JPH08504167A

JPH08504167A - スタフィロコーカス感染の予防及び処理のための指図されたヒト免疫グロブリン

Info

Publication number: JPH08504167A
Application number: JP5514800A
Authority: JP
Inventors: ダブリュ．フィッシャー，ジェラルド
Original assignee: Government of the United States of America
Current assignee: Government of the United States of America
Priority date: 1992-02-25
Filing date: 1992-11-09
Publication date: 1996-05-07
Also published as: WO1993017044A1; AU3271893A; AU673508B2; CA2117480A1; EP0628056A4; EP0628056A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、スタフィロコーカス感染、たとえばＳ．エピダーミスを予防し、又は処理するための指図されたヒト免疫グロブリン及びそれを含む組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】スタフィロコーカス感染の予防及び処理のための指図されたヒト免疫グロブリンＩ．政府の興味本明細書に記載される発明は、それに対していづれの特許権の支払をも伴わないで政府目的により又は政府目的のために製造され、許可され、そして使用され得る。 II．発明の分野本発明は、スタフィロコーカス（staphylococci）感染の予防及び処理のための指図されたヒト免疫グロブリンに関する。 III．発明の背景過去２０年間にわたって、スタフィロコーカスは、入院を要する患者における感染の重要な原因になって来ている。皮膚上でのそれらの高い流行性のために、スタフィロコーカスは衰弱している又は免疫抑制された患者において重度の感染を引き起こすように理想的には位置する。ヒトにおいて最とも頻繁に病原性であるスタフィロコーカス種は、スタフィロコーカスアウレウス（Staphylococcus aureus）（SA）及びスタフィロコーカスエピダーミジス（Staphylococcus ep idermidis）（SE）である。両グループは、抗微生物治療を困難にする複数の抗生物質に対する耐性を生ぜしめる。最近、SEは、患者における院内感染の主な原因になって来ており、ここで患者の処理は外来性材料の配置、たとえば脳脊髄液分路、血管用カテーテル又は連結用補テツを包含する。SEは連続した移動性腹膜透析を有する患者において手術後の傷感染腹膜炎の通常の原因である。弱められた免疫性（悪性、骨髄移植）を有する患者又は中心の静脈カテーテルを通しての消化管栄養物を受ける患者はまた、SE敗血症を進行せしめる高い危険性を有する（Patrick,J. Pediat.，1990）。 SEは、未熟児における新生児院内敗血症の通常の原因として発生して来た。Fl eer及び同僚（Pediatr Intect Dis，1983）により示されるように、SE感染は消化管栄養を受けた未熟児に頻繁に生じる。早産児は、抗体、補体及び好中球機能の異常を伴って弱体化された免疫性を有する。脂質注入は、現在、多くの育児室において消化管栄養治療の標準の成分であり、そしてFischer及び同僚（Lancet ，1980；2：819〜20）により開示されるように細菌感染に対して免疫性をさらに弱体化する。最近の研究は脂質エマルジョン注入と新生児におけるコーギュラーゼ（coagulase）陰性スタフィロコーカス細菌とを関係づけた（Freeman and Col leagues，N.Engl.J.Med，1990）。さらに、Fleer及び同僚（J Inf Dis，1985）による研究は、新生児は、その血清が明白に検出できるレベルのSEペプチドグリカンに対するIgG抗体（スタフィロコーカスに対するオプソニン性抗体はペプチドグリカン抗原に向けられるように思えた）を有する事実にもかかわらず低レベルのSEに対するオプソニン性抗体を有することを示した。それらの研究はSEに対する新生児の感受性が弱体化されたオプソニン性活性に関連することを示唆したが、SEに対して向けられた抗体がオプソニン性であるか又は新生児に対して陽性的に付与される場合、保護を提供することができるかどうか明白でない。さらに、食菌作用及び食細胞による細菌の殺害をさらに弱体化する内部脂質（intralip id）の存在が抗体の活性を阻害するかどうかはまだ知られていない。 SEに関するプールされたヒト免疫グロブリンのオプソニン活性が Clark及び同僚（J Med Microbiol，1986）により研究され、そして補体及びIgG の両者がSEの効果的オプソニン化のために臨界であることを示した。しかしながら、多くの研究において補体は必要とされず、そしてFleer（1985）の報告に反して、ペプチドグリカンによる血清の吸収はSEのためのオプソニン活性を除去することが示された。