JPH08504268A - 光学的分析用センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ｉ）基質との触媒反応の結果としてそれらの環境に変化を発生させ得る酵素と、（ｉｉ）かかる酵素のための基質と、から選択される物質の分析に使用するセンサ装置が記載される。かかる装置は、光学的導波管を有し、該導波管はその長手方向一表面の不連続領域に、環境変化の結果により自身の光学的特性を変化させる種を、分析対象の物質と相補的な一対の酵素基質／酵素の要素と共に直接的或いは間接的に不動化する。かかる装置を使用した分析方法も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 光学的分析用センサ 本発明は、化学または生化学エンティティーの分析に使用する装置、特に酵素 或いは酵素基質の検出用バイオセンサに関する。 酵素センサ（酵素電極）は、多様な分析物の検出用に生産されてきた。その１ 例として、血液ガスの濃度測定用のセンサがある（Clarke&Lyons,Annals of the NewYork Academy of Science，Vol.102，pp29-45,1962）。このようなバイオセ ンサの多くは、ｐＨを変化させる触媒反応を有する酵素を使用しており、かかる ｐＨの変化は電流測定式または電位差測定式の電極の何れかを用いて記録される 。関連する分析物の濃度はｐＨの変化率または絶対変化を調べることにより監視 される。かかる装置の分析性能及び作業安定性を改善するために、酵素をｐＨ電 極の表面の半透過性の膜の裏に頻繁に不動化させる。このように研究される分析 物としてはペニシリン（Guilbault,G．G,Handbook of Immobilised Enzymes，Ma rcel Dekker,NewYork,1984）及びグルコース（Clarke&Lyons,1962）が含まれる 。マイクトエレクトロニックス分野における進歩により、これらのｐＨベースの 酵素センサ電極を小型化する試みがなされ、従来のマクロ−ｐＨ電極に替わる非 常に小型でｐＨに敏感なイオン選択式の磁場作用トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）が 提供された。ペニシリン及びグルコース用のセンサは、かかる技術を用いて作り 出され、文献（Biosensors: Fundamentals and Applications，A.P.F.Turner，I .Karube，G.S.Wilson編著作，Oxford Scientific Publications，1987）にも概 説されている。 しかし、かかる電位差計式機構には多くの欠点がある。例えば、それらは試料 内に存在する他のイオンによって電気的騒音及び干渉を起こし易い。従って、光 学的な技術に使用するためのかかる装置の均等物を作り出す試みがなされてきた 。 ペニシリン用のセンサについては報告されているが（Kulp T.J.，Analytical Chemistry，Vol.59，pp2849-2853，1987）、それによれば、光ファイバーを採用 し、その一端をポリマーでコーティングし、その中にペニシリナーゼ及びｐＨ依 存性の蛍光染料を組み込むか或いはそれに結合させている。前記酵素がその基質 と反応するため、前記染料の光学的性質の変化を測定し、この変化によって基質 の濃度が得られる。しかし、このような装置には多くの欠点がある。特に困難な 点は、十分に感度のある分析を達成するためには、繊維の一端への実質的な質量 の酵素及び染料の不動化を必要とする構造に関連するものである。使用に際して もまた、例えば試料の蛍光染料や混濁による試料からの光学的干渉により困難が 生じる。 本発明は、前記の電位差測定ｐＨセンサ及び光ファイバーセンサの欠点の多く を克服する、酵素ベースの光学バイオセンサを提供する。 