JPH08505520A - 呼吸合胞体ウイルスに対するヒト中和性モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびサブグループＢと結合しこれを中和するヒトモノクローナル抗体およびその断片を開示する。また、該モノクローナル抗体を用いる診断および免疫治療法、ならびに該モノクローナル抗体を産生する細胞系統も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 呼吸合胞体ウイルスに対するヒト中和性モノクローナル抗体 本願は、１９９２年９月１６日出願の米国特許出願第０７／９４５，５１５号 の一部継続出願である。 発明の背景 １．発明の分野 本発明は一般には免疫学の分野に関し、特に呼吸合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉ ｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）と結合してこれを 中和するヒトモノクローナル抗体に関する。 ２．関連技術の記載 ＲＳＶは小児気道の主要なウイルス病原体であり、肺炎および細気管支炎の主 因であった。米国だけでも重症または致死的ＲＳＶ疾患を発症する危険性の高い かなり多数の幼児および子供（約１０万〜２０万人）がいる。危険性の高い者に は気管支肺形成障害、先天性心臓疾患、嚢胞性繊維症、腫瘍または各種の免疫不 全をもつ幼児や子供、ならびに骨髄移植前の免疫抑制された成人を含む（例えば 、Mclntosh and Chanock（1990）Virology，2nd edn．（Fields and Knipe編集 ）Raven Press，Ltd.，New York，pp.1045-1072）。 抗体がＲＳＶ感染と疾患に対する耐性を媒介することがいくつかの証拠により 示されている。第１に、重症疾患の危険性が高い場合には、ＲＳＶに対する母親 のＩｇＧ抗体濃度と、生後数カ月 間の幼児の感染に対する耐性との間に相関がある（Ogilvie et ａl.，J．Med．V irol.，7:263，1981）。第２に、高濃度のＲＳＶ中和抗体を含む回収されたヒト ＩｇＧまたはＲＳＶ中和性マウスモノクローナル抗体は、予防的に投与すると肺 感染から小動物を保護し、また治療的に投与すると最高のＲＳＶ感染にある小動 物や実験霊長類の肺の中のウイルス力価を低下させることができる（Walsh et a l.，Infectin and Immunity，43:756，1984；Prince et al.，J．Virol.，55:51 7，1985；Prince et al.，Virus Research，3:193，1985；Prince et al.，J．V irol.，63:1851，1987；Hemming et al.，J．Int．Dis.，152:1083，1985）。第 ３に、高力価のＲＳＶ中和抗体を含む回収されたヒトＩｇＧの臨床研究により、 これらの抗体が幼児および小さい子供の重症のＲＳＶ疾患に治療的効果を示すこ とができるという予備的示唆を提供した（Hemming et al.，Antimicrob．Agnts ．Chemotherap.，31:1882，1987）。これが証明されれば、重症疾患の危険性の 高い幼児を保護するための免疫予防と治療のために、また重症のＲＳＶ下部気道 感染の場合の治療のために、ＲＳＶに対する中和抗体を開発することは極めて興 味深い。 現在のところ、利用できるＲＳＶワクチンはまだない。現在予防的有効性が評 価されている方法は、回収された血漿から調製されたヒトＩｇＧを定期的に静脈 接種しなければならない。必要とするグロブリンが大量（１ｋｇ当たり１〜２ｇ ）であること及び、この物質を秋、冬および初春の間、毎月２〜４時間にわたっ て診療所または病院で静脈内投与する必要性のために、この方法は極めて実用的 でない。 ＲＳＶビリオンの表面上の主な中和抗原は主要糖タンパク質Ｆ（ウイルス融合 ）およびＧ（付着）である。免疫アフィニティー精製されたＦまたはＧ糖タンパ ク質に対して調製された単一特異性抗血清は、ＲＳＶを高い有効性で中和する（ Walsh et al.，J．Gen．Microbiol.，67:505，1986）。Ｇではなく、Ｆに対する 抗血清もまた、ＲＳＶ−感染細胞の、近隣非感染細胞への融合を阻害する。 回収されたヒト血漿調製物よりも大きな特異的活性をもつヒトＲＳＶ抗体調製 物を開発する必要性がある。この問題を有効に解決する可能性としては、ＲＳＶ に対するヒトモノクローナル抗体の利用があるであろう。ポリクローナル抗血清 とは対照的に、ＲＳＶ−特異的モノクローナル抗体はその性質上、高濃度の特異 的抗体を含む。したがって、モノクローナル抗体の使用は予防または治療に必要 とするグロブリンの量を数桁の規模で減少するであろう。その結果、有効量のモ ノクローナル抗体を長期にわたって静脈内（ＩＶ）よりもむしろ筋肉内（ＩＭ） 投与できる。危険性の高い幼児の予防には抗体を病院でＩＶ投与する必要がなく 、家庭でＩＭ投与できる。治療に必要とするグロブリンの量の減少は、初期の軽 症のＲＳＶ下部気道疾患をもつ患者に抗体をＩＭ投与して治療することにより入 院を避けることもできる。さらに、モノクローナル抗体の特異的活性の増加と、 それに伴う必要な治療濃度の減少、ならびにこのような抗体を肺に直接導入する ときの治療有効性の増加により、エアゾール治療が可能となる。実際、エアゾー ル投与には、ＲＳＶモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）₂断片で十分である。有 用な抗体調製物は、これらの抗原サブグル ープＡおよびＢの両者を含む広範なＲＳＶ単離物を中和することもできる。これ らＡおよびＢの２つのサブグループは、時期によってさまざまな比率で集団の間 を同時に循環し、Ｆ糖タンパク質では５０％、Ｇ糖タンパク質では１−５％関連 すると推定されている（Mclntosh and Chanock，上掲）。 過去数年間で、これまでの方法を２つの点で変更することによりＲＳＶ感染に 対する局所的免疫療法の有効性が増加した。第１に、この糖タンパク質の主要保 存中和エピトープに対するＲＳＶ Ｆマウスモノクローナル抗体の混合物がコッ トン（ｃｏｔｔｏｎ）ラットにおけるＲＳＶ感染の局所的免疫療法に有効である ことが示された。第２に、ＲＳＶポリクローナル抗体を小顆粒エアゾール（２μ ｍ以下）で直接肺内に送達することも治療的に有効であった。モノクローナル抗 体の使用は、治療に必要なＩｇＧの量を少なくとも２桁の規模で減少するはずで ある。コットンラットを用いる別の研究で、パラインフルエンザウイルス３型（ ＰＩＶ３）抗体も気道に直接投与すると治療的であることが示された。局所的免 疫療法の有用性はＲＳＶに限定されない。このアプローチは、病原体の影響が下 部気道の管腔に並ぶ細胞に限定されるその他の呼吸性ウイルス病原体にも有効で あるだろう。 発明の概略 本発明は、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびＢと 結合してこれを中和するヒトモノクローナル抗体、ならびにこれらモノクローナ ル抗体を産生する細胞系統を提供する。本発明はさらに、これらモノクローナル 抗体のパラトープに中和機能を付与し、ＲＳＶと特異的に結合してこれを中和す るそ の他の抗体を同定するために免疫原性的に使用しうるアミノ酸配列を提供する。 本発明のモノクローナル抗体は、ＲＳＶ疾患の診断および免疫療法用試薬として 特に有用である。 本発明のモノクローナル抗体の主な利点は、これらがヒトポリヌクレオチド配 列によってコードされるという事実による。したがって、本発明のモノクローナ ル抗体をＲＳＶ疾患の診断および免疫療法にインビボで使用すると、異種または キメラ由来のモノクローナル抗体が使用されるときに通常遭遇する問題である、 受動投与された抗体に対するかなりの宿主免疫応答の問題を大いに減少する。 本発明の抗体は、肺に直接投与するとＲＳＶ疾患の改善に特に有効である。驚 くべきことに、Ｆａｂ断片でこのことが事実であることが見いだされた。ＲＳＶ 抗体を直接肺に局所送達することは、ＲＳＶ疾患の治療に抗体を非経口投与する よりも大きな利点をもつ。前者の経路で送達される抗体は治療において８０−１ ６０倍有効であり、これによって治療に必要な抗体の量を８０−１６０の係数で 減少する。治療に必要な抗体の量をさらに減少することは、ヒトモノクローナル 抗体または“ヒト化”マウスモノクローナル抗体を用いることにより達成され、 その結果、治療に必要な量をさらに２５−５０の係数で減少することができる。 このことは、ＲＳＶ感染の処置にモノクローナル抗体を肺に直接投与すると、非 経口処置で治療するために必要な抗体の全体量を２０００−８０００の係数で減 少することができることを意味する。呼吸ウイルス感染に対してＦａｂ断片をイ ンビボで使用できることは、抗体分子全体を用いるのに比べて以下の有意な利点 を有す る：（１）組織浸透性が大きい；（２）Ｆｃと関連する炎症などのエフェクター 機能を回避する；及び（３）迅速なクリアランス。 