Clark及びEasmon（1986）による追加の研究は、いくつかの組の標準の静脈内免疫グロブリン（IVIG）がSEに対する種々のオプソニン活性を有することを示した。IVIG組の１／３が補体を伴って良好でないオプソニン化を有し、そして14のうちたった２つが補体を伴わないでオプソニン性であった。IV IGロットは多くの血漿ドナープールから作られる事実にかかわらず、SEに対する良好なオプソニン抗体は一様に存在しなかった。それらの研究は、連続した移動性腹膜透析を受ける患者における腹膜防御を高めるために免疫グロブリンの可能性ある使用に向けられ、そしてIVIGが細菌性敗血症の予防又は処置のために使用されるかどうかを試験せず、又は未熟又は免疫抑制された患者における敗血症及び致死性感染を予防し、又は処置するためへの抗体の使用を試験せず、そして特にインビボ研究がSEを予防し又は処置するために抗体を試験しなかった。従って、抗体が、未熟性又は弱体化された免疫性に対して有益な治療を提供する証拠は存在しない。現在使用されているオプソニンアッセイは遅く、そしてSEに対する抗体のために血液；血漿又は免疫グロブリンをスクリーンするためにやっかいである。SE抗体についてスクリーンするために急速な抗原結合アッセイを有することは、そのアッセイがインビトロにおいてオプソニン活性及びインビボにおいて保護にさらに関連する場合、重要である。 IgGがSEに対する保護を高めることができるかどうかを決定するために、SE感染を有する患者に相当する適切な動物モデルが必要とされる。これは、新生児が低レベルの補体及び弱められた好中球及びマクロファージ機能を有するので、臨界である。免疫グロブリンのオプソニン活性はインビトロ保護において最適な条件下で適切であるが、保護は未熟又は弱体化された免疫系を有する患者において存在し得ない。Clark及び同僚（J Clin Pathol，1986）により示されたように、ほとんどのIVIG調製物は、補体が除去される場合、オプソニン性ではない。しかしながら、SEは低ウィルス性であるので、SE敗血症の適切な動物モデルは入手できなかった。 Yoshida及び同僚（J Microbiol，1976）は、感染された成熟マウスを24〜48時間以内で90〜100％殺す、SEのウィルス性株に対して報告した。このモデルは、患者に見られるモデルとはひじょうに異なり、そしてまれなタイプのSE感染を示す。ヒトからのSEの80種の新鮮な単離物が分析される場合、それらはマウスを殺すことができなかった。新規のSE表面多糖類に対する非ヒト抗体がウィルス性SE 株からマウスを保護した。Yoshida及び同僚（J Med Microbiol，1977）によるのちの報告は、彼らのこれまでの観察を確認した。免疫化誘発された非ヒト抗体による受動的予防は、IgG画分は保護しないが、IgM画分は保護を付与したことを示した。従って、IgG抗体が保護性でないことがこのモデルにおいて示された。本明細書においてこれまで示されたように、新生児はSEに対する良好なレベルのIg Gを有するが、しかし低レベルのオプソニン抗体を有し（Fleerand同僚、J.Infec t.Dis，1985）、これはこの研究での発見に合致し、そしてSEに対するIgGの保護での役割は不明であることを示した。1987年、Ichiman及び同僚（J Appl Bacter iol，1987）による報告は、SEの選択されたウィルス性株に対するヒト血清における保護抗体の分析を包含することに彼らの動物研究を拡張した。保護抗体がIgA，IgM及びIgG免疫グロブリン画分に見出された。それらの研究は、IgGが保護性でないことを示すこれまでのデータと矛盾し、そして、免疫グロブリンクラス（IgG，IgM及びIgA）のいづれかのために決定的な役割を確立しない。 Yoshida，Ichiman及び同僚により記載される動物モデルにおいては、成熟した非免疫抑制マウスが使用され、そして死は敗血病ではない毒素に関連しているように思えた（Yoshida及び同僚、J.Microbiol，1976）。ほとんどの臨床学的単離物はそれらのモデルにおいて致死の原因を引き起こさなかった。定量的血液培養は行なわれなかったので、抗体が未熟の免疫抑制された患者において又は特に内部脂質の存在下でSE敗血症を予防するか又は治療するかいづれかは未知である。抗体は、一定のカプセル封入された細菌、たとえばヘモフィラスインフルエンザ（Hemophilus influenzae）及びストレプトコーカスプネウモニア（Streptoco ccus pneumoniae）に対してヒトにおいて保護を提供する。個人、たとえば抗体を欠いている幼児はそれらの細菌による感染に敏感であり、そして菌血症及び敗血症は通常である。それらの細菌に対する抗体が存在する場合、それは血液から細菌の清浄を促進することによって保護を提供する。Ｈ．インフルエンザ及びＳ．プネウモニアに対する抗体を有する免疫グロブリンはそれらの細菌による敗血症から幼児を保護する。Espersen及び同僚（Arch Intern Med，1987）による文献は、併発された菌血症を有する患者及び菌血症及び心内膜炎を有する患者においてSEに対するIgG抗体を分析するために抗原結合RIAアッセイの使用を開示する。