JPH08505152A

JPH08505152A - ワクチン製剤

Info

Publication number: JPH08505152A
Application number: JP6515529A
Authority: JP
Inventors: クーパーコックス，ジョン; エドワードスパークス，ロバート; クレイジェイコブス，アーウィン; サイモンメイスン，ノーバート
Original assignee: シーエスエル、リミテッド
Priority date: 1993-01-08
Filing date: 1993-12-24
Publication date: 1996-06-04
Anticipated expiration: 2019-10-27
Also published as: AU5805394A; EP0678035B1; CA2152949A1; NZ259285A; AU667003B2; EP0678035B9; CA2152949C; EP0678035A4; DE69332031T2; JP3583128B2; ATE218884T1; KR100291357B1; DE69332031D1; KR960700070A; WO1994015636A1; EP0678035A1

Abstract

(57)【要約】安定な粒状形のワクチン製剤が開示されている。即時放出製剤はアルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んでいる。制御又は遅延放出製剤は、別々の免疫原含有部分を含む生分解性ポリマーの連続マトリックスを含んでなる微小球粒子からなる。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチン製剤発明の分野本発明はワクチン製剤に関し、１つの具体的な態様においてそれは制御又は遅延放出ワクチン、パルス性又はパルス放出ワクチン及びシングルショットワクチンとして様々に記載されているタイプのワクチン製剤に関する。本発明の製剤は人及び獣用ワクチンとしての使用向けであり、後で液体懸濁液中に配合される乾燥粉末の形態で、あるいは投与用に固体ペレット又はインプラントで提供される。典型的には、液体懸濁液の形態をした本発明のワクチン製剤の投与は非経口投与、例えば皮下又は筋肉内注射による。発明の背景１回の投与でフルコースのワクチンの送達は人及び獣医学双方で魅力があり、いくつかの特許及び他の公開（例えば、ＵＫ特許第１，５６７，５０３号）明細書がこの可能性について扱っている。獣適用の場合、利点には以下がある：（i）時間減少-動物は1回だけ処置すればよい（ii）コスト減少-1回の獣医訪問及び処置コスト減少（iii）推奨される投与スケジュールで保証されるコンプライアンス（投与回数、投与間隔）。人医学でも上記３つの利点が重要であり、コンプライアンスは幼児への反復アクセスがしばしば不可能である開発途上国で極めて重要である。加えて、特に幼児で予防接種に伴う痛み及び苦痛は、人医学で１回のワクチン投与を有利にする追加理由である。不活化ワクチン（通常、破傷風又はジフテリアトキソイド）を用いた予防接種の初期研究では、少くとも４週間、好ましくはそれ以上の投与間隔で、２回以上の別個のワクチン投与の重要性を証明した。３回目の投与は、特に母性抗体の移行が初期免疫応答を妨げる若い動物又は幼児で、十分な免疫応答を誘導するために時々必要である。理論免疫学における最近の研究はこれらの発見を支持して、“親和性成熟”という語句を導入した。親和性成熟とは、望ましい免疫原に対する高親和性抗体を分泌する形質細胞が優先的に選択されて、それより低い親和性の抗体を分泌する形質細胞が失われるプロセスについて表す。そのプロセスは抗原結合に関して濾胞樹状細胞と形質細胞との競合を伴い、このため限定量の抗原の存在下のみで有効に生じることができる。親和性成熟のプロセスは一次ワクチン投与後２〜３週目まで始まらないことがあり、２回目の抗原投与はそのプロセスが有効に完了するまで行われないことが重要である。これは、１回目の用量が多すぎる抗原を含有していないならば、多数回予防接種スケジュールで容易に達成できる。しかしながら、このプロセスを１回の遅延放出ワクチン投与で達成するためには、２回目以後の投与分がそれらの抗原配合分を早く放出しすぎないことが重要である。これを達成するために、抗原は規定された分解時間を有するマトリックス内に含有されねばならない。このマトリックスは生分解性であるべきであるが、生物適合性マトリックスが許容されるとして提案されていた。いくつかの選択肢がCox & Coulter，1992により記載されている。遅延放出ワクチンを開発する大きな努力はE1dridgeら，1990；1991の研究で集約しており、彼等は抗原含有微小球を作るために生分解性コポリマー-ポリラクチドコグリコリドを用いて、インビボで抗原含有分の遅延放出を観察した（オーストラリア特許明細書第７９９２９／８７号及び３３４３３／８９号参照）。類似の観察は、アクリレートポリマーから作られるナノ粒子を用いて、Kreuter，1 990により報告された。上記研究者らは遅延放出ワクチンの概念が可能であると示すことができたが、彼等がワクチンの製造に用いたプロセスはワクチンのルーチン製造にとり不適にするいくつかの欠点をもっていた。主要な問題は：（i）変性させる化学的及び物理的条件への生物学的物質の暴露（ii）スケールアップの困難性（iii）親水性化合物（例えば、タンパク質）の低い配合効率であった。 Vectorpharma International SpAの欧州特許公開第４８６９５９号明細書では、薬理活性物質を含有した制御放出粒状医薬組成物、即ちポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマーのような生分解性ポリマー、及び／又は多糖ゲル化及び／又は生物付着性ポリマー、両親媒性ポリマーを含めた他のポリマー、粒子の界面性質を変える物質と薬理活性物質を含んだ組成物について開示されている。その医薬組成物の製造に際しては、ポリマー物質が溶媒の不在下又は最少必要量の溶媒中で界面性質を変える物質と同時溶解され、その後薬理活性物質が最終粒子の形成前に、例えばエマルジョン、押出し、スプレードライ又はスプレー凝固技術によりポリマー溶液に溶解又は分散される。