呼吸ウイルス感染の治療におけるＦａｂ断片のインビボ治療の有効性は以下の 事実からすると驚くべきことであり、予期せぬことである：（１）Ｆａｂは非共 有結合性であり、単一の部位に結合することができるのみであり、したがってウ イルス中和のために通常必要と考えられる別のウイルス粒子とのクロスリンクが 排除されること；および（２）補体カスケード及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣ Ｃ）に影響するためにはウイルスクリアランスにＦｃ部分が必要であると考えら れてきたこと。ＲＳＶと特異的に結合するＦａｂ断片の肺投与がＲＳＶ感染の改 善に有効に使用しうるという予期せぬ知見に基づいて、インビボでのウイルス増 殖が気道の管腔表面で起こるあらゆるウイルス感染にこの教示を広く適用するこ とが可能である。 図面の簡単な説明 図１は、ラムダＨｃ２発現ベクターを示す。 図２は、Ｌｃ２発現ベクターを示す。 図３は、ｐＣｏｍｂ組み合わせファージミドベクターの模式構造を示す。 図４は、クローン１３、１９、１１、および無作為に選択されたその他の４つ のクローンのＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインを示す。 図５ａは、ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサー要素（ｈＣＭＶ Ｐ／Ｅ）の 転写制御下にシグナルペプチド（ｓ．ｐ．）と融合させたカッパＬ鎖の発現に用 いるベクターを示し、ポリアデニル化はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配 列（ｐｏｌｙ Ａ）によって提供される。このプラスミドはＣｏｌＥ１複製起点（ｏｒｉ）と大 腸菌中での選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）とをもつ。シグナルペ プチドをコードするＤＮＡリンカー配列および成熟タンパク質の最初の３つのＮ 末端アミノ酸（１文字表記）を下に示す。矢印はシグナルペプチド切断部位を示 す。３番目のアミノ酸は用いるリンカーによりＱまたはＥである。ＳａｃＩ部位 はｐＥＬ １０ ＣＱで破壊されるので、これをカッコに示す。 図５ｂは、ＩｇＧｌ Ｈ鎖の発現に用いるベクターであるｐＥＨ．１０Ｃを示 す。不変部へのクローン化Ｆｄの融合に用いたＣγ１ドメインのＢｓｔＥII部位 を示す。Ｌ鎖構築物の特徴に加えて、このベクターは真核細胞での選択用ネオマ イシン耐性（ｎｅｏＲ）遺伝子をもつ。 発明の詳細な説明 本発明は、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびＢに 特異的かつこれを中和するヒトモノクローナル抗体に関する。本発明の好ましい 態様では、ＲＳＶの糖タンパク質Ｆのエピトープポリペプチド配列と結合するこ とのできるヒトモノクローナル抗体を開示する。また、これらの抗体によってウ イルスが結合されたときにＲＳＶの中和を付与するアミノ酸配列を開示する。こ の特異性はヒトモノクローナル抗体および同様の特異性を有するヒトモノクロー ナル抗体をＲＳＶ疾患の診断および免疫療法に用いることを可能にする。 ”ＲＳＶ疾患”の用語は、ＲＳＶによって直接または間接に引き起こされるす べての疾患、ならびにＲＳＶによる感染に患者を かかり易くする疾患を意味する。前者の範疇に入る疾患の例には、肺炎および細 気管支炎を含む。後者の範疇に入る疾患（すなわち、患者を重症のＲＳＶ感染の 危険にさらすような疾患）には、嚢胞性繊維症、先天性心臓疾患、癌、および一 般に臓器移植を受ける患者や未熟児のような免疫抑制状態または免疫系の機能低 下の段階を引き起こすすべての症状を含む。 ある面においては、本発明はＲＳＶ中和部位と反応性である組み合わせ由来の ヒトモノクローナル抗体、およびこのような抗体を産生する細胞系統に関する。 本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞系統の単離は、興味の対象であるモ ノクローナル抗体の一次反応パターンの決定ができる慣用のスクリーニング法を 用いて実施できる。したがって、試験すべきヒトモノクローナル抗体がＲＳＶの 抗原性サブグループＡおよびＢと結合してこれを中和するならば、試験すべきヒ トモノクローナル抗体と本発明の細胞系統によって産生されるヒトモノクローナ ル抗体とは均等である。 また、過度の実験を行うことなく、あるヒトモノクローナル抗体が、本発明の ヒトモノクローナル抗体のＲＳＶへの結合を妨げるか否かを確認することによっ て、前記のあるヒトモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特 異性をもつかを決定することができる。もし、試験すべきヒトモノクローナル抗 体が、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合を減少させることによって示 されるように、本発明のヒトモノクローナル抗体と競合するならば、これら２つ のモノクローナル抗体は、同じかまたは密接に関連するエピトープと結合する可 能性が高い。あるヒ トモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性をもつか否か を決定する更に別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体とこれが通常反応 性であるＲＳＶとを前培養し、次いで試験すべきヒトモノクローナル抗体を加え て、試験すべきヒトモノクローナル抗体がＲＳＶへの結合能力において阻害され るかを決定することである。もしも試験すべきヒトモノクローナル抗体が阻害さ れるならば、本発明のモノクローナル抗体と同じか、あるいは機能的に均等なエ ピトープ特異性をもつ可能性が高い。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリ ーニングもＲＳＶを用い、モノクローナル抗体がＲＳＶを中和するか否かを決定 することによって実施することができる。 本発明のヒトモノクローナル抗体を用いることによって、ヒトモノクローナル 抗体をスクリーニングしてその抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ結 合特異性をもつか否かを同定するために使用することができ、かつ、活発な免疫 感作にも使用できる抗イディオタイプ抗体を作製することが今度は可能となる（ Herlyn et al.，Science，232:100，1986）。このような抗イディオタイプ抗体 は、周知のハイブリドーマ手法を用いて作製できる（Kohler and Milstein，Nat ure，256:495，1975）。抗イディオタイプ抗体は興味の対象である細胞系統によ って産生されるヒトモノクローナル抗体上に存在する特有の抗原決定基を認識す る抗体である。これらの抗原決定基は抗体の超可変領域に位置する。特定のエピ トープと結合するのはこの領域であり、したがって抗体の特異性を担う部分であ る。抗イディオタイプ抗体は興味の対象であるモノクローナル抗体を動物に免疫 感作することによって 調製できる。免疫された動物は免疫抗体のイディオタイプ抗原決定基を認識して これに応答し、これらイディオタイプ抗原決定基に対する抗体を産生する。第２ の動物を免疫感作するのに用いられた細胞系統によって産生される本発明のヒト モノクローナル抗体に特異的な、免疫された動物の抗イディオタイプ抗体を用い ることにより、免疫感作に用いられたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイ プをもつ別のクローンを同定することが今度は可能となる。２つの細胞系統のヒ トモノクローナル抗体間のイディオタイプの同一性は、２つのモノクローナル抗 体が同じエピトープ抗原決定基の認識に関して同じであることを示すものである 。したがって、抗イディオタイプ抗体を用いることにより、同じエピトープ特異 性をもつモノクローナル抗体を発現するその他のハイブリドーマを同定すること が可能である。 さらに、抗イディオタイプ手法を用いてエピトープを模倣するモノクローナル 抗体を作製することも可能である。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して 作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、この第１モノクローナル抗 体によって結合されるエピトープの”イメージ”（image）である超可変領域中 に結合ドメインをもつであろう。したがって、抗イディオタイプモノクローナル 抗体結合ドメインは抗原として有効に作用するので、抗イディオタイプモノクロ ーナル抗体を免疫感作に用いることができる。 本発明で使用する”抗体”という用語は、エピトープ抗原決定基と結合するこ とのできる全体の分子、ならびにＦａｂやＦ（ａｂ’）₂などのようなその断片 を含む。本発明においては、Ｆａ ｂ断片が好ましい。Ｆａｂは治療様式としてＦ（ａｂ’）₂や全免疫グロブリン 分子に比べていくつかの利点を有している。第１に、Ｆａｂは同種抗原に対する 結合部位を１つしかもたないので、免疫複合体の形成が排除されるが、二価のＦ （ａｂ’）₂や全免疫グロブリン分子が標的抗原と遭遇するとこのような複合体 が形成される。組織中に免疫複合体が蓄積すると好ましくない炎症反応をもたら すので、この点は重要である。第２に、ＦａｂはＦｃ領域をもたないので、補体 カスケードの開始のようなＦｃによって活性化される好ましくない炎症反応を引 き起こすことができない。