このアッセイはSE特異的IgGを同定するためにSEの超音波抽出物を使用した（この研究における表面抗原は、異なった方法により得られる、Yoshida及び同僚により使用される抗原とは異なる；軽い音波オスシレーション）。併発されていない細菌症を有する，患者はSEに対するIgG 抗体を有さない。それらのデータは、IgGが血液からのSEの効果的な根絶のためには不必要であることを示唆する。さらに、心内膜炎を有する菌血症患者の89％はSEに対する高レベルのIgGを進行せしめた。それらの患者においては、IgGは保護的ではない。なぜならば、高レベルのIgG抗体（後で進行せしめた）は重症の菌血症及び心内膜炎に関連しているからである。それらの研究に基づけば、SE敗血症及び心内膜炎におけるIgGの保護役割は、特に免疫性、衰弱、内部脂質注入又は免疫抑制の存在下で確立されない。さらに、Patrickなど（J.Pediat.，1990 ）の広範なレビューは、SE感染のために可能性ある予防又は治療剤としての免疫グロブリンを包含しない。 SEが高い危険性の個人、たとえば外来性物体移植物を有する患者、早産児及び免疫抑制された患者において重要な病原体であることは医学界により認識されている。従って、SE感染、たとえば敗血症又は心内膜炎を予防し、又は処理し、そしてそのような高い危険性の人々の血液からのSEの清浄を促進する必要性がヒト免疫グロブリンのために存在する。 IV．発明の要約従って、スタフィロコーカス感染を予防し、又は処理するために新規の指図されたヒト免疫グロブリンを供給することが本発明の目的である。この病原体に対する指図されたヒト免疫グロブリンを生成するためにＳ．エピダーミスに対する特異的抗体のための血清（血漿）又はプールされた免疫グロブリンをスクリーンすることが有用であることが見出された。この指図されたヒト免疫グロブリンは、それがＳ．エピダーミスの表面抗原と反応し、そしてファゴサイト−シスを増強し、そしてＳ．エピダーミスをインビトロで殺害する高レベルのヒト抗−スタフィロコーカス抗体を有することにおいて、標準のヒト免疫グロブリン調製物とは異なる（80％以上のオプソノファゴサイト−シス殺菌活性）。さらに、Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリンは、インビボで免疫性を高め、そして致死性感染を予防し、並びに未熟性及び弱体化された免疫性の状態における血液からＳ．エピダーミスの清浄を高める。これは、免疫抑制又は未熟性が、Ｓ．エピダーミスを飲み込み、そして殺害するファゴサイト− シス細胞の能力を付与することによって抗体を無効果にすることが予測されるので驚くべき事である。標準の免疫グロブリンプール又は正常なドナーは確実なレベルの、Ｓ．エピダーミスに対するオプソニン抗体を有さないが、指図されたヒト免疫グロブリンは、静脈内に与えられる場合、ファゴサイト−シスを促進し、そしてファゴサイト −シスによりＳ．エピダーミスを殺害する特異的抗体をすぐに供給することもまた、本発明のもう１つの良好な目的である。本発明の追加の利点は、SEにより感染された、未熟又は免疫抑制された患者に対するオプソニン抗体を供給することによって、抗生物質治療が感染の血液又は部位からの改良されたＳ．エピダーミス清浄により増強され得ることである。もう１つの利点は、静脈内又は筋肉内に与えられた指図されたヒト免疫グロブリンが患者の血液における抗体のレベルを高めるので、指図されたヒト免疫グロブリンが菌血症及び局部感染を引き起こすＳ．エピダーミスを予防することである。Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリンを生成する方法は次の段階を包含する：ａ）インビトロでの抗原結合アッセイ：（ELISA）を用いてＳ．エピダーミスに対する抗体について血漿（血漿又は免疫グロブリンのプール；免疫グロブリン又は免疫グロブリン調製物のプール）をスクリーンし、続いて、インビトロでのオプソノファゴサイト−シス殺細菌アッセイを用いて機能的活性を確保すること（80％以上の殺細菌活性）。ｂ）保護効能が、新生児のＳ．エピダーミス敗血症の授乳ラットモデルを用いて、指図されたヒト免疫グロブリンの保護活性を分析することによってインビボで記録され得る（死亡率及び細菌清浄）。これは、未熟性及び／又は内部脂質誘発された免疫抑制の存在下で抗体効力を試験する最初のインビボモデルであると思われる。これらの方法は、Ｓ．アウレウスに対する指図されたヒト免疫グロブリンを生成するためにSEの代わりに他のスタフィロコーカス、たとえばSAを用いてくり返えされ得る。 SEに対するこの新規の指図されたヒト免疫グロブリンは、高い危険性の患者、たとえば集中的な治療ユニットにおける新生児及び成人において又は内在する外来性物体、たとえば静脈及び動脈カテーテル又は心室分路体（shunt）を有する患者における致死性SE感染を阻止するために使用され得る。指図されたヒト免疫グロブリンはまた、SE感染のために処理される患者において細菌清浄を高めるために、抗生物質の他に、付随する治療にも使用され得る。