前記のように、この技術は、薬理活性物質がポリマー化合物とその溶媒との混合液に直接暴露され、それが薬理活性物質として用いられる生物学的物質を変性させてしまうという大きな欠点をもっている。免疫原にコンホメーション変化がない、換言すれば免疫原の天然構造を維持していることを保証するように、免疫原性物質が有機溶媒又は他の有機相に溶解状態で暴露されない、ワクチン製剤及びその製造方法を提供することが本発明の主目的である。発明の概要本発明の第一面によれば、アルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んでなる、安定な粒状形の即時放出ワクチン製剤が提供される。本発明のこの面によれば、アルミニウム塩吸着免疫原の水性懸濁液を形成して、その懸濁液をスプレードライするステップを含んでなる、上記のような安定な粒状形をした即時放出ワクチン製剤の製造方法も提供される。類似製剤のフリーズドライ又は凍結乾燥はCsizerら（ＵＳ特許第４５７８２７０号）により記載されている。このプロセスはいくつかの欠点を有しており、最も重要なことはアルミニウムゲル構造の部分的保留が達成できるようにデキストラン及びタンパク質双方を多量に加える必要性である（各々４０及び６〜４mg/m l)。タンパク質のこの多量添加はアルミニウムゲルからワクチン抗原をはずすように作用することがあり、加えてほとんどの場合に免疫原性であり、結果的にワクチン抗原に対する免疫応答を台無しにしがちである。凍結乾燥に伴う他の問題は、大規模生産が難しく、設備コストがかなり高くて、得られる製品が易流動性微細顆粒よりもむしろフレークを形成し易いことである。意外にも、アルミニウムゲルのゲル形成性質は、安定化効果を発揮しうるいかなる他の物質（最少量のワクチン抗原、典型的には１〜１０μg/mlは別にする）の非存在下であってもスプレードライ中に完全に保持される。スプレードライ粉末への水の添加により、出発物質と類似した沈降性質で、典型的ゲルを即時に形成する。本発明の第二面によれば、安定な粒状形で制御又は遅延放出ワクチン製剤が提供され、その粒子は別々の免疫原含有部分を含む生分解性ポリマーの連続マトリックスを含んでなる微小球粒子である。この面において、本発明は、上記生分解性ポリマーを溶解させた連続有機相中に免疫原と場合によりアジュバントを含む水性懸濁液のエマルジョンを形成し、その後油中水型エマルジョンをスプレードライして、別々の免疫原含有部分を含むポリマーの連続マトリックスを含んだ上記微小球粒子を形成するステップを含んでなる、前記のように安定な粒状形の制御又は遅延放出ワクチン製剤の製造方法も提供する。別の方法において、これらの微小球粒子は、上記生分解性ポリマーを溶解させた連続有機相中、粒状免疫原含有物質、好ましくは広く前記されるような安定な粒状形の即時放出ワクチン製剤と場合によりアジュバントの懸濁液をスプレードライして、別々の免疫原含有部分を含むポリマーの連続マトリックスを含んだ上記微小球粒子を形成することにより作られる。これら２つのプロセスは、例えばEldridgeら，1991、O'Haganら，1991、Singh ら，1991及びBodmeier & Cheng，1988で既に記載された方法よりも大きな利点を示す。Eldridgeら，1991及びBodmeier & Cheng，1988のプロセスにおいて、タンパク質はＰＬＧを溶解するために要求される有機溶媒に直接暴露される。結果的に、抗原は変性され、ほとんどの抗原は水溶性であるため、配合効率は乏しくなる。O'Haganら，1991及びSinghら，1991ではこれらの欠点を克服するために試みられる複雑なプロセスを考案した。いずれのプロセスも商業的規模にできず、加えて前者は乏しい配合効率を示し、後者は多量の外来タンパク質の注入を要した。最後に、これらの方法はいずれもアジュバントの同時配合に本来向いていない。本発明の即時放出ワクチン製剤と制御又は遅延放出ワクチン製剤は双方とも、好ましくは１０nm〜２５０μｍ、更に好ましくは１〜１００μｍの範囲内にある微小球粒子の形態をしている。安定な粒状形をしたワクチン製剤は、少くとも１種の即時放出ワクチン製剤及び／又は少くとも１種の制御又は遅延放出ワクチン製剤を医薬又は獣薬用に許容されるキャリア又は希釈剤と混合することにより、投与用のワクチン組成物に作られる。非経口投与用のワクチン組成物の製造用に適したキャリア又は希釈剤は当業界で周知である。一方、ワクチン組成物は既知キャリア物質と固体ペレット又はインプラントの形態で作ってもよい。発明の詳細な説明本発明によれば、制御又は遅延放出ワクチン製剤の免疫原含有微小球は、非常に高い処理量のポテンシャルで製造のワンステッププロセスにより作られる。最終製品は易流動性粉末である。通常ではプロセスの必須成分ではないが、アジュバントは免疫原と共にこれらの微小球中に配合され、これはいくつかの利点を示す：（i）免疫原は乾燥プロセス中に選択された立体配置で保たれる。（ii）アジュバントはパルス放出毎に免疫系を刺激するために役立つ。（iii）インビボ滞留時間中に、遅延放出ポリマーは生分解をうけるが、免疫原は固体支持体への付着により熱及びおそらく酵素変性から保護される。本発明に至る研究において、アルミニウム塩吸着免疫原が複雑な技術と安定剤の過剰及び許容されない使用によらずに粉末又は他の乾燥形で製造できないと通常考えられていたため、即時放出組成物は安定な固体乾燥形で提供しうることが意外にもわかった（例えば、Csizerら）。しかしながら、本発明の第一面によれば、安定な固体製品は水性懸濁液中で作られたアルミニウム塩吸着免疫原を乾燥することにより易流動性粉末として製造できることがわかった。免疫原は、例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩アジュバントに吸着させられる。好ましくは、懸濁液はタンパク質安定剤も含有し、適切な安定剤には例えば糖とトレハロース、ラクトース、デキストロース及びグルコサミンのような糖誘導体がある。次いで得られた懸濁液は乾燥、好ましくはスプレードライされて、易流動性粉末を形成する。前記のように、このようなアルミニウム塩吸着免疫原の乾燥は免疫原を変性せず、しかもアルミニウム塩アジュバントを分解しないことがわかり、実際に予備実験からの結果では免疫原の免疫原性がこのような粉末処方で高まることを示している。