本発明の１つの形態によれば、（ｉ）基質との触媒反応の結果としてそれらの 環境に変化を生ずることができる酵素及び（ｉｉ）かかる酵素のための基質から 選択される物質の分析に用いるためのセンサ装置であって、光学的導波管を含み 、該導波管がその１つの長軸方向表面の不連続領域（「測定領域」）上に直接ま たは間接的に不動化された、その光学的性質がその環境における上記の変化の結 果として変化する種を、分析対象の物質と相補的な酵素基質／酵素対の要素と共 に、含むセンサ装置が提供される。 前記触媒反応の発生のために共同因子を必要とする酵素の場合には、前記共同 因子が装置内に存在していても良く、前記共同因子が別に供給されても良い。 本発明の更に別の形態によれば、試料内の酵素または酵素基質の分析方法であ って、次の工程： （ａ）前記に定義したように、本発明による装置の存在下で試料を恒温保持す る工程と； （ｂ）該装置を照射する工程と； （ｃ）それによって前記装置の前記測定値領域中の種によって示される適切な 光学的性質（「測定信号」）を監視する工程と； （ｄ）前記測定領域における環境の変化によって前記光学的性質が変化する か否か、必要な場合には、この光学的性質の変化の程度及び／比率を測定する工 程と； （ｅ）適切なアルゴリズムを用いて、酵素と酵素基質との相互作用によって生 前記測定領域における環境の対応変化を測定し、それによって分析対象の分析物 の濃度の測定値を導出する工程とを含む前記方法。 発生する前記触媒反応に共同因子が必要な場合で、その共同因子がもはや装置 内に或いは装置上に存在しない場合には、それは上記工程（ａ）恒温保持前に、 恒温保持中に、或いはそれに引き続いて試料内に導入すべきである。 本発明による広く多様なセンサの例としては、軽量棒或いは「試験片（test-s trip）」バイオセンサ、例えばＥＰ１７１１４８に概説されている型の毛管フィ ル装置等の試料の封じ込めを採用する「試料の流通」形態またはデバイスを使用 する装置等がある。 前記装置における使用には、自体の触媒作用の結果として環境の変化を生じる 酵素が適合する。特に注目に値するのは、例えばペニシリナーゼ、グルコースオ キシダーゼまたはウレアーゼ等の、それら自体の触媒作用の結果としてｐＨの変 化を生じる酵素である。その他多くの変化が可能であり、その中でも、例えば、 その触媒作用の結果として酸素を消費するグルコースオキシダーゼを使用するか 、或いはその触媒作用によって過酸化水素を産生するパーオキシダーゼを使用す る、関わる前記溶液における酸素の濃度の変化（増加或いは減少）等がある。 自体の環境の変化の結果として光学的性質が変化する種は、例えば関わる変化 に敏感な発蛍光体或いは染料である。好ましいｐＨに敏感な種としては、フルオ レセイニソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイナミン及びフルオレセイ ンヨード酢酸等がある。自体の環境において酸素濃度に敏感である好ましい種は 、ＦＩＴＣである。多くの蛍光種がそれらの環境中でＨ2Ｏ2の濃度に敏感である 。 本発明による装置によって、消失性波抱合の現象をに関与する方法により、 発蛍光体または染料の光学的性質の変化をきたす分析における特別な用途が見い だされる。かかる方法は公知のものであり、米国特許No.４８１０６５８に記載 されている。かかる技術の使用は、導波管の表面に非常に近い所に位置する発蛍 光体から発生する信号の、分析対象のバルク中に含まれる発蛍光体からの信号と の区別を可能にし、それによって試料による光学的干渉から起こる問題が除去さ れる。 装置の放射線照射は、不動化された種の、例えば蛍光などの光学的性質の発現 を起こすはずである。装置の放射線照射を行う際の正しい方法は、しかし装置の 特性に依存する。毛管フィル型の装置に関しては、例えばその技術は、導波管の 長軸に対して９０゜か或いはそれに近い角度での導波管の測定領域の放射線照射 を、概ね含み、それによってその領域内の種を励起する。繊維型の導波管に関し ては、例えば放射線照射技術は、例えば、繊維に対して長軸方向の伝達及び引続 き起こる測定領域内での種の励起に概ね含むであろう。使用し得る種々の型の装 置へのそれらの適応性についてのかかる技術及び考察は、当業者には公知である 。測定する種の光学的性質は、例えば、波長、発光する蛍光の強度または分極で あろう。 