本発明の他の目的、特徴及び利点は次の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な記載及び特定の例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的により与えられ、そして本発明の範囲内での種々の変更及び修飾は当業者に明らかであろう。本明細書に使用されるような用語、Ｓ．エピダーミスに対する標準のヒト免疫グロブリン及び指図されたヒト免疫グロブリンは次のように定義される：標準のヒト免疫グロブリン−多くのドナーから、ドナーの選択を伴わないで免疫グロブリンをプールし、又はＳ．エピダーミスに対する抗体活性を確保するために免疫グロブリンをスクリーンすることによって調製されたヒト免疫グロブリン。Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリン−Ｓ．エピダーミスに対する抗体についてスクリーンし（殺細菌活性＞80％）、それによってＳ．エピダーミスに対する抗体の保護レベル及びＳ．エピダーミス感染を予防し又は処理するために適切な抗体の保護レベルをヒト免疫グロブリンに付与することによって調製された免疫グロブリン。殺細菌活性-37℃で２時間のインキュベーションの後、好中球介在のオプソノファゴサイト−シス殺細菌アッセイを用いて、抗体の添加により殺害された細菌の百分率。Ｖ．図面の簡単な説明第１図：第１図は、ヒト標準静脈免疫グロブリンのいくつかのプールが分析される場合、抗原結合アッセイにより測定される場合のＳ．エピダーミスに対する抗体活性における著しい差異が存在したことを示す（ELISA、1:100の希釈を用いて1.5時で最高の0.0.読み取り）。それらは、種々の技法を用いて精製されたIgGのプールであった。最高の力価を有する３種のプールのうち、２種はCutter Laborator ies，Berkeley Californiaからであり（40P07，40R09）、そして１種はSandoz， East Hanover，N.J.からであった（069）。Cutterからの１種の調製物はまた、最少の活性の次であった（2801）。それらのデータは、標準のスクリーンされていないヒト免疫グロブリンがＳ．エピダーミスに対する種々のレベルの抗体を有し、そして免疫グロブリンを調製するために使用され、又は大きなドナープールサイズを用いる単一の方法はＳ．エピダーミスに対する良好な抗体活性を確保しないであろうことを示す。さらに、ドナーは、スタフィロコーカスに対する高レベルの抗体を有する血漿又は血漿ドナーの単位を同定する実施可能性を示す、Ｓ．エピダーミスに対する高い抗体活性（Sam）を有することが示された。第２図：第２図は、補体の存在下でＳ．エピダーミスのファゴサイト−シス及び殺害を促進するための免疫グロブリンの能力を測定するインビトロでの機能的（オプソニン）アッセイを用いれば、そのオプソニン活性はまた、標準のヒト免疫グロブリンの種々のロット及び調製において変化し得ることを示す。この図はまた、Ｓ．エピダーミスに対して高レベルの抗体を有するものとしてELISAにより同定された免疫グロブリンがまた、インビトロにおいて高レベルの機能的抗体を有することを示す。これは、この研究が、TCA抽出されたＳ．エピダーミス抗原に結合するIgGがＳ．エピダーミスのファゴサイト−シス及び殺害を促進するであろうことを示すので臨界である。従って、インビトロスクリーニングアッセイを用いて、Ｓ．エピダーミス感染を予防し又は処理するために信頼できるレベルの抗体を有する、Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリンをだれでも選択することができる。それはまた、多くの標準のヒト免疫グロブリンロットがＳ．エピダーミスに対してほとんど又はまったくオプソニン活性を有さないので、スクリーンされていない免疫グロブリンは信頼できる保護を提供しないことを示す。従って、標準のヒト免疫グロブリンはSEに対して均一の高レベルの抗体を確保せず、そして多数のドナーが通常の細菌、たとえばＳ．エピダーミスに対して良好なレベルの抗体を提供すると予測される事実にもかかわらず、均一的に保護性ではない。第３図：第３図は、指図された免疫グロブリンは長期のＳ．エピダーミス菌血症の進行から動物を保護するが、しかし標準の免疫グロブリンは保護しないことを示す。指図された免疫グロブリンにより処理された動物は、低いピーク菌血症レベル（ 9.2×10²vs.6.5×10³）を有し、そしてその菌血症をより効果的に清浄した（72 時間で５細菌／ml vs. 380細菌／ml；幾何学的平均レベル）。さらに、感染後72 時間で、指図された免疫グロブリンを与えられた動物18／24（75％）がそれらの菌血症を除去し、そして100％が生存し、ところが標準の免疫グロブリンを与えられた動物4／20（20％）は死亡し、そしてたった１／16（6％）が72時間でそれらの菌血症を除去した。予防の他に、指図された免疫グロブリンはＳ．エピダーミス除去を促進するので、多くの患者が弱体化された免疫性を有し、そして細菌を効果的に除去しない抗生物質治療に付随するものとして、Ｓ．エピダーミスにより感染された人々のために価値あるものである。 