発明の第二態様によれば、制御又は遅延放出マイクロカプセル化ワクチンの製造プロセスが提供される。このプロセスでは、生分解性ポリマーが溶解された連続有機相中に、好ましくはアジュバントと共にワクチン免疫原を乳化させるが、それらはすべて水相中である。次いでこの油中水型エマルジョンは、アジュバントと共に免疫原の少くとも１種の、但し好ましくは多くのポケットを取り囲んだポリマーの連続マトリックスを含んだ微小球を形成するように、適切な条件下でスプレードライされる。このプロセスによれば、スプレードライ前に形成されるエマルジョンは、前記先行技術の遅延放出ワクチン組成物の製造で作られた水中油型エマルジョンと対照的に、油中水型エマルジョンであることが注記される。上記プロセスの修正法において、微小球は有機溶媒中ポリマー溶液中における微粒子免疫原の懸濁液である微小滴をスプレードライすることにより作られるが、その微粒子抗原はポリマー溶液に溶解していない形であり、好ましくはここで記載された安定な粒状形をした即時放出ワクチン製剤である。本発明のワクチン製剤は、例えば破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳抽出ワクチン、インフルエンザウイルス等を含めた、人及び獣用ワクチン双方で知られる様々な免疫原に関して使用に適している。本発明で用いられる生分解性ポリマーは、非水相中に存在でき、生物適合性であり、インビボで遅延分解できる、いかなるポリマー物質であってもよい。適切なポリマーには、例えばポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物及びシアノアクリレートと一部のタンパク質及び多糖類を含めた様々な天然ポリマーがある。本発明による使用に特に適したポリマーにはＤ-、Ｌ-及びＤＬ-ポリ乳酸（Ｄ-ＰＬＡ、Ｌ-ＰＬＡ、ＤＬ-ＰＬＡ）及びポリグリコール酸（ＰＧＡ）のホモポリマーとそれらの様々なコポリマー（ＰＬＧ）がある。好ましくは、油中水型エマルジョンの形成には、１種以上の乳化剤が使われ、適切な乳化剤には例えばツイーン（Tween）８０、スパン（Span）８５と様々なレシチン及びレシチン誘導体がある。本発明による遅延放出ワクチン製剤中への配合に適したアジュバントには、既に記載されたアルミニウム塩アジュバント（水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム）だけでなく、ワクチン分野で周知の他の粒状及び非粒状アジュバントがある。適切なアジュバントは、例えばCox及びCoulter，1992により記載されている。本発明のワクチン製剤及びその製造方法に関する他の特徴は、下記非制限例から明らかであろう。例１即時放出破傷風ワクチンの製造破傷風菌（Clostridium tetani）を無タンパク質カゼイン加水分解産物培地で６日間培養したところ、約６０Lf/ml（インビトロフロキュレーション単位）の破傷風毒素が生産された。細菌細胞及び残屑を遠心により除去し、その後毒素を濃縮し、３０，０００ＭＷカットオフ限外濾過膜で洗浄した。ホルムアルデヒド及びリジン溶液を各々０．３及び０．９％w/vの最終濃度まで加え、トキソイド化を３７℃で２週間続けた。得られたトキソイドを硫酸アンモニウム沈降により精製した。破傷風トキソイドを、連続攪拌下でアルミニウムアジュバントの懸濁液への抗原のゆっくりした添加により、アルミニウム塩アジュバント（水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム）に吸着させた。攪拌を一夜続けた。水酸化アルミニウムゲルはSuperfos，Denmarkから“アルヒドロゲル”（Alhydrogel）として販売されていた。リン酸アルミニウムゲルはリン酸三ナトリウムでの塩化アルミニウムの溶液の逆滴定により作った。所望時に、安定剤を５０％（w/v）の濃度まで水に溶解し、その後吸着された破傷風トキソイドに加えて、表１で示された必要な最終濃度にした。アルミニウム塩吸着破傷風トキソイドの水性懸濁液を８０psi（約５．６kg/cm² ）の噴霧圧力及び６０℃の出口温度において４０／１００／１２０同軸タイプノズル装備のドライテック・コンパクト・ラボラトリー・スプレー・ドライヤー（Drytec Compact Laboratory Spray Dryer）でスプレードライした。得られた微小球は直径約３μｍ程度の大きさを有し、これを易流動性粉末として集めた。例２即時放出ジフテリアワクチンの製造ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）は、０．２％（w/v）の全窒素含有率を有するように修正されたカゼイン加水分解産物を配合して、１．５％（ w/v）マルトースを含有した培地で培養した。種を管で２４時間表面培養物として増殖させ、その後５００mlエルレンマイヤーフラスコ中２５０ml容量に接種し、２００rpmでテーブル回転しながら３５℃ で３日間インキュベートした。毒素を濾過により清澄化して細菌を除去し、限外濾過（５０，０００ＭＷカットオフ）により原容量の１％まで濃縮し、次いでその容量において原容量の半分のＰＢＳで洗浄した。最終精製は２２００Lf/mgタンパク質窒素の純度までセファデックス（Sephadex）Ｇ-１００カラムで行った。操作はCox（1975）で詳細に記載されている。ホルムアルデヒド及びリジン溶液を各々０．３及び０．９％（ w/v）の最終濃度まで加え、トキソイド化を３７℃で４週間続けた。ジフテリアトキソイドを破傷風トキソイドに関して前記されたようにアルミニウム塩アジュバントに吸着させ、アルミニウム塩吸着ジフレリアトキソイドの水性懸濁液を前記のようにスプレードライした（例１）。例３即時放出ボツリヌス菌Ｃ＆Ｄワクチンの製造ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）株Ｃ及びＤをSterne（1958）から修正されたセロファン袋装置で増殖させた。袋外部の増殖培地は修正コーン浸漬培地であって、透析袋内においてＰＢＳで平衡化させた。ボツリヌス菌の種培養物をＰＢＳに接種し、嫌気性条件下３７℃で１８日間インキュベートした。次いで透析袋の内容物を回収し、細胞を遠心除去し、ホルムアルデヒドを０．５％（w/v）の最終濃度まで加えた。