JPH08505125A

JPH08505125A - 抗ｅ型肝炎ウイルス活性を検出するための方法および組成物

Info

Publication number: JPH08505125A
Application number: JP6510397A
Authority: JP
Inventors: エイ．フィールズ，ハワード; オー．ファボロフ，マイケル; イー．クジャコフ，ユーリ
Priority date: 1992-10-21
Filing date: 1993-10-21
Publication date: 1996-06-04
Also published as: US5736315A; AU684478B2; EP0673386A1; US6022685A; WO1994009032A1; AU5450094A; CA2147622A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｅ型肝炎ウイルスの抗原性ペプチドおよびポリペプチドを提供する。また、本発明のコンジュゲートされたペプチドおよびコンジュゲートしていないペプチドの混合物が提供される。本発明のペプチドおよびペプチド混合物を用いて被験体中のＥ型肝炎ウイルス感染を検出する方法がまた意図される。

Description

【発明の詳細な説明】抗Ｅ型肝炎ウイルス活性を検出するための方法および組成物発明の背景発明の分野本発明は、被験体において抗Ｅ型肝炎ウイルス活性を検出するための方法および組成物に関する。本発明の組成物は、Ｅ型肝炎ウイルスの抗原性ペブチドおよびＥ型肝炎ウイルスの抗原性ペブチドの混合物を含む。本発明の方法は、本発明のペプチドおよび本発明のペプチド混合物を用いるＥ型肝炎ウイルス感染の血清学的診断を含む。背景技術Ｅ型肝炎ウイルス(HEV)は、最近発見された腸内伝達される非Ａ、非Ｂ（ET-NA NB）肝炎感染源である。この疾患は、多くの開発途上国で重大な問題として残っている。他のウイルス性肝炎感染源と異なり、HEV感染は、しばしば感染妊婦において高い死亡率を伴う。最初に報告されたET-NANB肝炎の発生は、1955年にインドのニューデリーで起こった。しかし、原因としてＡ型肝炎ウイルスを排除するために、IgM抗Ａ型肝炎ウイルスに対する血清学的試験が利用可能となった後でのみ、この非常に大きな発生はET-NANB肝炎として認識された。その時以来、ET-NANB感染の流行病が多くの国々で記録されている。最近まで、ET-NANB肝炎発生の診断は、Ａ型肝炎ウイルス（HAV）およびＢ型肝炎ウイルス（HBV）の血清学的マーカーの非存在にのみ基づき得た。続いて、ET- NANB肝炎検出の特異的試験は、免疫電子顕微鏡法（IEM）を基にし、そこでは、小容量の急性感染個体からの便懸濁液を、急性期または回復期血清とインキュベートしそして電子顕微鏡法で検査した（Bradleyら、PNAS USA 1987;84:6277-628 1、1987）。このように、IEMは、抗体の供給源として、急性期および回復期血清を用いて、27-32nmのウイルス様粒子を同定した。しかし、大部分の臨床検体は、IEMを用いて可視化するに十分なウイルス様粒子を含まないので、この方法は、臨床分析または疫学的分析には有用ではない。より最近、Reyesら（Science 247:1335-1339、1990）は、HEV由来の部分cDNA クローンの単離および配列決定に成功した。続いて、このHEVゲノムはカリチウイルスと類似の構築を有するRNAポジティブ鎖ウイルスとして特徴付けられた。３つのオープンリーディングフレーム（ORF）が同定された（Tamら、Virology、 185:120-131、 1991）。２つのタイプの共通HEVエピトープが、0RF２および0RF ３によりコードされるタンパク質で同定された（Reyesら、Gastroenterolgia Ja ponica 26 （追補3）：142-147、1991b；Ichikawaら、Immunol．35:535-543、199 1）。両者は、それらそれぞれのタンパク質のＣ末端に位置している。これらのエピトープは、β-ガラクトシダーゼまたはグルタチオン-S-トランスフェラーゼとのハイブリッドタンパク質として発現され、実験的に感染したカニクイザル（cynomologus macaques）（Reyesら、「Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型ウイルス性肝炎」T．Shikata、R．H．Purcell、T．Uchida編El sevier Science Publishers、NY、237-245頁、1991a）またはヒト（Goldsmithら、Lancet 339:328-331、1992）から得られた急性期および回復期血清由来の抗体によりまたは酵素免疫アッセイ？により認識された。これらのハイブリッドタンパク質は、タンパク質のキメラ部分が折り畳みにネガティブに影響し得る欠点を有する。さらに、個体はこれらの配列に対して発現された抗体を有し得る。 ORF２は、HEV構造タンパク質の発現に関与することが示唆された（Tamら、199 1）。さらに、このタンパク質のＣ末端側の半分を含む組換えポリペプチドは、H EVに感染した患者において抗HEV活性検出のための重要な診断試薬であることが示された。 Reyesら（1991a）は、HEVビルマ株ゲノム由来のDNAの発現により得られた、OR F３によりコードされるタンパク質のＣ末端領域の短いフラグメントは、HEVメキシコ株で感染したカニクイザルからの血清と反応しないことを示した。反対に、メキシコ株由来の組換え発現タンパク質は、HEVビルマ株で感染したカニクイザルからの血清と反応しなかった（Yarboughら、J．Virol．65:5790-5797、1991）。２つの株のORF３のＣ末端領域での配列比較は、78％の相同性を示した（Yarbo ughら、1991）。さらに、アジアおよび北アメリカからの多岐に渡る地理からの単離株により共有されるタイプ共通ウイルスエピトープがあるようである（Yarboughら、1991；Go ldsmithら、1992）。このように、感度に乏しいことおよび以前に利用できた試験を実施することが困難なため、HEV感染のための迅速、単純および高感度の診断試験の必要性が存在する。本発明は、Ｅ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出するための合成ペプチド、および診断試験におけるそれらの使用を提供することによりこれらの必要性を満足する。本発明は、HEVに対する抗体（抗HEV）の検出のための免疫診断アッセイにおける合成ペプチドの利用を提供する。発明の要旨本発明は、HEVの抗原性ペプチドを提供する。例えば、本発明のペプチドは、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12または13で定義されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸から構成され得る。本発明のペプチドは、コンジュゲートされ得ないか、またはそれらは固相上へのペプチドの配置を促進するキャリア分子にコンジュゲートし得る。また、少なくとも４個の異なるペプチドを含有する組成物が提供され、ここで、これらのペプチドは、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号８および配列番号９で定義される。本発明は、さらに、被験体からの抗体含有サンプルを、検出可能な量のペプチドと接触すること、およびこのペプチドとそれと特異的に反応する抗体との反応を検出すること（この反応はＥ型肝炎感染の存在を示す）により被験体中のＥ型肝炎ウイルス感染を検出するための種々のペプチドの組成物を用いる方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、HEV ORF２(A)およびHEV ORF３(B)によりコードされるタンパク質のハイドロパシープロット、およびペプチドの合成に選択された配列の位置を示し；図２は、抗HEV活性の度数分布を示し；そして図３は、最初陽性と試験されそして0.lから2.5より大きい吸光度値を生じた血清を用いる中和試験の結果を示す。発明の詳細な説明抗原本発明は、HEVの抗原性ポリペプチドフラグメントまたはペプチドを提供する。このペプチドは、一般に精製された形態で存在する。本明細書で使用される用語「精製された」は、天然に存在する汚染物質を本質的に含まないペプチドを意味する。本発明の精製された抗原性HEVペプチドまたはポリペプチドはまた、本明細書では「抗原」または「HEV抗原」と呼ばれそしてペプチド番号または配列番号（表１および２）のいずれかと交替して呼ばれる。本発明のペプチドは、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12または13により定義されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸から本質的に構成され得る。従って、本発明のペプチドは、配列表で見い出される配列と同一の一般配列を有する。本発明のペプチドは、コンジュゲートされ得ないか、またはそれらは固相上へのペプチドの配置を促進するキャリア分子にコンジュゲートされ得る。キャリアタンパク質は、それに合成ペプチドがコンジュゲートし得、そしてヒト血清中で抗体と反応し得ないタンパク質である。このようなキャリアの例はウシ血清アルブミン（BSA）である。一旦抗原のアミノ酸配列が提供されれば、本明細書で教示された方法および標準のペプチド合成技法を用いて、抗原の免疫反応性領域と相同であるように選ばれたペプチドフラグメントを合成すること、そしてこれらのフラグメントを、由来した配列中の特定のアミノ酸残基の包含、欠失または改変により、改変することが可能である。従って、この抗原に由来する非常に多数のペプチドの合成または精製が可能である。あるいは、抗原性ペプチドは、全抗原から化学的または機械的破壊により単離され得る。このようにして得られた精製ペプチドは、本明細書で教示された方法によりそれらの抗原原性および特異性を測定するために試験され得る。免疫反応性のペプチドは、抗原アミノ酸配列に由来する少なくとも約５個の保存アミノ酸のアミノ酸配列として定義される。本発明のペプチド/ポリペプチドフラグメントはまた、この抗原性ペプチド/ポリペプチドを産生し得る発現系でこのポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることにより得られる組換えタンパク質であり得る。本発明のペプチド/ポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書で教示されるように、溶解度のようないくつかの付加的な性質を提供するように設計された配列に付着したHEV抗原の免疫反応性部分を含み得る。HEV抗原のアミノ酸配列は、１つまたはそれより多いアミノ酸が別のアミノ酸で置換された配列を含み得る。例えば、より剛直な２次構造を提供することによりエピトープの反応性を増加するためにジスルフィド結合し得るアミノ酸を除去/添加するようないくつかの別の性質を提供し、その生体寿命を増加するまたはその細胞毒性を改変するまたは感染を予防する。いずれの場合でも、ペプチドは、免疫反応性および免疫原性を有さなければならない。ペプチド混合物本発明はまた、本明細書で例示されるような（例えば、実施例２に記載される混合物５、７および９）ペプチドの混合物（組成物）を提供する。個々のペプチドに加えて、本発明の混合物はまた、本明細書では「抗原」または「HEV抗原」と呼ばれ得る。個々のペプチドについては、本発明の混合物は、コンジュゲートされたペプチド、コンジュゲートしていないペプチドまたは両方を含み得る。