本発明による好ましい装置及び方法は、それにおいて酵素の触媒作用の結果と して起こる環境の変化がｐＨの変化であるものである。続く説明は、それにおい てｐＨの変化が起こる分析の装置及び方法という点を述べているが、本発明はか かる変化を限定するものではないと考えられる。本発明による装置については、 不動化された種がｐＨに敏感な発蛍光体であり、分析対象の分析物が酵素−基質 である（それ故本発明による装置はその上に不動化された酵素を含む）。ここで 本発明の実施例に関して更に特別に説明する。 かかる実施例による本装置においては、前記発蛍光体及び酵素が直接または間 接に多くの方法で導波管の表面上に不動化されると思われる。直接不動化された 場合には、これらの成分が導波管上に別に不動化されるか、或いは前記発蛍光体 が酵素に抱合し、その結果生じた抱合体が導波管上に不動化されるのか、 の何れかである。発蛍光体は、例えば従来からの共役方法不動化する。酵素と酵 素／発蛍光体の抱合体は、従来の共有結合法或いは当業者には公知の適切な吸着 共役技術で不動化する。間接的な不動化は、導波管に結合する介在種の使用によ り達成される。その導波管には、種、酵素、発蛍光体、或いは酵素／発蛍光体抱 合体を連続して結合する。例として、前記酵素に対する抗体または導波管に結合 したアビジンがビオチニレート化した酵素を不動化する。 間接的不動化法の更に別の実例としては、酵素及び場合によっては発蛍光体ま たは酵素／発蛍光体抱合体を含む、分析対象の分析物を透過しうる膜の使用を含 み、そこに含まれない種は、上記のように導波管に不動化する。選択的に、前記 膜は、かかる種を何等含まないが、単に導波管に不動化されたそれらの種を覆う だけである。いずれの場合においても、前記膜の機能は、試料内の汚染物質によ る酵素の分解を防止し、また前記酵素の触媒作用によっておこるｐＨの変化を減 少する試料の緩衝能の作用を最小にすることである。 以前に述べたように、自体の基質と結合し、及び場合によってはその分解物を 成生物に触媒するために共同因子を必要とする酵素に関しては、初期にこの共同 因子が本装置の測定領域の付近に適量存在する可能性がある。選択的に、必要な 量の共同因子を本装置による前記試料の恒温保持の前に前記試料に添加するか、 或いは恒温保持が開始した時に前記試料に導入することができる。共同因子が最 初に存在する場合に、これは例えば、前述の膜中に含有させることにより達成さ れる。選択的にこれが、例えば、前述に存在すると述べた膜の有無にかかわらず 、測定領域内の適切な物質の可溶性の層内に含まれていると思われる。ＥＰ １ ７１１４８に概ね記載されている型の毛管フィル装置に関しては、前記共同因子 は可溶性の離脱しやすい形で好都合に、測定領域内（の試料の汚染を制限するプ レートの１つの上）に含まれるか、或いは選択的に試料の恒温保持時に前記共同 因子が測定領域近くに導入されるようにもう１つのプレート上の相応する領域に 含まれると思われる。 前記導波管は、様々な材料から作り出したもので良いが、それらの選択の唯 一の基準は、センサの照射に使用する光の波長及びその結果生じる導波管表面か らの伝達光の波長に対し透明でなければならない。適した材料としては、ガラス 、石英、及び（ポリカーボネートなどの）ポリマー材等がある。 発蛍光体の光学的性質の変化は、従来の方法で測定する。その例は、米国特許 No.４８１０６５８及び Badley その他、Philosophical Transactions of the RoyalSociety of London,Ser.B,Vol.36,pp143-160,1987 に記載されている。 前述したように、本発明による広く多様な装置が発案されている。 国際特許出願 No.PCT/GB91/02058 に述べられているように、測定領域のほか に更に内部較正のための別個の領域をセンサ装置内に含めることが可能である。 かかる原理は本発明によりセンサ装置に応用することができる。 