トキソイド化を３７℃で完了（７〜１４週間）まで続け、効力をBritish Pharmacopoeia-Veterinary（1985）で記載されたように調べた。ボツリヌストキソイドタイプＣ及びＤをクイル（Quil）Ａ（Superfos）と混合し、破傷風トキソイドに関して前記されたようにスプレードライした（例１）。例４百日咳菌由来ＰＴＤ即時放出ワクチンの製造百日咳菌（Bordetella pertussis）の培養物を、振盪フラスコ中において１mg /ml ２，６-ジメチルβ-シクロデキストリンを含有した修正Stainer及びSholte 培地（Stainer & Sholte，1970）で増殖させた。フラスコは、約２．０×１０¹⁰ 生物/mlの細胞密度に達したとき、１８０rpmで４２時間静かに攪拌しながら３７ ℃でインキュベートした。百日咳毒素（ＰＴＸ）を濾過で清澄化後に培養上澄から精製した。ＰＴＸを本質的にSekuraら（1985）で記載されたようにアフィニティクロマトグラフイーでアシアロフェチュインと特異的に結合させ、洗浄し、その後ｐＨ９．０の５０mM トリス／４Ｍ尿素緩衝液で溶出させた。ＰＴＸは、反応が９mMリジンの添加で終結したとき、ｐＨ９．６で２．５mMグルタルアルデヒドの存在下４℃で４８時間かけてトキソイド化させた。その方法は本質的にオーストラリア特許明細書第６０１４１５（７１５８１／８７）号で記載されたとおりであった。得られた百日咳トキソイド（ＰＴＸ）をアルミニウム塩アジュバントに吸着させ、前記のようにスプレードライした。例５遅延放出破傷風ワクチンの製造Ａ．エマルジョン操作ポリラクチド及びポリグリコリド（ＰＬＧ）の５０：５０及び８５：１５コポリマーとポリ乳酸（ＰＬＡ）のホモポリマーをＵＳＡ、アラバマ州、バーミンガムのバーミンガム・ポリマー社（Birmingham Polymers Ltd.）から得た。コポリマーをクロロホルム又はトリクロロエチレン５部及び１，１，２-トリクロロエタン３部の混合液に１０％w/v溶解率まで溶解させた。これらポリマー溶液の各々について、エマルジョンを下記のように作った：（a）ポリマー溶液９３部に大豆レシチン１部及びアルミニウム塩吸着破傷風トキソイドの水性懸濁液６部を加えるか、又は（b）ポリマー溶液８８部にツイーン８０及びスパン８５の１：５混合物１部とアルミニウム塩吸着破傷風トキソイドの水性懸濁液１１部を加えた。アルミニウム塩吸着破傷風トキソイドの水性懸濁液の調製法は前記例１で記載されている。混合液を超音波プローブ又は高速ブレンダー〔例えば、シルバーソン（Silverson）ブレンダー〕で激しく攪拌して、ミルク様粘稠性及び外観の安定な油中水型エマルジョンを得た。このエマルジョンを３０psi（約２．１kg/cm² ）の噴霧圧力及び３５℃の出口温度において４０／１００／１２０同軸タイプノズル装備のドライテック・コンパクト・ラボラトリー・スプレー・ドライヤーでスプレードライした。得られた微小球は直径３０μｍ程度の大きさを有し、これを易流動性粉末として集めた。微量の残留有機溶媒を真空蒸発により除去した。いくつかの製剤を下記可変要素を考慮して作った：（a）ポリマーの選択 -５０：５０ＰＬＧ８５：１５ＰＬＧＰＬＡ（b）アジュバントの選択-水酸化アルミニウム -リン酸アルミニウム（c）安定剤の選択 -０、０．５及び５．０％トレハロースＢ．懸濁操作：ポリマー溶液を前記セクションＡで記載されたように調製し、その後例１で記載されたように調製された粒状即時放出アルミニウム塩吸着破傷風トキソイドの微小球を最終１％w/v懸濁液に加えた。混合液を十分に攪拌して均一懸濁液を維持し、前記セクションＡで記載されたように３０μｍ程度の粒度までスプレードライした。一部の実験では、アルミニウム塩アジュバントの不在下で小さな微小球にスプレードライされた破傷風トキソイドを同様にポリマー溶液に懸濁し、大きな微小球は前記のようにスプレードライした。例６エマルジョン操作による遅延放出ボツリヌス菌Ｃ＆Ｄの製造ＰＬＧの５０：５０及び８５：１５コポリマーとホモポリマーＰＬＡをジクロロメタンに１０％w/vまで溶解した。これらポリマー溶液の各々について、油中水型エマルジョンを下記のように作った：ポリマー溶液８８部にツイーン８０及びスパン８５の１：５混合物１部とボツリヌス菌Ｃ及びＤとクイルＡの水性混合液１１部を加えた。混合液を高速ブレンダーで激しく攪拌し、その後１５psi（約１．１kg/cm²）の噴霧圧力及び６５℃の入口温度において６０／１００／１２０ノズル装備のドライテック・コンパクト・ラボラトリー・スプレー・ドライヤーで直ちにスプレードライした。得られた微小球は直径約２０μｍの大きさを有し、これを易流動性粉末として集めた。微量の残留有機溶媒を真空蒸発により除去した。例７インプラント中への微小球の配合本発明の微小球粒子は、特に家畜及び同伴動物の皮下組織中への埋込み用に、インプラントに形成してもよい。この方法は簡単で容易にパッケージ化される装置で多数の微小球を送達する利点を有している。インプラントは、特定のワクチン又は活性免疫原にとり望ましい放出を行わせるために、“即時”放出微小球、 “遅延放出微小球”又は遅延及び即時放出微小球双方の規定混合物を含有していてよい。これらのインプラントは通常円柱形であり、標準製薬打錠操作により作キストロース、リジン及びステアリン酸マグネシウムのような様々な賦形剤を、圧縮及び打錠プロセスを助けるために加えてもよい。崩壊剤〔例えば、デンプンも埋込み時における微小球の分散特徴を増すために加えてよい。インプラントの大きさは１回当たりに要求される微小球の量に応じて変わるが、通常直径２〜４ mm及び長さ３〜１０mmの範囲である。更にポリマーコーティングも、埋込み後に活性免疫原の放出を促進又は遅延させるために、インプラントに適用してよい。例８Ａ．ワクチン製剤の試験（a）インビトロ試験リン酸アルミニウムゲルを最終濃度１０％w/vのクエン酸ナトリウムを含有した塩水に２mgＡｌＰＯ₄／mlまで希釈により溶解させた。サンプルを一夜又は完全に透明になるまで３７℃でインキュベートした。この処理で、既に結合したタンパク質分子が下記アッセイのために遊離された水溶液を得た。破傷風プロトトキシン精製された破傷風プロトトキシンを自己分解の開始前に回収された破傷風菌の細胞から抽出により得た。好ましくは、細胞を接種後７２〜９０時間目に回収し、直ちに４℃で冷却し、その温度で後の処理中保った。