JPH08504087A

JPH08504087A - 自己組立て組換えパピローマウィルスキャプシッド蛋白質

Info

Publication number: JPH08504087A
Application number: JP50748194A
Authority: JP
Inventors: アール．ロウィー、ダグラス; ティー．シラー、ジョン; キルンバウアー、ラインハルト
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 1996-05-07
Anticipated expiration: 2023-02-13
Also published as: ES2248791T3; EP1621635A2; US20030219873A1; EP1538209A2; US5744142A; US5756284A; US7361356B2; DE69333859D1; AU2004203609A1; CA2143845C; AU2004203609B2; NL300275I1; EP1621635A3; DE122007000027I1; JP2004208696A; WO1994005792A1; LU91388I2; US5871998A; ATE302795T1; EP0662132A1

Abstract

(57)【要約】配座抗体エピトープを含むキャプソメア構造体及びウィルスキャプシッドに自己組み立て可能な組み換えパピローマウィルスキャプシッドタンパク質が提供される。キャプソメア構造体及びウィルスキャプシッドは、ウシ、サルまたはヒトパピローマウィルスＬ１配座をコード化する配列のタンパク質の発現産物であるキャプシッドタンパク質からなり、脊椎動物において高い力価で中性化抗体応答を誘導するワクチンとして調整することができる。自己組み立てキャプシッドタンパク質はまたパピローマウィルス感染症用の診断の免疫学的検定法の要素として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】自己組立て組換えパピローマウィルスキャプシッド蛋白質技術分野本発明は組換えウィルスタンパク質に関する。特に、本発明はウィルス感染症の診断、予防および治療における使用に適した組換えウィルスタンパク質に関する。背景技術パピローマウィルスはヒトを含むさまざまな種の動物の上皮に感染し、一般に感染部位に良性の上皮および腺維上皮腫細胞、すなわちいぼ状組織を誘発する。脊椎動物の種はそれぞれ、はっきりと区別できる一群のパピローマウィルスに感染する。各パピローマウィルス群は、いくつかの型のパピローマウィルスを含む。例えば、６０種類を超える数のヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）遺伝子型が単離されている。パピローマウィルスは上位種に特異的な感染因子である。例えば、ウシパピローマウィルスがヒトなどの異種において乳頭腫を誘発することはできない。また、パピローマウィルスの型も、あるパピローマウィルス型による感染に対する中和免疫性は通常は他の型に対する免疫性を持たせることはないという点で免疫抗原としては極めて特異的であることが分かっている。これらの型が相同種に感染するとしても、である。ヒトでは、ヒトパピローマウィルスによって引き起こされる性器疣贅は性的に伝播する疾病である。性器疣贅はごく普通に起こり、無症状すなわち不顕性のＨＰＶ感染は臨床感染よりもさらに一般的に見られるものである。ヒトにおける良性病変、特にある特定のパピローマウィルス型から生じる良性病変は、進行して悪性に変わる。このため、悪性腫瘍関連パピローマウィルス型の１つによる感染は、世界的に見て女性で２番目に多いガンである頚部ガンの発達における最も危険な要因であると考えられている（ｚｕｒＨａｕｓｅｎ，Ｈ．，１９９１；Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．，１９９２）。頚部ガンでは何種類かのＨＰＶ遺伝子型が発見されたが、ＨＰＶ１６は頚部ガンの５０％から単離される最も一般的な型である。パピローマ抗原に対する中和抗体の産生についての免疫学的研究から、脊椎動物ではパピローマウィルス感染およびこれらの感染に関連した悪性腫瘍は、免疫処置によって防止可能であるということが分かっている。しかしながら、効果的なパピローマウィルスワクチンの開発はさまざまな困難さが原因で滞っている。まず、効果的なワクチンの開発には必須であるパピローマウィルスの構造および免疫遺伝学的特徴を特定するために必要な感染性ウィルスの多量のストックを in vivoで生成するのは不可能であった。培養細胞はパピローマウィルスオンコタンパク質およびその他の非構造的タンパク質を発現するが、これらの細胞はin vitroにおいて熱心に研究されてきた。しかしながら、構造的ウィルス蛋白質Ｌ１およびＬ２（および感染性ウィルスの次のアセンブリ）は、感染した上皮組織の末端的に違えた層においてのみ発生する。従って、ウィルス遺伝子、タンパク質および構造の特徴は、必然的に乳頭腫から採集したウィルスについての研究から集められたものであった。特に、パピローマウィルス構造およびこれに関連した免疫性についてはウシパピローマウィルス系において研究されていた。なぜなら、このウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）いぼ状組織からであれば多量の感染性ウィルス粒子を単離することができるからである。今日までのパピローマウィルス構造についての研究によって得られた情報から、パピローマウィルスは、全て、保存されたＬ１優性キャプシッドタンパク質およびこれよりは保存されないＬ２劣性キャプシッドタンパク質からなる（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．，１９８７）非エンベロープ状態の５０〜６０ｎｍのｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ構造であることが分かる（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｌ．，ｅｔａｌ．，１９６３）。これら２つのタンパク質の配列は互いに全く関連がない。キャプシッドにおけるＬ２の機能および位置は明らかになっていない。しかしながら、免疫学的データからＬ２のほとんどはＬ１に対して内在的であるのではないかと思われる。近年、ＢＰＶ１およびＨＰＶ１ビリオンについての高解像度低温，電子顕微鏡解析によって、これら２つのウィルスは、７２個の五放射キャプソメアを持つ極めてよく似た構造を有し、おそらくそれぞれのキャピソメアがＴ＝７対称性のビリオン外被を形成する５個のＬ１分子から構成されていることが分かってきた（Ｂａｋｅｒ，Ｔ．，１９９１）。劣性Ｌ２キャプシッドタンパク質のビリオンにおける位置はまだ特定されておらず、Ｌ２やその他のウイルスタンパク質がキャプシッドアセンブリに必要であるか否かもはっきりしていない。外面的に、パピローマウィルス構造は対称性およびキャプソメア数が同一である、ポリオーマ４５ｎｍビリオンの構造に似ている（Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｍ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，１９９１）。しかしながら、ポリオーマウィルスとパピローマウィルス種へのスキャプソメア内部のシステムは異なっており、ポリオーマウィルスの優性および劣性のキャプシッドタンパク質は遺伝的にＬ１およびＬ２に関連していない。ウシパピローマウィルスについての研究は、ＢＰＶ用に開発された、定量的な病巣形質転換感染アッセイによって促進されているが、ＨＰＶには利用できない（Ｄｖｏｒｅｔｚｋｙ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，１９８０）。従って、パピローマウィルスに対する免疫についての理解は、ウシパピローマウィルス系に基づいて導き出されていた。そのままのウシパピローマウィルスを使用しての限られた研究から、分娩時の上皮ＢＰＶ感染を防止するワクチンとして感染性あるいはホルマリン不活性化したＢＰＶウィルスを非皮膚接種するのが効果的であることが分かった（Ｏｌｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，１９６０；Ｊａｒｒｅｔｔ．，Ｗ．ｅｔａｌ．，１９９０）。残念なことに、他の種に感染するパピローマウィルスに対するワクチンの開発にも、他の種類のウシに対するワクチンの開発にでさえも、ＢＰＶビリオンを使用することはできない。なぜなら、これらのウィルスは極めて特異性が高くそのままのウィルス粒子のオンコ遺伝子ポテンシャルに関連しているためである。これらパピローマウィルス免疫性についての研究の有意な結論は、乳頭種ウィルスを中性化する抗体の能力が、型特異的な立体配座に関してビリオン表面に依存するエピトープに対する反応能力に関連しているようである。例えば、感染性ＢＰＶ１ビリオンに対して育成されたウサギの抗血清は、Ｃ１２７細胞の病巣形質転換（Ｄｏｒｅｔｚｋｙ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，１９８０）およびウシ胎児皮膚移植片の形質転換を抑制するが、変性ビリオンに対して育成された抗血清は抑制しない（Ｇｈｉｍ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，１９９１）。これとは対照的に、細菌的に誘導したＢＰＶＬ１およびＬ２と（Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｉ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，１９８４；Ｊｉｎ．，Ｘ．，ｅｔａｌ．，１９８９）in vivoで合成されたワタオウサギパピローマウィルス（ＣＲＰＶ）Ｌ１およびＬ２（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，１９９１；ＬｉｎＹ．Ｌ．ｅｔａｌ．，１９９２）とに対して中和血清が生成されたが、これらの血清はいずれも天然のビリオンの構造的な特徴は有しておらず、力価は小さく、細胞免疫反応を検出するためにＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された組み換えＨＰＶＬ１融着ペプチドを使用して成功する例は極めて限られていた（Ｈｏｐｆｌ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，１９９１）。ＢＰＶ系において得られた結果とＨＰＶ系において得られた結果とは一貫している。これらの結果において、ネズミ異種移植アッセイにおいてＨＰＣ１１感染を中和する単一クローン性の抗体は変性されたＨＰＶ１１ビリオンではなく天然のＨＰＶ１１ビリオンであると認識された（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，１９９０）。パピローマウィルスキャプシッドはin vitroで産生するために単離されている。Ｚｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔａｌ（１９９１）および（１９９２）は、ＨＰＶＬ１およびＬ２遺伝子と、ＨＰＶＥ３／Ｅ４遺伝子を組み合わせたＨＰＶＬ１およびＬ２遺伝子とをワクチンウィルスベクターにクローニングし、この組み換えワクチンウィルスでＣＶ−１哺乳類細胞を感染することによってウィルス様の粒子（微片）を産生した。