さらに、本発明のコンジュゲートされたペプチドは、１つのキャリアにコンジュゲートされた個々のペプチドの総量（例えば混合物７）または単一キャリアにコンジュゲートされた異なるペプチドの総量（例えば混合物９）であり得る。混合物および個々のペプチドは、基質（固相）に付着または結合し得る。より詳細には、本発明は少なくとも４個の異なるペプチドを含有する組成物を提供し、ここで、このペプチドは、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号８、および配列番号９により定義されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸から本質的に構成される配列を有する。この混合物のペプチドは、個々にまたは混合物としてキャリアにコンジュゲートされ得、そして次いで基質に結合され得る。この組成物は、さらに配列表の配列番号７で定義されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸から本質的に構成されるペプチドを含むとき、混合物７が提供される。また、少なくとも８個のペプチドを含む組成物が提供され、ここで、このペプチドは、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号10および配列番号11で定義されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸から本質的に構成される配列を有する。この混合物のペプチドは、個々にまたは混合物としてキャリアにコンジュゲートされ、そして次いで基質に結合され得る。本発明の他のペプチド混合物は、例えば以下を含み得る：ペプチド２ならびに１種またはそれ以上のペプチド３，５，６， 1112，13，22，23，28，29，33および40；ペプチド３ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，５，６，11，12，13，22，23，28，29，33および40；ペプチド５ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，６，11，1213，22，23，28， 29，33および40；ペプチド６ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，11，12，13，22，23，28，29，33および40；ペプチド11ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，６，12，13，22，23，28，29，33および40；ペプチド12ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，６，11，13，22，23 ，28，29，33および40；ペプチド13ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，６，11，12，22，23，28，29，33および40；ペプチド22ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，６，11，12，13，23，28，29，33および40 ；ペプチド23ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，６，11，12，ペプチド２，３，５，６，11，12，13，22，23，29，33および40；13，22，23， 28，33および40；ペプチド33ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，６，11，12，13，22，23，28，29および40；およびペプチド40ならびに１種またはそれ以上のペプチド２，３，５，６，11，12，13，22，23，28，29および33 ．これらのペプチドを、それぞれ表１および２に示す。抗原性／免疫反応性の測定本発明のペプチドと反応する抗体との免疫反応性を有する他のペプチドを選択する方法もまた提供される。例えば、HEVと反応する抗体との免疫反応性を有するペプチドの免疫反応性について最小配列を決定する方法は、以下の工程を包含する：(a)本発明のペプチドを改変する工程；(b)該改変されたペプチドと被験体由来の確認されたHEV陽性血清サンプルとを接触させる工程；および(c)該改変ペプチドと抗HEV抗体との反応を検出する工程、ここで該反応は該改変ペプチドがH EVとの免疫反応性を有することを示す。本発明の他のペプチドに適用し得るこの方法の例を、実施例１に示す。本発明のいかなるペプチドも同様に改変され得る。免疫原性の測定このようにして得られた精製ペプチド／ポリペプチドフラグメントは、それらの免疫原性および特異性を測定するために試験され得る。簡単にいうと、種々の濃度の推定の免疫遺伝学的に特異的なペプチドが調製され、動物に投与され、そして各濃度に対する動物の免疫学的応答（すなわち、抗体の産生）が測定される。投与される抗原の量は、被験体（例えば、ヒトまたは他の感受性のある動物）、被験体の健康状態、被験体の大きさなどに依存する。その後、抗原を接種した感染-感受性動物は、特定の免疫原性ペプチドの可能性のあるワクチン効果を試験するために、ウイルスに曝され得る。推定免疫原性ペプチドの特異性は、接種された動物由来の血清または他の流体を、他の密接に関連したウイルスとの交差反応性について試験することにより確認され得る。あるいは、免疫原性は、感染性ウイルスの中和を試みるために、免疫された動物由来の血清を用いるインビトロ方法で試験され得る。次いで、これは、ペプチドが中和抗体を誘起したか否かを測定するために、細胞培養物中に添加され得る。組換えモザイクタンパク質本発明は、HEVゲノム（Yarboroughら、1991）中の抗原性ペプチドのアミノ酸配列およびその核酸コーディング配列を提供するので、組換えモザイクタンパク質は、本発明の多数のペプチドを含むように生成され得る。タンパク質はとりわけペプチド５、６、22、23、33、および40のエピトープを含み得、そして実質的にタンパク質の抗原性に影響を与えない他のアミノ酸も含み得る。このモザイクタンパク質は、エピトープの提示を妨害し得る外来アミノ酸がないので、非常に感受性および特異性である。本発明のモザイクタンパク質は、本明細書に記載のように、診断試験およびワクチンに使用され得ることが考慮されている。このモザイクタンパク質を発現する現在の好ましい方法は、ベクター-宿主発現システムによるものである。ベクターおよび宿主本発明の核酸を含むベクターもまた提供される。本発明のベクターは、抗原を発現し得る宿主中にあり得る。このようなベクターおよび宿主を作成することおよび使用することは、本発明の教示を用いると、当業者の技術レベルの範囲内である。抗原の発現に有用な、当業者に公知の多くのE．coli発現ベクターがある。使用に適切な他の細菌宿主には、Bacillusｓubtilusなどのバチラス、およびSalmo nella、Serratia、および種々のPseudomonas種などの他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合可能な発現制御配列（例えば、複製起点）を含む、発現ベクターもまた作成し得る。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Trp）プロモーター系、β-ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系などの、多くの種々の周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、必要に応じてオペレーター配列とともに、発現を制御し、そして、例えば、転写および翻訳を開始および完了するためのリボソーム結合部位を有する。必要であれば、アミノ末端のメチオニンが、Metコドンを抗原の5'およびフレーム内に挿入することにより提供され得る。また、抗原のカルボキシ末端の伸長は、標準オリゴヌクレオチド変異誘発手順を用いて取り除かれ得る。さらに、酵母発現が用いられ得る。酵母発現系にはいくつかの利点がある。第１に、酵母分泌系で産生されたタンパク質が正確なジスルフィド結合を示すことの証拠が存在する。第２に、翻訳後グリコシル化が、酵母分泌系により効果的に行われる。Saccharomyces cerevisiaeのプレプロα因子リーダー領域（MFα-1遺伝子によりコードされている）は、酵母からのタンパク質分泌を導くのに通常的に用いられる。プレプロα因子のリーダー領域は、シグナルペプチドおよびプロセグメントを含み、プロセグメントはKE X2遺伝子によりコードされる酵母プロテアーゼに対する認識配列を含む：この酵素は、Lys-Argジペプチド開裂シグナル配列のカルボキシル側の前駆体タンパク質を開裂する。抗原コーディング配列は、プレプロα因子リーダー領域にインフレームで融合され得る。次いで、この構築物は、アルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーターまたは解糖プロモーターなどの強力な転写プロモーターの制御下に置かれる。抗原コーディング配列には、翻訳終結コドンが続き、これに転写終結シグナルが続く。あるいは、抗原コーディング配列は、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易にするために用いられる第２のタンパク質コーディング配列（例えば、Sj26またはβ-ガラクトシダーゼなど）に融合され得る。融合タンパク質の成分を分離するためのプロテアーゼ開裂部位の挿入は、酵母での発現に用いられる構築物に適用し得る。哺乳動物細胞は、折り畳み（folding）およびシステイン結合などの重要な翻訳後改変、複雑な炭水化物構造の付加、および活性タンパク質の分泌に都合のよい環境でのタンパク質の発現を可能にする。哺乳動物細胞での抗原発現に有用なベクターは、強力なウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間の抗原コーディング配列の挿入により特徴づけられる。ベクターは、選択性マーカーとして用いるためのゲンタマイシンまたはメトトレキセートのいずれかへの耐性を与える遺伝子を含み得る。抗原および免疫反応性ペプチドのコーディング配列は、メトトレキセート耐性をコードするベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞株中に導入され得る。形質転換された細胞のベクターDNAの存在は、サザン分析により確認され得、そして抗原コーディング配列に対応するRNAの生成はノーザン分析により確認され得る。完全なヒトタンパク質を分泌し得る多くの他の適切な宿主細胞株が当該技術分野で開発されており、これらには、CHO細胞株、HeLa細胞、ミエローマ細胞株、Jurkat細胞などが含まれる。これらの細胞の発現ベクターには、複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要な情報のプロセシング部位（例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列）などの発現制御配列が含まれる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。目的のDNAセグメントを含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存して変わる周知の方法によって、宿主細胞中に転移され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核生物の細胞に通常利用されるが、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に用いられ得る。