従って、本発明による装置の１つの実施例によって、導波管が付加的に、測定 領域（「較正領域」）とは異なる、前記長軸方向表面の１つまたは任意に２つ以 上の不連続領域に、直接または間接的に不動化された、特定の分析の実施のため に適した他の試薬を有し、これらの他の試薬が、分析の作業中に試料内に導入さ れる任意の補助試薬と共に、且つ存在する場合の分析対象の分析物と共に、前記 較正領域において（ｉ）測定領域における触媒反応と同様な、好ましくは強化さ れたもしくは減衰された程度の触媒反応、または（ｉｉ）非触媒反応、または（ ｉｉｉ）前記領域に存在する種の光学的性質の検出不能な変化を生ずる触媒反応 の何れかを励起するように選択される装置。 前述で定義した分析方法の実施例により、前述で定義した１つまたはそれ以上 の較正領域を含む本発明による装置の存在下で試料を恒温保持し、それによって 前記装置の前記較正領域中の種によって示される適切な光学的性質（「較正信号 」）を監視し、測定信号と前記較正信号とから、適切なアルゴリズム用いて、分 析対象の分析物の濃度の測定値を導出する工程を更に含む。 従って、前記装置の実施例中のｉｉ）またはｉｉｉ）の例において、国際特許 出願 No.PCT/GB91/02058 の用語集を用いると前記較正領域は「ゼロ信号較正領 域」に相応するはずである。上記の例ｉ）によれば、較正領域においては反 応は類似して起こるが、測定領域におけるものと同程度に強められ、較正領域は 、国際特許出願 No.PCT/GB91-02058を用いれば、「陽性較正領域」に相応する。 上記の例ｉ）によれば、較正領域においては反応は類似して起こるが、測定領域 におけるものより低い程度に減少し、同様の用語集を用いると、較正領域はそれ 故「陰性較正領域」に対応する。 本発明の更に別な形態によると、前記に定義したような分析方法における使用 に適した機器が示され、それは；使用時に、照射が該装置に侵入して、装置内の 環境の変化の結果としてその光学的性質が変化する、不動化された種を励起する ように配置されることができる照射源と；放出される放射線を監視する手段とを 含む前記に定義した装置からなる。 本発明による装置の特定の実施例を次に添付図面に関して説明する。 図１ａは、センサがディップスティック（dipstick）型である装置の実施例の概 略図である。ガラスシート形状光学導波管１の１つの長軸方向表面２領域１０上 に、酵素（Ｅ）４とｐＨ感受性発蛍光体（Ｆ）３とが不動化される。 図１ｂは、使用中の図１ａ装置の説明図である。使用時に、装置を試料５中に 浸漬する、試料が関連する分析物を含む場合には、この試料５が不動化酵素４の 基質になり、酵素４はその基質と結合して、基質の生成物への分解を触媒する。 この触媒反応は、酵素の局部的環境に、即ち導波管の表面において、ｐＨ変化を 生じる。このｐＨ変化は不動化発蛍光体３の蛍光性の変化を生じる。放射線源１ ３からの、発蛍光体３を励起させるため適切な波長の光線（適切なフィルター１ ４を用いて選択する）が、導波管の表面６を照射すると、導波管の末端７から生 じる伝達光線（propagated light）が消失性に検出される。このようにして、不 動化発蛍光体３の放出蛍光の波長、強度または極性の変化率または絶対的変化を 測定し、不動化酵素４の活性を演鐸することができる。これから、試料５中の酵 素−基質、分析下の分析物の濃度を算出することができる。 このような装置を分析すべき分析物の既知濃度を含む溶液中に浸漬させるこ とによって、較正することができる。適切な恒温保持期間後に、導波管の蛍光特 性を測定し、測定信号対分析濃度の標準曲線を形成することができる。次に、こ の標準曲線を用いて、装置の作業下の測定信号を分析対象の分析物の濃度に関連 付けることができる。 図２ａは、流動試料の分析センサを用いることができる装置の別の実施例の概 略図である。図２ａに示すセンサは分析の適用に適した断面形状を有する中空構 造体の内面の一部を形成するが、内面の部分８は好ましくは実質的に円筒形であ る。導波管１の１つの長軸方向表面２の領域１０上には、酵素（Ｅ）４とｐＨ感 受性発蛍光体（Ｆ）３とが不動化される。 装置の実施例の作業モードは図１ｂに示す装置に関して述べた通りである。図 ２ｂは使用中の図２ａの装置を示す。