培養物を１０，０００ｇで２５分間遠心し、０．１５ＭＮａＣｌで２回洗浄し、その後１mMフェニルメチルスルホニルクロリド（ＰＭＳＦ）、１mg/mlペプスタチン及び１mg/mlロイペプチンを含有した１ＭＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．５に原容量の１／３０まで再懸濁した。１６時間後、抽出されたプロトトキシンを遠心により細胞残屑から分離した。初回プロトトキシン精製は沈降、４０％飽和硫酸アンモニウム、その後１mMPＭＳＦと各１mg/mlのペプスタチン及びロイペプチンを含有したｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸緩衝液への再懸濁によった。最終精製はＦＰＬＣの陰イオン交換カラムにおいてこの緩衝液で行った。ジフテリア毒素例２で記載されたような純度２２００Lf/mgタンパク質窒素の精製ジフテリア毒素ボツリヌスＣ及びＤ毒素ボツリヌス毒素を濾過により清澄化し、その後濃縮し、限外濾過（５０，０００ＭＷカットオフ）により部分的に精製した。百日咳ＰＴＸＰＴＸを例４で記載されたように精製した。最終純度は９９％を超えていた。酵素イムノアッセイ精製された抗原をｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムで１０μg/ml（約５Lf/ml）に希釈し、４℃で一夜ポリスチレンプレート〔マキシゾルブ社（Max isorb/NUNC），デンマーク〕をコートするために用いた。このインキュベート後に、内容物を吸引し、ウェルを２０℃で１時間にわたりｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中カゼイン溶液（１mg/ml）で後コートした。内容物を再び捨て、ウェルを安定化溶液ですすぎ、その後プレートを乾燥し、密封金属ホイルポーチで貯蔵した。すべての血清希釈はカゼインを含有したＰＢＳツイーン希釈液、ブルーデリューアント（Blue Diluent）（ＣＳＬ、オーストラリア）で行った。試験サンプルを２０℃で６０分間インキュベートし（０．１ml／ウェル）、ＰＢＳツイーンで６回洗浄し、その後西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）-複合化ヒツジ抗マウスＩｇ、ヒツジ抗ウマＩｇ又はウサギ抗ヒツジＩｇと共に同様にインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性をＨ₂Ｏ₂及びテトラメチルベンジジンを含有した基質溶液０．１ml／ウェルの添加により測定した。室温で５分間後、反応を０．０５ml／ウェル０．５ＭＨ₂ＳＯ₄の添加により停止させた。吸光度読取りは自動ＥＩＡプレートリーダーにより４５０nmで行った。１１５IU/mlの副標準血清の滴定がすべてのプレートに含まれていた。（b）インビボ試験ナイーブマウスに全部で０．１〜１．０Lfの破傷風トキソイドと各１μgのジフテリアトキソイド及びＰＴＤを皮下投与した。マウスから規則的間隔で眼採血し、それらの血清抗体レベルを前記の有効なアッセイを用いてＥＩＡにより試験した。ヒツジに２cpu/回のボツリヌスＣトキソイド、２１．８cpu/回のボツリヌスＤトキソイド及び０．４mgのクイルＡを含有した二価ボツリヌスを投与した。ウマに１０Lf/回の破傷風トキソイドを筋肉内経路で投与した。Ｂ．即時放出製剤の結果表１は例１に従い作られたいくつかの微小球即時放出ワクチン製剤に関するインビトロ及びインビボ試験データについて示している。群７は陽性コントロールであった；１００の力価がバックグラウンドと考えられる。水酸化又はリン酸アルミニウムいずれかに吸着された破傷風トキソイドと一緒に５％トレハロースの含有で、インビトロ活性の保持率が高くて免疫原性の減少がない微小球を形成できたことがわかる（群２及び６）。表２は微小球即時放出ジフテリアトキソイド（ＤＴ）及び百日咳ＰＴＤワクチンに関するマウスのインビボ試験データについて示している。すべての場合において、乾燥微細粒状ワクチンは、乾燥時にゼロ喪失という仮定に基づき同用量レベルで投与されたときに、それが作られた液体ワクチンと少くとも同じくらい免疫原性であったことがわかる。表３は微小球即時放出破傷風ワクチンに関するウマのインビボ試験データについて示している。結果は２回目投与後４週目の二次力価を示している（投与は４週間隔で行った）。すべてのウマは一次免疫後４週目に血清反応陰性であった。乾燥ワクチンで追加免疫されたウマ（ウマ１、２及び７）は、液体ワクチン追加免疫をうけたウマ（ウマ８）よりも良い力価を平均して有することがわかる。表４はクイルＡで補助された微小球即時放出ボツリヌスＣ＆Ｄワクチンに関するヒツジのインビボ試験データについて示している。１群動物５匹に投与した。２回の乾燥即時放出ワクチン投与は、１２週間の試験期間にわたり、２回の普通液体ワクチン投与と同一結果を示したことがわかる（群２cf.群１）。Ｃ．遅延放出製剤の結果表５はいくつかの微小球遅延放出ワクチンに関するインビボ試験について示している。陰性コントロールである群１を除き、すべてのマウスに１Lf破傷風トキソイドを投与した。群２は陽性コントロール（液体アルミニウム吸着破傷風トキソイド）であり、群３は未吸着抗原である。群４〜７は懸濁操作により、群８〜１３はエマルジョン操作により調製した。実質的遅延放出応答は、特に群９、１１及び１３でみることができる。表６はいくつかの微小球遅延放出ワクチンに関するインビボ試験について示している。これらのワクチンは抗原安定剤としてトレハロース（５％w/v）を用いて作り、マウスに１回当たり０．１Lf破傷風トキソイドを投与した。すべてのワクチンを1回の投与で与え、特定時期にアッセイ用に採血した。結果は、液体又は乾燥いずれかだけで即時放出ワクチンをうけた群（群１〜３）で応答する腐蝕と比較して、すべての遅延放出ワクチンで有意な遅延放出応答を示す。表３はウマにおける破傷風トキソイドワクチンの結果について示している。１回の即時放出ワクチン投与（ウマ９及び１０）では８週間の研究期間にわたりウマで検出しうる抗体レベルを誘導できなかったことがわかる。逆に、即時及び遅延放出成分双方を含有したワクチンを１回投与したウマ（ウマ３〜６）は遅延放出の結果として８週目に明確な抗体力価を示した。