ヒトγ-インターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固第VII I因子、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼNexinl、および好酸球巨大塩基性タンパク質の発現のために開発されたベクターと同様に、哺乳動物細胞での抗原発現のための他のベクターが用いられ得る。さらに、ベクターは、哺乳動物細胞（COS7など）中での挿入されたDNAの発現に有用な、CMVプロモーター配列およびポリアデニル化シグナルを含み得る。 DNA配列は、配列が発現制御配列に作動可能に連結された、すなわちその機能を確実にする配置にした後、宿主中で発現させ得る。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとしてまたは宿主の染色体DNAの必須部分としてのいずれかで宿主生物体中で複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性またはヒグロマイシン耐性）を含み得る（例えば、米国特許第4,704,362号を参照のこと）。変異ペプチド／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたペプチド／ポリペプチド生成物が産生されるようなコーディング配列の転写（発現配列）および翻訳を容易にする配列を含み得る。このようなポリヌクレオチドの構築は当該技術分野では周知である。例えば、このようなポリヌクレオチドには、プロモーター、転写終結部位（真核生物の発現宿主におけるポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、および、必要に応じて、真核生物の発現宿主に使用するエンハンサー、および、必要に応じてベクターの複製に必要な配列が含まれ得る。精製抗体抗原と特異的に反応する精製モノクローナル抗体はまた、本発明の範囲内にある。抗体は、抗原のユニークエピトープと特異的に反応し得、あるいは、これらはまた、他の生物体のエピトープと反応し得る。用語「反応性の」は、抗原と非無作為的に結合または会合し得ることを意味する。本明細書で用いられる「特異的に反応する」とは、特定された１つの抗原（この場合はHEV抗原）以外のあらゆる抗原と実質的に交差反応しない抗体または他のリガンドについて記載している。抗体は、HarlowおよびLane（Antibodies；A Laboratory Manual，Co1d Spr1 ng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1988）に記載されているように作成され得る。簡単にいうと、精製抗原は、免疫応答を誘起するのに十分な量および間隔で動物に注入され得る。抗体は、直接的に精製され得るか、あるいは、脾臓細胞が動物から得られ得る。次いで、細胞は、不朽化細胞株と融合され、そして抗体分泌についてスクリーニングされる。抗体は、抗原を分泌する細胞についてDNAクローンライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。次いで、それらのポジティブクローンは、実施例または他の方法（例えば、Kellyら、Bio/Technology 10：163-167，1992およびBebbingtonら、B io/Technology 10:169-175，1992を参照のこと）に記載されているように配列決定され得る。本明細書中で提供されるHEV抗原性ペプチドに反応する、精製非ヒト、好ましくは哺乳動物、のポリクローナル抗体もまた考慮されている。ポリクローナル抗体もまた、標準的な免疫および精製プロトコール（HarlowおよびLane 、1988）により得られ得る。抗体は、基質に結合され得、または検出可能な部分（moiety）で標識され得、あるいは結合と標識の両方され得る。本発明の組成物で考慮されている検出可能な部分は、以下の診断方法の記載中に挙げられ、蛍光マーカー、酵素マーカー、および放射性マーカーを含む。血清学的検出（診断）方法抗原による抗体の検出本発明は、被験体のHEV感染を検出する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：適切な反応条件下で、検出可能な量の本発明のHEV抗原性ペプチドまたはポリペプチドと、被験体由来の抗体含有サンプルとを接触させる工程；および該ペプチドと、これに特異的に反応する抗体との反応を検出する工程である。ここで、この反応は、HEVの存在または以前にHEVに感染したことを示す。検出可能な量の本発明のペプチドは、その配列および抗原性が提供されると、実験的に測定され得る。混合物中の個体のペプチドの濃度もまた実験的に測定され得る。より高いコンジュゲーション有効性を有するペプチドは、より低い有効性でコンジュゲートされたペプチドよりもさらに低い濃度で混合物中に添加される。混合物中に合わされたペプチドの検出可能な濃度の例は、実施例２に記載の混合物５、７、９で提供される。例えば、混合物７および９は組成物であり、その中での、コンジュゲーション工程の前での、配列番号１で定義されたペプチドの好ましい濃度は約８μg/mlであり、配列番号２で定義されたペプチドの濃度は約14μg/mlであり、配列番号７で定義されたペプチドの濃度は約４μg/mlであり、配列番号８で定義されたペプチドの濃度は約４μg/mlであり、そして配列番号９で定義されたペプチドの濃度は約20μg/mlである。抗原性的に効果的および検出可能でもある、上記の値を含む濃度比の範囲が決定され得ることもまた、理解される。例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号８、および配列番号９に定義されたペプチドの濃度比は、約８： 14：４：４：20であり得る。このような効果的な比の決定はまた、実施例２に教示されたようにキャリアに対するペプチドの比を考慮に入れるべきである。抗体／リガンドを用いた抗原の検出抗原を有するHEVを検出する方法の１例は、被験体からの流体または組織サンプルを、抗原と特異的に反応する精製した抗体量と接触させることにより行われ、そしてリガンドと抗原との反応を検出する。抗原は、無傷のHEVビリオン上、抗原を発現するHEV感染細胞上にあり得るか、または抗原のフラグメントであり得ると考えられる。本明細書中で意図されるように、抗体は、抗原を結合する任意のリガンド、例えば、無傷の抗体、抗体のフラグメント、または抗原との反応性を有する他の試薬を含む。この方法の流体サンプルは、抗原または抗原を含む細胞（例えば、髄液、血液、胆汁、血漿、血清、唾液および尿）を含む任意の体液を包含し得る。体液の他の可能な例には、痰、粘液などが挙げられる。 ELISA 免疫蛍光アッセイ（IFA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および免疫ブロットのような酵素免疫アッセイは、容易に適合され、HEV抗体の検出をなし得る。抗体の検出において効果的なELISA法は、例えば、以下のようであり得る：( 1)抗原を基質に結合する；(2)結合した抗原を抗体を含有する流体または組織サンプルと接触させる：(3)上記のものを、結合した抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素）と反応する検出可能な部分に結合した二次抗体と接触させる；(4)上記のものを、酵素の基質と接触させる：(5)上記のものを、呈色試薬と接触させる；(6) 色の変化を観察する。競合阻害アッセイ HEVまたは先のHEV感染の検出に有用であり得る他の免疫学的技術には、HEV抗原と特異的に反応する抗体の検出のためにモノクローナル抗体（MAb）が用いられる。簡単に言えば、被験体由来の血清が、基質（例えば、ELISA 96ウエルプレート）に結合した抗原と反応する。過剰の血清は、完全に洗い流される。次いで、標識化（酵素結合、蛍光、放射性など）モノクローナル抗体が、先に反応した抗原-血清抗体複合体と反応する。モノクローナル抗体結合の阻害量が、コントロール（被験体の血清抗体がない）に対して測定される。モノクローナル抗体阻害の程度は、モノクローナル抗体結合特異性に基づくので、特定の変種または株に対して非常に特異的な試験である。MAbsはまた、IFAにより細胞中での直接検出のために用いられ得る。微細凝集アッセイ微細凝集試験がまた、被験体中のHEVの存在を検出するために用いられ得る。簡単に言えば、ラテックスビーズ、赤血球または他の凝集可能な粒子が、抗原で覆われ、そして被験体由来のサンプルと混合され、その結果、抗原と特異的に反応する、組織または体液中の抗体は、抗原と架橋して凝集を生じる。凝集した抗原-抗体複合体は、裸眼または分光光度計で観察可能な沈殿物を形成する。上記の試験の改変では、抗原と特異的に反応する抗体は、それによって検出される組織または体液中のビーズおよび抗原に結合され得る。サンドイッチアッセイ／フローサイトメトリー／免疫沈降さらに、代表的なサンドイッチアッセイとして、抗体が基質に結合され、そして抗原と反応し得る。その後、第２の標識化抗体が、第１の抗体により認識されないエピトープに結合し、そして第２の抗体が検出される。本発明は、HEVまたは先のHEV感染の検出のためのHEV抗原を提供するので、他の血清学的方法（例えは、フローサイトメトリーおよび免疫沈降）もまた、検出方法として用いられ得る。本明細書中に教示された診断方法において、抗原は、基質に結合され得、そして血液、血清、尿または唾液のような流体サンプルにより接触される。このサンプルは、被験体から直接、または部分的に精製された形態で取り出され得る。この方法で、抗原に特異的な抗体（一次抗体）が、結合した抗原と特異的に反応する。その後、検出可能な部分に結合した、または検出可能な部分で標識化した二次抗体が、添加され得、一次抗体の検出を増強する。一般に、二次抗体、あるいは、抗原の異なるエピトープと特異的に反応するか、リガンドまたは反応した抗体と非特異的に反応するかのいずれかの他のリガンドが、その能力について選択され、一次抗体上の多数の部位と反応する。従って、例えば、二次抗体のいくつかの分子が、各一次抗体と反応し得、一次抗体をより検出可能にする。検出可能な部分検出可能な部分は、沈殿物または色の変化の視覚的検出、顕微鏡操作による視覚的検出、あるいは分光光度法、放射線測定などによる自動検出を可能にする。検出可能な部分の例には、（蛍光顕微鏡操作のための）フルオレセインおよびローダミン、（光学顕微鏡操作または電子顕微鏡操作のいずれか、および生化学的検出のための）西洋ワサビペルオキシダーゼ、（光学顕微鏡操作または電子顕微鏡操作のための）ビオチン-ストレプトアビジン、および（色変化による生化学的検出のための）アルカリホスファターゼが挙げられる。検出する疾患本明細書中で提供される精製HEV抗原が疾患と関連するので、本発明はまた、被験体内のHEVが関連した疾患症候群の検出方法を提供する。この方法は、HEV抗原およびそれと特異的に反応する抗体の検出のために上記に掲げた方法によりなされ得る。HEV抗原または抗HEV抗体の存在は、被験体内の疾患症候群の存在を示す。本発明はまた、被験体由来の抗体含有サンプルを、検出可能な量のペプチドまたは混合物と接触させることにより、被験体内の急性期のＥ型肝炎感染を診断する方法を提供する。これらのペプチドまたは混合物は、比較的急速に衰退する免疫応答を有し、そして特異的に反応するペプチドおよび抗体の反応を検出する。この反応は急性のＥ型肝炎感染を示す。