これらの研究はＺｈｏｕによって解釈され、上皮細胞におけるＨＰＶ１６のＬ１およびＬ２タンパク質の発現はビリオン型の微片の組立てを可能にするために必要で十分なものであるということが確立された。Ｌ１およびＬ２タンパク質を発現する再組み換えワクチンウィルスで感染させた細胞では、ＨＰＶキャプソメアの不完全に組み立てられたアレイであると思われる核中に小さな（４０ｎｍ）ウィルス様の粒子（微片）が認められた。Ｌ１タンパク質のみあるいはＬ２タンパク質のみを発現させても、ウィルス様の粒子（微片）は産生されなかった。また、Ｌ１およびＬ２遺伝子を含有する単一組み換えワクチンウィルスで再感染させた細胞でも粒子を産生させることはできなかった。中和活性は全く報告されなかった。Ｇｈｉｍｅｔａｌ．（１９９２）は、ＨＰＶ１からＬ１すなわち主に手足のいぼ状組織に関連した非遺伝子ウィルス型が哺乳類細胞において発現すると、Ｌ１タンパク質はそのままのビリオンに認められる立体配座エピトープを含有していたと報告した。Ｇｈｉｍは、粒子が産生されるか否かは特定しておらず、Ｌ１タンパク質が中和抗体を誘導できるか否かについても評価していなかった。もっと最近になって、Ｈａｇａｎｓｅｅｅｔａｌ．（１９９３）は、ヒト細胞においてＨＰＶ１からＬ１が発現されると、Ｌ１は自己組み立てされてウィルス様の粒子になると報告した。中和抗体についての研究は行われなかった。例えばパルボウィルスなどの他のウィルス系における研究から、キャプシッドアセンブリだけでは免疫原性を持たせることはできないだろうということが分かる。パルボウィルスＶＰ２は、昆虫細胞において発現させるとそれ自体で自己組み立てされるが、ＶＰ１およびＶＰ２の両方を含有する粒子のみが中和抗体を誘導できた（Ｋａｊｉｇａｙａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，１９９１）。細胞培養において選択した種および型の更新可能なパピローマウィルス試薬を産生するための方法を開発することには利点がある。また、サブユニットワクチンとして利用可能な立体配座天然ウィルス粒子の特性を付与する免疫を有するこのようなパピローマウィルス試薬を産生することにも利点がある。従って、本発明の目的は、このような組み換え立体配座パピローマウィルスタンパク質と、その産生および使用方法を提供することにある。発明の開示本発明は、自己組み立てられ、極めて特異的かつ極めて免疫原的な立体配座エピトープを有するキャプソメア構造を形成する組み換えパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を提供することによって、パピローマウィルス感染とその良性および悪性の後遺症とを診断および防止することを目的としたものである。従って、本発明によれば、バキュロウィルス転移ベクターに挿入され、そのベクターのプロモーターによって作用的に発現される、パピローマウィルスのＬ１立体配座コード化配列を含む遺伝子構成物が得られる。パピローマウィルスＬ１立体配座コード化配列は、ウシ、サル、ヒトの遺伝子から単離することができる。好ましい実施態様において、パピローマウィルスＬ１立体配座コード化配列は、野生型ＨＰＶ１６遺伝子から単離される。特に好ましい実施態様において、パピローマウィルスＬ１立体配座コード化配列は、配列番号：６である。遺伝子構成物は、さらにパピローマウィルスＬ２コード化配列を有する。本発明の他の態様によれば、本発明による遺伝子構成物によって形質転換された非哺乳類真核性宿主細胞が得られる。本発明の他の態様によれば、キャプソメア構造またはその一部に組み立てられる、組み換えパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を産生するための方法であって、（１）Ｌ１立体配座キャプシッドタンパク質を転移ベクターにコード化するパピローマウィルス遺伝子をクローニングするステップであって、前記遺伝子のオープンリーディングフレームは前記ベクターの制御下にある前記ステップと、（２）組み換えベクターを宿主細胞に転移するステップであって、クローン化したパピローマウィルス遺伝子はパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を発現する前記ステップと、（３）宿主細胞からパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を含有するキャプソメア構造を単離するステップと、を含む方法が得られる。好ましい実施態様において、クローン化したパピローマウィルス遺伝子は本質的に立体配座Ｌ１コード化配列からなり、発現タンパク質は組み立てられて本質的にＬ１キャプシッドタンパク質からなるキャプソメア構造になる。他の好ましい実施態様において、上述した方法のクローニングするステップは、Ｌ２キャプシッドタンパク質をコード化するパピローマウィルス遺伝子をクローニングすることをさらに含み、それによって前記Ｌ１およびＬ２タンパク質を同時に宿主細胞に発現させる、前記宿主細胞が哺乳類細胞である時に前記転移ベクターはワクチンウィルスではないという条件で、単離されたキャプソメア構造はＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質を有する。立体配座Ｌ１コード化配列は、ウシ、サル、ヒトパピローマウィルスからクローンすることができる。好ましい実施態様によれば、立体配座Ｌ１コード化配列は野生型ＨＰＶ１６パピローマウィルスからクローニングされる。特に好ましい実施態様において、立体配座Ｌ１コード化配列は配列番号：６である。また、好ましい実施態様において、転移ベクターはバキュロウィルスに基づく形質転換ベクターであり、パピローマウィルス遺伝子は昆虫細胞において活性であるプロモーターの制御下にある。従って、この実施態様では、組み換えバキュロウィルスＤＮＡはＳｆ−９昆虫細胞にトランスフェクションされる。本発明による方法の別の実施態様において、形質転換ベクターは酵母の転移ベクターであり、組み換えベクターは酵母細胞にトランスフェクションされる。本発明のさらに他の態様によれば、本発明の方法によって産生される、本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるウィルスキャプソメア構造またはその蛋白質が得られる。また、ウィルスキャプソメア構造は本発明の方法により生成される本質的にパピローマウィルスＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。特に好ましい実施態様において、ウィルスキャプソメア構造は、野生型ウィルスからクローニングされたＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡの発現産生物であるパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質を含む。本発明によるこのウィルスキャプシッドまたはキャプソメア構造若しくはその一部あるいは断片は、本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。一方、これらのキャプシッドまたはキャプソメア構造若しくはその断片は、本質的に野生型ＨＰＶ１６パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。上述した本発明のいずれかの方法によるウィルスキャプシッド構造は、未変性（天然の）パピローマウィルスに対する中和抗体を誘導可能な免疫原立体配座エピトープを有するキャプシッドタンパク質を含む。キャプシッドタンパク質は、ウシ、サル、ヒトのパピローマウィルスＬ１タンパク質であることができる。好ましい実施態様において、パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質は、野生型ＨＰＶ１６遺伝子の発現産生物である。特に好ましい実施態様において、ＨＰＶ１６遺伝子は配列番号：６の配列を含む。本発明のさらに他の態様によれば、免疫治療スケジュールに沿って投与した場合に少なくとも約１０3のパピローマウィルス中和抗体力価を誘導できるだけの効果的な免疫原濃度において、パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質または１１タンパク質およびＬ２キャプシッドタンパク質の立体配座エピトープを有するペプチドを含む単回量のワクチンが得られる。好ましい実施態様において、ワクチンはＨＰＶ１６キャプシッドタンパク質であるＬ１キャプシッドタンパク質を含む。特に好ましい実施態様において、このワクチンは野生型ＨＰＶＬ１タンパク質のＬ１キャプシッドタンパク質を含む。本発明の方法によれば、野生型ＨＰＶ１６パピローマウィルスゲノムからのＬ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を使用することで、ワクチンの使用に適し、スケールでの調製量のウィルス様粒子の産生を特に促進できる。本発明のさらに他の態様によれば、脊椎動物におけるパピローマウィルス感染を防止または治療するための方法であって、本発明によるパピローマウィルスキャプソメア構造またはその断片を、免疫産生法に基づいて脊椎動物に投与するステップを含む方法が得られる。好ましい実施態様において、パピローマウィルスキャプソメア構造は野生型ＨＰＶ１６Ｌ１キャプシッドタンパク質を含む。本発明によれば、さらに、脊椎動物においてパピローマウィルス感染を防止または治療するための方法であって、本発明によるパピローマウィルスキャプソメア構造すなわちキャプソメア構造を含むワクチン産生物を、免疫産生法に基づいて脊椎動物に投与することを含む方法が得られる。好ましい実施態様において、パピローマウィルスワクチンは野生型ＨＰＶ１６Ｌ１キャプシッドタンパク質を有する。また、本発明の範囲内で、パピローマウィルス感染に対して脊椎動物を免疫感作するための方法であって、配座パピローマウィルスＬ１コード化配列を有する本発明の組み換え遺伝子構成を脊椎動物に投与し、前記コード化配列が前記脊椎動物の細胞まらは組織において発現できるようにすることで、パピローマウィルスに対して効果的な中和免疫応答を誘導することを含む方法が得られる。好ましい実施態様において、立体配座パピローマウィルスＬ１コード化配列は、ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６から誘導される。特に好ましい実施態様において、ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６は野生型パピローマウィルスである。本発明のさらに他の態様によれば、脊椎動物におけるパピローマウィルス感染に対するヒトの体液免疫性を検出するための方法であって、（ａ）パピローマウィルスキャプソメア構造の少なくとも１つの立体配座エピトープを有するパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を抗体検出に有効な量で供給するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のペプチドを、パピローマウィルス感染についての検査対象となる脊椎動物から得られた体液の標本と接触させ、前記標本に含有されるパピローマウィルス抗体がこれに結合して抗原−抗体錯体を形成させるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の錯体を、検出可能に標識した免疫グロブリン結合因子と接触させるステップと、（ｅ）前記錯体に結合する標識した免疫グロブリン結合因子によって前記標本中の抗パピローマウィルス抗体を検出するステップと、を含む方法が得られる。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、ペプチドは本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなる。他の実施態様において、ペプチドは本質的にヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６の発現産生物からなる。特に好ましい実施態様において、ペプチドは本質的に野生型ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６遺伝子の発現産生物からなり、例えばこのペプチドは本質的に配列番号：６の発現産生物からなる。本発明のさらに他の態様によれば、パピローマウィルスの感染が疑わしい動物由来の標本においてパピローマウィルスを検出するための方法であって、前記パピローマウィルスのキャプシッドの立体配座エピトープの１つまたは複数に対する特異性を有する抗体と標本とを接触させるステップであって、抗体は検出可能なシグナルを発生させる標識を有し、あるいは検出可能に標識された試薬に結合されるステップと、抗体をパピローマウィルスに結合できるようにするステップと、検出可能なラベルによって標本中に存在するパピローマウィルスの存在を決定するステップと、を含む方法が得られる。本発明のさらに他の態様によれば、パピローマウィルスの感染が疑わしい動物におけるパピローマウィルスに対する細胞免疫応答を決定するための方法であって、前記動物の免疫コンポーネント細胞と野生型の組み換えパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質すなわち本発明の結合された組み換えＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質とを接触させるステップと、キャプシッドタンパク質に対する前記細胞の増殖によってパピローマウィルスに対する細胞免疫性を評価するステップとを有する方法が得られる。本発明のこの態様の好ましい実施態様にいおいて、組み換えパピローマウィルスタンパク質を動物の皮膚に導入する。本発明のさらに別の態様によれば、本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるキャプソメア構造またはパピローマウィルスＬ１タンパク質およびＬ２キャプシッドタンパク質を含むキャプソメア構造、またはこれらのキャプソメア構造のいずれかに対する抗体を単体または組み合わせで有し、単一包装のパッケージ容器にパピローマウィルスに対する体液または細胞免疫についてのアッセイを実施するための材料と共に備えるパピローマウィルス感染診断キットが得られる。発明の詳細な説明我々は、ＢＰＶまたはＨＰＶ１６のＬ１優性キャプシッドタンパク質をコード化する遺伝子は、適当な転移ベクターによって宿主細胞に導入された後に、高いレベルでＬ１を発現することができ、また組換えＬ１は自己組み立てされて、そのままのビリオンのキャプシッド構造物に極めてよく似た無核キャプッシド構造物を形成する能力を本質的に有することを発見した。さらに、本発明の自己組み立てされた組換えＬ１キャプシッドタンパク質は、組換え細菌より抽出したＬ１タンパク質や変性型ビリオンとは異なり、パピローマウイルス感染症から守ることができる多量の中和抗血清を誘導する能力において、そのままのパピローマウイルス粒子（微片）と同じ有効性を有する。本発明におけるキャプシッドタンパク質の免疫原性を高いレベルで扱えば強い抗体結合性が得られるため、本タンパク質は血清スクリーニング検査で立体配座ビリオンエピトープの抗体を検出し測定するための感応剤となる。また、この免疫原性により、本発明のキャプッシドタンパク質はパピローマウイルスによる感染症から宿主動物を守る高効果ワクチンまたは中和抗体を誘引する免疫原として使用することもできる。これら見解は最近Ｋｉｒｎｂａｕｅｒらによって報告され（1992）、米国出願番号０７／９４１，３７１の根拠になった。今回我々は、良性のパピローマウイルス病変より単離された野生型ＨＰＶ１６ゲノムから発現されるキャプッシドタンパク質Ｌ１は、前述のバキュロウイルス系で発現された場合、これまで明らかにされていない効果によって自己組み立てされ、ウシパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質が有する効果とに匹敵することを明らかにした。ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子の塩基配列ＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡ源は、例えばＺｈｏｕら（1991）が報告した研究で開示された通り、プロトタイプクローン、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｋ０２７１８で、頸部癌より単離されている（Ｓｅｅｄｐｒｆら、1985 ）。我々は、野生型ＨＰＶ１６ゲノム由来のＬ１は、単一点での突然変異によりプロトタイプゲノムとは異なるが、ＢＰＶ１またはＢＰＶＬ１／Ｌ２でみられる効果と同様の効果により、自己組み立てされてウイルス様粒子を形成する。プロトタイプＨＰＶゲノム由来のＬ１をＬ２と共に使用した場合に見られる自己組み立てと比較すると、野生型ゲノム由来のＬ１は少なくとも100倍以上の効率で自己組み立てされる。種々のＨＰＶ１６Ｌ１発現産物の自己組み立て効率を遺伝子レベルで考察するため、良性病変及び異形成関連病変の両者、もしくは癌より単離したＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子のオープンリーディングフレームについて塩基配列を調べた。分析の結果、プロトタイプ株の報告されているＬ１の塩基配列の内、下記の通り2箇所にエラーが検出された。（1）ｎｔ６９０２とｎｔ６９０３の間に3つのヌクレオチド（ATG）の挿入がなければならない、Ｌ１タンパク質中にはセリンの挿入をもたらす。（2）報告されているプロトタイプ塩基配列中には、Ｌ１タンパク質の配列からアスパラギン酸を除去する、nt6952-6954からなる3つのヌクレオチドの欠失がなければならないが、nt5637-7155からなるプロトタイプＨＰＶ１６Ｌ１ゲノムの正確なヌクレオチド配列は配列番号:5のヌクレオチド配列で、本文中に掲載されている。配列番号５及び６中のヌクレオチド塩基の番号付けは、1番から始めており、報告されているＨＰＶ塩基配列のヌクレオチド塩基の番号付けは、nt5638-7156 の配列であるが、塩基配列リストの1-1518に対応している。従って元の塩基配列中で対応する部位は当業者により容易に同定される。この他3つのＨＰＶ１６Ｌ１ゲノム、クローン16PAT及びクローン114/16/2及びクローン114/16/11について塩基配列を調べて、これらの塩基配列を修正したプロトタイプの配列と比較した。クローン16PATはUniversity of Rochester School of MedicineのDennis McCa nce氏より供与されたもので頸部の異形成（前悪性）病変よりクローニングされたものであるが、効率的な自己組み立てを行わないＬ１を発現する。クローン114/16/2及び114/16/11はハイデルベルクGerman Cancer Research Ce nterのMatthias Du"rst氏より供与されたものであるが、非悪性病変よりクローニングされ両者とも効率的に自己組み立てされるＬ１を発現する。異形成、悪性進行癌及び良性病変に関連するＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子の特徴の比較パピローマウイルス感染異形成病変より単離したクローン16PATと、悪性頸部癌より単離したプロトタイプＨＰＶ１６は両者ともnt6242-6244の位置でヒスチジンをコード化しているのに対し、良性のパピローマウイルス感染病変より単離したクローン2及び11は（他の多くのパピローマウイルスと同様に）同位置でアスパラギン酸をコード化している。プロトタイプ、悪性関連のＨＰＶ１６種と良性病変由来のＨＰＶ１６種との間にあるこのただ一個のアミノ酸の違いにより、自己組み立ての効率に差が生じているのは明かである。きわめて近縁のＨＰＶタイプの間では、この場所にアスパラギン酸があることが効率的な自己組み立てを得るのに必要で、アスパラギン酸をヒスチジンに置き換えるとキャプッシドタンパク質からこの能力が失われる。悪性関連ウイルスにおいてキャプッシド組み立てが失われることは、中和抗体産生に必要な立体配座エピトープの喪失と関連しており、またこれはパピローマウイルスが免疫制御を逃れるための免疫原性の低下と関係していると思われる。従って、効率的に自己組み立てされるキャプシッドタンパク質を発現するHPV Ｌ１遺伝子は、（1）パピローマウイルス感染症の良性病変から野生型ＨＰＶ１６Ｌ１のオープンリーディングフレームを単離するか、または（2）プロトタイプ塩基配列のnt6242-6244部位でアスパラギン酸をコード化する様に部位特異性突然変異を行うことにより得ることができる。組換えキャプシッドタンパク質本発明の方法により、任意のパピローマウイルスの組換えキャプシッド粒子も調製することができる。Ｌ１またはＬ２キャプシッドタンパク質のいずれか一方のみ、またはＬ１及びＬ２キャプシッドタンパク質の両者からなる粒子を調製することができる。Ｌ１/L2キャプシッドタンパク質粒子は天然のパピローマウイルスビリオンの組成とより一層密接に関係するが、おそらくＬ２のほとんどはキャプシッド構造内でＬ１よりも内部にあるため、Ｌ２はＬ１ほど免疫に関して重要とは思われない。Ｌ２が存在しなくてもＬ１は自身で自己組み立てされることが出来るが、自己組み立てされたＬ１/L2キャプシッドタンパク質粒子はさらに天然のパピローマウイルスビリオンの組成と密接に関係している。従って、Ｌ１のみを含む粒子の方は単純であり、Ｌ１／Ｌ２を含む粒子の方が一層真正の構造を有していると思われる。自己組み立てされたＬ１及びＬ１／Ｌ２粒子は両者とも高力価の中和抗体を誘導し、従ってワクチン産生に適している。野生型ＨＰＶゲノムにより発現されるＬ１キャプシッドタンパク質を含む粒子は、Ｌ１のみの場合でもＬ１／Ｌ２のいずれの場合でも、特に望ましい。組替え型Ｌ１またはＬ１／Ｌ２結合キャプシッド粒子の作成はＬ１（またはＬ１及びＬ２）遺伝子を適当なベクターにクローニングしてベクターを形質転換した真核細胞内で両タンパク質に対応する立体配座をコード化する塩基配列を発現させることにより行う。キャプシッド様構造を形成する能力はキャプシッドタンパク質が高力価の中和抗体を産生する能力と密接に関係しており、自己組み立てされて立体配座エピトープを有するキャプシッド構造を形成させる能力を持つキャプシッドタンパク質を産生するためには、実質的に全てのキャプシッドタンパク質をコード化する塩基配列を発現させなければならないと思われる。従って、実質的に全てのキャプシッドタンパク質をコード化する塩基配列がクローニングされる。遺伝子は、真核細胞系で発現されるのが望ましい。昆虫の細胞は望ましい宿主細胞であるが、適当な酵母発現ベクターが使用される場合は酵母細胞も宿主細胞として適切である。同様に適当な哺乳動物発現ベクターを用いて形質転換した哺乳動物細胞も組み立てされたキャプシッドタンパク質を産生するために用いることができるが、培養した哺乳動物細胞は非哺乳動物細胞よりも哺乳動物に感染する可能性のある未知のウイルスを有していると思われるため、培養した哺乳動物細胞は余り有利ではない。好ましいプロトコールに従って、バキュロウイルス系を使用する。