第３に、小さいＦａｂ分子の組織浸透性は、大きい全 体抗体よりもはるかに良好である。第４に、Ｆａｂは大腸菌などの細菌中で容易 かつ安価に生産することができるが、全免疫グロブリン抗体分子を有用な量で生 産するには哺乳動物細胞を必要とする。後者の場合には、免疫グロブリン配列を 哺乳動物細胞にトランスフェクションして形質転換する必要がある。次いで、こ れらの配列の増幅を厳密な選択工程によって実施し、安定な形質転換体を同定し て維持しなければならない。全免疫グロブリン分子は、血清含有培地の問題が付 随する培養で安定に形質転換された高発現細胞によって生産されなければならな い。これとは対照的に、大腸菌中でのＦａｂの生産はこれらの困難性を排除し、 細胞培養由来の生成物よりも安価な抗体断片を大きな発酵器中で生産することが できる。 Ｆａｂに加えて、ＲＳＶの少なくとも１つのエピトープ、好ましくはＲＳＶの 糖タンパク質Ｆに結合特異性をもつ小さい抗体断片およびエピトープ結合ペプチ ドも本発明に含まれ、ウイルスを 中和するために使用することもできる。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに付与された米 国特許第４，９４６，７７８号（そのすべてを参照により本明細書に包含する） 記載の方法によって１本鎖抗体を構築できる。１本鎖抗体は可動性リンカー部分 で結合されたＬ鎖およびＨ鎖の可変領域を含む。更に小さいのは、単離されたＶ Ｈ単一ドメインを含む単一ドメイン抗体として知られる抗体断片である。それが 由来する全体の抗体の結合特異性の少なくともいくつかをもつ単一ドメイン抗体 を得る方法は当業者に公知である。例えば、Ｗａｒｄらの“大腸菌から分泌され る各種の単一免疫グロブリン可変ドメインの結合活性”（Nature 341:644-646） は、単離形でこれに結合する標的エピトープへの十分な親和性をもつ抗体Ｈ鎖可 変領域（ＶＨ単一ドメイン抗体）を得るためのスクリーニング法を開示する。 本発明のモノクローナル抗体は、例えば液相または固相担体と結合して使用で きる免疫アッセイに、インビトロで使用するのに適している。さらに、これらの 免疫アッセイでのモノクローナル抗体は各種方法で検出しうるように標識できる 。本発明のモノクローナル抗体を用いることのできる免疫アッセイの型の例とし ては、直接または間接法の競合または非競合免疫アッセイがある。このような免 疫アッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ （免疫）アッセイがある。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、 生理学的試料の免疫組織学的アッセイを含む、順、逆、または同時モードのいず れで行うこともできる免疫アッセイを用いて実施できる。当業者には過度の実験 を行うことなくその他の免疫アッセイ法を知り、認 識することができる。 本発明のモノクローナル抗体は多種類の担体に結合させてＲＳＶの存在の検出 に用いることができる。公知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または 修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含む。本発明 の目的にとっては、担体の性質は可溶性または不溶性いずれでもよい。当業者は モノクローナル抗体を結合するその他の適当な担体を知っており、または慣用の 実験によってこれらを確認できるであろう。 多種類の標識および標識方法が当業者に公知である。本発明で使用できる標識 の型の例としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、コロイド状金属、化学発光 物質、および生物発光物質を含む。当業者であれば本発明のモノクローナル抗体 に結合するためのその他の適当な標識を知っており、または慣用の実験によって これらを確認できるであろう。さらに、本発明のモノクローナル抗体へのこれら の標識の結合は、当業者に公知の標準法を用いて行うことができる。 本発明の目的のためには、ＲＳＶが生物学的液体および組織中に存在するとき は、これを本発明のモノクローナル抗体によって検出できる。検出しうる量のＲ ＳＶを含むいかなる試料でも用いうる。試料は尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清 及びその類似物などの液体でも、また組織、糞及びそれらの類似物などの固体ま たは半固体でも、あるいは組織学的診断で通常用いられる固体組織でありうる。 より感度のよい結果が得られる別の標識法は、抗体を低分子量のハプテンと結 合することからなる。これらのハプテンは、次に第２の反応で検出できる。例え ば、アビジンと反応するビオチン、あるいは特定の抗ハプテン抗体と反応できる ジニトロフェノール、ピリドキサールまたはフルオレセインなどのハプテンが通 常用いられる。 本発明で用いるように、“エピトープ”の用語は、抗体のパラトープが結合す る抗原上のあらゆる抗原決定基を意味する。エピトープ抗原決定基は、通常アミ ノ酸や糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常特異的な三次元 構造特性と特異的電荷特性とをもつ。 本発明のアッセイに用いる物質はキット調製に理想的に用いうる。このような キットは、バイアル、チューブなどの１以上の容器手段を密に収納すべく区切ら れたキャリア手段からなり、各容器手段は、この方法で用いる分離された要素の １つを含む。例えば、容器手段の１つは検出しうるように標識されたか、または 標識されうる本発明のヒトモノクローナル抗体を含みうる。キットはまた緩衝液 を含む容器および／または酵素標識または蛍光標識などのレポーター分子と結合 したアビジンまたはストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質のような レポーター手段からなる容器を含む。 抗原のインビボ検出に本発明のヒトモノクローナル抗体を用いるには、検出し うるように標識されたモノクローナル抗体を診断的有効量で投与する。”診断的 有効量”という用語は、検出しうるように標識されたヒトモノクローナル抗体の 量が、該モノクロ ーナル抗体が特異的なＲＳＶ抗原をもつ部位の検出を可能にするのに十分な量で 投与されることを意味する。 投与する、検出しうるように標識されたヒトモノクローナル抗体の濃度はＲＳ Ｖへの結合がバックグランドと比較して検出するのに十分なように投与すべきで ある。さらに、最良の標的−バックグランドの信号比を得るために、検出しうる ように標識されたモノクローナル抗体は循環系から迅速に除去されることが望ま しい。 結果として、インビボ診断用の、検出しうるように標識されたヒトモノクロー ナル抗体の投与量は年齢、性別、個々人の疾患の程度により異なる。ヒトモノク ローナル抗体の投与量は約０．０１ｍｇ／ｍ²〜約５００ｍｇ／ｍ²、好ましくは ０．１ｍｇ／ｍ²〜約２００ｍｇ／ｍ²、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ²〜約 １０ｍｇ／ｍ²で変更しうる。このような投与量は例えば、複数の注入をするの か、組織、およびその他の当業者に公知の要因により変更できる。 インビボでの診断用画像化では、利用できる検出装置の型が用いる放射性同位 体を選択するうえでの主要な要因である。選択する放射性同位体は用いる装置で 検出しうる崩壊形をもつものでなければならない。インビボ診断の放射性同位体 を選択する際のさらに別の重要な要因は、放射性同位体の半減期が、標的による 最大取り込み時間においても検出可能である程度に長く、しかし宿主への有害な 放射線が最小になる程度に十分短いことである。理想的には、インビボ画像化に 用いる放射性同位体は粒子放射がなく、しかし１４０−２５０ｋｅＶの範囲で慣 用のガンマカメラで 容易に検出しうる多数の光子を生成するものである。 インビボ診断では放射性同位体は中間体官能基（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を用いて直接または間接に免疫グロブリン と結合することができる。金属イオンとして存在する放射性同位体を免疫グロブ リンと結合するのによく用いられる中間体官能基は、ジエチレントリアミン五酢 酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）や同様の分子などの 二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体と結合できる金属イオ ンの典型例は、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、および²⁰¹ Ｔ１である。 インビボ診断の目的のために、本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像 化（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）の場合のように、常磁性同位体で 標識することもできる。一般に、診断画像化を可視化するあらゆる慣用の方法を 用いることができる。通常、カメラ画像化にはガンマおよび陽電子放射の放射性 同位体が用いられ、ＭＲＩには常磁性同位体が用いられる。