ワクチン本発明の抗原は、免疫原性量の抗原および薬学的に受容可能なキャリアを含むワクチンの構築に用いられ得る。ワクチンは、抗原に対して特異的な、本発明のペプチドあるいはキャリアに結合したペプチドあるいは結合または非結合ペプチドの混合物あるいはエピトープであり得る。あるいは、それは、他の病原菌に対する抗体と潜在的に反応し得る。次いで、このワクチンは、HEV感染の予防方法に用いられ得る。抗原の免疫原性量は、標準の手法を用いて決定され得る。簡単に言えば、推定の特異的免疫反応性ペプチドまたはポリペプチドの種々の濃度が調製され、動物に投与され、そして各濃度に対する動物の免疫学的応答（例えは、抗体の産生、または細胞性の応答）が測定される。本発明のワクチンにおける薬学的に受容可能なキャリアは、生理食塩水または他の適切なキャリア（Arnon，R．（編）Synthetic Vaccines Ｉ：83-92、CRC Pr ess，Inc.、Boca Raton、Florida、1987）を含み得る。アジュバントはまた、ワクチンのキャリアの一部であり得、そのような場合、それは用いられる抗原、投与の様式、および被験体に基づいた標準の分類基準により選択され得る（Arnon ，R．（編）、1987）。投与の方法は、経口または舌下手段によるか、または注射によるものであり得、用いられる特定のワクチン、および投与される被験体に依存する。ワクチンが予防薬または治療薬として用いられ得ることが、上記から理解され得る。従って、本発明は、被験体にワクチンを投与することによる、HEV感染および関連した疾患の予防方法、または治療方法を提供する。抗体検出キット本発明の診断キットは、HEVまたはその抗原性ペプチドと特異的に反応する一次抗体を検出するのに用いられ得る。このキットは、基質に結合される本発明の HEV抗原、HEV抗原と特異的に反応する抗体と反応する二次抗体、および二次抗体と一次抗体との反応を検出するための試薬を含み得る。このようなキットは、EL ISAキットであり得、そして、基質、抗原、一次抗体および二次抗体、そして適切に任意の他の必要な試薬（例えば、上記のような検出可能な部分、酵素基質、および呈色試薬）を含み得る。あるいは、この診断キットはイムノブロットキットであり得、これは一般的に本明細書に記載の成分および試薬を含み得る。抗原検出キット本発明は、HEV抗原を保有するHEV株による感染を診断するためのキットを提供する。特に、このキットは、HEV抗原、または抗体と特異的に反応するその免疫反応性ペプチドを検出し得る。このキットは、基質に結合される抗体、抗原と反応する二次抗体、および二次抗体と抗原との反応を検出するための試薬を含み得る。このようなキットは、ELISAキットであり得、そして、基質、一次抗体および二次抗体、そして適切に任意の他の必要な試薬（例えば、上記のような検出可能な部分、酵素基質、および呈色試薬）を含み得る。あるいは、この診断キットはイムノブロットキットであり得、これは一般的に本明細書に記載の成分および試薬を含み得る。本発明の診断キットに含まれる特定の試薬および他の成分は、キットで実施される特定の診断法に従って、当該分野で利用可能なものから選択され得る。このようなキットは、被験体由来の組織および体液サンプル中の抗原を検出するのに用いられ得る。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、制限するものではない。それらは用いられ得る典型的なものであるが、当業者に公知の他の手法が代替的に用いられ得る。実施例１抗原性ペプチドの選択および合成配列選択推定抗原性ペプチドについて配列を選択するために、以下の３つの基準を用いた：親水性、フレキシビリティー、および二次構造。タンパク質のハイドロパシープロット（Kyte， J．およびDoo1itle，R.F．J．Mol．Bio1．157:105-132，1982）および二次構造（Chou，P.Y.およびFasman，G.D．Ann.Rev．B1ochem，47:251-276，1978）の推定は、コンピューター分析（PROSIS；Hitachi Software Engineering Co.，Ltd ．）を用いて行った。鎖に沿ったタンパク質のセグメントフレキシビリティーを、KarplusおよびSchulzにより記載の方法（Naturwissenschaften 72:212-213，1 985）により分析した。さらに、タンパク質の二次構造を、PtitsinおよびFinkel steinにより開発された方法（Biopolymers 22:15-25，1983）により推定した。合成されるように選択された合成ペプチドの配列を表１および２に示す。合成のために選択されたペプチドのほとんどは、その推定二次構造がβターンまたはランダムコイルとして表される親水性でフレキシビリティーのある配列を含む（表１および２）。完全ORF3タンパク質をほとんどカバーする合成ペプチドを、分子のＮ末端側半分の２つの非常に疎水性の強い領域を除いて調製した。さらに別の基準（Eisenberｇら，Ｊ．Mol.Biol．179:125-142，1984；Kleinら，Biochem ． B1ophys．Acta 815:468-476，1985）を用いて、これらの２つの領域が膜貫通 αヘリックスであると推定し得る。ハイドロパシープロットは、抗原性ペプチドの選択に重要である。なぜならこれは、疎水性領域が、通常、αヘリックスとして表される可能性を有し、そして免疫系との相互作用に利用され得ない膜貫通領域として機能し得るからである。Ｎ末端領域が強疎水性である可能性により、このタンパク質は、おそらくHEV粒子の排出においてある役割を果たすと考えられる細胞膜に関連し得ることが示唆された。 HEビリオンは、検出され得る量の脂質を含まないが、大きなORF2によりコードされる構造タンパク質のＮ末端の強疎水性領域の存在は、HEVの形態形成における膜の可能な役割を別に示す。この所見を考慮すると、これらの２つの疎水性領域の間の短い配列が、ORF3タンパク質のＣ末端の比較的親水性である領域に及ぶペプチドに加えて、合成のために選択された。この短い親水性配列は、これらの２つの膜貫通ドメイン間に位置するループであり得る。この領域が曝されると、それはORF3タンパク質の強い抗原性エピトープになり得た。 ORF2の長さのために、合成ペプチドを別の考えを用いて選択した。このタンパク質のＮ末端側半分全体は、ArgおよびLysを高濃度で含む。これらのアミノ酸は、核酸に結合する可能性を有し、これは、ビリオン粒子において、この領域は内部局在化を有し得ることを示唆する。それにも関わらず、HBV、HDV、またはHCV のようなウイルス粒子の内部タンパク質が重要な診断試薬であるという認識のもとに、少数のペプチドを、合成のために、タンパク質のＮ末端側半分の親水性およびフレキシブルな領域から選択した。ペプチド合成ペプチドは、FMOC化学法（BaranyおよびMerrifield，1980）により、ABI Mode1 430Aペプチド自動合成機（Applied Biosystems，Inc.，Fost er City，CA）またはACT Model MPS 350マルチプルペプチド合成機（Advanced C hemtech，Louisville，KY）で製造者のプロトコルに従って合成した。プロトコルは既に記載されており、FastMoc^TMサイクルとして利用可能である（Applied B iosystems，Inc．1990，FastMoc^TM chemistry：Model 430A Peptide Synthesize r User Bulletin 32におけるペプチド合成のHBTU活性化；およびModel 431A Pep tide Synthesizer User Bulletin 33におけるペプチド合成のHBTU活性化）。これらは、0.10mmolおよび0.25mmolの２つのスケールであり、それぞれ全サイクル時間が20分および60分である。Fmoc脱保護は、N-メチルピロリドン（NMP）中でピペリジンにより行い、そして樹脂をNMPで洗浄した。両スケールにおいて、1.0 mmolのFmocアミノ酸をNMP、およびDMF（N,N-ジメチルホルムアミド）中１mmolの 0.45Ｍ HBTU（2-（H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3,-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）／0.45Ｍ HOBt（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール）に溶解した。溶解したFmocアミノ酸を、1.7〜2.0mmolのDIEA（ジイソプロピルエチルアミン）と一緒に反応容器に移し、そして、0.l0mmolサイクルでは約10分間、0.25mmolサイクルでは30分間、ペプチド樹脂と反応させた。ペプチドを、５％チオアニソール／2.5％エタンジチオール／2.5％H₂O／90％T FAまたは2.5％エタンジチオール／５％H₂O／92.5％TFAのいずれかを200μl含有する試験管内に、10 mgのペプチド樹脂を入れ、１時間混合することにより切断した。次いで約3.5ml のH₂Oを加え、混合物を２〜３mlのt-ブチルメチルエーテルで３〜５回抽出し、そして水層を濾過した。溶解しなかったペプチドは、分析の前に適切に、酢酸、水酸化アンモニウム、またはイソプロパノールを加えて水層中に溶解させた。アミノ酸分析による特徴付け、高速液体クロマトグラフィー、およびキャピラリー電気泳動を行った後、ペプチドを酵素イムノアッセイに直接用いた。ペプチドの抗原活性酵素イムノアッセイ（EIA）を用いるペプチドの初期分析（表１および２）を、中央アジアの発生地帯から得た血清で行った（表３）。この採取からのすべてのサンプルを、HEV感染のために近年開発されたウエスタンブロット分析およびペプチドＥIAにより試験した。血清中央アジア（1985）、メキシコ（1986）、およびケニア（1991）の腸内伝達非Ａ非Ｂ肝炎の発生地帯からの血清を用いて、ORF2およびORF3によりコードされたタンパク質のHEV特異的エピトープを同定した。この分析のネガティブコントロールとして、HAV、HCV、 HBV、 HDV感染マーカーを有するヒト由来の採取した血清、または正常血液供給者由来の採取した血清を用いた。１歳から67歳までのウイルス性肝炎患者由来の血清を、世界における地理的に異なる地域（中央アジアおよびメキシコ）における1984年と1992年との間のウイルス性肝炎の発生地帯から採取した。黄疸の発症時から黄疸の27日目までの感染患者から、可能性なときはいつでも血清を得た。さらに、病院を退院してから１〜24カ月後の患者から、回復期血清を得た。すべての血清を、市販の試験（Prep arat，Nizny Novgorod，Russina；Abbott Laboratories，North Chicago，IL）を用いて、HAV、HBV、およびΠCVのマーカーを血清学的に排除することにより、本来NANBHとして診断した。試薬：西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合アフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgGをTAGO（Burlingame，CA）から得、そして1:40,00 0希釈で用いた。この検出分子の特異性を確認するために、HRPに結合したヒトIg GまたはヒトIgMに特異的なモノクローナル抗体を１：2000希釈て用いた。ウエスタンブロツトアツセイすべての血清を、Favorovら（J．Med．Virol．36:246-250，1992）に従って行うウエスタンブロットにより抗HEV活性について試験した。 