クローニングされる遺伝子、実質的にウシパピローマウイルス（ＢＰＶ１）またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ１６）Ｌ１キャプシッドタンパク質またはヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６Ｌ１及びＬ２をコード化するあらゆる塩基配列を、わき腹領域を含むバキュロウイルスベクターに挿入して遺伝子構築物を形成し、組換えＤＮＡを野生型バキュロウイルスＤＮＡと共に実施例１記載のSf-9昆虫細胞に同時形質転換させて感染時に挿入遺伝子を大量に発現することの出来る組換えウイルスを作成する。実際のタンパク質産生は新しい昆虫細胞を組換えバキュロウイルスに感染させることよって行う。従つて、Ｌ１キャプシッドタンパク質及びＬ１及びＬ２キャプシッドタンパク質は、実施例2に記載されている通り組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞内で発現される。実施例1の操作では、BPV1の全Ｌ１遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Saik iら、1987）により増幅し、AcMNPV（Autographa californica核多角体病ウイルス）に基づくバキュロウイルスベクター（Summers．M.ら、1987）内にクローニングした。Ｌ１オープンリーディングフレームをバキュロウイルス核多核体病プロモーターの制御下においた。Ｌ１クローンを野生型（Wt）バキュロウイルスＤＮＡと共にSf-9昆虫細胞（ATCC Accession No．CRL 1711）内に同時形質転換して組換えクローンのプラークを精製した後、高力価の組換えウイルスが生産された。Wt AcMNPVまたはRPV1 L1組換えウイルス（AcBPV-L1）を感染させた細胞の抽出物（実施例2）をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。クーマシーブルー染色後、AcBPV1-L1ウイルスを感染させた培養物の抽出物中に、予想したサイズ55キロダルトンのユニークなタンパク質が検出された。このタンパク質のBPV Ｌ１への同定はBPV Ｌ１特異性モノクローナル抗体（Nakai.Y.ら、1986）を用いたイムノブロットにより確認した。即ち、組換えウイルスによるBPV Ｌ１の発現が感染昆虫細胞溶解物のSDS-PAGE電気泳動によって認められた。パピローマウイルスＬ１が異型細胞内に過剰発現された場合、自己組み立てされてウイルス様粒子を形成するという仮説を確かめるために、AcBPV-Ｌ１感染細胞の薄切片を電子顕微鏡下で観察してパピローマウイルス様構造物の存在を調べた。ＢＰＶ組換えウイルスを感染させた細胞が望ましくは核内で局所化した多くのおよそ50nmの環状構造物を含み、これらの構造物は野生型バキュロウイルス感染細胞からは認められなかった。in viv oパピローマウイルスビリオンの組み立ては核内で起こること、ビリオンの直径は55nmと報告されていることから、これらの結果からＬ１のウイルス様粒子への組み立てか起こったことが示唆された。宿主細胞内で形成したキャプシッドタンパク質の発現後、実施例4記載の通りウイルス粒子を感染細胞の溶解物から精製した。さらにＬ１タンパク質が自己組み立てされた証拠を得るために、勾配遠心により感染昆虫細胞からウイルス様粒子を単離した。真正のＢＰＶビリオンと比較すると、電子顕微鏡下で精製組換えＢＰＶＬ１及びＨＰＶ１６Ｌ１キャプシッドタンパク質の形成が認められた。高分子の塊状の構造物を、40%ショ糖中の遠心分離によりＬ１組換えまたは野生型感染細胞の溶解物から分離し、沈澱物に対してCsCl密度勾配遠心分離を行った。分画を集めて、イムノブロットによりＢＰＶＬ１特異性モノクローナル抗体に対する反応性を調べた。勾配から得たＬ１陽性分画を炭素膜格子に吸着させ、1%酢酸ウラニルで染色して透過型電子顕微鏡で観察した。電子顕微鏡では、陽性分画が多くの環状構造を含みキャプソメアが規則的に配置されていた。ウイルス様粒子のピークを含むCs Cl分画の密度はおよそ1.3mg/mlで、前報の無核ＢＰＶビリオン（Larsen.P.ら、1 987）の密度と一致した。もっと小さな環状物及び部分的に組み立てされた構造物も見られたが、多くは直径顔代を50nmであった。電子顕微鏡では、大きい方の粒子のサイズ、サブユニット構造が感染性ＢＰＶビリオンときわめてよく類似しており、染色と写真撮影を同時に行った。これらの粒子は非感染またはWtAcMNPV感染細胞の調製物中では認められなかった。これらの結果より、BPV Ｌ１は、Ｌ２または他のパピローマウイルスタンパク質非存在下で組み立てされてウイルス様粒子を形成する能力を本質的に有することが示唆された。さらに、分化している上皮または哺乳動物細胞を制限する特異性因子はパピローマウイルスキャプシッドの組み立てに必要ではなかった。昆虫細胞内での自己組み立て能がパピローマウイルスＬ１の一般的性質であるかどうかを調べるため、ＨＰＶ１６のＬ１も発現させたところ、構造類似体の組換えバキュロウイルスによりヒト性器癌内にＨＰＶタイプが多く検出された。SD S-PAGEにより、予想された58kdのサイズのタンパク質がＨＰＶ１６Ｌ１組換えウイルスを感染させた昆虫細胞内で大量に発現された。このタンパク質はイムノブロット上でＨＰＶ１６Ｌ１モノクローナル抗体と強く反応した。このモノクローナル抗体も見かけの分子量がおよそ28kdからおよそ48kdの範囲にある別の５つのバンドを僅かに染色した。この抗体もBPV Ｌ１と若干反応し、従ってこの抗体は同イムノブロット上でＢＰＶの55kdのタンパク質を僅かに染色した。CsCl勾配精製後、免疫反応分画を電子顕微鏡で観察し、電子顕微鏡上で本分画に50nmのパピローマウイルス様粒子が含まれていることが認められた。BPV Ｌ１調製物に比べるとヒトの系では、いくらか不完全で小さな組み立て粒子が見られたが、おそらくこれは、発現の量が少ないか、かなりの程度のＨＰＶ１６Ｌ１の分解がSDS-PAGE上で見られたことから、この結果からＨＰＶ１６のＬ１及びおそらく他のタイプのＬ１タンパク質は組み立てされてビリオンタイプの構造物を形成する能力を本質的に有していることが示唆される。また、実施例に記載の通り、アカゲザルPVの組換えパピローマウイルスキャプシッド粒子の調製も行った。免疫原としての組換え配座キャプシッドタンパク質異型細胞内で合成された自己組み立て主要キャプシッドタンパク質に基づくサブユニットワクチンはヒトB型肝炎を含む多くの病原ウイルスによる感染の予防に有効であることが明らかにされている（Stevens.C.ら、1987）。非感染性またはホルマリン不活性化ＢＰＶはワクチンとして有効であるがＢＰＶ形質転換細胞は有効ではないことを明らかにする研究により、初期の遺伝子産物よりもウイルスキャプシドタンパク質は免疫応答を誘引することが示唆されている。他の論文のデータからも、細菌から抽出されたＬ１タンパク質は中和抗体の力価が低いにもかかわらず一部免疫応答を誘引することが示唆されている。従って、昆虫細胞内で発現してウイルス様粒子に組み立てられるBPV Ｌ１について家兎中の中和抗体を誘導する能力を調べた。2種類の調製物について試験を行った。それらは、Ｌ１組換えまたは野生型感染Sf-9細胞の全細胞抽出物と種々の遠心分離及び硫安沈澱により単離した部分的精製粒子である。1次接種後、家兎に隔週毎に2回追加接種を行った。家兎血清について、マウスC127細胞へのＢＰＶ感染阻害能を標準量のＢＰＶウイルスから誘導される病巣数の現象を測定することにより、調べた。代表的なアッセイを行い、組換えBPV Ｌ１を接種した動物で誘導される中和抗血清の力価を生のＢＰＶビリオン及び変性ＢＰＶビリオンに対する抗血清と比較した。バキュロウイルス由来Ｌ１を接種して作成した免疫血清では、少なくとも 1:11,000希釈（力価11,000:表1）でＢＰＶウイルスの感染性を50%減少させることができたが、同じ家兎の免疫前血清では最も低い希釈試験である1:20の希釈率でも病巣の形質転換を阻害できなかった。粗調製物及び部分精製粒子は高力価中和抗体を含み、最高力価が測定値で290,000であり、共に有効であった。この値は感染性ＢＰＶビリオンに対して上昇した陽性コントロール抗血清の中和力価と同じ値であって、これと比較して、細菌で誘導したＬ１を用いた前報の試験での最高力価は36であった(Pilancinski.W.ら、1984）。野生型バキュロウイルス感染細胞からの抽出物を接種した家兎から得た血清では、1:20の希釈率で感染性を阻害することができなかったことから、中和活性はＬ１に特異的であることが示唆された。1%SDS中で煮沸して部分精製Ｌ１粒子を破砕したところ、調製物は中和抗体の誘導する能力を失った（表1）。Ｌ１は自己組み立てされてビリオン様粒子を形成することができ、誘導する中和抗体の力価が少なくとも以前のin vit ro産生抗原よりもオーダーで3つ異なることから組換えＬ１キャプシッドタンパク質は自然に伝染したパピローマウイルスに対して効果的な長期間の抑制効果を誘導する能力を潜在的に有することが示唆される。これらの結果から、昆虫細胞内で組み立てされたＬ１粒子は立体配座的に免疫能を左右するエピトープの存在下で感染性ウイルスに近い形状になることが明らかである。またこれらの結果から、Ｌ２は高力価の中和抗体の産生には必要ないことが明かである。細菌により誘導されたＬ１の中和免疫原性が弱いことが報告されたが、これはコンフォメーションが適切ではないと思われることまた組み立てされてビリオン様構造物を形成しないことが原因である。また、Ｌ１の多数の電気泳動的変異体がビリオン内で検出された（Larsen.P.ら、1987）。これら修飾物のいくつかはおそらく細菌により誘導されたＬ１内には存在しないと思われるが、これは中和抗体の産生を促進すると思われる。ここで開示された高力価の中和抗血清を誘導する組換えＬ１（またはＬ２）パピローマウイルスキャプシッドタンパク質は伝染性乳頭腫症に対する予防のためのワクチンとしての使用するのに適した能力を有している。危険な状態にある集団で、免疫処置により恩恵を受けることの出来る集団の例は乳頭腫疣贅の恐れのあるウシの群、非生殖型のＨＰＶ感染に対する全てのヒト、及び生殖ＨＰＶ型の感染に対する性的活動のあるヒトである。治療目的のワクチン処理は、通常Ｌ１（及びＬ２）キャプシッドタンパク質を発現する生産的パピローマウイルス病変に対して有用である。このような病変は疣贅または咽頭乳頭腫症などの良性感染症に最も発症しやすい。新生児の咽頭乳頭腫症は通常、ちつ分泌物内に感染性のパピローマウイルスが存在する産道内を幼児が通過する際に伝染する。パピローマウイルスに対する感染症の妊娠婦人への治療目的のワクチン処理により、胎盤関門を通過し、胎児の循環系に入ってこの種のパピローマウイルス感染症に対する幼児への予防的受動免疫を行う能力を有する中和IgG抗体を誘導することができる。さらにちつ液や乳汁に分泌される母性IgAにより幼児保護機構が供給される。Jarrett（19 91）はＢＰＶ誘導性疣贅の治療時に働くＬ２の何等かの有効性を示した。一般の悪性腫瘍はＬ１またはＬ２を発現せず、頸部癌などの状態における組換えＬ１またはＬ２でのワクチン処理の有効性については明らかにされていない。良性及び悪性パピローマウイルス疾患に対する保護免疫は組換えＬ１キャプシッドタンパク質の有効量をパピローマウイルス感染症の恐れのある個体に投与することによって誘導される。キャプシドタンパク質を含むワクチンは、従来の免疫処置プロトコルに従って、非経口的あるいは局所的に直接投与される。もう一つの具体例では、立体配座をコードするＬ１の塩基配列を転移ベクター、例えば（軽度の一過性感染を引き起こす）セムリキ森林ウイルスベクター、受容者である細胞または組織内に誘導され、そこで免疫化キャプシッドタンパク質が発現される組換えウイルスにクローニングすることができる。ワクシニアウイルスもまた遺伝子伝達体として使用できる。