰＬＣ及び／又は分光測定によるメラニンのアッセイ -培養物の毎日の観察 -透過型電子顕微鏡検査による超微細構造メラニン生産に関するＰＩ及びＰIVの刺激効果メラニン細胞の前駆体である胚細胞のＰＩ及びＰIV処理は、質的観点及び量的観点の双方からそれらの分化を刺激する。メラニン細胞の数は培養で少くとも２倍に増加する。細胞当たりの生合成メラニンの量も、８日間の培養後に、匹敵する倍率で増加する（１．４ng／細胞）。 TITN-ALCATEL SAMBA 2005システムで共焦顕微鏡検査による研究の予備試験では、メラニン粒子（メラノソーム）自体を分析できることを示している。ペプチドＰＩ及びＰIV処方はメラニン芽細胞の分化を刺激する。以下の顕著な結果を強調することが重要である。それらはメラニン芽細胞経路でまだ調べられていない前駆体胚細胞を刺激しない。したがって、それらは誘導物質ではなく、ターゲットとしてメラニン芽細胞のみを有し、前駆細胞に無効果で、既に誘導されたメラニン芽細胞で刺激効果を有する。ＰＩ及びＰIVの細胞毒性の分析 -神経芽細胞２つの被験ペプチド処方は神経芽細胞又はニューロンで毒性又は刺激効果を有しない。細胞体の大きさ、神経突起の長さ及び数、超微細構造と、最後に処理ニューロンの寿命は、コントロールニューロンの場合に匹敵する。 -グリア細胞（星状細胞）毒性作用はＰＩ及びＰIVで処理された大グリア細胞で観察されず、それは正常に分化して、コントロール星状細胞と比較して遅延はない。 -筋芽細胞ここでも、毒性作用は超微細構造レベルであっても検出されない。筋芽細胞は、コントロール筋芽細胞と比較して、遅延及び異常性なしに拡散及び分化する。 -繊維芽細胞、間葉類似結果が得られる：毒性作用は観察されない。一方ではメラニン生産に関する、他方では様々な他の細胞カテゴリーの分化に関するＰＩ及びＰIV効果についてすべての細胞学及び生化学研究では、以下を証明している： -ＰＩ及びＰIVは質的観点及び量的観点の双方からメラニン生産を刺激する。 -ＰＩ及びＰIVは研究された他の細胞タイプ、即ちニューロン、星状細胞、筋肉細胞、繊維芽細胞等で刺激効果がない。 -ＰＩ及びＰIVは全く正常に分化及び成長するこれら様々な細胞カテゴリーで細胞毒性作用を有しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/22 ＡＢＥＡＢＦ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１． α-ＭＳＨから得られる４つのアミノ酸の配列を少くとも１つ有するペプチド配列を含んだ化合物であって、アミノ酸が天然又は非天然形であり、上記配列がチオクト酸又はこの酸の誘導体と対応塩、エステル又はアミドの形で接合されている化合物。２．ペプチド配列が少くとも下記配列： -Ｈｉｓ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ- （上記式中Ｐｈｅはフェニルアラニン又はフェニルアラニンのハロゲン化誘導体を表し、アミノ酸はＤ、Ｌ又はＤＬ形をとることができる）を含んでいる、請求項１に記載の化合物。３．下記式：〔Ｌｉｐ〕Ｘ-Ｈｉｓ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-Ｙ（上記式中Ｌｉｐはチオクト酸又はその誘導体の１つである；ＸはＧｌｕ、ＯＨ又はＮＨ₂である；ＹはＴｒｐ-Ｇｌｙ-ＯＨＴｒｐ-Ｇｌｙ-ＮＨ₂ Ｔｒｐ-ＮＨ₂ Ｔｒｐ-ＯＨである；ＰｈｅはホモＰｈｅ又はｐ-フルオロＰｈｅである；アミノ酸はＤ、Ｌ又はＤＬ形である）を有する、請求項２に記載の化合物。４．チオクト酸誘導体がチオクト酸、ジヒドロリポ酸及びＮ-リポイル-リジンから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。５．下記配列：Ｉ〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ II 〔ＤＨＬｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ III 〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…パラフルオロＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ …Ｇｌｙ…ＮＨ₂ IV 〔（ＤＬ）Ｌｉｐ〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…ＮＨ₂ Ｖ〔Ｎ．リポイル−リジン〕Ｇｌｕ…Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ VI 〔Ｎ．リポイル−リジン〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…Ｇｌｙ…ＮＨ₂ VII 〔Ｎ．リポイル−リジン〕Ｈｉｓ…Ｄ．ホモＰｈｅ…Ａｒｇ…Ｔｒｐ…ＮＨ₂ と、塩、エステル又はアミドの形をしたこれら分子の誘導体のうち少くとも１つを含んでいる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。６．一部アミノ酸がグリコシル化及び／又は硫酸化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。７．請求項１〜５のいずれか一項に記載された少くとも１種の化合物を活性成分として含有している医薬組成物。８．経口又は腹腔内投与されるように処方されている、請求項７に記載の組成物。９．外部局所経路で投与されるように処方されている、請求項７に記載の組成物。１０．アレルギー及び／又は炎症反応の治療用である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。１１．請求項１〜６のいずれか一項に記載された少くとも１種の化合物を含有している皮膚化粧品組成物。