trypE（37kDa）のＮ末端領域およびORF2によりコードされるポリペプチドのＣ末端側半分（46.8kDa）を含む組換えキメラタンパク質、C2およびC2-1（Purdyら，1992）を、HEVに対するIgGおよびIgMクラスの抗体を検出するウエスタンブロット（WB）診断試験の開発のために用いた。組換え融合タンパク質C2（83.8kDa）および融合タンパク質C2-1（49.5kDa）を Escherichia coliで発現させ、そしてこれらのタンパク質を含む溶解物を以前に記載されているようにして（Purdyら，1992）得た。C2およびC2-1溶解物を混合し、８％または11％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した(Purdyら，1992）。分離したタンパク質を、BAS 83 ニトロセルロース（Scheicheｒ & Schuell，Keene，NH）に、TE70 SemiPhor（Ho efer，San Franc1sco，CA）を用いて、以前に記載されているようにして（Purdy ら，1992）、トランスブロットした。２mmストリップを切り出し、４℃で保存する前に、５mM EDTA、150mM NaCl、0.05％NP-40、0.25％ゼラチン、および1.0％ウシ血清アルブミン（NET-BSA）を含む50mM Tris-HCl、pH 7.5中で、20℃で16〜 20時間インキュベートした。ストリップは、NET-BSA中４℃で１〜２週間保存し得るか、または減圧下で乾燥させて長期間保存し得た。未知の血清検体を、組換えプラスミドを含まないE．coli溶解物の１％抽出物を含有するNETバッファー中で希釈し（最小希釈１：20）、そして室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、このストリップをNETバッファー中で10分間３回洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合アフィニティー精製検出抗体とインキュベートした。これらは、ヤギ抗ヒトIgMおよびヤギ抗ヒトIgG（TAGO，Burlingame，CA；Sigma Chem ica1 Co.，St．Louis，MO）を含有していた。ヒト免疫グロブリンイソタイプの特異性を、HRP結合ネズミモノクローナル抗ヒトIgGおよび抗ヒトIgM（American Qualex，La Mirada，CA）を用いて確認した。次いで、このストリップを、呈色のために、100mgの3,3’-ジアミノベンジジンおよび100μlのH₂O₂を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.2中でインキュベートした。非特異的反応を取り除くために、C2およびC2-1タンパク質を、個別に配置させて、ポリアクリルアミドゲルから切り出した。これらを、0.5M Tris-HClバッファー、pH6.8中に別個に溶出し、8.5％SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により再精製し、トランスブロットし、そして非特異的反応を与える血清検体を用いて試験した。さらに、各分析に対してコンジュゲートの免疫反応性を確認するために、精製免疫グロブリン重鎖（γ特異的およびμ特異的、Chemicon，E1 Seg undo，CA）を電気泳動により分離し、トランスブロットし、そして別個に免疫染色した。 HEV感染検出のためのこの方法は、あまり感度が高くないので、急性感染または前感染の大多数の場合を検出することができない。さらに、記載のウエスタンブロット法は、使用前に組換えタンパク質の精製が必要とされるので時間がかかる。酵素イムノアッセイマイクロタイターウエル（Immulon I，Dynatech Laboratories，Inc.）を、10 0μlの合成ペプチドと、ウエルあたり５μgの濃度で吸着させた。ヒト血清を、0 .l％Tween 20および10％正常ヤギ血清を含有する0.1M PBS、pH7.5中で１：50に希釈し、そして100μlを各ウエルに加え、吸着ペプチドに対して反応性の抗体を捕獲させた。抗ペプチド活性を含む血清を同定するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合アフィニティー精製抗ヒト抗体（重鎖特異的；TAGO，Inc. ，Burlingame、 CA，USA）を用いた。カットオフを、平均ネガティブコントロール値の３倍になるように統計的に確立させた。中央アジア流行病表３に示されるように、５つのORF3特異的ペプチドのうち４つ（２、３、５、および６）および１２のORF2特異的ペプチドのうち４つ（11、12、22、および23 ）は、ほとんどの血清と反応性であった。１つを除いてすべてのウエスタンブロット分析により陽性血清が、EIAにおいて、１つまたはそれ以上の合成ペプチドと反応性であった。ペプチド５および６は、優性抗原性エピトープを提示するようである。なぜなら、これらの２つのペプチドは、分析したほとんどすべての血清（97.5％）由来の抗体に結合するからである。40のウエスタンブロット抗HEV 陽性血清のうちたった１つだけが、これらのペプチドと反応性ではなかった（表３）。ペプチド２、３、11、12、22、および23は、血清の約30％と反応した。ペプチド10、13、および14（表３）は、抗HEV陽性および陰性の両血清との反応性を呈示した。これらのペプチドは非特異性であると考えられた。従って、大きなORF2 および小さなORF3によりコードされる８つの免疫反応性領域（ペプチド２、３、５、６、11、12、22、および23）が同定された（表３）。ペプチド33および40（表２）もまた、非常に免疫反応性である。ペプチド33は、抗HEV陽性血清の81％と反応した（データは示さす）。ペプチド40は、陽性血清の45％と反応性である（データは示さず）。両ペプチドともHEV感染の診断に非常に重要である。これらの２つのペプチドは、本発明の混合物中に含まれ（例えば、混合物９）、抗HEV抗体の検出のためのペプチドEIAの感受性を改善し得る。メキシコ流行病本発明のペプチドの大部分（５および６を包含する）の合成は、HEVのビルマ株の配列に基づいた。ペプチド28および29はメキシコ株配列（Yarboughら、1991 ）に基づいて、５および６と正確に同じ位置で、しかし異なる配列で、選択され、そして合成された。ペプチド５および６と28および29との比較分析によって、これらのペプチドには厳密な株の特異性はないことが示された（表４）。ペプチド28および29は、予期されたように1986年のメキシコでの発生からの血清と反応性である；しかし、ペプチド５、６、22、23、28、および29の組み合わせでさえ、ウエスタンブロット分析または蛍光抗体ブロッキングアッセイ（KrawczynskiおよびBrad1ey、1989）によって陽性であるメキシコでの発生からの血清すべてを同定はしなかった（表４、サンプル395）。IFAにおいては、既知の感染した組織を未知の血清に接触させ、洗浄し、ディテクターで標識されたヒト抗HEV IｇGを添加し、そして標識の存在について観察した。同じ検体（395）はどのペプチドとも反応しなかったが、しかし、この検体はウエスタンブロット分析およびIFAでは、強い反応性であった。さらに、検体67（表４）は、ウエスタンブロット分析およびIFAで、抗HEV陰性であったが、ペプチド５、６、および22と反応性であった。ペプチド５および６は、常に同じ血清のセットと反応した；しかし、同様の位置を有するがメキシコのHEV株配列に基づくペプチド28および29は、常に同じ検体と同時に反応するわけではなかった。ペプチド28中に存在するエピトープは、ペプチド29中に存在するエピトープよりもより免疫反応性であると思われた（表４）。従って、ペプチド５および28と、６および29との間には一次構造の違いが存在し、これがこれらのエピトープの抗原活性の変化に至らしめ得る。ケニヤ流行病最近のケニヤでの発生から得られた血清を分析した際、ペプチド５、６、22、23、28、および29をこの血清に対して試験した。ペプチド分析のために選択された93体の血清のうち24体の血清が、半年以内の黄疸が報告されている患者から得られたものであった（表５）。残りの69検体は、黄疸の病歴はないが発生が起こった同じ地域に住んでいた人々から採取された（表６）。最初に、すべての血清を、抗HEV活性についてウエスタンブロット分析で特徴付けし、そしてＡ型肝炎ウイルス（HAV）に対するIgM抗体の存在についてEIAで特徴付けした。すべての血清がIgM抗HAV活性について陰性であった（示さす）。黄疸が報告されたケースからの血清のうち23体が、ペプチドEIAによって抗HEV 陽性であることが見いだされた。過去６ヶ月以内の黄疸が報告されていない個体から得られた検体のうち27体の血清は、ウエスタンブロット分析によって抗HEV 陽性であることが見いだされた（表６）。ペプチド29はこれらのケニヤからの血清と非反応性であり、そしてペプチド28 はほんの少数のサンプルとしか反応性でないことが見いだされた。しかし、ペプチド５および６は、黄疸が報告されたケースからの血清の約71％と反応し、そしてウエスタンブロット分析で抗HEV陽性であることが見いだされた血清の48.2％と反応した。黄疸の病歴がない個体からの１検体（138）は、ペプチド５および６と特異的に反応性であるが、ウエスタンブロット分析では反応性ではないことが見いだされた。ペプチド22および23はペプチド５および６より反応性であった。黄疸が報告されたケースの患者からの血清の95％より多くが、これらの両方のペプチドで同定された。黄疸の病歴がない人々からの、ウエスタンブロット分析で陽性の血清の約82％もまた、これらのペプチドと反応性であった。ウエスタンブロット分析で陰性の８体の血清はペプチド22および23と特異的に反応性の抗体活性を有することが見いだされた。このように、ペプチド22および23の組み合わせは、ペプチド５および６よりも、より多くの抗HEV陽性血清を同定した。別々に用いた個別のペプチド22および23は、ペプチド５および６よりも強い免疫反応性を示した。例えば、ペプチド22は、黄疸が報告された人々から得られた血清、あるいは抗HEV 活性に関するウエスタンブロット分析で陽性の血清の79.2％および66.7％とそれぞれ反応し、そしてペプチド23はその79.2％および63％とそれぞれ反応した（上記の５および６の70.8％および48.2％と比較）。合成ペプチドEIAにおいて、ペプチド５、６、22、および23全体で、ケニヤでの発生からのHEV感染が報告されたケースすべてを同定し得た。ウエスタンブロット分析はペプチドEIAと比べると感度が低い。黄疸患者から得られた１検体（144）だけが、ウエスタンブロット分析で陽性と同定されなかった（表５）。黄疸にかからずに抗HEV活性を有する血清の多くは、過去のHEV感染または無症候性HEV感染のせいであり得る。黄疸が報告されたケース中では、疾患歴がないケース中よりも、４種の異なるペプチドに対して免疫反応性の事例がより多くあった。ペプチド５、６、および22、および23は、この疾患が報告されたケース中、同じパーセントの患者を同定した。しかし、ペプチド５および６は、黄疸のケースと報告されなかったグループからの血清との反応性が２倍低かった（表６参照）。ペプチド５および６の抗原性エピトープに対する体液性免疫応答はペプチド22および23のエピトープよりも速く低下し得る。従って、ペプチド５および６はHEV感染の種々の段階での特異的な（differential）診断のために使用し得る。逆に、ペプチド13は、急性感染から３年後までの血清中の抗体を検出し得る。