血清スクリーニング剤としての組換えキャプシッドタンパク質パピローマウイルスビリオンタンパク質に対するヒト免疫応答に関する公知の血清検査では、原則として細菌で誘導したＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質を利用しており、その結果は他のＨＰＶ感染症の測定（Ｊｅｎｉｓｏｎ，Ｓ．ｅｔａｌ．，１９９０）とはあまりよい相関関係にはない。上記のＢＰＶパピローマウイルス免疫検査により、細菌より抽出されたパピローマウイルスビリオンタンパク質は、タイプ特異性で多くの中和抗体により認識される立体配座により影響を受けるエピトープを示さないことが示唆されている。主に線状エピトープを認識するこのようなアッセイと比較すると、自己組み立てされるＬ１粒子を用いた血清検査は、ヒトの集団において抗ＨＰＶビリオン免疫性の程度をさらに正確に測定すると思われる。従ってここに開示された組換えＬ１キャプシドタンパク質とは立体配座エピトープを示しており、いくつかのタイプの結合アッセイとしてパピローマウイルスに対する中和抗体に関する免疫性を検出するための特異性の高い診断薬として使用できる。その操作方法は、一般に抗原抗体対の形でキャプシッドタンパク質と特異的に結合する体液中の抗体を検出する手段を提供する固相あるいは液相アッセイとして行われる。循環抗体を評価するための当業者間で周知の手順の一例として、二重抗体ラジオイムノアッセイおよび酵素イムノアッセイなどの液相アッセイや、ストリップラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティングおよびＧａｌｌｏｅｔａｌ．に付与された米国特許第４，５２０，１１３号酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｓｋｏｌｄｅｔａｌ．に付与された米国特許第５，０３９，６０７号に開示されているｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃアッセイなどが挙げられる。抗体の検出用として好ましいＥＬＩＳＡ法は、ＨａｒｌｏｗＥ．およびＬａｎｅ，Ｄ．著、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８，ｐｐ．５６３〜５７８に開示されているようなものである。ここに開示の組換えＬ１またはＬ１／Ｌ２キャプシッドタンパク質を使用し、例えばＢｒａｄｌｅｙ，Ｌ．，１９８０に開示の抗原誘導Ｔ細胞増殖応答や、特にＳｔａｒｌｉｎｇに付与された米国特許第５，０８１，０２９ウィルス抗原に対する細胞応答などのin vivoあるいはin vitroのアッセイによってパピローマウィルスに対する細胞性免疫を測定することもできる。パピローマウィルスに対する細胞性免疫は、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．，１９８０に開示されているような従来のin vivo遅延型過敏性反応皮膚試験や、組換えＨＰＶＬ１融合タンパク質の皮内注射によるＨｏｐｆｌ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，１９９１に開示されている好ましい方法によっても特定することができる。また、本発明のキャプシッドタンパク質を免疫遺伝子として使用し、周知の方法によって多クローン性あるいは単一クローン性抗体を得ることもできる。これらのパピローマウィルス特異抗体は、特に抗体の綱や種に特異的な第２の標識抗体と組み合わせて、免疫組織化学などの様々な周知のアッセイ手順に基づいて、体の組織や体液の標本中におけるキャプシッドタンパク質の存在の検出に診断的に利用することもできる。後述の遺伝子操作は、本発明による遺伝的調節ユニットの要素の調製に対する一般的な用途について述べたものである。上述したように、場合によっては上述の範囲内に含まれる各組換え分子にこの手順を利用できないこともある。このような状態が起こる状況は、当業者らによって簡単に知ることができる。このような場合はいずれも、例えば適当な代替制限酵素の選択、他の周知の試薬への変更、反応条件の日常的な修正など、当業者間で周知の修正法によって操作を成功させる。一方、ここに開示の他の手順や周知の手順なども、本発明の対応の組換え分子の調製に適用することもできる。どの調製方法でも、開始物質は周知のものであるか、あるいは周知の開始物質から簡単に調製可能なものである。後述の実施例において、特に記載のない限りは温度はいずれも摂氏であり、部およびパーセントは重量部および重量パーセントを意味する。さらに加工することなく、当業者は、上述の開示内容を使用して、本発明を最大限に利用することができる。従って、以下の好ましい実施例は単に一例にすぎず、開示内容の残りの部分を限定するものではない。実施例１ＢＰＶ１ＤＮＡのクローニングした原型（Ｃｈｅｎ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，１９８２），ＧｅｎＢａｎｋＡｓｓｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ０２３４６またはＨＰＶ１６ＤＮＡ（Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，１９８５）ＧｅｎＢａｎｋＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＮｏ．Ｋ０２７１８、あるいは野生型ＨＰＶ１６ＤＮＡ配列ＩＤ番号；２）をテンプレートとして使用して、全長Ｌ１あるいはＬ１およびＬ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲによって増幅した。独特の制限部位をオリゴヌクレオチドプライマーに組み込んだ（下線を付してある）。ＢＰＶ１−Ｌ１プライマー配列ＩＤ番号：３）；（センス）および配列ＩＤ番号：４）；（アンチセンス）；ＨＰＶ１６−Ｌ１プライマー配列ＩＤ番号；５）；（センス）；および配列ＩＤ番号：６）：（アンチセンス）Ｌ１コード化配列は、ＢＰＶ１については第１メチオニンコドン（太字）、ＨＰＶ１６については第２メチオニンで開始する。ＢＰＶ１−Ｌ１を５′−ＥｃｏＲ１として３′−ＫｐｎＩ断片に対し、ＨＰＶ１６−Ｌ１を５′−ＢｇｌＩＩとして３′−ＢｇｌＩＩ断片に対して、ＡｃＭＮＰＶ塩基対バキュロウィルス転移ベクターｐＥＶｍｏｄ（Ｗａｎｇ，Ｘ．，ｅｔａｌ．，１９９１）の多面プロモータの多重クローニング部位の下流にクローニングし、ＡｃＭＮＰＶ／Ｌ１接合による配列決定によって確認した。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）（Ｈａｒｔｉｇ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，１９９１）を使用して、２μｇの量のＣｓＣｌ精製組換えプラスミドを１μｇの野生型ＡｃＭＮＰＶＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共にＳｆ−９細胞（ＡＴＣＣ）に同時トランスフェクションし、組換えバキュロウィルス溶菌を上述したように精製した（Ｓｕｍｍｅｒｓ．，Ｍ．，ｅｔａｌ．，１９８７）。実施例２昆虫細胞中のＬ１タンパク質またはＬ１／Ｌ２タンパク質の発現ｗｔＡｃＭＮＰＶ（ｗｔ）またはＡｃＢＰＶ−Ｌ１（Ｂ−Ｌ１）またはＡｃＨＰＶ１６−Ｌ１（１６−Ｌ１）およびＡｃＨＰＶ１６−Ｌ２（１６−Ｌ２）組換えウィルスによって、Ｓｆ−９細胞を疑似感染（疑似）させるかあるいは１０の感染多重度で感染させた。７２時間後、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液において煮沸することによって細胞をｌｙｓｅし、１０％ゲル内でライゼートにＳＤＳ−ＰＡＧＥを施した。タンパク質を０．２５％クーマシーブルーで染色するか、免疫ブロッティングしてＢＰＶＬ１ｍＡｂＡＵ−１（Ｎａｋａｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，１９８６）またはＨＰＶ１６Ｌ１ｍＡｂＣＡＭＶＩＲ−１（ＭｃＬｅａｎ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，１９９０）でプローブし、125Ｉ標識Ｆａｂ抗ネズミＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。Ｐは、多面タンパク質を示す。抗ＢＰＶＬ１ｍＡｂは予測した５５ｋｄのタンパク質を認識した。抗ＨＰＶ１６Ｌ１ｍＡｂは予測した５８ｋｄのタンパク質をかなり染色すると共に、上述したように分子量がこれよりも小さい５つのバンドも淡く染色した。また、上述したように、この抗ＨＰＶ１６Ｌ１は、ＢＰＶＬ１タンパク質と若干交差反応した。実施例３抗血清の製造家兎に対し、凍結／溶解を１サイクル行い２０×ダウンスホモジネート（家兎＃１，２および８により調製した全細胞Ｓｆ−９溶解物（３×１０⁷細胞）、または差動遠心分離および３５％硫安沈澱（＃３、４、６および７により部分精製したＬ１タンパク質２００μｇを、完全フロイトアジュバント中に添加したものを皮下より注入して免疫し、次に不完全フロイトアジュバント中に同様の調製物を添加したものを用いて２週間間隔で２回追加免疫を行った。実施例４粒子の精製及び透型電子顕微鏡による解析Ｓｆ−９細胞（２×１０6／ｍｌ）５００ｍｌをＡｃＢＰＶ−Ｌ１またはＡｃＨＰＶ１６−Ｌ１またはＡｃＨＰＶ１６−Ｌ１／Ｌ２（１６−Ｌ１／Ｌ２）組換え体バキュロウイルスに感染させた。７２時間後、回収した細胞をＰＢＳ中で６０秒間超音波処理した。低速分別後、溶解物を４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ショ糖／ＰＢＳ中、１１，０００ｇで２．５時間遠心分離を行った（ＳＷ−２８）。再懸濁したペレットを１４１，０００ｇ、室温で２０時間、１０〜４０％（ｗｔ／ｗｔ）ＣｓＣｌ／ＰＢＳ中で密度勾配沈降平行遠心分離を行った。分画を底から回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。免疫反応分画をＰＢＳを外液として透析、セントリコン３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）限外濾過により濃縮し、（ＨＰＶ１６−Ｌ１の場合）真空ポンプ付きＡ−１００ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）内で１０分間３０ｐｓｉで遠心分離してペレットを形成させた。ＢＰＶ１ビリオン（図２Ｂ）を記述通り（Cowsert,L．ら、1987）ウシ比贅（AB.Je nson氏より供与）より精製した。精製した粒子をカーボンコートＴＥＭグリットに吸着させ、１％酢酸ウラニルで染色してフィリップ電子顕微鏡ＥＭ４００Ｔにより倍率３６，０００倍で観察した。電子顕微鏡から結果が得られ、考察は上記で行っている。実施例５ＢＰＶ１中和アッセイ第２追加免疫３週間後に得られた血清の系列希釈を約５００フォーカス形成単位のＢＰＶ１ウイルスと共に３０分間インキュベートし、ウイルスをＣ１２７細胞に１時間吸着させて、この細胞を３週間培養した（Dvoretzky,I.ら、1980）。フォーカスを０．５％メチレンブルー／０．２５％カルボルフクシン／メタノール液で染色した。結果は、フォーカスの数を評価するして得た。考察は以下に行う。抗−ＡｃＢＰＶ−Ｌ１は家兎＃１より得られ、抗−ｗｔＡｃＭＮＰＶは家兎＃８より得られた（表８）。１：４００に希釈した前免疫血清を標準として使用した。抗−ＡｃＢＰＶ−Ｌ１は希釈率１：４００または１：６００で実質的にフォーカスを消失したが、抗ｗｔＡｃＭＮＰＶは希釈率１：４００または１：６００でフオーカスの数が上昇したように思われた。