８週目の力価は２回のワクチン投与をうけたウマの場合ほど高くなかったが、力価はより長く続くことが予想される。表４はヒツジのボツリヌスＣ及びＤワクチン投与の結果について示している。１回の遅延放出ワクチン投与は、それら自体（群３及び４）で及び即時放出ワクチンと組合せると、２回の即時放出ワクチン投与に匹敵して、１回の即時放出ワクチン投与から予想される場合をかなり超えた力価を１２週目に有することがわかる。この結果がアジュバントとしてクイルＡを用いて得られたことも更に重要である。例９スプレードライを用いた懸濁経路による制御放出ワクチンの製造この方法はトキソイド懸濁液の少量サンプル、典型的には１０ml中０．６〜１ｇ又は６０ml中１．６〜２ｇで用いたが、これは標準スプレードライヤーでは処理できない。このような少量を処理できる特別なスプレードライヤーを設置し、圧電力超音波ノズル〔ソノテック社（Sono-Tek Corp.）モデル８７００-１２０ＭＳ〕を用いてスラリーを噴霧した。このノズルの利点は、少量の物質を集めることを困難にする大きな空間と表面を要する多量の二次液の使用又は高圧の使用なしに小滴を作れることである。そのユニットに熱気、冷気及びフィルター源を設けた。熱気は噴霧スプレーを運んで、水を蒸発させた。次いで冷気は乾燥サンプルをフィルター上に集める前に熱気と混合させた。１１cm径フィルターの底を真空源に接続した。装置に３つの熱電対、即ちノズル近くの上部に１つ、装置の中央に１つ及びフィルターに１つがあった。２タイプのサンプル、（１）各ボトルが無発熱物質水１２ml中にＡｌＰＯ₄０．６ｇを含有した、ＡｌＰＯ₄に吸着された３０，０００Lf破傷風トキソイドの “飽和”調製液、及び（２）無発熱物質水６０ml中ＡｌＰＯ₄１．６５ｇに吸着された３０，０００Lf破傷風トキソイドの“飽和／３”調製液を処理した。双方のサンプルは無菌であった。攪拌条件下で加えられたスラリーの供給速度は１〜３ml/minであった。１２０khzで作動するノズルの電力は約７ワットであった。フィルターを真空の水銀で６に、冷気を５００cm³/minにセットした。典型的な熱電対読取りはノズル近くの上部で６３〜８６℃、中央で８３〜８５℃及び収集フィルター近くの底部で４６〜５８℃であった。製品の顕微鏡写真では、希釈された方のサンプルで５〜２０ミクロン球及び濃縮された方のサンプルで１０〜３０ミクロンを示した。固体回収率は４０〜７０％であった。 “飽和”サンプルからの製品を３分割し、各々固体物０．８６５ｇであった。溶媒２００ml中各ポリマー２０ｇの３つの溶液を作った。ポリ（ＤＬ-ラクチド）（０．５g/dlで内部粘度０．７３）及び８５／１５ポリ（ＤＬ-ラクチド-コグリコリド）（０．５g/dlで内部粘度０．６５）をトリクロロエチレン５部、１，１，２-トリクロロエタン３部に溶解し、５０／５０ポリ（ＤＬ-ラクチド-コグリコリド）（０．５g/dlで内部粘度０．７１）をクロロホルム５部、１，１，２ -トリクロロエタン３部に溶解した。固体物を溶液に分散し、３０分間攪拌してから、２０psi（約１．４kg／cm²）で２液ノズル〔スプレーイング・システムズ（Spraying Systems）、液体キャップ４０１００、空気キャップ１２０〕でスプレーした。それを室温空気中にスプレーし、乾燥後に布フィルターで回収した。粒子を１０４ミクロン篩で分けた。 “飽和／３”サンプルからの製品も本質的に同様に処理したが、但しこの場合にはサンプル１．５ｇを各最終スプレーランに使い、したがってトキソイド固体物対ポリマーの比率は“飽和”ケースの０．９６５対２０の代わりにこのケースでは１．５〜２０であった。例１０スプレードライエマルジョン技術によるポリラクチドカプセル化トキソイドの製造バーミンガム・ポリマーズ社供給のポリ（ＤＬ-ラクチド）（内部粘度０．７３g/dl）２０ｇを磁気スピン棒で一夜攪拌することによりトリクロロエチレン１０５ml及びトルエン７０mlの混合液に溶解させた。ドキュセートナトリウムとしても知られるジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（２．０ｇ）を溶解が完了するまで攪拌しながら加えた。アルミニウム塩吸着破傷風トキソイドの飽和水性懸濁液（１２ml）をポリマー溶液に細流で加え、スピン棒で攪拌した。更に、超音波プローブもいれて、この少量の溶液で安定なエマルジョン調製のために必要な剪断を加えた。混合液をスプレードライ室内にいれられた２液スプレーノズルにシリンジで約３０ml/minで供給した。スプレー室への入口温度は環境であり、ノズル圧力は２０psiで制御した。製品を乾燥後に出口フィルターソックスから取り出した。参考文献: １．Cox，J．C.及びCoulter，A．R.（1992），″Advances in adjuvant techn ology and application″（アジュバント技術及び適用の進歩）in Animal Paras ite Control Utilising Biotechnology，ed．W．K．Yong，CRC Press Inc.，Boc a Raton，Florida，pp．49-112．２．Eldridge，J．H.，Hammond，C．J.，Meulbroek，J．A.，Staas，J．K.，G illey，R．M.及びTice，T．R.，Controlled vaccine release in the gut-assoc iated lymphoid tissues．I．0rally administered biodegradable microsphere s target the Peyer's patches（腸関連リンパ組織における制御ワクチン放出．Ｉ．経口投与された生分解性微小球はパイアー斑を標的にする），J．Control． Release，11，205，1990．３．Eldridge，J．H.，Staas，J．K.，Meulbroek，J．A.，McGhee，J．R.，Ti ce，T．R.及びGilley，R．M.，Biodegradable microspheres as a vaccine deli very system（ワクチンデリバリーシステムとしての生分解性微小球），Mol．Im munol.，28，287，1991．４．Kreuter，J.