このような方法で特 に有用な元素は¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒおよび⁵⁶Ｆｅを含む。 本発明のヒトモノクローナル抗体はインビボおよびインビトロでＲＳＶ疾患の 治療過程をモニターするのに用いることができる。したがって、例えばＲＳＶで 感染された細胞数の増加または減少、あるいは体内または各種体液中にに存在す るＲＳＶ濃度の変化を測定することにより、ＲＳＶ疾患の改善を目的とする治療 法が有効であるか否かを決定することが可能となる。 ヒトモノクローナル抗体はＲＳＶ疾患に免疫治療的にも使用で きる。本明細書でモノクローナル抗体について使用する“免疫治療的”または“ 免疫治療”という用語は、予防的および治療的投与の両方を意味する。したがっ て、モノクローナル抗体は、ＲＳＶ疾患の可能性および／または重症度を軽減す るために危険性の高い患者に投与したり、あるいは既に活発なＲＳＶ感染を発症 した患者に投与することができる。 本発明では、インビトロでＲＳＶを中和するＦａｂ断片がインビボでＲＳＶ感 染を処置するのに治療的に使用できるという驚くべき発見によって、その他の肺 性ウイルス感染にも同様のアプローチが使用できることを示唆する。したがって 、広い意味においては、本発明はウイルスを中和するＦａｂ断片を、インビボで 該ウイルスによって引き起こされ、該ウイルスの増殖が宿主の気道の管腔に限定 されるような感染の治療に使用することを包含する。このようなウイルスは、イ ンフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、および コロナウイルス、ならびに本明細書の実施例に示すようにＲＳＶを含む。その他 の肺性ウイルスに特異的なＦａｂ断片の同定は、過度の実験を行うことなく慣用 の中和アッセイを用いて当業者により実施できる。 本発明のモノクローナル抗体の投与量の範囲は、ＲＳＶ疾患の症状が改善され 、あるいは感染の可能性を減少するという所望の効果をもたらすのに十分な量で ある。投与量は高粘稠度（ｈｙｐｅｒｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）症候群、肺水腫、う っ血性心不全及びその類縁などの副作用を引き起こすほど多くてはならない。一 般に、投与量は年齢、症状、性別、および患者の重症度により変更し、当業者に より決定される。あらゆる合併症があった場合には、 投与量は個々の医師により調整される。投与量は、１日１回以上の投与回数で、 １日又は数日にわたって、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好まし くは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．２ｍｇ／ ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで変更しうる。好ましいのは、出現からウイルス複製の “後戻り”を避けるために、２−５日またはそれ以上続けて抗体を投与すること である。 本発明のヒトモノクローナル抗体は、注入による非経口投与または時間をかけ た漸次注入によって投与できる。本発明のヒトモノクローナル抗体は静脈内、腹 腔内、筋肉内、皮下、洞内、または経皮投与できる。治療的に用いるときは、本 発明のヒトモノクローナル抗体の好ましい投与経路は肺エアゾールである。本発 明の抗体を含むエアゾール送達系を調製する方法は当業者に周知である。一般に 、このような系はパラトープ結合能などの抗体の生物学的性質を有意に損なわな いような成分を用いるべきである（例えば、Sciarra and Cutie，Aerosols，Rem ington Pharmaceutical Sciences，18th edition，1990，pp.1694-1712を参照： この文献は参照としてここに包含する）。当業者は過度の実験を行うことなく抗 体エアゾールを製造する各種パラメーターおよび条件を容易に決定できる。 非経口投与用製剤は、滅菌の水性または非水性溶液、懸濁液および乳剤を含む 。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、 オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが ある。水性担体には水、食塩水および緩衝液を含むアルコール／水性溶液、乳剤 ま たは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロ ース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または不揮発 油を含む。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充物、電解質補充物（リンゲ ルデキストロースを基礎とするものなど）及びその類縁物などを含む。保存料お よびその他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス 及びその類縁物なども含めてよい。 本発明はまた、本発明のヒトモノクローナル抗体を含む、ＲＳＶ疾患の免疫治 療用薬剤または医薬組成物を製造する方法にも関する。 本発明の好ましい態様は、そのＨ鎖がＣＤＲ３中でポリペプチドＡＰＩＡＰＰ ＹＦＤＨ（配列番号１）、ＨＬＰＤＹＷＮＬＤＹＴＲＦＦＹＹＭＤＶ（配列番号 ２）、およびこれらのペプチドの保存性変異体を含むヒトモノクローナル抗体に 関する。ＲＳＶの糖タンパク質Ｆ中のエピトープ配列と結合し、かつこれと結合 したときにＲＳＶの中和を行うある種のアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる 。本明細書で用いる“保存性変異体”の用語は、アミノ酸残基を別の生物学的に 類似のアミノ酸で置換することを意味する。保存性変異体の例としては、イソロ イシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンなどのごとき１つの疎水性残基を 別のもので置換、又は極性残基を別のもので置換、例えばアルギニンをリシンで 置換、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換、若しくはグルタミンをアスパラギ ンで置換する及びその類縁などを含む。“保存性変異体”の用語はまた、置換さ れたポリペプチドをもつ抗体もＲＳＶを中和するという条件で、非置換の親アミ ノ酸の代 わりに置換アミノ酸を使用することを含む。同様に、本発明の別の好ましい態様 は、上記のＨ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこれらのポリ ヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列に関する。相補的ポリヌクレ オチド配列は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチ ド配列とハイブリダイズする配列を含む。 本発明の好ましいベクターは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（１ ）原核細胞分泌シグナルドメイン、（２）異種ポリペプチド、および（３）繊維 状ファージ膜アンカードメインを含む融合ポリペプチドをコードし、かつこれを 発現できるヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。ベクター は融合ポリペプチドを発現するＤＮＡ発現制御配列、好ましくは原核細胞制御配 列を含む。 繊維状ファージ膜アンカーは、繊維状ファージ粒子のマトリックスと会合して 、これによって融合ポリペプチドをファージ表面に導入することのできるｃｐII IまたはｃｐVIIIコートタンパク質のドメインが好ましい。 分泌シグナルは、グラム陰性菌のペリプラズム膜に対するタンパク質を標的と するタンパク質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルはｐ ｅｌＢ分泌シグナルである。エルウィニア・カロトバ（Erwinia carotova）由来 の２つのｐｅｌＢ遺伝子産物変異体からの分泌シグナルドメインの予測されるア ミノ酸残基配列が、Ｌｅｉら（Lei et al.，Nature，331:543-546，1988）によ り記載されている。ｐｅｌＢタンパク質のリーダー配列は融合タンパク質の分泌 シグナルとして以前に使用されてい る（Better et al.，Science，240:1041-1043，1988；Sastry et al.，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，86:5728-5732，1989；Mull inax et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，87:8095-8099，1990）。本発明で使用しうる大腸菌由来の他の分 泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列が、Ｏｌｉｖｅｒ（Neidha rd，F．C．編集，Escherichia coli and Salmonella typhimurium，American So ciety for Microbiology，Washington，D．