１：００希釈時に「ｎｒｓ」と表記することとした正常家兎血清のネガティブコントロールを抗ＢＰＶ−１ビリオンの標準として使用したところ、抗ＢＰＶ−１ビリオンは希釈率１：４００または１：６００で実質的にフォーカスを消失したと思われた。抗ＢＰＶ−１ビリオンは以前の研究（Nakai,Y .ら、1986）で、野生のＢＰＶビリオンに対して励起された。最後に、ダコは変性ＢＰＶビリオンに対して励起された市販の家兎抗血清（Dako Corp.，Santa Ba rbara，California）である。この血清は、見かけ上抗体を含まないコントロールよりも大量のフォーカスを発生させた。ネガティブコントロールとして、ウイルスを含まない検査では、実質的にフォーカスを発生しなかった。実施例６ＢＰＶ１に対する血清中和力価実施例５と同様にしてアッセイを行った。家兎＃１、２および８に粗全細胞Ｓｆ−９溶解物を接種し、家兎＃３、４、６および７には部分精製したＬ１タンパク質（表１）を接種した。家兎＃６および７を、１％ＳＤＳ中で煮沸変性させたＬ１タンパク質調製物で免疫した。各家兎とも、２回目の追加免疫後３〜６週間後に少なくとも２回採血して検査を行ったところ、同一の抗体価であることが認められた。各家兎の免疫前血清の力価は、２０より小さく、最も低い希釈率で検査した。参考文献配列表（１）概要：（ｉ）出願人：米国政府，代表者 Health and Human Services長官（ｉｉ）発明の名称：自己組立て組換えパピローマウィルスキャプシッドタンパク質（ｉｉｉ）配列数：６（ｉｖ）代理人住所：（Ａ）代理人：KNOBBE，MARTENS，OLSON&BEAR （Ｂ）通り：620 Newport Center Drive Sixteenth Floor （Ｃ）都市：Newport Beach （Ｄ）州：カリフォルニア州（Ｅ）国：ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号：９２６６０（ｖ）コンピュータ読取可能な形式：（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）ＯＳ：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：PatentIN Release 1.0,Version 1.25 （ｖｉｉ）先行出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０７／９４１，３７１（Ｂ）出願日：１９９２年９月３日（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／０３２，８６９（Ｂ）出願日：１９９３年３月１６日（ｉｘ）通信情報：（Ａ）電話：７１４−７６０−０４０４（Ｂ）ファクシミリ：７１４−７６０−９５０２（２）配列ＩＤ番号：１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１５１７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｖｉ）原ソース：（Ａ）微生物：ヒトパピローマウィルス（Ｂ）菌株：ＨＰＶ１６（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）位置：１．．１５１８（ｘｉ）配列の説明：配列ＩＤ番号：１：（２）配列ＩＤ番号：２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１５１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）位置：１．．１５１８（ｘｉ）配列の説明：配列ＩＤ番号：２：（２）配列ＩＤ番号：３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｖｉ）原ソース：（Ａ）微生物：ウシパピローマウィルス（ｖｉｉ）即時ソース：（Ｂ）クローン：ＢＰＶ１Ｎ（ｘｉ）配列の説明：配列ＩＤ番号：３：（２）配列ＩＤ番号：４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｖ）アンチセンス：あり（ｖｉｉ）即時ソース：（Ｂ）クローン：ＢＰＶ１Ｙ（ｘｉ）配列の説明：配列ＩＤ番号：４：（２）配列ＩＤ番号：５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｖｉｉ）即時ソース：（Ｂ）クローン：ＨＰＶ１Ｎ（ｘｉ）配列の説明：配列ＩＤ番号：５：（２）配列ＩＤ番号：６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ４４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｖ）アンチセンス：あり（ｖｉｉ）即時ソース：（Ｂ）クローン：ＨＰＶ１６Ｙ（ｘｉ）配列の説明：配列ＩＤ番号：６：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月１３日【補正内容】ピローマウィルスＬ１立体配座コード化配列は、ウシ、サル、ヒトの遺伝子から単離することができる。好ましい実施態様において、パピローマウィルスＬ１立体配座コード化配列は、野生型ＨＰＶ１６遺伝子から単離される。特に好ましい実施態様において、パピローマウィルスＬ１立体配座コード化配列は、配列番号：２である。遺伝子構成物は、さらにパピローマウィルスＬ２コード化配列を有する。本発明の他の態様によれば、本発明による遺伝子構成物によって形質転換された非哺乳類真核性宿主細胞が得られる。本発明の他の態様によれば、キャプソメア構造またはその一部に組み立てられる、組み換えパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を産生するための方法であって、（１）Ｌ１立体配座キャプシッドタンパク質を転移ベクターにコード化するパピローマウィルス遺伝子をクローニングするステップであって、前記遺伝子のオープンリーディングフレームは前記べクターの制御下にある前記ステップと、（２）組み換えベクターを宿主細胞に転移するステップであって、クローン化したパピローマウィルス遺伝子はパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を発現する前記ステップと、（３）宿主細胞からパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を含有するキャプソメア構造を単離するステップと、を含む方法が得られる。好ましい実施態様において、クローン化したパピローマウィルス遺伝子は本質的に立体配座Ｌ１コード化配列からなり、発現タンパク質は組み立てられて本質的にＬ１キャプシッドタンパク質からなるキャプソメア構造になる。他の好ましい実施態様において、上述した方法のクローニングするステップは、Ｌ２キャプシッドタンパク質をコード化するパピローマウィルス遺伝子をクローニングすることをさらに含み、それによって前記Ｌ１およびＬ２タンパク質を同時に宿主細胞に発現させる、前記宿主細胞が哺乳類細胞である時に前記転移ベクターはワクチンウィルスではないという条件で、単離されたキャプソメア構造はＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質を有する。立体配座Ｌ１コード化配列は、ウシ、サル、ヒトパピローマウィルスからクローンすることができる。好ましい実施態様によれば、立体配座Ｌ１コード化配列は野生型ＨＰＶ１６パピローマウィルスからクローニングされる。特に好ましい実施態様において、立体配座Ｌ１コード化配列は配列番号：２である。また、好ましい実施態様において、転移ベクターはバキュロウィルスに基づく形質転換ベクターであり、パピローマウィルス遺伝子は昆虫細胞において活性であるプロモーターの制御下にある。従って、この実施態様では、組み換えバキュロウィルスＤＮＡはＳｆ−９昆虫細胞にトランスフェクションされる。本発明による方法の別の実施態様において、形質転換ベクターは酵母の転移ベクターであり、組み換えベクターは酵母細胞にトランスフェクションされる。本発明のさらに他の態様によれば、本発明の方法によって産生される、本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるウィルスキャプソメア構造またはその蛋白質が得られる。また、ウィルスキャプソメア構造は本発明の方法により生成される本質的にパピローマウィルスＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。特に好ましい実施態様において、ウィルスキャプソメア構造は、野生型ウィルスからクローニングされたＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡの発現産生物であるパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質を含む。本発明によるこのウィルスキャプシッドまたはキャプソメア構造若しくはその一部あるいは断片は、本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。一方、これらのキャプシッドまたはキャプソメア構造若しくはその断片は、本質的に野生型ＨＰＶ１６パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。上述した本発明のいずれかの方法によるウィルスキャプシッド構造は、未変性（天然の）パピローマウィルスに対する中和抗体を誘導可能な免疫原立体配座エピトープを有するキャプシッドタンパク質を含む。キャプシッドタンパク質は、ウシ、サル、ヒトのパピローマウィルスＬ１タンパク質であることができる。好ましい実施態様において、パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質は、野生型ＨＰＶ１６遺伝子の発現産生物である。特に好ましい実施態様において、ＨＰＶ１６遺伝子は配列番号：２の配列を含む。本発明のさらに他の態様によれば、免疫治療スケジュールに沿って投与した場合に少なくとも約１０3のパピローマウィルス中和抗体力価を誘導できるだけの効果的な免疫原濃度において、パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質または１１タンパク質およびＬ２キャプシッドタンパク質の立体配座エピトープを有するペプ好ましい実施態様において、ペプチドは本質的に野生型ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６遺伝子の発現産生物からなり、例えばこのペプチドは本質的に配列番号：２の発現産生物からなる。本発明のさらに他の態様によれば、パピローマウィルスの感染が疑わしい動物由来の標本においてパピローマウィルスを検出するための方法であって、前記パピローマウィルスのキャプシッドの立体配座エピトープの１つまたは複数に対する特異性を有する抗体と標本とを接触させるステップであって、抗体は検出可能なシグナルを発生させる標識を有し、あるいは検出可能に標識された試薬に結合されるステップと、抗体をパピローマウィルスに結合できるようにするステップと、検出可能なラベルによって標本中に存在するパピローマウィルスの存在を決定するステップと、を含む方法が得られる。本発明のさらに他の態様によれば、パピローマウィルスの感染が疑わしい動物におけるパピローマウィルスに対する細胞免疫応答を決定するための方法であって、前記動物の免疫コンポーネント細胞と野生型の組み換えパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質すなわち本発明の結合された組み換えＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質とを接触させるステップと、キャプシッドタンパク質に対する前記細胞の増殖によってパピローマウィルスに対する細胞免疫性を評価するステップとを有する方法が得られる。