VI．好ましい態様の詳細な記載例本明細書に提供される例は、スタフィロコーカスエピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリンの生成及びスタフィロコーカスエピダーミスにより引き起こされる感染の予防又は処理のためへの前記免疫グロブリンの使用においての本発明の実施を、いづれの包含される制限も伴わないで、例示するための方法を提供する。代表的な実験のプロフィールは、Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリンを製造するための方法を例示し、そしてＳ．エピダーミス感染を予防し、又は処理するためにその有用性を示すために選択された。材料及び方法スタフィロコーカス菌株：いづれのＳ．エピダーミス菌株でも使用され得るが、それらの実験においては、American Type Culture Collection，Rockville，M Dからの２種の菌株（ATCC #31432及びATCC #35984）を使用した。Ｓ．エピダーミス敗血症を有する子供の血液からの臨床学的単離物（Hay）をまた使用し、そしてまた、ATCCに寄託する。材料及び方法免疫グロブリン：標準の静脈内免疫グロブリンを大きな免疫グロブリンプールを提供するためにそれらの実験で使用した。Gamimmune,Cutter Laboratories In c．Berkeley，California；Sandoglobulin，Sandoz，East Hanover，N.J.；Gamm agard，Hyland，Los Angeles，Californiaからの調製物を比較のために分析した。個々のドナーからの血清をまた、Ｓ．エピダーミスに対する抗体活性について分析した。卜リクロロ酢酸（TCA）抗原抽出スタフィロコーカスエピダーミス株（ATCC #35984, ATCC #31432及びHay）を、Tryptic Soy Broth（Difco）1000mlにおいて37℃で対数相まで増殖した。次に、細菌を2500RPMで10分間、遠心分離し、そして上清液をアスピレートし、そして捨てた。細菌の底を、２％トリクロロ酢酸（TCA）200mlに再懸濁し、そして４℃で一晩撹拌した。次に、その混合物を2500RPMで10分間、遠心分離し、そして上清液をアスピレートした。その上清液に、４体積の無水エタノールを添加し、そして４℃で一晩、再遠心分離した。2500RPMで10分間の遠心分離の後、上清液を除き、そして捨てた。次に、５mlの通常の塩溶液を抗原沈殿物に添加し、それを培養し、無菌性を確保し、そして次に、貯蔵のために凍結乾燥した。酵素結合イムノアブゾーベントアッセイ（ELISA）を用いての抗原結合研究Ｓ．エピダーミス抗原を、25μｇ／mlの濃度で炭酸塩緩衝液に溶解した。96ウェルの平底マイクロタイタープレート（NUNC，Roski1ide，Denmark）の個々のウェルに、10μｌを添加し、そして使用まで４℃で貯蔵した。免疫グロブリンを１％に希釈し、そして２倍の希釈溶液をリン酸塩緩衝溶液−Tweenにおいて調製した。個々のウェルに、100μｌの一連の希釈溶液を添加し、そしてプレートを４ ℃で１時間インキュベートした。プレートをH₂O−Tweenにより４度洗浄した。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトIgG（100μｌ；１：250）を添加し、プレートを４℃で１時間インキュベートし、そして次に、洗浄されたH₂O−Tween及びジエタノールアミン緩衝液中、Ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質100μｌを添加した。室温での90分のインキュベーションの後、色彩の進行を、405nmでの吸光度により決定した。オプソニンアッセイ：免疫グロブリンプール及び血清におけるＳ．エピダーミスに対する機能的抗体を決定するために、好中球介在の殺細菌アッセイを使用した。好中球を、デキストラン沈殿法及びフィコール−ヒパーク（ficall-hypaque）密度遠心分離により成人の静脈血から単離した。0.1ml／ウェルの合計体積を要するマイクロタータープレートアッセイを用いて、洗浄された好中球（約10⁶個の細胞）を、３×10⁴ 個のおよそ中間対数相の細菌と共に、丸底マイクロタイターウェルに添加した。新生ウサギ血液（１０μｌ；Ｓ．エピダーミスに二対する抗体の不在を確かめるためにスクリーンされた）を、活性補体の源として使用した。５％標準免疫グロブリン（又は血清）40μｌを添加し、そしてマイクロタイタープレートを一定の激しい振盪を伴って37℃でインキュベートした。サンプル（10μｌ）を、ゼロ時点及びインキュベーションの２時間後に個々のウェルから取り、希釈し、激しく振盪し、細菌を分散し、そして血液寒天プレート上で37℃で一晩、培養し、生存細菌の数を定量した。対照は、好中球のみ、補体のみ及び好中球＋補体から成った。スタフィロコーカス敗血症モデル：授乳ラットモデルを用いて、Ｓ．エピダーミスに対する抗体のインビボ活性を決定した。