図１ｂの装置に比較した図２の装置の利点 は、装置を配置した試料流通を周期的に中断して、装置を再校正することができ る。この実施例は例えばフローインジェクション分析及び高性能液体クロマトグ ラフィーのような、他の分析方法と組み合わせて有利に用いることができること である。 図３ａは、センサが欧州特許 No.１７１１４８により概ね記載されている種類 の蛍光毛管フィル装置である。装置の他の実施例を概略的に説明する。このよう な装置は、毛管空隙によって分離された２枚の平坦なプレートを含む。このセン サは、その長軸方向表面２の１つの部分１０上に、酵素４とｐＨ感受性発蛍光体 ３とが不動化された、ガラスシート形状の下部光学導波管１からなる。 図３ｂは、使用中の図３ａの装置を説明する。試料５を装置中に導入すると、 試料５は毛管作用によって装置中に侵入する。装置の作用機序は図１ｂに示す装 置に関して述べた通りである。 図４ａは、較正領域１１を付加的に含むこと以外は、図１ａの装置と同様な装 置の実施例を概略的に説明する、この較正領域の一部には酵素（Ｅ）４とｐＨ感 受性発蛍光体（Ｆ）３が不動化され、この較正領域は、溶解性の放出可能な形で 、定量の酵素基質（Ｓ）１５も含む。使用時に、サンプル分析物の存在 のために測定領域１０において生じる反応は図１ａの装置における反応に類似す る。較正領域１１において生じる反応は領域１０における反応と同じであるが、 付加的な酵素基質の存在のために、度合の強化される反応である。このように、 この領域１１は正の（positive）較正領域に相当する。 図４ｂは、代替え較正領域１１を示す、この領域は不動化された酵素（Ｅ）と ｐＨ感受正発蛍光体（Ｆ）のほかに、その上に、酵素Ｅ特異的な酵素阻害剤（Ｉ ）１６の定量も溶解性の放出可能な形で含む。従って、使用中に、試料分析物の 存在のために領域１１において生じる反応は、測定領域１０における反応に比べ て度合の減衰した反応である。従って。この領域は負（negative）の較正領域に 相当する。 図４ｃは、図１ａの装置が付加的に２つの較正領域１１と１２を含む装置の実 施様態を概略的に説明する。較正領域１１は上記較正領域に関して述べたような 試薬を含む。較正領域１２の一部の上には、不活性酵素（Ｅ’）１７（即ち、そ の基質にもはや結合しないという意味で不活化した酵素）とｐ１１感受正発蛍光 体（Ｆ）３とが不動化される。このため、使用中に、酵素１７がその基質への結 合が生じないので。領域１２では触媒反応が生じない。それ故、この領域は使用 中はゼロ信号較正領域に相当する。この代わりに酵素１７がその基質に結合する が、基質の生成物への分解を触媒しないという意味で不活化される場合には、こ の領域は使用中は負の較正領域に相当する。共同因子を必要とする酵素の場合に は、共同因子の不存在がこれらの可能性の何れかと同様な結果を生じる。 図４ｄは代替えの較正領域１２を示す、この代替え較正領域１２上にはｐＨ感 受性発蛍光体３のみが不動化される、即ち、酵素は存在しない。この領域は使用 中はゼロ信号較正領域に相当する。 図４ｅは、代替え較正領域１２を示す。代替え較正領域１２上には試料分析物 に特異的な酵素（Ｅ’’）１８とｐＨ感受正発蛍光体（Ｆ）３とが不動化される 。この領域は使用中はゼロ較正領域に相当する。 図４ｆは、代替え較正領域１２を示す、この代替え較正領域１２上には酵素（ Ｅ）４と非ｐＨ感受正発蛍光体（Ｆ’）１９とが不動化される。この領域も使用 中はゼロ信号較正領域に相当する。 センサがディップスティック型である、他の実施例の装置であって、上記較正 領域１１と１２の代替え組合せを用いたもの、または領域１１と１２にかんして 上述した種類の較正領域から選択された２個のより多い較正領域を用いるものが 考えられる。 同様に、図２ａと３ａの装置が同様な追加の較正領域を含むような、装置の実 施例も考えられる。図５ａと５ｂはこのような実施例の２種類を示す。 図６ではセンサが、測定領域１０の他に２個の較正領域１１と１２を含み、か く較正領域上に酵素（Ｅ）とｐＨ感受正発蛍光体（Ｆ）３とが不動化された蛍光 毛管装置ある、装置の実施例を説明する。