本発明のこの態様の好ましい実施態様にいおいて、組み換えパピローマウィルスタンパク質を動物の皮膚に導入する。本発明のさらに別の態様によれば、本質的にパピローマウィルス分析の結果、プロトタイプ株の報告されているＬ１の塩基配列の内、下記の通り2箇所にエラーが検出された。（1）ｎｔ６９０２とｎｔ６９０３の間に3つのヌクレオチド（ATG）の挿入がなければならない、Ｌ１タンパク質中にはセリンの挿入をもたらす。（2）報告されているプロトタイプ塩基配列中には、Ｌ１タンパク質の配列からアスパラギン酸を除去する、nt6952-6954からなる3つのヌクレオチドの欠失がなければならないが、nt5637-7155からなるプロトタイプＨＰＶ１６Ｌ１ゲノムの正確なヌクレオチド配列は配列番号:１のヌクレオチド配列で、本文中に掲載されている。配列番号１中のヌクレオチド塩基の番号付けは、1番から始めており、報告されているＨＰＶ塩基配列のヌクレオチド塩基の番号付けは、nt5638-7156の配列であるが、塩基配列リストの1-1518に対応している。従って元の塩基配列中で対応する部位は当業者により容易に同定される。この他3つのＨＰＶ１６Ｌ１ゲノム、クローン16PAT及びクローン114/16/2及びクローン114/16/11について塩基配列を調べて、これらの塩基配列を修正したプロトタイプの配列と比較した。クローン16PATはUniversity of Rochester School of MedicineのDennis McCa nce氏より供与されたもので頸部の異形成（前悪性）病変よりクローニングされたものであるが、効率的な自己組み立てを行わないＬ１を発現する。クローン114/16/2及び114/16/11はハイデルベルクGerman Cancer Research Ce nter のMatthias Du"rst氏より供与されたものである請求の範囲１．組換えベクター内のパピローマウィルスＬ１発現産物をコード化する塩基配列を含む遺伝子構成物であって、前記構成物が、前記パピローマウィルスＬ１発現産物を含む構造物の自己組み立てにより少なくとも一つのパピローマウィルスＬ１エピトープの形質転換宿主細胞内での発現を誘導することを特徴とする、パピローマウィルスＬ１発現産物をコード化する塩基配列を含む遺伝子構成物。２．前記構造物がさらにパピローマウィルスＬ２発現産物を含むことを特徴とする請求項１記載の構成物。３．さらに前記パピローマウィルスＬ２発現産物をコード化する第２の塩基配列を含むことを特徴とする請求項２記載の構成物。４．前記組換えベクターがバキュロウィルスベクターであり、前記宿主細胞が昆虫の宿主細胞であることを特徴とする請求項１記載の構成物。５．前記組換えベクターがワクシニアベクターであり、前記宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞であることを特徴とする請求項１記載の構成物。６．前記組換えベクターが酵母のベクターであり、前記宿主細胞が酵母宿主細胞であることを特徴とする請求項１記載の構成物。７．前記形質転換宿主細胞が、前記遺伝子構成物を含むウィルスの感染によって形成されることを特徴とする請求項１記載の構成物。８．前記ウィルスが、前記塩基配列と宿主細胞内の天然ウィルスを含むプラスミドの相同組換えにより形成されることを特徴とする請求項７記載の構成物。９．前記構造物が、本質的に前記パピローマウィルスＬ１発現産物およびパピローマウィルスＬ２発現産物からなることを特徴とする請求項１記載の構成物。１０．前記構造物が、本質的に前記パピローマウィルスＬ１発現産物からなることを特徴とする請求項１記載の構成物。１１．前記塩基配列が、ヒトパピローマウィルスＬ１遺伝子、ウシパピローマウィルスＬ１遺伝子またはサルパピローマウィルスＬ１遺伝子に由来することを特徴とする請求項１記載の構成物。１２．前記塩基配列が、組み立て能を有する産物を特定することができるＨＰＶ６Ｌ１遺伝子に由来することを特徴とする請求項１記載の構成物。１３．前記塩基配列が、配列番号：２のアミノ酸配列をコード化するものとして特徴付けられる請求項１記載の構成物。１４．前記塩基配列が、配列番号：２のヌクレオチド配列を有するものとして特徴付けられる請求項１記載の構成物。１５．請求項１乃至１４のいずれか１つに記載の遺伝子構成物により形質転換された宿主細胞。１６．少なくとも１つのパピローマウィルスＬ１エピトープを製造する方法であって、請求項１乃至１４のいずれか１つに記載の遺伝子構成物により、前記エピトープの発現を誘導するステップを含むことを特徴とする少なくとも１つのパピローマウィルスＬ１エピトープを製造する方法。１７．遺伝子構成物の誘導下で発現されたパピローマウィルスＬ１エピトープであって、前記構成物が組換えベクター内でパピローマウィルスＬ１発現産物をコード化する塩基配列を含み、前記構成物が前記パピローマウィルスＬ１発現産物を含む構造物の自己組み立てにより前記エピトープの形質転換宿主細胞内での発現を誘導することを特徴とする遺伝子構成物の誘導下で発現されたパピローマウィルスＬ１エピトープ。１８．前記構造物が、さらにパピローマウィルスＬ２発現産物を含むことを特徴とする請求項１７記載のエピトープ。１９．前記構成物が、さらに前記パピローマウィルスＬ２発現産物をコード化する第２の塩基配列を含むことを特徴とする請求項１８記載のエピトープ。２０．前記組換えベクターが、バキュロウィルスベクターであり、前記宿主細胞が昆虫の宿主細胞であることを特徴とする請求項１７記載のエピトープ。２１．前記組換えベクターがワクシニアベクターであり、前記宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞であることを特徴とする請求項１７記載の構成物。２２．前記組換えベクターが酵母のベクターであり、前記宿主細胞が酵母宿主細胞であることを特徴とする請求項１記載の構成物。２３．前記形質転換宿主細胞が、前記遺伝子構成物を含むウィルスの感染によって形成されることを特徴とする請求項１７記載のエピトープ。２４．前記ウィルスが、前記塩基配列と宿主細胞内の天然ウィルスを含むプラスミドの相同組換えにより形成されることを特徴とする請求項２３記載のエピトープ。２５．前記構造物が、本質的に、前記パピローマウィルスＬ１発現産物およびパピローマウィルスＬ２発現産物からなるものであることを特徴とする請求項１７記載のエピトープ。２６．前記構造物が、本質的に、前記パピローマウィルスＬ１発現産物からなるものとして特徴付けられる請求項１記載のエピトープ。２７．前記塩基配列が、ヒトパピローマウィルスＬ１遺伝子、ウシパピローマウィルスＬ１遺伝子またはサルパピローマウィルスＬ１遺伝子に由来することを特徴とする請求項１７記載のエピトープ。２８．前記塩基配列が、組み立て能を有する産物を特定することができるＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子に由来することを特徴とする請求項１７記載のエピトープ。２９．前記塩基配列が、配列番号：２のアミノ酸配列をコード化するものとして特徴付けられる請求項１７記載のエピトープ。３０．前記塩基配列が、配列番号：２のヌクレオチド配列を有するものとして特徴付けられる請求項１７記載のエピトープ。３１．パピローマウィルスＬ１発現産物およびパピローマウィルスＬ２発現産物を含む構造物の自己組み立てにより構成および配列されるパピローマウィルスＬ１エピトープ。３２．パピローマウィルスＬ１発現産物を含む構造物の自己組み立てにより構成および配列されるパピローマウィルスＬ１エピトープ。３３．実質的にパピローマウィルスＬ１発現産物およびパピローマウィルスＬ２発現産物からなる構造物の自己組み立てにより構成および配列されるパピローマウィルスＬ１エピトープ。３４．実質的にパピローマウィルスＬ１発現産物からなる構造物の自己組み立てにより構成および配列されるパピローマウィルスＬ１エピトープ。３５．前記パピローマウィルスＬ１発現産物が、ヒトパピローマウィルスＬ１遺伝子、ウシパピローマウィルスＬ１遺伝子またはサルパピローマウィルスＬ１遺伝子に由来する配列によりコード化されることを特徴とする請求項３１乃至３４のいずれか１つに記載のエピトープ。３６．前記パピローマウィルスＬ１発現産物が、組み立て能を有する産物を特定することができるＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子に由来する構造物によりコード化されることを特徴とする請求項３１乃至３４のいずれか１つに記載のエピトープ。３７．前記パピローマウィルスＬ１発現産物が、配列番号：２のアミノ酸配列をコード化することを特徴とする構造物によりコード化されることを特徴とする請求項３１乃至３４のいずれか１つに記載のエピトープ。３８．前記パピローマウィルスＬ１発現産物が、配列番号：２のヌクレオチド配列を有することを特徴とする構造物によりコード化されることを特徴とする請求項３１乃至３４のいずれか１つに記載のエピトープ。３９．請求項１乃至１４のいずれか１つに記載の遺伝子構成物を含む単位投与量のワクチン。４０．請求項１乃至４のいずれか１つに記載のエピトープを含む単位投与量のワクチン。４１．免疫投与スケジュールに従って投与を行う場合に、少なくとも約１０³ の抗体価を中和するパピローマウィルスを誘導するのに充分な濃度の、請求項３９または４０記載の単位投与量のワクチン。４２．哺乳動物中の天然のパピローマウィルスの抗体を検出する方法であって、少なくとも１つのパピローマウィルスＬ１エピトープを供給するステップと、前記抗体の存在または量を決定するために前記エピトープを前記哺乳動物由来の体液検体と接触させるステップと、を含み、それによって上記抗体を検出することを特徴とする野生のパピローマウィルスの抗体を検出する方法。４３．哺乳動物由来の標本中の野生のパピローマウィルスを検出する方法において、少なくとも１つの配座Ｌ１エピトープの抗体を提供するステップと、前記パピローマウィルスの存在または量を決定するために前記抗体を前記標本を接触させるを含み、それによって前記パピローマウィルスを検出することを特徴とする野生のパピローマウィルスを検出する方法。４４．哺乳動物における天然のパピローマウィルス感染症診断用キットであって、単一包装の容器内に、前記感染症を決定するのに有効な少なくとも１つの立体配座Ｌ１エピトープまたは前記エピトープの抗体、及びそれらに加えて、前記エピトープと前記哺乳動物由来の体検体中の天然のパピローマウィルスに対する免疫グロブリンとの間の結合を検出するための材料、または前記抗体と前記哺乳動物由来の体検体中の天然のパピローマウィルスとの間の結合を検出する材料を含むことを特徴とする天然のパピローマウィルス感染症診断用キット。４５．パピローマウィルス感染症の予防または治療に使用される少なくとも１つのパピローマウィルスＬ１エピトープ。４６．パピローマウィルス感染症の予防または治療に使用される請求項３９または４０記載のワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/566 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者シラー、ジョンティー. アメリカ合衆国 20902 メリーランド州、シルバースプリング、メイプルビュードライブ 11306 (72)発明者キルンバウアー、ラインハルトアメリカ合衆国 20814 メリーランド州、ベテスダ、ノースブルックレーン 8315、＃905

Claims