Wistarラット（生後２日目）に、0.2mlの20％内部脂質（Intralipid ）（Cutter，Berkeley California）を、0800及び1400で腹膜内に投与した。生後３日で、個々の動物に再び、0.2mlの20％内部脂質を0800及び1400で付与し、そして0.2mlの５％免疫グロブリン又は血清をIP投与した。内部脂質の最後の投与の後すぐに、0.05ml（約５×10⁷個）の中間対数相のＳ．エピダーミスを、尾に対して頭側で皮下注射した。生後24時間もたたない授乳ラットは、10⁷〜10⁸個のＳ．エピダーミスにより皮下感染される場合、致死性Ｓ．エピダーミス敗血症を進行する。選択された動物における菌血症レベルを分析するために、血液0.01 mlを前記授乳ラットの尾から、感染後24，48及び72時間で得た。血液をマイクロピペットにより、滅菌条件下で採取し、そしてTryptic Soy Broth（Difco）により連続的に希釈した。細菌をプレート上にサブ培養し、Ｓ．エピダーミス菌血症を確かめ、そしてすべての動物を５日後、生存について測定した。結果Ｓ．エピダーミスに対するヒト免疫グロブリンの抗原結合活性Ｓ．エピダーミスに対する抗体についてのいくつかの標準の免疫グロブリン調製物のELISA試験の結果を第１図に示す。ほとんどの標準の免疫グロブリンは、Ｓ．エピダーミスに対する低レベルの抗体を含んだ。しかしながら、Ｓ．エピダーミスのTCA抽出抗原に対する抗体についてスクリーンすることによって、１人のドナーからの血清及びいくつかの免疫グロブリンロットは、Ｓ．エピダーミスに対して高められたレベルの抗体を有することが見出された（O.D.読み取り1.014，1.026及び1.002）。Ｓ．エピダーミスに対する抗体の変動は、種々の技法により調製された調製物間に存在し、そして単一の調製物におけるロット対ロットの変動も同じように見られ、この事は、すべての免疫グロブリンプールが同じではないことを示唆する。Ｓ．エピダーミスに対するヒト免疫グロブリンのオプソニン活性一定の生物に対して指図されたすべての抗体は免疫性を増強することができず、そして感染からの増強された保護を提供する。すなわち、抗体は細菌に結合でき、そしてインビトロでオプソニン作用を増強せず、又は感染された宿主の血清からの除去も増強しない。従って、機能的アッセイをまた利用して、ELISAにより検出されたＳ．エピダーミスに対する抗体がまた、好中球により生物のファゴサイト−シス及び殺害を促進することができるかどうかを決定した（第２図）。オプソニン抗体活性は、低い（25％以下の殺細菌活性）〜中ぐらいの活性（25〜 80％）の範囲であり、そして少々は高い（80％以上）殺細菌活性を有した。従って、高い殺細菌活性を有する２種の標準ヒト免疫グロブリン調製物を、TCA S.エピダーミス抗原に結合する抗体及びインビトロ試験により決定されるオプソニン抗体活性を測定するインビトロアッセイに基づいて、Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリンとして選択した。単一のドナーからの血清はまた、Ｓ．エピダーミスに対して良好なオプソニン活性を有した（80％以上のオプソノファゴサイト−シス細菌活性）。何人かの個人からの血清及び血漿が研究されたが、このドナーのみが高いオプソニン活性を有した。従って、ドナースクリーニングは、Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリンを生成する他の方法としてプールされた免疫グロブリンに寄与する個々の血液又は血漿ドナーを検出できた。さらに、血液又は血漿単位がまた、プーリングのためにスクリーンされ得た。動物保護研究表の記載第１表第１表は、標準のヒト免疫グロブリン（Ｓ．エピダーミスに対して中ぐらいの活性を有した）及び塩溶液対照に比較して、Ｓ．エピダーミス（40R09）に対する指図されたヒト免疫グロブリン（ELISA及びオプソニンアッセイスクリーニングにより選択された）の効果を示す。第１表は、未処理の対照動物が約50％の死亡率を有するが、Ｓ．エピダーミスに対する指図された免疫グロブリンを付与された動物は完全に保護された（死亡率なし）ことを示す。標準の免疫グロブリンは一部の保護のみを付与した。Ｓ．エピダーミスに対する低いレベルの抗体を有する他の標準の免疫グロブリンロットは、死亡率が塩溶液よりも一層高いので、ほとんど効果的ではない。しかしながら、指図された免疫グロブリンが常に100 ％効果的であることは予測できないが、しかしそれは標準の免疫グロブリン又は未処理の動物よりも確実に生存性を改良することが予測され得る。第２表第２表は、免疫化（Ｓ．エピダーミスワクチン）によりウサギに生成された指図された免疫グロブリンが、Ｓ．エピダーミスに対する抗体についての免疫グロブリンをスクリーンすることによって生成される指図されたヒト免疫グロブリンに類似する生存体を生成することを示す。Ｓ．エピダーミスワクチンによる個人の免疫化及び免疫グロブリン抽出についての血漿の採取は、Ｓ．エピダーミス感染を予防し、又は処理するための指図されたヒト免疫グロブリンを生成するためのもう１つの方法である。第３表第３表は、内部脂質がＳ．エピダーミスにより感染された授乳ラットにおいて投与量関連の高められた死亡率を引き起こすことを示す。