この装置の上部プレート２１の領域２ ０には、酵素基質（Ｓ）１５の層が溶解性の放出可能なかたちで配置される。こ の装置の上部プレート２１の領域２２には、酵素阻害材（Ｉ）１６の層が溶解性 の放出可能な形で配置される。使用中に、試料が装置内のキャビティに侵入する と、試薬１５と１６が溶解し、それぞれ領域１１と１２の方向に拡散する。この ため、領域１１では領域１０に於ける反応に比べて強化された反応が生じ、領域 １２では領域１０に置ける半応に比べて減衰した反応が生じる。従って、使用中 の領域１１は正の較正領域であり、使用中の領域１２は負の較正領域である。 以下の非限定的な実施励によって、本発明を更に説明する。 実施例１（光学グルコースセンサ）１．１ 発蛍光体−及び酵素−塗布導波管の製造 約１ｍｍの厚さを有するPermablocガラス（Pilkington Glass Ltd.，英国、セ ントヘレン）を超純粋中で超音波攪はんしながら潜在（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０ ）によって洗浄した。このガラスの表面をｐＨ３から４の水中アミノプロピルエ トキシフランの２％溶液中で７５℃において２時間恒温保持することに よって、活性化した。水中ですすぎ洗いした後に、このガラスシートを１１５℃ において少なくとも４時間感想させた。つぎに、このガラスを０．０５Ｍリン酸 塩緩衝液（ｐＨ７）中のグルタルアルデヒドの２．５％溶液中で６０分間恒温保 持した後に、蒸留水で完全に洗浄した。このガラスをリン酸塩緩衝液（ｐＨ７） 中のグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４．）の１％溶液中で２−４時 間恒温保持した。次に、このガラスシートを緩衝剤溶液によって洗浄した。公知 の方法による６Ｍ尿素溶液でのソーキング（soaking）によって好ましくない吸 着タンパク質を除去した。このガラスシートを次にＦＩＴＣｎｏ１％溶液と共に 恒温保持した後に、洗浄工程を実施した。これによって、図３ａとｂに説明する ような蛍光毛管フィル装置試験装置のプレートＩが形成された。１．２ 蛍光毛管フィル装置試験装置の製造 上記工程１．１から得られた導波管上に直径１００μｍのガラス微小球を含む 紫外線硬化接着剤（UVS91,Norland Inc.,米国）の結合トラックをスクリーンプ リントすることによって、ＥＰ−Ａ−０１７１１４８に開示されているような試 験装置を製造した。その上にＷＯ９０／１４５９０に述べられているような不透 明な蓋（lid）がスクリーンプリントされているＰｅｒｍａｂｌｏｃガラスシー トを該導波管上に載せ、このラミネートに真空をくわえた。この真空の結果、ガ ラス上層が該接着剤上に押圧されて、該ガラス微小球がガラスシートの間に１０ ０μｍキャビティを画定する。次に、このラミネートを紫外線源に暴露させて、 接着剤を硬化させる。最後に、該ラミネートシートを、ＥＰ−Ａ−０１７１１４ ８に述べられているように、切断して、個々の試験装置を形成する。１．３ グルコース分析の測定に用いる装置 図７は、英国特許 No.８９１１４６２．３号に述べられているように、適切な 分析測定の実施に用いられた、簡単な蛍光測定装置を示す。キセノフラッシュラ ンプ５１（Heinmann）からの光線がレンズ５２によって、略平行にされ てから、ＦＩＴＣの励起に用いられる波長範囲を画定するフィルタースタック５ ３を通過する。このフィルタースタックは下記３種のフィルターを含む： BG57Schott ガラスフィルター（Ealing Electro Optics UK Ltd，英国、ワト フォード）、４５０−４８０ｎｍ ＦＩＴＣ帯域干渉フィルター（Optometrics Ltd.，英国）、４７４ｎｍショートパス干渉フィルター（ComarInstruments Ltd .,英国、ケンブリッジ）。 第２レンズ５４は励起光線を蛍光毛管フィル装置５６のアクティ表面上に開口 ５５を通して集束させた。蛍光毛管フィル装置の光学エッジ６３から放出される 光線は開口５７を通り、この開口５７は蛍光毛管フィル装置５６内に含まれる溶 液から直接放出される光線が検出光学要素（detection optics）に侵入するのを 阻止する。