メキシコから得られた血清が中央アジアまたはケニヤから得られた血清と比べて異なるパターンの、合成ペプチドとの相互作用を有する限りにおいては、株の特異性が示される（表３〜６）。５および６、または28および29を含有するORF3 タンパク質領域間の相同性はわずか78％である（Yarboughら、1991）。メキシコの血清では、ペプチド５および６はペプチド28および29と同じパーセントの陽性例を同定した（表２）。しかし、中央アジアからの血清（データは示していない）およびケニヤでの発生からの血清では、ペプチド28および29は、これらのペプチドを用いた抗HEVについて陽性の血清のパーセンテージが低いことから明らかなように、反応性が低かった。従って、HEVのビルマ株は、HEVのメキシコ株よりもケニヤまたは中央アジアのウイルスとより大きな関係があることが、我々のデータから示される。 ORF3でコードされるタンパク質には少なくとも４ヶ所の抗原性領域があり、そしてORF2でコードされるタンパク質には少なくとも７ヶ所の抗原性領域がある。構造タンパク質から合成のために選択された12個のペプチドのうち、わずか４個（33％）がHEV感染個体からの血清と特異的に反応性であった。最小抗原性配列の同定６（または７、または８など）アミノ酸長のペプチドのセットを合成すべきである。これらのペプチドは５aa長領域（または６または７aa長ペプチドなど）ずつオーバーラップしており、そして全体として、抗原性エピトープがすでに見いだされた配列（例えば、ペプチド５、または６または22、または23、または13など）を含んでいる。このセットからの短いペプチドそれぞれの抗原活性を、本明細書中に記載されている手順で分析する。６aa長（または７aa、または８aaなど）の免疫反応性領域を、４aa領域ずつオーバーラップされた５aa長の他のペプチドを設計するために使用した。もし、これらのペプチド中に抗原活性が残っているなら、４aa長の、より短いペプチドのセットを合成する。すべてのペプチドを比較分析して、最も強くかつ特異的に抗HEV抗体と免疫反応性のペプチド配列を見つける。これらのペプチドはまた、混合物として、抗HEV抗体の検出のために使用し得る。実施例２抗HEV活性を検出するための、合成ペプチドに基づくエンザイムイムアッセイ最初に、HEVのビルマ株に基づきかつORF2およびORF3にコードされる17種の合成ペプチドを、上記のように免疫反応性のエピトープを同定するために個別に使用した（表３）。HEV感染個体から得られた血清に対して試験すると、これらのペプチドのうち８種が重要な免疫診断上のエピトープを含んでいた。ORF3のＣ末端に対応するペプチド５および６は、約90％を超える急性期の血清（表３）、および約30％の回復期の血清を同定した（データは示していない）。他の合成ペプチドは、個別に試験すると、ペプチド５および６に比べより低い反応性の度合いを与えるか、あるいは非特異的反応を示した。従って、これら合成ペプチドの種々の混合物について、固相上において試験した。合成ペプチドの種々の混合物の診断上の有意性を確認するために、各混合物をパネル血清に対して試験した。このパネルは、中央アジアの汚染地域におけるHE V発生から得られた45急性期検体（黄疸の発症から１〜10日後）、およびこれらの患者からの、追跡検査の14回復期検体（黄疸の発症から４〜６ヶ月後）から成っていた。さらに、非汚染地域からの健常ドナー集団から得られた36体の血清を、ネガティブコントロールとして使用した。10％正常ヤギ血清（NGS）、１％ウシ血清アルブミン（BSA）、および0.05％Tween20を含有する0.01M PB S（pH7.2〜7.4）からなる正常ヤギ血清バッファー（NGS-Buff）で、各検体を希釈した。パネルの各メンバーの抗HEV活性をWB分析で確認した（Favorovら、J．M ed．Virol.、1992）。急性期および回復期の血清はすべて、WBで試験して陽性であり、他方、ドナー血清はすべてWBで陰性であった。上記のパネルは、固相に吸着した合成ペプチドの異なる組み合わせを評価するために使用されるのみならず、急性期および回復期の血清、および健常ドナー集団の血清における陽性率をそれぞれ確認することによって、ペプチド−EIAの感度および特異性を評価するためにも使用される。３つの異なるアプローチが、固相に吸着した合成ペプチドの種々の混合物を形成するために使用された。コンジュゲートされていないペプチド混合物第１のアプローチ（混合物１〜５）は、種々の濃度のコンジュゲートされていない合成ペプチドのみで構成した。各混合物の結果を実験的に求め、そして固相に吸着した混合物５が最も良好な結果を生じた。この混合物は以下の合成ペプチドで構成されていた：＃６（20μg/ml）、＃５（10μg/ml）、＃11（５μg/ml）、＃12（１μg/ml）、＃22（１μg/ml）、＃23（５μg/ml）、＃28（２μg/ml）、および＃29（２μg/ml）。ペプチド＃28および＃29は上記のようにHEVのメキシコ株に基づいており、そしてペプチド＃５および＃６の正確なヌクレオチド位置に対応する。混合物５を使用した抗HEVの頻度は、急性期血清では41/45（91.1％）、回復期血清では12/14（85.7％）、健常ドナー血清では3/36 （8.3％）であった。この8.3％陽性率は、偽陽性反応の結果であると考えられた。 BSAにコンジュゲートされた個々のペプチド第二のアプローチは、個々の合成ペプチドをBSAにコンジュゲートすることを伴う。これらペプチドは、BaumingerおよびWilchekの方法(15)に従い、l-エチル -3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロド（EDＣ）（Pie rce Chemical Co.，Rockford，IL）を用いてBSAにコンジュゲートした。手短に述べれば、10mgの個々の合成ペプチドまたはそれらの混合物を最終濃度が１mg /mlとなるように蒸留水に溶かした。このペプチド溶液に最終濃度が10mg/mlとなるようにEDCの結晶を加え、そしてpHを5.0に調整した。この反応混合物を５分間室温でインキュべートし、そしてBSAを添加して最終モル比がペプチドおよそ１モルあたりに各々BSAの10アミノ酸とした。この反応混合物をさらに４時間室温でインキュベートした。コンジュゲーション反応を最終濃度が100mMとなるように酢酸ナトリウム（pH4.2）を加えて停止させ、さらに１時間、この反応混合物を室温でインキュベートした。このペプチド−タンパク質コンジュゲートを、pH 7.2の0.01Mリン酸緩衝生理食塩水に一晩（４℃）透析することによって、残渣のペプチドおよび他の反応生成物から単離した。上記ペプチド−タンパク質コンジュゲートは、上記と同じバッファー中、-20℃で保存した。このプロトコールは、配列に関わらず他のペプチドについても適用し得る。コンジュゲートは、正常ヤギ血清バッファー（NGS-Buff：10％正常ヤギ血清（ NGS）、1％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.05％Tween20を含有する0.01MのP BS（pH7.2-7.4）からなる）で希釈した。このバッファーはまた、中和試験を行うためにも用いた（Neut-Buff）。コンジュゲーション後、種々の濃度のコンジュゲートされたペプチドを混合し（混合物１〜７）、そして固相に吸着させた。最適な結果は、混合物７により得られ、そして経験的に決定した。この混合物は、以下のコンジュゲートされたペプチドて構成された：＃23（20μg/ml）、＃6（14μg/ml）、＃5（8μg/ml）、＃22（4μg/ml）、および＃13（4μg/ml）。混合物７を用いた抗HEVを示す頻度は、急性期の血清では44/45（97.8％）、回復期の血清では12/14（85.7％）、そして健常ドナー血清では1/36（2.8％）であった。この検体については、偽陽性反応と考えられた。ペプチド＃13は、コンジュゲートせずに供試した場合に著しい非特異的反応を示した（表１）が、BSAにコンジュゲートした後は、この非特異的反応は、混合物５および７との比較において消失した。 BSAにコンジュゲートされたペプチド混合物第三のアプローチは、混合物７で上記に示したように、各合成ペプチドの同じ濃度での混合物（混合物９）をBSAとコンジュゲートすることを伴う。この方式では、理論的には、各エピトープがBSAの各分子上に示され、人工的抗原複合体（天然の抗原の免疫反応性に近似し得る）の合成を引き起こす。さらに、このような複合体は、固相上に、これら抗原エピトープのより均一な分配を可能とし得る。混合物９を用いた場合、急性期の血清では45/45が抗HEV活性について陽性であり、回復期の血清では13/14が陽性であった。これに対して、全ての健常ドナーの血清については陰性であった。ペプチド−EIA Immulon II EIAマイクロタイターウェル（Dynatech Laboratories，Inc．Chan ti1ly，VA）に、105μlの個々のペプチドまたはコンジュゲートされたペプチドを吸着させた（室温、一晩）。吸着後、各ウェルを0.5％Tween20を含有する脱イオン水で５回洗浄した。次いで、各検体をNGS-Buffで適当に希釈し、そして該希釈された各検体100μlを各ウェルに加えた。37℃で１時間のインキュベーション後、各ウェルを７回洗浄し、そして100μlの希釈されたコンジュゲートを各ウェルに加えた。次いで、各ウェルを37℃、１時間、再びインキュベートし、そして 100μlの基質（Abbott Laboratoriesから入手したo-フェニレンジアミンおよびH₂ O₂）溶液を添加した。各ウェルを、暗黒条件下、室温で15〜30分間インキュベートし、その後、1NのH₂SO₄50μlを加えて、酵素反応を停止した。各ウェルは、吸光値が493nmにセットされたELISAリーダーで計測した。陽性の結果についてのカットオフ値は、480 WBの陽性および陰性血清の度数分布を基に統計学的に決定した。固相に吸着した混合物９中の５つのエピトープ中の３つの個々の抗原の免疫学的活性を評価するために、個々のモルモット-抗ペプチド＃23、＃6および＃5を連続した２倍ずつの希釈液を固相に加え、インキュベートした。洗浄サイクル後、HRPをコンジュゲートしたヤギ-抗モルモットIgGを用いて上記固相上の抗原エピトープ活性を検出した。コントロールとして、モルモット-抗ペプチド＃28を同様に希釈し、混合物９について試験した。混合物９には、ペプチド＃28活性はない。1:32,000の希釈を越えた各抗ペプチド血清のエンドポイントは、これらエピトープが免疫学的に活性であり、固相への吸着後の混合物９中で利用できることを示した。これに対して、ネガティブコントロールでは、いずれの希釈についても非活性であった。度数分布陽性血清と陰性血清とを識別するための上記ペプチド−EIAの有用性を決定するために、483体の血清を選択し、１:100の希釈において、混合物９について試験し、度数分布を求めた（図２）。この度数分布は、３つのゾーンを規定した。それらは、陽性ゾーン、陰性ゾーン、および中間ゾーンと呼称した。陽性ゾーンについてのカットオフ値は、ネガティブコントロールの平均値＋6.3（平均値の標準偏差(SD)）と等しい。 0.07を下まわる吸光値（平均＋3.9SDまたは平均値×3.2）が、陰性ゾーン内とみなされ、これに対して、0.07より上および0.10未満の吸光値は、中間ゾーン内とみなされた。３検体が、中間ゾーンに該当した。1:10での希釈における再現性試験では、これらの血清は、抗HEV活性について陽性と評価された。中和アッセイ中和試験は、血清中の抗HEV活性を確認するために行った。