【特許請求の範囲】１．バキュロウィルスの転移ベクターに挿入され且つ該ベクターのプロモーターによって作用的に発現される、パピローマウィルスＬ１の配座をコード化する塩基配列を含むことを特徴とする遺伝子構成物。２．前記パピローマウィルスＬ１の配座をコード化する塩基配列が、ウシ、サルまたはヒト遺伝子から単離されることを特徴とする請求項１記載の遺伝子構成物。３．前記パピローマウィルスＬ１の配座をコード化する塩基配列が、野生型ＨＰＶ１６遺伝子から単離されることを特徴とする請求項２記載の遺伝子構成物。４．前記パピローマウィルスＬ１の配座をコード化する塩基配列が、配列番号：６であることを特徴とする請求項３記載の遺伝子構成物。５．パピローマウィルスＬ２をコード化する塩基配列をさらに含むことを特徴とする請求項３記載の遺伝子構成物。６．請求項１乃至５のいずれか一つの遺伝子構成物によって形質転換された、非哺乳動物真核性宿主細胞。７．組み立てられてキャプソメア構造物またはその一部となる、組換えパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を製造する方法であって、Ｌ１の配座キャプシッドタンパク質をコード化するパピローマウィルス遺伝子をクローニングするステップであって、前記遺伝子のオープンリーディングフレームが転移ベクターのプロモーターの制御下にある上記ステップと、組換えベクターを宿主細胞に形質転換するステップであって、クローン化パピローマウィルス遺伝子が前記パピローマウィルスキャプシッドタンパク質を発現させる上記ステップと、前記細胞から前記パピローマウィルスキャプシッドタンパク質を含むキャプソメア構造物を単離するステップと、を含むことを特徴とする組換えパピローマウィルスキャプシッドタンパク質を製造する方法。８．クローン化パピローマウィルス遺伝子が、本質的に配座Ｌ１をコード化する塩基配列からなり、発現されたタンパク質が組み立てられて本質的にＬ１キャプシッドタンパク質からなるキャプソメア構造物を形成することを特徴とする請求項７記載の方法。９．クローニングするステップがさらにＬ２キャプシッドタンパク質をコード化するパピローマウィルス遺伝子をクローニングするステップを含むことによって、前記Ｌ１およびＬ２タンパク質が同時に発現され、単離されたキャプソメア構造物がＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質を含むこと特徴とする請求項７記載の方法。１０．立体配座Ｌ１をコード化する塩基配列がウシ、サルまたはヒトパピローマウィルスからクローニングされることを特徴とする請求項７または９記載の方法。１１．立体配座Ｌ１をコード化する塩基配列が野生型ＨＰＶ１６パピローマウィルスからクローニングされることを特徴とする請求項７または９記載の方法。１２．前記立体配座Ｌ１をコード化する塩基配列が配列番号：６であることを特徴とする請求項１１記載の方法。１３．前記宿主細胞が昆虫の細胞であることを特徴とする請求項７記載の方法。１４．前記ベクターがバキュロウィルスに基づく転移ベクターであり、パピローマウィルス遺伝子が昆虫の細胞内で有効なプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項７記載の方法。１５．前記組換えバキュロウィルスＤＮＡが、Ｓｆ−９昆虫細胞内にトランスフェクションされることを特徴とする請求項７記載の方法。１６．前記組換えバキュロウィルスＤＮＡが、Ｓｆ−９昆虫細胞内に野生型バキュロウィルスＤＮＡと同時トランスフェクションされることを特徴とする請求項１５記載の方法。１７．前記ベクターが酵母の転移ベクターであり、組換えベクターが酵母細胞にトランスフェクションされることを特徴とする請求項７記載の方法。１８．請求項７記載の方法により製造される、本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質を含むウィルスキャプソメア構造物またはその一部。１９．請求項９記載の方法により製造される、本質的にパピローマウィルスＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質を含むウィルスキヤプソメア構造物。２０．前記パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質が、野生型ウィルスからクローニングされたＨＰＶＬ１ＤＮＡの発現産物であることを特徴とする請求項１８または１９記載のウィルスキャプソメア構造物。２１．本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質を含むウィルスキャプシッド、キャプソメア構造物またはその一部。２２．本質的に野生型ＨＰＶ１６パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質を含むことを特徴とする請求項２１記載のウィルス構造物。２３．前記キャプッシドタンパク質が野生のパピローマウィルスに対する抗原を中和することのできる免疫原性立体配座エピトープを含有していることを特徴とする請求項１８、１９、２１または２２記載のウィルス構造物。２４．前記パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質がウシ、サルおよびヒトのパピローマウィルスＬ１タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４記載のウィルス構造物。２５．前記パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質が野生型ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子の発現産物であることを特徴とする請求項２４記載のウィルス構造物。２６．前記ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子が配列番号：６の塩基配列を含む請求項２５記載のウィルス構造物。２７．免疫投与スケジュールに従って投与を行う場合に、少なくとも約１０3の抗体力価を中和するパピローマウィルスを誘導するのに充分な有効免疫原濃度のパピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２キャプッシドタンパク質の立体配座エピトープを有するペプチドを含むことを特徴とする単回量のワクチン。２８．前記Ｌ１キャプッシドタンパク質がＨＰＶ１６キャプッシドタンパク質であることを特徴とする請求項２７記載のワクチン。２９．前記Ｌ１キャプッシドタンパク質が野生型ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質であることを特徴とする請求項２８記載のワクチン。３０．脊椎動物におけるパピローマウィルス感染症の予防または治療方法において、免疫産生法による請求項１８または１９記載のパピローマウィルス構造物の前記脊椎動物への投与を含むことを特徴とするパピローマウィルス感染症の予防または治療方法。３１．前記パピローマウィルス構造物が野生型ＨＰＶ１６Ｌ１キャプッシドタンパク質を含むことを特徴とする請求項３０記載の方法。３２．脊椎動物におけるパピローマウィルス感染症の予防または治療方法において、免疫産生法による請求項３０記載のパピローマウィルス構造物の前記脊椎動物への投与を含むことを特徴とするパピローマウィルス感染症の予防または治療方法。３３．脊椎動物におけるパピローマウィルス感染症の予防または治療方法において、免疫産生法による請求項２７記載のパピローマウィルスワクチンの前記脊椎動物への投与を含むことを特徴とするパピローマウィルス感染症の予防または治療方法。３４．前記パピローマウィルスワクチンが野生型ＨＰＶ１６Ｌ１キャプッシドタンパク質を含むことを特徴とする請求項３３記載の方法。３５．パピローマウィルス感染症に対する脊椎動物の免疫方法において、前記脊椎動物に対して、配座パピローマウィルスＬ１をコード化する塩基配列を含み、パピローマウィルスに対して有効な中和免疫応答が誘導されることによって、前記塩基配列が前記脊椎動物の細胞または組織内での発現を可能にする組換え遺伝子構成物の投与を含むことを特徴とするパピローマウィルス感染症に対する脊椎動物の免疫方法。３６．前記立体配座パピローマウィルスＬ１をコード化する塩基配列がヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６より誘導されることを特徴とする請求項３５記載の方法。３７．前記ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６が野生型パピローマウィルスであることを特徴とする請求項３６記載の方法。３８．脊椎動物のパピローマウィルス感染症に対する液性免疫を検出する方法において、（ａ）少なくとも一つのパピローマウィルス構造物の立体配座エピトープを有する、有効抗体検出量のパピローマウィルスキャプッシドペプチドを供給し、（ｂ）パピローマウィルス感染症に対する検査のために（ａ）のペプチドと脊椎動物由来体液検体を接触させ、前記検体中に含まれるパピローマウィルス抗体を結合させてさらに抗原抗体錯体を形成し、（ｃ）前記錯体に結合した標識免疫グロブリン結合因子により前記検体中の抗パピローマウィルス抗体を検出することを特徴とする脊椎動物のパピローマウィルス感染症に対する液性免疫を検出する方法。３９．前記ペプチドが本質的にパピローマウィルスＬ１キャプッシドタンパク質からなることを特徴とする請求項３７記載の方法。４０．前記ペプチドが本質的にヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６の発現産物であることを特徴とする請求項３８記載の方法。４１．前記ペプチドが本質的に野生型ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１６遺伝子の発現産物であることを特徴とする請求項３９記載の方法。４２．前記ペプチドが本質的に配列番号：６の発現産物であることを特徴とする請求項４０記載の方法。４３．パピローマウィルスの感染が疑わしい動物由来の標本における前記ウィルスの検出方法において、前記標本を一つ以上の前記パピローマウィルスのキャプシッドの配座エピトープに特異性を有する抗体と接触させるステップであって、前記抗体が検出可能なシグナルを産生する標識を有しているかまたは検出用標識試薬と結合されるステップと、前記抗体を前記パピローマウィルスと結合させるステップと、前記検出可能な標識手段により前記標本中のパピローマウィルスの存在を決定するステップと、を含むパピローマウィルス検出方法。４４．パピローマウィルスの感染が疑わしい動物由来の標本における前記ウィルスに対する細胞性免疫を決定する方法において、前記動物の免疫能細胞を請求項１８または１９記載の組換え野生型パピローマウィルスＬ１キャプシッドタンパク質またはＬ１およびＬ２結合タンパク質と接触させるステップと、前記細胞の前記キャプッシドタンパク質に対する増殖応答により前記パピローマウィルスに対する細胞性免疫を評価するステップと、を含むパピローマウィルス検出方法。４５．前記組換えパピローマウィルスタンパク質が前記動物の皮膚内に導入されることを特徴とする請求項４４記載の方法。４６．パピローマウィルス感染症診断用キットにおいて、単一包装の容器内に本質的にパピローマウィルスＬ１キャプシドタンパク質からなるキャプソメア構造物、まはたパピローマウィルスＬ１タンパク質およびＬ２キャプシドタンパク質を含むキャプシド構造物、または前記キャプソメア構造物単一体もしくは結合体のいずれかに対する抗体、またそれらに加えてパピローマウィルスに対する体液性または細胞性免疫のアッセイを行うための材料を含む、パピローマウィルス感染症診断用キット。