C.，1:56-69，1987）に記載されてい る。 ベクター用の好ましい膜アンカーは繊維状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄおよび 均等な繊維状ファージから得られる。好ましい膜アンカードメインは遺伝子III 及び遺伝子VIIIによってコードされるコートタンパク質中に見られる。繊維状フ ァージコートタンパク質の膜アンカードメインは、コートタンパク質のカルボキ シ末端領域の部分であり、脂質二重層膜をスパニング（spanning）する疎水性ア ミノ酸残基の領域と、膜の細胞質表面に通常見られ、膜から伸長する荷電したア ミノ酸残基の領域を含む。ファージｆ１においては、遺伝子VIIIコートタンパク 質の膜スパニング領域は、Ｔｒｐ−２６からＬｙｓ−４０までの残基を含み、細 胞質領域は４１から５２のカルボキシ末端１１残基からなる（Ohkawa et al.，J ．Biol．Chem.，256:9951-9958，1981）。膜アンカーの例は、ｃｐVIIIの２６か ら４０残基からなる。したがって、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基 配列はＭ１３繊維状ファージ遺伝子VIIIコートタンパク質（ｃｐVIIIまたはＣＰ ８とも呼ぶ）に由来する。遺伝子VIIIコートタンパク質は、典型的にはコートタ ンパク質の約２５００から３０００コピーをもつファージ粒子の大部分以 上の成熟繊維状ファージ上に存在する。 さらに、別の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維 状ファージ遺伝子IIIコートタンパク質（ｃｐIIIとも呼ぶ）に由来する。遺伝子 IIIコートタンパク質は、典型的にはコートタンパク質の約４から６コピーをも つファージ粒子の一端にある成熟繊維状ファージ上に存在する。繊維状ファージ 粒子の構造の詳細な説明、そのコートタンパク質および粒子構造については総説 （Rached et al.，Microbiol．Rev.，50:401-427，1986；Model et al.，“The Bacteriophages：Vol.2”，R．Calendar編集，Plenum Publishing Co.，pp.375- 456，1988）を参照されたい。 ＤＮＡ発現制御配列は、構造遺伝子産物を発現するためのＤＮＡ発現シグナル のセットを含み、既に周知のように、シストロンが構造遺伝子産物を発現できる ようにシストロンに機能的に結合した５’および３’要素の両方を含む。５’制 御配列は転写開始のためのプロモーター、および翻訳可能なＤＮＡ配列を上流の ５’末端で機能的に結合したリボゾーム結合部位を規定する。 大腸菌で高レベルの発現を達成するには、大量のｍＲＮＡを生成するための強 力なプロモーターのみならず、ｍＲＮＡが効率よく翻訳されることを確実にする ためのリボゾーム結合部位を必要とする。大腸菌では、リボゾーム結合部位は開 始コドン（ＡＵＧ）、および開始コドンから３−１１ヌクレオチド上流に位置す る３−９ヌクレオチドの長さの配列を含む（Shine et al.，Nature 254:34，197 5）。シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれる配列：ＡＧＧＡＧＧＵは大 腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端 と相補的である。ｍＲＮＡへのリボゾームの結合およびｍＲＮＡの３’末端での 配列はいくつかの要因に影響される： （１）ＳＤ配列と１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の相補性の程度。 （２）ＳＤ配列とＡＵＧの間にある距離と、おそらくはＤＮＡ配列（Roberts et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:760，1979a；Roberts et al.，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 76:5596，1979b；Guarente et al.，Science 209:1428，19 80及びGuarenteet al.，Cell 20:543，1980）。この距離が系統的に変化するプ ラスミド中における遺伝子の発現レベルを測定することにより、最適のものが得 られる。種々のｍＲＮＡを比較すると、（ＡＵＧのＡの位置を０とした場合）− ２０から＋３０の位置からの配列が統計的に好ましいことが示された（Gold et al.，Annu．Rev．Microbiol.，35:365，1981）。リーダー配列が翻訳に劇的に影 響することが示された（Roberts et al.，1979a，上掲）。 （３）リボゾーム結合に影響する、ＡＵＧに続くヌクレオチド配列（Taniguchi et al.，J．Mol．Biol.，118:533，1978）。 ３’制御配列は、異種融合ポリペプチドとともに、及び、これと機能的に結合 した、フレーム中の少なくとも１つの終止（ストップ）コドンを規定する。 好ましい態様においては、使用するベクターは原核細胞複製起点またはレプリ コン、すなわち形質転換する細菌宿主細胞などの原核宿主細胞中で、組換えＤＮ Ａ分子の染色体外での自動的複製と維持を指示する能力をもつＤＮＡ配列を含む 。このような複製起点は当業者に周知である。好ましい複製起点は宿主細胞中で 効 率よいものである。好ましい宿主細胞は大腸菌である。大腸菌中でベクターを使 用するための好ましい複製起点はｐＢＲ３２２で見られるＣｏｌＥ１およびその 他の各種慣用のプラスミドである。ｐＡＣＹＣで見られるｐ１５Ａ複製起点やそ の誘導体も好ましい。ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは分子生物学でよく 使用されており、各種プラスミドで使用でき、また少なくともＳａｍｂｒｏｏｋ ら（Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Har bor Laboratory Press，1989）により記載されている。 ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは、別のレプリコンが同じ大腸菌細胞中 の第２のプラスミドに存在しても、それぞれ大腸菌中でプラスミドの複製を指示 する能力をもつので、本発明で使用するのに特に好ましい。言い換えると、Ｃｏ ｌＥ１およびｐ１５Ａは、同一宿主中で２つのプラスミドの維持を可能にする非 干渉性（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）レプリコンである（例えば、上掲Ｓ ａｍｂｒｏｏｋの１．３−１．４参照）。この特徴は本発明では特に重要である 。なぜなら、ファージ複製を許す１つの宿主細胞が２つの別個のベクター（すな わち、異種融合ポリペプチドの発現のためのベクターと、ヘテロダイマー性レセ プター、この場合ＲＳＶと結合してこれを中和するモノクローナル抗体の発現の ためのベクター）の独立かつ同時の複製をサポートしなければならないからであ る。 さらに、原核細胞レプリコンを含むこれらの態様には、その発現によって形質 転換する細菌宿主に薬剤耐性の如き選択的利点を付与する遺伝子をも含む。典型 的な細菌薬剤耐性遺伝子はアンピ シリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニ コールに対する耐性を付与するものである。ベクターは、典型的には翻訳可能な ＤＮＡ配列の挿入のための慣用の制限酵素部位も含む。ベクターの例には、Ｂｉ ｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手可能 なプラスミドｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびに Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なｐＰＬおよ びｐＫＫ２２３がある。 繊維状ファージ粒子の表面上において、本発明のモノクローナル抗体の如きヘ テロダイマー性レセプターを発現させるためのベクターは、第１および第２のレ セプターポリペプチドの形で翻訳可能な第１および第２のＤＮＡ配列を受け取り 発現するのに適した組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子であり、ここでレセプターポ リペプチドのうちの１つは繊維状ファージコートタンパク質膜アンカーと融合し ている。すなわち、レセプターポリペプチドのうちの少なくとも１つは、繊維状 ファージ膜アンカードメインと原核細胞分泌シグナルドメインとを含む融合ポリ ペプチドである。 ヘテロダイマー性レセプターを発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、ベクタ ー中に存在する２つの別個のカセットに、２つの翻訳可能なＤＮＡ配列を独立に クローニング（挿入）して、へテロダイマー性レセプター、またはヘテロダイマ ー性レセプターを含むポリペプチドのリガンド結合部分の第１および第２ポリペ プチドを発現するための２つの別個のシストロンを形成するための系を提供する 。