，Large-scale production problems and manufacturing of nanoparticles in Specialized Drug Delivery Systems（特殊薬物デリバリーシステムにおける大規模生産問題及びナノ粒子の製造），Manufacturing and Prod uction Technology，Tyle，P.，Ed.，Marcel Dekker，New York，1990，257．５．O'Hagan，D．T.，Jeffery，H.，Roberts，M．J．J.，McGee，J．P.及びDa vis，S．S.，Controlled release microparticles for vaccine development（ワクチン開発用の制御放出微粒子），Vaccine，9，768，1991．６．Singh，M.，Singh，A.及びTalwar，G．P.，Controlled delivery of diph theria toxoid using biodegradable poly（D，L-lactide）microcapsules（生分解性ポリ（Ｄ，Ｌ-ラクチド）マイクロカプセルを用いたジフテリアトキソイドの制御デリバリー），Pharm．Res.，8，958，1991．７．Bodmeier，R.及びCheng，H.，Preparation of biodegradable poly（±） lactide microparticles using a spray-drying technology（スプレードライ技術を用いた生分解性ポリ（±）ラクチド微粒子の製造），J．Pharm．Pharmacol. ，40，754，1988．８．Cox，J.，New methods for the large-scale preparation of diphtheria toxoid：Purification of toxin（ジフテリアトキソイドの大規模製造のための新規方法：毒素の精製），App．Microbiol.，29，464，1975．９．Sterne，M.，The growth of Brucella abortus strain 19 in aerated di alysedmedium（通気透析培地中ブルセラ・アボータス株１９の増殖），J．Gen． Micro.，18，747，1958．１０．British Pharmacopoeia-Veterinary（1985），Her Majesty's Statione ryOffice，London．１１．Stainer，D.及びSholte，M.，A simple chemically defined medium fo r the production of Phase I Bordetella pertussis（Ｉ期百日咳菌の生産のための簡単な化学的に規定された培地），J．Gen．Micro.，63，211，1970．１２．Sekura，R．D.，Zhang，Y．I.及びQuentin-Mi1let，M-J．B.，Pertussi s toxin：Structural elements involved in the interaction with cell（百日咳菌毒素：細胞との相互作用に関与する構造要素），Pertussis toxin．Ed．Sek ura et al.，Academic Press，p．45，1985．

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月２２日【補正内容】この面において、本発明は、上記生分解性ポリマーを溶解させた連続有機相中に免疫原と場合によりアジュバントを含む水性懸濁液のエマルジョンを形成し、その後油中水型エマルジョンをスプレードライして、別々の免疫原含有部分を含むポリマーの連続マトリックスを含んだ上記微小球粒子を形成するステップを含む、前記のように安定な乾燥粒状形の制御又は遅延放出ワクチン製剤の製造方法も提供する。別の方法において、これらの微小球粒子は、上記生分解性ポリマーを溶解させた連続有機相中、粒状免疫原含有物質、好ましくは広く前記されるような安定な粒状形の即時放出ワクチン製剤と場合によりアジュバントの懸濁液をスプレードライして、別々の免疫原含有部分を含むポリマーの連続マトリックスを含んだ上記微小球粒子を形成することにより作られる。これら２つのプロセスは、例えばEldridgeら，1991、O'Haganら，1991、Singh ら，1991及びBodmeier & Cheng，1988で既に記載された方法よりも大きな利点を示す。Eldridgeら，1991及びBodmeier & Cheng，1988のプロセスにおいて、タンパク質はＰＬＧを溶解するために要求される有機溶媒に直接暴露される。結果的に、抗原は変性され、ほとんどの抗原は水溶性であるため、配合効率は乏しくなる。O'Haganら，1991及びSinghら，1991ではこれらの欠点を克服するために試みられる複雑なプロセスを考案した。いずれのプロセスも商業的規模にできず、加えて前者は乏しい配合効率を示し、後者は多量の外来タンパク質の注入を要した。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１２月２０日【補正内容】発明の概要本発明の第一面によれば、アルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んでなる安定な乾燥粒状形の即時放出ワクチン製剤が提供され、上記粒子はスプレードライすることにより製造された微小球粒子である。本発明のこの面によれば、アルミニウム塩吸着免疫原の水性懸濁液を形成して、その懸濁液をスプレードライするステップを含む、上記のような安定な乾燥粒状形をした即時放出ワクチン製剤の製造方法も提供される。類似製剤のフリーズドライ又は凍結乾燥はCsizerら（ＵＳ特許第４５７８２７０号）により記載されている。このプロセスはいくつかの欠点を有しており、最も重要なことはアルミニウムゲル構造の部分的保持が達成できるようにデキストラン及びタンパク質双方を多量に加える必要性である（各々４０及び６〜４mg/m l）。タンパク質のこの多量添加はアルミニウムゲルからワクチン抗原をはずすように作用することがあり、加えてほとんどの場合に免疫原性であり、結果的にワクチン抗原に対する免疫応答を台無しにしがちである。