内部脂質のみを受ける対照の動物は100％生存率（43／43）を有するが、しかし16g／kgの内部脂質を与えられた未熟ラットはたった46％（6／13）の生存率を有した。高い投与量の内部脂質は、通常無毒性のＳ．エピダーミスが子供の動物を不可抗力にするために十分に免疫系を弱めるように思われる。第４表第４表は、内部脂質を与えられていないが、Ｓ．エピダーミスにより感染されている正常な生後３日目の授乳ラットが菌血症を誘発することを示す。しかしながら、72時間にわたって、それらの免疫系は血液から前記生物を除去することができ、そしてすべてのラットは生存する。第１表は、Ｓ．エピダーミスに対する指図されたヒト免疫グロブリン（Ｓ．エピダーミスに対してオプソニン又は抗原結合活性について標準の免疫グロブリンをスクリーンすることによって選択された）は、内部脂質による弱体化された免疫性の設定において致死性感染からの完全な保護を提供するが、しかし標準の免疫グロブリン（中ぐらいの抗体レベルを有する）は部分的保護（塩溶液に関して約50％である保護に比較して、５匹の動物のうち１匹が死亡した）のみを有することを示す。他の免疫グロブリン調製物による追加の研究（Alpha Pharmaceutic als；指図されたヒト免疫グロブリン8016A、90％以上のオプソニン活性×標準のヒト免疫グロブリン8007A、50 ％以下のオプソニン活性）は、指図されたヒト免疫グロブリンがまた、標準のヒト免疫グロブリンよりも高められた生存率［（8016A−64／95（67％）vs．8007A −39／90（43％）］を付与することを示した。さらにより著しいことには、指図されたヒト免疫グロブリンがＳ．エピダーミス菌血症のピークレベルを低め、そして細菌の急速な除去を促進した事実であった（第３図）。それらの研究は、抗体がＳ．エピダーミスに対する保護及び血液からの高められた細菌除去のために重要であり、そして弱体化された免疫性を有する未熟宿主においてさえ、効果的な予防又は治療方式であることを示した。標準のヒト免疫グロブリンにより処理された動物の多くは感染後72時間で菌血性のままであったが、しかしたった１／ 20の動物が指図されたヒト免疫グロブリンを受けた後72時間で、まだ菌血性であった。さらに、72時間での平均菌血症レベルは著しく異なった（指図されたヒト免疫グロブリンによる菌血症0.5×10¹vs標準のヒト免疫グロブリンによる菌血症 3.8×10²）。さらなる研究において、Ｓ．エピダーミスに対するウサギ指図された免疫グロブリンは、Ｓ．エピダーミスワクチンによりウサギを免疫化することによって生成された。このワクチン誘発性指図された免疫グロブリンと、Ｓ．エピダーミスに対する抗体について免疫グロブリンをスクリーンすることによって生成された指図されたヒト免疫グロブリンとを比較した（第２表）。ワクチン誘発性指図された免疫グロブリンはスクリーニングにより生成された指図されたヒト免疫グロブリンに類似する保護活性を有し（9／11 vs 12／13の生存率）、そしてそれらの個々は対照よりも良好であった（11／19の生存率）。それらのデータは、Ｓ．エピダーミスワクチン誘発性抗体がＳ．エピダーミスの予防及び処理のために使用され得、そしてワクチンが指図されたヒト免疫グロブリンを生成するために使用され得ることを示す。第３表多くの細菌、たとえばＳ．エピダーミスは正常な人々においては病原性ではない。しかしながら、内部脂質に関して見られるように、未熟免疫系又は弱められた免疫性を有する子供においては、Ｓ．エピダーミスは敗血病及び死を引き起こす。従って、抗体の有効性を試験するためのいづれかの動物モデルはそれらの要因を包含すべきであることは臨界である。本発明者の知識によれば、スタフィロコーカスエピダーミスに対する抗体が未熟及び／又は免疫抑制された宿主において保護を提供し、そして細菌の除去を増強することを示したことは最初である。16mg／kgまでの用量で与えられた内部脂質はいづれの子供の動物にも死を引き起こさなかった（対照、第３表）。内部脂質の不在下で、生後３日目の動物は、感染後、Ｓ．エピダーミスを有する菌血症になるが、しかし72時間にわたって感染を除去し、そして生存する（第４表）。しかしながら、内部脂質は投与量関連態様で免疫性を弱め、そして生後３日目の動物がＳ．エピダーミスにより感染される場合、致死性敗血症が動物の67％までに生じた。生後１日目でのラットは菌血症を十分に除去せず（未熟の免疫性のために）、そして致死性敗血症を進行せしめる。それらのモデルにおいて、ラットはＳ．エピダーミス菌血症を除去することができず、そして致死性敗血症を進行せしめた。指図されたヒト免疫グロブリンは生存性を高めることができ、そして細菌の除去を促進することができるが、しかし標準のヒト免疫グロブリンは除去を促進しなかった（第３図）。第４表 SEが正常な幼児ラットに注射される場合、それらは２時間で菌血症になり、そして次に血液から細菌をゆっくり除去し始める。すべての動物は、感染後72時間で、菌血症を除去した。従って、これは、通常の環境下で、新生児の免疫性は、弱体化されるが、結果的にSEを制御することができる。しかしながら、生後すぐにＳ．