２つのシストロンを発現するためのＤＮＡ発現べクターをジシストロン（ｄｉ ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクター と呼ぶ。 このべクターは、方向性連結に適したヌクレオチド配列を介して、挿入ＤＮＡ と機能的に結合した上流および下流に翻訳可能なＤＮＡ配列を含む第１カセット を含む。上流の翻訳可能な配列は本明細書で規定する分泌シグナルをコードする 。下流の翻訳可能な配列は本明細書で規定する繊維状ファージ膜アンカーをコー ドする。このカセットは、方向性連結に適したヌクレオチド配列を介して、翻訳 可能な挿入ＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）がカセット中に方向性をもって挿入 されるときに産生されるレセプターポリペプチドを発現させるためのＤＮＡ発現 制御配列を含むことが好ましい。好ましくは繊維状ファージ膜アンカーは、繊維 状ファージ粒子のマトリックスと結合して融合ポリペプチドをファージ表面上に 取り込むことのできるｃｐIIIまたはｃｐVIIIコートタンパク質のドメインであ る。 レセプター発現ベクターはまた、第２レセプターポリペプチドを発現するため の第２カセットを含む。第２カセットは、方向性連結に適したヌクレオチド配列 を介して、カセットの読み取り枠中で少なくとも１つの終止コドンを典型的に規 定するベクターの下流ＤＮＡ配列と３’末端で機能的に結合した、本明細書で規 定する分泌シグナルをコードする第２の翻訳可能なＤＮＡ配列を含む。第２の翻 訳可能なＤＮＡ配列は、５’要素を形成するＤＮＡ発現制御配列と５’末端で機 能的に結合する。第２カセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ） を挿入すると、インサートＤＮＡによってコードされるポリペプチドをもつ分泌 シグナルのレセプターを含む第２融合ポリペプチドを発現することが できる。 上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は上述した原核細胞分泌シグナルをコードする。 ｐｅｌＢ分泌シグナルをコードする上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、レセプター 発現ベクター中に含まれる好ましいＤＮＡ配列である。下流の翻訳可能なＤＮＡ 配列は上述した繊維状ファージ膜アンカーをコードする。したがって、下流の翻 訳可能なＤＮＡ配列は、繊維状ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIコートポリ ペプチドのいずれかの膜アンカードメインに対応する、そして好ましくはこれと 同一のアミノ酸残基配列をコードする。 本発明のＤＮＡ発現ベクター中のカセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（インサ ートＤＮＡ）を挿入すると、適当な宿主中でレセプターポリペプチドを発現する ことができるヌクレオチド配列を形成するベクターの領域である。発現能を有す るヌクレオチド配列をシストロンと呼ぶ。したがって、カセットは上流および下 流に翻訳可能なＤＮＡ配列と機能的に結合したＤＮＡ発現制御要素を含む。シス トロンは、翻訳可能なＤＮＡ配列がこのような目的に適したヌクレオチド配列を 介して上流と下流配列の間に方向性をもって挿入する（方向性連結）ときに形成 される。得られる３つの翻訳可能なＤＮＡ配列、すなわち上流配列、挿入配列お よび下流配列はいずれも同じ読み取り枠内で機能的に結合している。 したがって、ヘテロダイマー性レセプターを発現するためのＤＮＡ発現ベクタ ーは、翻訳可能なＤＮＡ配列をベクターのカセット部分にクローニングして、モ ノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖の如き、ヘテロダイマー性レセプターの第１ および第２レセプターポリペプチドを発現することのできるシストロンを生成す る 系を提供する。異種融合ポリペプチドまたはヘテロダイマー性レセプターのいず れを発現するために用いるときでも、発現ベクターは、適合性宿主中で構造遺伝 子産物を発現できるものとして特徴付けられる。 本明細書中では、“ベクター”の用語は、異なる遺伝子環境間で、それがあら かじめ機能的に結合していた別の核酸を運搬することのできる核酸分子をいう。 好ましいベクターは、それが機能的に結合するＤＮＡ断片中に存在する構造遺伝 子産物を自動的に複製および発現できるものである。したがって、ベクターは上 述したレプリコンと選択マーカーを含むことが好ましい。 ＤＮＡ配列や断片に関してここに使用する“機能的に結合した”という用語は 、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ鎖の１本の鎖と、好ましくは慣用のホスホジエス テル結合によって共有結合されている配列または断片を意味する。当業界で公知 のように、本発明の転写単位またはカセットが機能的に結合するベクターの選択 は、ベクター複製やタンパク質発現などの所望する機能性、ならびに形質転換す る宿主細胞などの組換えＤＮＡ分子を構築する技術に固有の限定条件に直接依存 する。 方向性連結、すなわちポリリンカーに適したヌクレオチド配列は、（１）上流 および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列を複製および運搬するように機能的に結合し 、かつ（２）ＤＮＡ配列の方向性連結のための部位または手段をベクターに提供 するようなＤＮＡ発現ベクターの領域である。典型的には、方向性ポリリンカー は２以上の制限酵素認識配列または制限部位を規定するヌクレオチド配列である 。制限酵素の切断により、２つの部位が付着末端を 生じ、これにより翻訳可能なＤＮＡ配列をＤＮＡ発現ベクターに連結しうる。好 ましくは、制限酵素の切断により２つの制限部位が非相補的な付着末端を提供し て、これにより翻訳可能なＤＮＡ配列がカセットへの方向性挿入が可能になる。 １つの態様においては、方向性連結手段は、上流の翻訳可能なＤＮＡ配列、下流 の翻訳可能なＤＮＡ配列、またはその両者に存在するヌクレオチドによって提供 される。別の態様では、方向性連結に適したヌクレオチド配列は、多方向性クロ ーニング手段を規定するヌクレオチド配列を含む。方向性連結に適したヌクレオ チド配列が多数の制限部位を規定する場所を、多クローニング部位と呼ぶ。 好ましい態様では、ＤＮＡ発現ベクターは、本発明の教示に従って、ゲノムを 封入する繊維状ファージ粒子の形態でデザインすると操作が簡便である。この態 様では、ＤＮＡ発現ベクターは、繊維状ファージ複製起点を規定するヌクレオチ ド配列をさらに含み、その結果、適当な遺伝的相補性が提示されたときに、ベク ターが１本鎖複製形態の繊維状ファージとして複製でき、かつ繊維状ファージ粒 子中にパッケージングされ得る。この特徴は、ＤＮＡ発現ベクターをファージ粒 子中にパッケージングし、ファージ粒子集団を含む他の粒子から、粒子およびそ の中に含まれるベクターを続いて分離することを可能にする。 既に周知のように、繊維状ファージ複製起点は、複製開始部位、複製終止部位 および複製によって産生される複製形態のパッケージング部位を規定するファー ジゲノムの領域である（例えば、Rasched et al.，Microbiol．Rev．50:401-427 ，1986；Horiuchi，J．Mol．Biol．188:215-223，1986参照）。 本発明で使用するための好ましい繊維状ファージ複製起点は、Ｍ１３、ｆ１ま たはｆｄファージ複製起点である（Short et al.，Nucl．Acids Res．16:7583-7 600，1988）。好ましいＤＮＡ発現ベクターは、ジシストロン発現ベクターｐＣ ＯＭＢ８、ｐＣＫＡＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８、ｐＣＯＭＢ３、ｐＣＫＡＢ３、ｐ ＣＯＭＢ２−３およびｐＣＯＭＢ２−３’である。 本発明を十分に開示したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、各 種変更及び修飾がなしうることが当業者には自明であろう。実施例１ ファージ粒子上にヘテロダイマー性レセプターを作製するためのジシストロン発 現ベクターの構築 直接スクリーニングできる多数のＦａｂ抗体断片を作製するためのベクター系 を得るために、Ｈｕｓｅら（Science 246:1275-1281，1989）記載の通りに、バ クテリオファージラムダ中に予め発現ライブラリーを構築した。しかしながら、 これらの系は、Ｂａｒｂａｓら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA33:7978-7982，19 91）が記載するような、発現Ｆａｂに繊維状ファージ粒子の表面を標的とさせる ようなデザイン特徴を含んでいない。 ベクター系選択に用いた主要な基準は、直接スクリーニングできる最も多くの Ｆａｂ断片作製の必要性であった。バクテリオファージラムダは、３つの理由に より発現ベクター開発の出発点として選択された。第１に、ファージＤＮＡのイ ンビトロパッケージングがＤＮＡを宿主細胞へ再導入する最も効率よい方法であ った。