凍結乾燥に伴う他の問題は、大規模生産が難しく、設備コストがかなり高くて、得られる製品が易流動性微細顆粒よりもむしろフレークを形成し易いことである。意外にも、アルミニウムゲルのゲル形成性質は、安定化効果を発揮しうるいかなる他の物質（最少量のワクチン抗原、典型的には１〜１０μg/mlは別にする）の非存在下であってもスプレードライ中に完全に保持される。スブレードライ粉末への水の添加により、出発物質と類似した沈降性質で、典型的ゲルを即時に形成する。本発明の第二面によれば、安定な乾燥粒状形で制御又は遅延放出ワクチン製剤が提供され、その粒子は別々の免疫原含有部分を含む生分解性ポリマーの連続マトリックスを含んだスプレードライにより製造される微小球粒子である。請求の範囲１．安定な乾燥粒状形の即時放出ワクチン製剤であって、粒子がアルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んだスプレードライにより製造される微小球粒子であることを特徴とする、ワクチン製剤。２．アルミニウム塩アジュバントが水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムである、請求項１に記載のワクチン製剤。３．タンパク質安定剤を更に含んだ、請求項１に記載のワクチン製剤。４．安定剤が糖又は糖誘導体である、請求項３に記載のワクチン製剤。５．安定剤がトレハロース、ラクトース、デキストロース及びグルコサミンからなる群より選択される、請求項４に記載のワクチン製剤。６．粒状形が易流動性粉末である、請求項１に記載のワクチン製剤。７．アルミニウム塩吸着免疫原の水性懸濁液を形成し、その後上記懸濁液をスプレードライするステップを含む、請求項１に記載のワクチン製剤の製造方法。８．粒子が別々の免疫原含有部分を含む生分解性ポリマーの連続マトリックスを含んだスプレードライにより製造される微小球粒子である、安定な乾燥粒状形の制御又は遅延放出ワクチン製剤。９．免疫原含有部分がアジュバントも含んでいる、請求項８に記載のワクチン製剤。１０．免疫原含有部分がアルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んだ粒子を含有している、請求項８に記載のワクチン製剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジェイコブス，アーウィンクレイアメリカ合衆国ミズーリ州、ユーリカ、バレー、トレイル、５ (72)発明者メイスン，ノーバートサイモンアメリカ合衆国ミズーリ州、セント、ルイス、ラントン、ドライブ、645

Claims

【特許請求の範囲】１．アルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んでなる、安定な粒状形の即時放出ワクチン製剤。２．アルミニウム塩アジュバントが水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムである、請求項１に記載のワクチン製剤。３．タンパク質安定剤を更に含んだ、請求項１に記載のワクチン製剤。４．安定剤が糖又は糖誘導体である、請求項３に記載のワクチン製剤。５．安定剤がトレハロース、ラクトース、デキストロース及びグルコサミンからなる群より選択される、請求項４に記載のワクチン製剤。６．粒状形が易流動性粉末である、請求項１に記載のワクチン製剤。７．アルミニウム塩吸着免疫原の水性懸濁液を形成し、その後上記懸濁液をスプレードライするステップを含む、請求項１に記載のワクチン製剤の製造方法。８．粒子が別々の免疫原含有部分を含む生分解性ポリマーの連続マトリックスを含んでなる微小球粒子である、安定な粒状形の制御又は遅延放出ワクチン製剤。９．免疫原含有部分がアジュバントも含んでいる、請求項８に記載のワクチン製剤。１０．免疫原含有部分がアルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んだ粒子を含有している、請求項８に記載のワクチン製剤。１１．生分解性ポリマーがポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマーからなる群より選択される、請求項８に記載のワクチン製剤。１２．生分解性ポリマーを溶解させた連続有機相中に免疫原と場合によりアジュバントを含む水性懸濁液のエマルジョンを形成し、その後油中水型エマルジョンをスプレードライして微小球粒子を形成するステップを含む、請求項８に記載のワクチン製剤の製造方法。１３．エマルジョンが乳化剤を含有している、請求項１２に記載の方法。１４．生分解性ポリマーを溶解させた連続有機相中に粒状免疫原含有物質と場合によりアジュバントとの懸濁液を形成し、その後懸濁液をスプレードライして微小球粒子を形成するステップを含む、請求項８に記載のワクチン製剤の製造方法。１５．粒状免疫原含有物質がアルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んでいる、請求項１４に記載の方法。１６．請求項１〜６のいずれか一項に記載の少くとも１種の即時放出ワクチン製剤を医薬又は獣薬用に許容されるキャリア又は希釈剤と一緒に含んでなるワクチン組成物。１７．請求項８〜１１のいずれか一項に記載の少くとも１種の制御又は遅延放出ワクチン製剤を医薬又は獣薬用に許容されるキャリア又は希釈剤と一緒に含んでなるワクチン組成物。１８．少くとも１種の即時放出ワクチン製剤を安定な粒状形で更に含んでいる、請求項１７に記載のワクチン組成物。１９．即時放出ワクチン製剤がアルミニウム塩アジュバントに吸着された免疫原を含んでいる、請求項１８に記載のワクチン組成物。２０．非経口投与用に適した形をした、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。２１．キャリアが固体キャリアであり、ワクチン組成物が固体ペレット又はインプラントの形をしている、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。２２．請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物の患者への投与からなる、ヒト又は他の動物患者の予防接種方法。