簡単にいえば、上記ペプチド-EIAについてのプロトコールに従うが、検体は混合物９に添加する前に、混合物５（個々のコンジュゲートされていないペプチド群）と共にインキュベートし；混合物５とインキュベートした検体を取り出し、それを吸着された混合物９に加える。この試験は、特に、上記カットオフ値に近い吸光値を生じる検体および上記中間ゾーン内の吸光値を生じる検体について重要である。中和試験の使用は、顕著に、特に不適切に保存されていた検体あるいは何度も凍結溶解サイクルを行った検体について、偽陽性率を下げた。中和因子は、固相に吸着された上記ペプチドまたはそれらの混合物とは異なる。さもなければ、偽陽性反応が不適当に中和され、正しくは陰性検体を陽性と判断してしまうことになる。従って、個々のコンジュゲートされていない合成ペプチドを中和剤として用い、吸着された混合物９を含むウェルに添加する以前に液相において37℃で１時間、希釈された検体をインキュベートした。種々の濃度での試験後、各コンジュゲートされていない合成ペプチドの最適濃度は、以下の通り：＃23（40 μg/ml）、＃6（30μg/ml）、＃5（15μg/ml）、＃22（10μg/ml）、および＃13 （10μg/ml）であった。図３に、最初陽性と判断され、0.1から2.5を越える吸光値を生じた血清を用いた中和試験の結果を示す。血清は、吸光値が、上記中和混合物とのインキュベーション後、50％減少した場合に陽性と確認された。2.5より大きいOD値を生じる血清は例外として、全ての血清が63％から78％の間の範囲の平均中和活性に対して陽性と確認された。2.5より大きいOD値を生じる血清を1:500という高い希釈において再試験した。全ての血清は、希釈後、うまく中和された。上記ペプチド-EIAの最終的なデザインは、1:50の最初の希釈においての中和と同時に、および中和せずに各検体を抗HEV活性について試験することを伴う。マイクロタイターウェルの最初の列は、NGS-buff中で希釈された血清を含有し、２番目の列は希釈され中和された血清を含有する。その結果、同一の血清が、縦の位置の二つのウェルに置かれている。2.0より高いOD値の最初の反応（中和されていない）血清は、1:100希釈において再試験した。さらに、ネガティブコントロールの平均値の２倍より高いOD値の血清および中和されない血清は1:10希釈において再試験した。これらの血清は、中和後、そのOD値が50％減少した場合、抗 HEV活性について陽性であるとみなされた。エンドポイント測定上記ペプチド-EIAの最終デザイン後、エンドポイント測定を2.0より高い0D値の33血清について実施した。これら血清の大部分は1:1000から1:10,000のエンドポイント力価を示した。このグループの３つの血清では、1:100,000を越えるエンドポイント力価を示した（データは示していない）。地域および供給源に関する抗HEV活性混合物９を用いたペプチド-EIAを使用し、２カ所のHEV汚染地域でのHEV流行地区（タジク、キルギス、中央アジア共和国、旧ソ連、；ならびにメキシコ）からの血清、HEV汚染地区（タジク共和国）から得た健常群衆からの血清、およびHEV 非汚染地区（USA）からの血清を包含する、世界の様々な地域から収集した血清の抗HEV活性を測定した（表７）。モンタナコレクション（The Montana collect ion）は、HAV発生に関する患者対照研究を代表した。さらに、HBV、デルタ肝炎ウイルス（HDV）およびHCVのマーカーについて陽性のロシアからの急性期の血清を、コントロールとして使用した。上記コントロールのいずれも抗HEV活性を示さなかった。このことは、上記ペプチド-EIAが、これら血清が過去にHEV感染したと、誤って同定しなかったを示している。上記モンタナコレクション中唯一つの血清が、抗HEV活性について、くり返し陽性（中和により確認した）であり、２年後に得た追跡検体についても陽性のままであった。上記見張られた州の検体は、米国の４カ所の地理的に隔絶された州において実行された積極的な監視システムから収集した急性期の血清を代表する。39血清が、追跡調査において慢性の余病の兆候がないNABCH として診断された。これらの血清の全てが、抗HEV活性について陰性であり、モンタナ内の一つの陽性血清を例外として、米国においては、世界の汚染地域への旅行においてなされた感染を除いて、HEV感染が希な事象であることを示した。 HEV汚染地域内の健常人から収集した639血清中、41（6.4％）が、過去にHEVにさらされたことを表す、抗HEV活性を示した。この値は、世界の汚染地域の健常群衆中の感染に関してのHEVのバックグラウンドを表す。最後に、旧ソ連の中央アジア共和国、タジクおよびキルギス中の２つのHEV発生地域において、各々血清の98.4％および85％が、抗HEV活性について陽性であった。正に、これらのデータは、抗HEVの検出のための上記ペプチド-EIAが、高い特異性および感度を有していることを示している。本願明細書において種々の刊行物が参照されている。これら刊行物中の開示はその全てにおいて、本発明に関係する技術状況をより詳細に説明するために本願明細書中に参考として援用されている。以上に参照したいかなる不完全な引用も以下の参考リスト中に見いだされ得る。参考文献 Balayan MS，Andjaparidze，Savinskaya SS,ら、糞−口経路による非Ａ型、非Ｂ型肝炎の証拠．Intervirology 1983;20:23-31． Barany，G.，およびMerrifield．（1980）．固相ペプチド合成。「The peptid es」（E．GrossおよびJ．Meienhofer編）1，1-284．Academiｃ Press，NY． Bradley DW，Krawczynski K，Cook EH，ら、腸内伝達された非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎：カニクイザル（cynomolgus macaque）およびタマリン（tamariln）における疾病の連続継代ならびに疾病関連27〜34nmウイルス様粒子の回収．PNAS USA 1987;84:6277-6281. Bradley，D.W．（1990a）．非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウイルスはＣ型肝炎、Ｅ型肝炎として同定される．Prog．Med．Virol．37，101-135． Bradley D.W．（1990b）．腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎．British Medi cal Bulletin 46，442-461 CDC（1987a）．腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎 −東アフリカ．MMWR 36，241-244．CDC（1987b）．腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎−メキシコ．MMWR 36，597-602． Bauminger S，Wilchek M．免疫複合体の調製におけるカルボジイミドの使用． Methods Enzymol 1980;70:151-159． Chou，P.Y.，およびFasman，G.D．（1987）．タンパク質コンフォメーションの経験的予測．Ann．Rev．Blochem．47，251 -276. Eisenberg，D.，Schwartz，E.，Kamaromy，M.，およびWall，R．（1984）．疎水性モーメントプロットを用いた、膜および表面タンパク質配列の解析．J．Mol ．Bi1ol．179，125-142. Favorov，M.O.，Fields，H.A.，Purdy，M.M.ら、（1992）．流行病および風土病的条件（setting）でのＥ型肝炎感染の血清学的同定．J．Med．Virol．36，24 6-250． Goldsmith，R.，Yarbough，P.O.，Reyes，G.R.，ら、（1992）．エジプトの子どもの急性散在性Ｅ型肝炎診断のための酵素結合イムノソルベントアッセイ．La ncet 339，328-331． Harada，S.，Watanabe，Y.，Takeuchi，K．ら、（1991）．処理されたＣ型肝炎ウイルスの核タンパク質の哺乳類細胞における発現．J．Virol．65，3015-302 1． Ichikawa，M.，Araki，M.，Rikihisa，T．ら、（1991）．腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウイルス由来のcDNAのクローニングおよび発現．Microbio1．Imm unol．35，535-543. Karplus，P.A.，およびSchu1tz，G.E．（1985）．タンパク質の鎖フレキシビリティーの予測：ペプチド抗原の選別手段．Naturewissenschaften 72，212-213 . Khuroo MS．非Ａ型、非Ｂ型肝炎に関する疫病の研究：輸血後非Ａ、非Ｂ型とは異なる別のヒト肝炎ウイルスの可能性．Am J Med 1980;68:818-824． Klein，P.，Kanehisa，M.，およびDeLisa，C．（1985）．膜選択性（spanning ）タンパク質の検出および分類．B1ochem．B iophys．Acta815，468-476． Krawczynski，K.およびBrad1ey，D.W．（1989）．腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎：実験的に感染したカニクイザルにおけるウイルス関連抗原の同定．J ．Infect．Dis．159，1042-1049． Kyte，J.およびDoolittle，R.F．（1982）．タンパク質のハイドロパシーの特性を示す単純な方法．J．Mol．Biol．157,105-132． Ptitsyn，O.B.,およびFinkr1stein，A.V．（1983）．タンパク質二次構造の理論およびその予測アルゴリズム．Biopolymers 22，15-25． Purcell RH，Ticehurst JR．腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎：疫学および臨床的特徴．Zuckerman AJ編．ウイルス性肝炎および肝臓疾病．New York: A1an R．Liss，1988:131-137． Purdy，M.，McCaustland，A.，Krawczynski，K.,ら、（1992）．ヒト症例および実験的に感染した霊長類由来の血清における、抗体により認識されるエピトープを有するＥ型肝炎ウイルス（HEV）-trpE融合タンパク質の発現．J．Arch．Vir ol.印刷中． Reyes，GR，Purdy MA，Kim JPら．腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎に関与するウイルス由来のcDNAの単離．Science1990；247:1335-1339． Reyes G.R.，Huang，C.C.，Yarborough，P.O.，ら．（1991 a）.Ｅ型肝炎（HEV）：菌株変異検出をマッブするエピトープ．「Viral hepatit is C，D，E」（T．Shikata，R.H．Purcell,T．Uh1da編），pp.237-245．Elsevie r Science Publishers,NY． Reyes，G.R.，Yarbough，P.O.，Tam，A.W.ら．（1991b）．Ｅ型肝炎（HEV）：腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎に関与する新規物質．Gatroenterologia Jap onica 26（追補３），142-147． Tam，A.W.