第２に、単一ファージプラークのレベルでタンパク質発現を検出すること が可能であった。最後に、ファージライブラリーのスクリーニングは、典型的に は、非特異的結合を伴う困難性をほとんど含まなかった。別のプラスミドクロー ニングベクターは、同定後のクローン分析において有利なのみである。ｐＣｏｍ ｂVIIIなどのジシストロン発現ベクターを使用し、これによってＨ鎖、Ｌ鎖また はＦａｂ発現インサートを含むプラスミドを切り出すことが可能であるので、本 発明の系でもこの利点は失われていない。 ａ．ジシストロン発現ベクターｐＣＯＭＢの構築 （ｉ）ラムダＺａｐ^TMIIの調製 ラムダＺａｐ^TMII、原ラムダＺａｐ（ＡＴＣＣ＃４０，２９８）の誘導体であ って、６つの特有のクローニング部位、融合タンパク質発現、およびファージミ ド（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−）の形でインサートを迅速に切り出す能力を 含む元のラムダＺａｐの特質すべてを保持するが、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを含む多く のＮｏｎ−Ｓｕｐ Ｆ株での増殖を可能にするＳＡＭ １００突然変異を欠く。 ラムダＺａｐ^TMIIはＳｈｏｒｔら（Nuc．Acid Res．16:7583-7600，1988）の記 載するように、ラムダＺａｐを制限酵素ＮｃｏＩで消化して得られる４２５４塩 基対（ｂｐ）のＤＮＡ断片中に含まれるラムダＳ遺伝子を置き換えることによっ て構築した。この４２５４ｂｐのＤＮＡ断片を、ラムダｇｔ１０（ＡＴＣＣ＃４ ０，１７９）を制限酵素ＮｃｏＩで消化した後にラムダｇｔ１０から単離したラ ムダＳ遺伝子を含む４２５４ｂｐのＤＮＡ断片で置換した。ラムダｇｔ１０から 単離した４２５４ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび標準プロトコ ル（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，編集，John W illey and Sons，NY，1987）を用いて、原ラムダＺａｐベクター中に連結し、ラ ムダＺａｐ^TMIIを得た。 （ii）ラムダＨｃ２の調製 大腸菌宿主細胞中で多数のＶ_H−コーディングＤＮＡ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ ）を発現させるために、ラムダＨｃ２と命名するベクターを構築した。このベク ターは以下のものを提供した：正しい読み取り枠内にＶ_H−コーディングＤＮＡ 相同体を入れる能力；Ｓｈｉｎｅら（Nature 254:34，1975）が記載するリボゾ ーム結合部位；ｐｅｌＢ分泌シグナルと命名するペリプラズム空 間に発現タンパク質を方向づけるリーダー配列；既知のエピトープ（エピトープ タグ）をコードするポリヌクレオチド配列；およびＶ_H−コーディングＤＮＡ相 同体と、エピトープタグをコードするためのポリヌクレオチドとの間のスペーサ ータンパクをコードするポリヌクレオチド。ラムダＨｃ２はＨｕｓｅら（Scienc e246:1274-1281，1989）により既に記載されている。 ラムダＨｃ２を調製するために、互いにハイブリダイズして２本鎖の合成ＤＮ Ａ配列を形成する２０−４０塩基の１本鎖ポリヌクレオチド断片をデザインする ことによって上記特徴をすべて含む合成ＤＮＡ配列を構築した。個々の１本鎖ポ リヌクレオチド断片を表１に示す。 各ポリヌクレオチド（０．１μｇ／μｌ）１μｌとＴ₄ポリヌクレオチドキナ ーゼ２０単位を７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール 、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液に加えることによ って、ポリヌクレオチドＮ２、Ｎ３、Ｎ９−４、Ｎ１１、Ｎ１０−５、Ｎ６、Ｎ ７およびＮ８（表１）をキナーゼ反応に付した。 溶液を３７℃に３０分保持し、溶液を６５℃に１０分保持することにより反応を 停止した。２０ｍｇのポリヌクレオチドＮ１およびポリヌクレオチドＮ１２の２ つの末端ポリヌクレオチドを、２０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、 ２．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および５０．０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液１／１０容量 とともに上記キナーゼ反応溶液に加えた。この溶液を７０℃、５分加熱し、水５ ００ｍｌのビーカー中、１．５時間かけて約２５℃ の室温に冷却した。この期間に１０個のポリヌクレオチドすべてをアニールして ２本鎖合成ＤＮＡインサートを形成した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７ ．５、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴ Ｐ）および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に、上記反応液４０μｌを 加えることによって、個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合させて合成ＤＮ Ａインサートを安定化した。この溶液を３７℃に３０分保持し、次いで溶液を６ ５℃に１０分保持することによりＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。上記反応 液５２μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を含 む溶液４μｌを混合することにより末端ポリヌクレオチドをキナーゼ反応に付し た。この溶液を３７℃に３０分保持し、次いで溶液を６５℃に１０分保持するこ とによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。 完成した合成ＤＮＡインサートを、制限酵素ＮｏｔｌとＸｈｏＩであらかじめ 消化しておいた実施例１ａ（ｉ）に記載のラムダＺａｐ^TMIIベクターに直接連結 した。連結混合物をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊａｌｌａ，ＣＡ）から入手 可能なＧｉｇａｐａｃｋ II Ｇｏｌｄパッキング抽出物を用いて製造者の説明 書に従ってパッケージングした。パッケージングした連結混合物を ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に播いた。個々のラムダプラー クを抜き取り、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供されたラムダＺａｐ^TM II用インビボ切り出しプロトコルに従ってインサートを切り出した。このイン ビボ切り出しプロトコルにより、ラムダＨｃ２ベクターからクローン化インサー トをファージミドベクターに移動し、操作と配列決定が容易になった。Ｓａｎｇ ｅｒら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463-5467，1977）の記載するサンガ ージデオキシ法を用い、またＡＭＶ逆転写酵素³⁵Ｓ−ＡＴＰ配列決定キット（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、説明書に従ってインサートの配列決定を行うこ とにより上記クローニング工程の精度を確認した。得られたラムダＨｃ２発現ベ クターを図１に示す。 （iii）ラムダＬｃ２の調製 大腸菌宿主細胞中で多数のＶ_L−コーディングＤＮＡ相同体を発現させるため に、Ｖ_L−コーディング相同体を正しい読み取り枠に入れる能力をもつラムダＬ ｃ２と命名するベクターを構築した。このベクターは、Ｓｈｉｎｅら（Nature 2 54:34，1975）に記載されるように、リボゾーム結合部位をもち；Ｌｅｉら（J． Bac．169:4379，1987）およびＢｅｔｔｅｒら（Science 240:1041，1988）が大 腸菌でＦａｂ断片を分泌させるのに用いて成功した、ｐｅｌＢ遺伝子リーダー配 列をもち；またクローニングのための制限酵素部位を含むポリヌクレオチドをも つ。ラムダＬｃ２はＨｕｓｅら（Science 246:1274-1281，1989）により既に記 載されている。 互いにハイブリダイズして２本鎖の合成ＤＮＡを形成する２０ −６０塩基の１本鎖ポリヌクレオチド断片をデザインすることによって、上記特 徴をすべて含む合成ＤＮＡ配列を構築した。２本鎖合成ＤＮＡ配列中の個々の１ 本鎖ポリヌクレオチド断片（０１−０８）の配列を表２に示す。 各ポリヌクレオチド１μｌ（０．１μｇ／μｌ）とＴ₄ポリヌクレオチドキナ ーゼ２０単位を、７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣ ｌ₂、５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、５００ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む溶液に加えることによって、表２に示すポリヌクレオチドをキナ ーゼ反応に付した。