エピダーミスにより感染されたラットの研究は、それらがまた、致死性感染を進行せしめることができることを示した。第１表授乳ラットモデルにおいて致死性Ｓ．エピダーミス感染からの保護を提供することにおいてのスタフィロコーカスエピダーミスに対する標準の免疫グロブリン及び指図された免疫グロブリンの効果第２表Ｓ．エピダーミス敗血モデル^*においてスクリーンされた指図された免疫グロブリンとワクチン誘発された抗−スタフィロコーカス指図された免疫グロブリンの治療効果の比較第３表動物モデル：授乳ラットにおけるスタフィロコーカスエピダーミス死亡率に対する内部脂質用量の効果Ｓ．エピダーミスによる感染(Haywood) ；約10⁷個の細菌SQ。標準モデルは、十分な４回目の用量が与えられる場合、３日目に、最後のIL投与の後、感染により生後２日目に開始する。 * ILは、２日目に４回目の投与後、感染により生後１日目に開始する。第４表内部脂質の代わりに通常の塩溶液を与えられた正常な授乳ラットにおけるスタフィロコーカスエピダーミス菌血症レベル * 血液１ml当たりの細菌の平均数

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 Ｅ 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ) ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＳ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．スタフィロコーカスエピダーミス感染の予防又は処理のための指図されたヒト免疫グロブリン。２．スタフィロコーカスエピダーミスの表面抗原と反応し、そしてスタフィロコーカスエピダーミスのインビトロでのファゴサイト−シス及び殺害及び／又はインビボにおけるスタフィロコーカスエピダーミスに対する保護を促進する、測定されるレベルの抗−スタフィロコーカスIgG抗体を含む請求の範囲第１項記載の指図されたヒト免疫グロブリン。３．前記測定されるレベルの抗−スタフィロコーカスIgG抗体が約80〜約100％の範囲内にオプソニン活性を有する請求の範囲第２項記載の指図されたヒト免疫グロブリン。４．Ｓ．エピダーミスによる感染を予防し又は処理するために十分な量の請求の範囲第１項記載の指図されたヒト免疫グロブリン及び医薬的に許容できるそのためのキャリヤーを含んで成る医薬組成物。５．請求の範囲第２項記載の指図されたヒト免疫グロブリンを含んで成る医薬組成物。６．請求の範囲第３項記載の指図されたヒト免疫グロブリンを含んで成る医薬組成物。７．Ｓ．エピダーミスELISA又はオプソニンアッセイにより血清、血漿又は免疫グロブリンプールをスクリーンすることによって請求の範囲第１項記載の指図されたヒト免疫グロブリンの調製方法。８．前記血清がＳ．エピダーミス ELISA又はオプソニンアッセイによりスクリーンされる請求の範囲第７項記載の方法。９．前記血清がＳ．エピダーミスELISAによりスクリーンされる請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記血清がＳ．エピダーミスオプソニンアッセイによりスクリーンされる請求の範囲第８項記載の方法。 11．前記血漿がＳ．エピダーミスELISA又はオプソニンアッセイによりスクリーンされる請求の範囲第７項記載の方法。 12．前記血漿がＳ．エピダーミスELISAによりスクリーンされる請求の範囲第1 1項記載の方法。 13．前記血漿がＳ．エピダーミスオプソニンアッセイによりスクリーンされる請求の範囲第11項記載の方法。 14．前記免疫グロブリンプールがＳ．エピダーミスELISA又はオプソニン性アッセイによりスクリーンされる請求の範囲第７項記載の方法。 15．前記免疫グロブリンプールがＳ．エピダーミスELISAによりスクリーンされる請求の範囲第14項記載の方法。 16．前記免疫グロブリンプールがＳ．エピダーミスオプソニンアッセイによりスクリーンされる請求の範囲第14項記載の方法。 17．請求の範囲第１項記載の指図されたヒト免疫グロブリンの調製方法であって、（ａ）血漿ドナーを免疫化し、そして（ｂ）指図された免疫グロブリン調製のために前記ドナーから血漿を除去する段階を含んで成る方法。 18．最少の保護標準を提供するために未熟又は内部脂質誘発された致死モデルを用いることによって保護レベルの指図されたヒト免疫グロブリンを評価するための方法であって、（ａ）インビトロアッセイによりスクリーニングし、そして（ｂ）免疫グロブリン調製物がＳ．エピダーミスに対する保護抗体を供給することを確かめるために動物致死性試験を用いる段階を含んで成る方法。 19．請求の範囲第１項記載のＳ．エピダーミスの指図されたヒト免疫グロブリンの治療的有効量の宿主への静脈内投与によりその宿主を処理するための方法。 20．請求の範囲第１項記載のＳ．エピダーミスの指図されたヒト免疫グロブリンの治療的有効量の宿主への筋肉内投与によりその宿主を処理するための方法。 21．Ｓ．エピダーミスによる感染の前、前記宿主が処理される請求の範囲第19 項記載の方法。 22．Ｓ．エピダーミスによる感染の後、前記宿主が処理される請求の範囲第20 項記載の方法。