レンズ系５８は放出光線を回収し、開口５９は、放出が測定される角 度範囲を画定する。これは消失性に結合した蛍光放出に関連する角度と一致する ように選択した。Ｓｃｈｏｔｔ ＯＧ５１５ｎｍコロイドガラス・ロングパス・ フィルター６０（Ealing Electro Optics UK Ltd.，英国、ワトフォード）は任 意の散乱ポンプ光線）を瀘過し、第２レンズは放出光線を光電子倍増型検出器） に集束させる（Hamamatsu R931A,Hakuto UK Ltd）．１．４ グルコース分析方法 様々な濃度のグルコースを含む緩衝溶液（０．０５Ｍリン酸塩、ｐＨ７）を調 製した。グルコースを含まない緩衝剤溶液またはグルコースを含む緩衝剤溶液を 蛍光毛管フィル装置に加え、装置から生じる信号の変化と時間の経過につれて監 視した。不動化酵素がグルコースの分解を触媒すると、装置内のｐＨは変化し、 不動化ＦＩＴＣの活性を変化させた。図８は装置内のグルコースの濃度上昇によ る、ＦＩＴＣから生じる信号の変化を示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年８月２２日 【補正内容】 請求の範囲 １．（ｉ）基質との触媒反応の結果としてそれらの環境に変化を生ずることがで きる酵素と、（ｉｉ）かかる酵素のための基質と、から選択される物質の分析に 使用するセンサ装置であって、該装置は試料液を毛管作用により導入し得るのに 充分な小寸法の１つ或いは複数のキャビティを有し、該キャビティの表面の不連 続領域（「測定領域」）上に、前記分析対象の物質と相補的な酵素基質／酵素対 の要素と共に、前記環境の変化の結果、自信の光学的性質が変化する蛍光体種を 直接的或いは間接的に不動化し、前記表面は、使用時に光伝達性導波管として作 用すると共に、前記キャビティの壁を成す透明な固体プレートの表面であること を特徴とする、センサ装置。 ２．前記酵素が前記触媒反応を生じさせるために共同因子を必要とし、該共同因 子は前記装置内或いは前記装置上に付加的に存在してなる、請求の範囲第１項記 載のセンサ装置。 ３．前記酵素の基質との触媒反応の結果として生じる前記環境変化はｐＨの変化 である、請求の範囲第１或いは２項記載のセンサ装置。 ４．前記導波管は更に、前記表面上の、測定領域（「較正領域」）とは別の１つ 或いはオプションとして複数の不連続領域に、実行する分析に適した更に別の試 薬を直接的或いは間接的に不動化し、前記更に別の試薬とは、使用時に、該更に 別の試薬が、分析作業中に前記試料内に導入された補助試薬、及び存在する場合 には分析対象のアナライトと共に、ｉ）前記較正試薬内に、好ましくは前記測定 領域内のレベル向上、或いは減少した範囲で触媒反応アナログを生じさせるか、 或いはｉｉ）触媒反応を生じさせないか、またはｉｉｉ）前記領域内に存在する 如何なる種の光学的特性に検出可能な変化をもたらさない触媒反応を生じさせる 、ものが選択されてなる、請求の範囲第１乃至３記載のセンサ装置。 ５．試料内の酵素または酵素基質の分析方法であって、 （ａ）請求の範囲第１乃至３項の何れかに請求される装置の存在下で試料を 恒温保持する工程と； （ｂ）該装置を照射する工程と； （ｃ）光学的特性（「測定信号」）を監視して、これにより該光学的特性を蛍 光体種により前記装置の前記測定値領域に示す工程と； （ｄ）前記測定領域における環境の変化により前記光学的性質が変化するか否 か、また必要な場合には、この変化の程度及び／或いは変化率を判断する工程と ； （ｅ）適切なアルゴリズムを用い、前記測定領域内の環境に酵素と酵素基質と の相互作用によって生じた対応する変化を判断し、それにより分析対象のアナラ イトの濃度を測定する工程と；よりなる分析方法。 ６．前記工程（ａ）において前記試料は請求の範囲第４項記載の装置の存在下で 恒温保持され、前記分析方法は、適切な光学的特性（「較正信号」）を監視し、 これにより、前記装置の前記較正領域に、前記種により、また前記測定信号及び 前記較正信号から前記適切な光学的特性を適切なアルゴリズムを用いて示し、分 析対象のアナライトの濃度を測定する工程を更に有してなる、請求の範囲第５項 に記載の分析方法。 ７．請求の範囲第５或いは６項記載の分析方法に用いるため適した装置であって 、請求の範囲第１乃至４項の何れかに記載の装置と；使用時に放射線が前記装置 に侵入して、前記装置内の環境の変化の結果光学的特性が変化する不動化された 種が励磁するように配置可能な放射線源と；放出される放射線を監視する手段と 、を含む前記装置。 ８．請求の範囲第５或いは６項記載の装置と、適切な補助試薬とよりなり、請求 の範囲第１乃至４項の何れかに記載の分析方法を実行するためのキット。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）基質との触媒反応の結果としてそれらの環境に変化を生ずることがで きる酵素、及び（ｉｉ）かかる酵素のための基質、から選択される物質の分析に 用いるためのセンサ装置であって、光学的導波管を含み、該導波管は、光学的性 質が上記の変化の環境結果として変化する種を、分析対象の物質と相補的な酵素 基質／酵素の要素と共に、その１つの長手方向表面の不連続領域（「測定領域」 ）上に直接または間接的に不動化された、センサ装置。 ２．前記酵素が前記触媒反応の発生のために共同因子を必要とし、前記共同因子 が装置内または上に付加的に存在する、請求の範囲第１項記載のセンサ装置。 ３．前記装置は毛管フィル装置である請求の範囲第１或いは２項記載の装置。 ４．酵素と基質との触媒反応の結果としての前記環境の変化はｐＨの変化である 、範囲第１乃至３項の何れか一つに記載の装置。 ５．変化の結果としてその光学的性質が変化する種は、発蛍光体または染料であ る、請求の範囲第１乃至４項の何れか一つに記載の装置。 ６．導波管が付加的に、測定領域（「較正領域」）とは異なる、前記長手方向表 面の１つまたは任意の２つ以上の不連続領域に、直接または間接的に不動化され た、特定の分析の実施のために適した他の試薬を有し、これらの他の試薬が、分 析の作業中に試料内に導入される任意の補助試薬と共に、且つ存在する場合の分 析対象の分析物と共に、前記較正領域において（ｉ）測定領域における触媒反応 と同様な、好ましくは強化されたもしくは減衰された程度の触媒反応、または（ ｉｉ）非触媒反応、または（ｉｉｉ）前記領域に存在する種の光学的性質の検出 不能な変化を生ずる触媒反応の何れかを励起する、請求の範囲第１乃至５項の何 れか一つに記載の装置。 ７．試料中の酵素または酵素基質の分析方法であって、次の工程： （ａ）請求項１−５の何れか一つに記載の装置の存在下で試料を恒温保持する 工程と； （ｂ）該装置を照射する工程と； （ｃ）それによって前記装置の前記測定領域中の種によって示される適切な光 学的性質（「測定信号」）を監視する工程と； （ｄ）前記測定領域における環境の変化によって前記光学的性質が変化するか 否か、望む場合には、この光学的性質の変化の程度及び／或いは速度を測定する 工程と； （ｅ）適切なアルゴリズムを用いて、酵素と酵素基質との相互作用によって生 ずる前記測定領域における環境の対応変化を測定し、それによって分析対象の分 析物の濃度の測定値を導出する工程とを含む分析方法。 ８．工程（ａ）において請求項６に記載の装置の存在下において試料を恒温保持 する請求項７記載の方法において、前記装置の前記較正領域中の種によって示さ れる適切な光学的性質（「較正信号」）を監視し、測定信号と前記較正信号とか ら適切なアルゴリズムを用いて分析対象の分析物の濃度の測定値を導出する工程 を更に含む分析方法。 ９．請求項７または８に記載の分析方法に用いるために適した装置であって、請 求項１−６の何れか一つに記載の装置と；使用時に、放射線が該装置に進入して 、装置内の環境の変化の結果としてその光学的性質が変化する、不動化された種 を励起するように配置可能な照射源と；放出される放射線を監視する手段とを含 む分析装置。 １０請求項７または８に記載の分析方法を実施するためのキットであって、請求 項１−６の何れか一つに記載の装置を、適切な補助試薬と共に含む前記キット。