，Smith，M.M.，Geurra，M.E.，ら．（1991）．Ｅ型肝炎（HEV）：全長ウイルスゲノムの分子クローニングおよび配列決定．Virology 185，120-13 1． Tassopoulos，N.C.，Koutelou，M.G.，Macagno，S.ら、（1990）．肝炎δウイルス劇症Ｂ型肝炎に対するIgM抗体の診断的重要性．J．Med．Virol．30，174-17 7． Vishwanathan，R．（1957）．デリーにおける感染性肝炎（1955-1956）．Indi an J．Med．Res．（追補）45，1-30． Wang，Q.H.，Lu，Z.M.，Wang，Y.Q.，およびChen，M.J．（1985)．ELISAによるIgM抗HBcの、HBV感染における診断的重要性．Chin．Med．J．98，703-707． Wong DC，Purcell RH，Screenivasan MA，SR Prasad，KMPavri．インドにおける流行病および風土病の肝炎：非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウイルス病因学の証拠．Lanc et 1980; ii:876-879． Wright，R．（1990）．ウイルス性肝炎比較疫学．BritiSh M eilcal Bulletin 46，549-558． Yarbough，P.O.，Tam，A.W.，Fry，K.E.，ら、（1991）．Ｅ型肝炎ウイルス：タイプ共通エピトープの同定．J．Virol．65，5790-5797． Zuckerman AJ．Ｅ型肝炎ウイルス：腸内伝達された非Ａ型、非Ｂ型肝炎の主要原因．Br Med J 1990;300:1475-1476．配列表 (1)一般的情報： (i)出願人：フィールズ，ハワードエイ．ファボロフ，マイケルオー．クシャコフ，ユーリイー． (ii)発明の名称：抗Ｅ型肝炎ウイルス活性を検出するための方法および組成物 (iii)配列数：20 (iv)連絡住所： (A)住所人：ニードルアンドローゼンバーグピー．シー． (B)番地：スイート 400，エヌ．ダヴリュー．カーネギーウェイ 133 (C)市：アトランタ (D)州：ジョージア (E)国：アメリカ合衆国 (F)郵便番号：30303 (v)コンピューター読み出し形態： (A)媒体型：フロッピーデイスク (B)コンピューター：IBM PC互換用 (C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS (D)ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0，バージョン＃l.25 (vi)現在の出願データ：無し (viii)代理人／事務所情報： (A)氏名：スプラット，グウェンドリンディー． (B)登録番号：P36,016 (C)照会／記録番号：1414.022 (ix)電話回線情報： (A)電話：(404)688-0770 (B)テレファックス：(404)688-9880(2)SEQ ID NO:1の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：21アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:1： (2)SEQ ID NO:2の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：19アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:2： (2)SEQ ID NO:3の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：10アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:3： (2)SEQ ID NO:4の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：15アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:4： (2)SEQ ID NO:5の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：22アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:5： (2)SEQ ID NO:6の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：16アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:6： (2)SEQ ID NO:7の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：19アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:7： (2)SEQ ID NO:8の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：18アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:8： (2)SEQ ID NO:9の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：20アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:9： (2)SEQ ID NO:10の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：21アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列.SEQ ID NO:10： (2)SEQ ID NO:11の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：19アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:11： (2)SEQ IDN0:12の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：20アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:12： (2)SEQ ID NO:13の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：19アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:13： (2)SEQ ID NO:14の情報： (1)配列の特色： (A)長さ：12アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:14： (2)SEQ ID NO:15の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：18アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:15： (2)SEQ ID NO:16の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：14アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:16： (2)SEQ ID NO:17の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：14アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:17： (2)SEQ ID NO:18の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：23アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID N0:18： (2)SEQ ID NO:19の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：15アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:19： (2)SEQ ID NO:20の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：18アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO:20：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/70 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:92） (72)発明者フィールズ，ハワードエイ. アメリカ合衆国ジョージア 30068，マリエッタ，ジャクソンクリークドライブ 1823 (72)発明者ファボロフ，マイケルオー. アメリカ合衆国ジョージア 30329，アトランタ，ドルードバレイドライブ 1405―エフ (72)発明者クジャコフ，ユーリイー. アメリカ合衆国ジョージア 30329，アトランタ，ドルードバレイドライブ 1402―エフ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１により定義されるペプチド。２．配列番号２により定義されるペプチド。３．配列番号３により定義されるアミノ酸配列を含むペプチド。４．配列番号４により定義されるアミノ酸配列を含むペプチド。５．配列番号５により定義されるアミノ酸配列を含むペプチド。６．配列番号６により定義されるアミノ酸配列を含むペプチド。７．配列番号７により定義されるアミノ酸配列を含むペプチド。８．配列番号８により定義されるペプチド。９．配列番号９により定義されるペプチド。 10．配列番号10により定義されるペプチド。 11．配列番号11により定義されるペプチド。 12．配列番号12により定義されるアミノ酸配列を含むペプチド。 13．配列番号13により定義されるアミノ酸配列を含むペプチド。 14．請求項１および２に記載のペプチドを含む組成物。 15．請求項８および９に記載のペプチドをさらに含む、請求項14に記載の組成物。 16．配列番号1、配列番号2、配列番号7、配列番号８および配列番号９により定義されるアミノ酸配列をそれぞれ含む５個のペプチドを含む組成物。 17．前記それぞれのペプチドの濃度比が約８：14：４：４：20である、請求項16 に記載の組成物。 18.各ペプチドがキャリアにコンジュゲートしている、請求項15または請求項16 に記載の組成物。 19．各ペプチドが基質に結合している、請求項15または請求項16に記載の組成物。 20．配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号10、および配列番号11により定義されるアミノ酸配列をそれぞれ含む８個のペプチドを含有する組成物。 21．被験体においてＥ型肝炎ウイルス感染を検出する方法であって、該被験体からの抗体を含むサンプルと請求項14、15、16、および20のいずれかに記載の組成物とを接触させる工程；および抗原抗体複合体の存在を検出する工程を包含する方法。 22．前記サンプルが血清を含む、請求項21に記載の方法。