溶液を３７℃に３０分保持し、溶液を６５℃に１０分保持す ることにより反応を停止した。各２０ｎｇの２つの末端ポリヌクレオチドである ０１と０８を、２０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、２．０ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂および１５．０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む溶液の１／１０ 容量とともに上記キナーゼ反応溶液に加えた。この溶液を７０℃、５分加熱し、 水５００ｍｌのビーカー中、１．５時間かけて約２５℃の室温に冷却した。この 期間に８個のポリヌクレオチドすべてをアニールして図３に示す２本鎖合成ＤＮ Ａインサートを形成した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよび１０単位のＴ４ＤＮＡリガ ーゼを含む溶液に、上記反応液４０μｌを加えることによって、個々のポリヌク レオチドを互いに共有結合させて合成ＤＮＡインサートを安定化した。この溶液 を３７℃に３０分保持し、次いで溶液を６５℃で１０分保持することにより、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。上記反応液５２μｌ、１０ｍＭのＡＴＰおよ び Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を含む溶液４μｌを混合することにより、 末端ポリヌクレオチドをキナーゼ反応に付した。この溶液を３７℃に３０分保持 し、次いで溶液を６５℃に１０分保持することによりＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼを不活性化した。 完成した合成ＤＮＡインサートを、制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩであらかじめ 消化しておいた実施例１ａ（ｉ）に記載のラムダＺａｐ^TMIIベクターに直接連結 した。その連結混合物を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＧｉｇａｐａｃ ｋ II Ｇｏｌｄパッキング抽出物を用いて製造者の説明書に従ってパッケージ ングした。パッケージングした連結混合物をＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）に播いた。個々のラムダプラークを抜き取り、製造者（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）によって提供されたラムダＺａｐ^TMIIのためのインビボ切り出しプ ロトコルに従ってインサートを切り出した。このインビボ切り出しプロトコルに より、操作と配列決定を容易にするため、ラムダＬｃ２ベクターからクローン化 インサートをプラスミドファージミドベクターに移動した。ＡＭＶ逆転写酵素³⁵ Ｓ−ｄＡＴＰ配列決定キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて製造者の説明書 に従い、インサートの配列決定を行うことにより、上記クローニング工程の精度 を確認した。得られたＬｃ２ベクターを図２に模式図として示す。 ラムダＬｃ３と命名する本発明で使用するための好ましいベクターは、上記調 製したラムダＬｃ２の誘導体である。ラムダＬｃ２は、ＥｃｏＲＩ制限部位の３ ’側でシャイン−ダルガルノリボゾーム結合部位の５’側に位置するＳｐｅＩ制 限部位（ＡＣＴＡＧＴ）を含む。ＳｐｅＩ制限部位は図１に示すように、ラムダ Ｈｃ２にも存在する。ｐＣｏｍｂと命名する組み合わせベクターを、ラムダＨｃ ２とＬｃ２の部分とを以下の実施例１ａ（iv）に記載するようにともに組み合わ せることによって構築した。得られる組み合わせｐＣｏｍｂベクターは２つのＳ ｐｅＩ制限部位を含ん でおり、このうち１つはラムダＨｃ２により、１つはラムダＬｃ２により提供さ れるものであり、その間にＥｃｏＲＩ部位を含む。２つのＳｐｅＩ制限部位が存 在するにもかかわらず、ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩ付着末端をもつＤＮＡ相同体は、 あらかじめＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで消化しておいたｐＣｏｍｂ発現ベクター中に 方向性をもって連結することに成功した。ＥｃｏＲＩ制限部位が、Ｌｃ２によっ て提供される３’ＳｐｅＩ部位に近いことにより、３’ＳｐｅＩ部位の完全消化 を阻害した。したがって、ｐＣｏｍｂをＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化しても ２つのＳｐｅＩ部位の間にあるＥｃｏＲＩ部位を除去しなかった。 第２のＳｐｅＩ制限部位の存在は、２つの部位の間の領域が除去されるので、 ＳｐｅＩのみによって消化されたｐＣｏｍｂベクターへの連結には好ましくない 。したがって、ラムダＬｃ３と命名される、第２のまたは３’ＳｐｅＩ部位を欠 くラムダＬｃ２の誘導体が、ラムダＬｃ２をまずＳｐｅＩで消化して直鎖状ベク ターを形成することにより作製された。末端を埋めて平滑末端とし、これをとと もに連結してＳｐｅＩ部位を欠くラムダＬｃ３を得た。ラムダＬｃ３は以下に記 載する組み合わせベクターの構築に好ましいベクターである。 （iv）ｐＣｏｍｂの調製 上述したインビボ切り出しプロトコルを用いて、発現ベクターラムダＨｃ２ま たはラムダＬｃ２からファージミドを切り出した。Ｈｏｌｍｅｓら（Anal．Bioc hem.，114:193，1981）によって記載される方法に従って、ファージミド含有細 胞から２本鎖ＤＮＡを調製した。インビボ切り出しで得られるファージミドは、 親ベ クターと同じ抗体断片クローニングおよび発現のためのヌクレオチド配列を含み 、それぞれラムダＨｃ２およびＬｃ２に対応するファージミドＨｃ２およびＬｃ ２と命名された。 ファージミドＨｃ２とファージミドＬｃ２の部分を組み合わせることによって 作製される組み合わせファージミドベクターｐＣｏｍｂの構築のために、ファー ジミドＨｃ２をまずＳａｃＩで消化してＬａｃＺプロモーターの５’側に位置す る制限部位を除去した。直鎖状ファージミドを次にＴ４ポリメラーゼで平滑末端 とし、連結によりＳａｃＩ部位を欠くＨｃ２ファージミドを得た。修飾Ｈｃ２フ ァージミドおよびＬｃ２ファージミドを、次に別々にＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩ で消化して、５’から３’にＳｃａＩ、ｎｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩおよびＥ ｃｏＲＩ制限部位をもつＨｃ２断片、ならびに：５’から３’にＥｃｏＲＩ、Ｓ ａｃＩ、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限部位をもつＬｃ２断片を得た。直鎖状ファ ージミドを次にそれぞれの平滑末端で連結し、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、 ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＡｐａＩおよびＳｃａＩの制限部位を順にも つ環状ファージミドｐＣｏｍｂを形成した。連結したファージミドベクターを次 いで適当な細菌宿主に挿入し、形質転換体を抗生物質アンピシリンで選択した。 選択したアンピシリン耐性の形質転換体を用いて２つのＮｏｔＩ部位の存在を スクリーニングした。得られたアンピシリン耐性の組み合わせファージミドベク ターをｐＣｏｍｂと命名し、その模式的構造を図３に示す。得られた組み合わせ ベクターｐＣｏｍｂは、２つの融合タンパク質を発現するための２つのカセット を もち、かつ５’から３’方向に並ぶ以下の機能的に結合した要素のためのヌクレ オチド残基配列をもつＤＮＡ分子からなる：ＬａｃＺ遺伝子から上流の誘導可能 なＬａｃＺプロモーターからなる第１カセット；ＮｏｔＩ制限部位；リボゾーム 結合部位；ｐｅｌＢリーダー；スペーサー；５’Ｘｈｏおよび３’ＳｐｅＩ制限 部位によって区切られるクローニング領域；デカペプチドタグとそれに続く発現 制御終止配列；発現制御リボゾーム結合部位からなる第２カセットの５’に位置 するＥｃｏＲＩ制限部位；ｐｅｌＢリーダー；スペーサー領域；５’ＳａｃＩお よび３’ＸｂａＩ制限部位で区切られるクローニング領域とそれに続く発現制御 終止配列および第２ＮｏｔＩ制限部位。 ｐＣｏｍｂ３と命名された好ましい組み合わせベクターは、ｐＣｏｍｂの調製 について上述したように、ファージミドＨｃ２とファージミドＬｃ３の部分を組 み合わせることによって構築される。得られる組み合わせベクターｐＣｏｍｂ３ は、第２カセット中の第２ＳｐｅＩ制限部位が除去されている点以外は、ｐＣｏ ｍｂと同じ２つの融合タンパク質を発現するためのｐＣｏｍｂと同じ２つのカセ ットをもつＤＮＡ分子からなる。 ｂ．バクテリオファージコートタンパク質膜アンカーをもつ融合タンパク質を発 現するためのベクターｐＣｏｍｂVIIIおよびｐＣｏｍｂIIIの構築 複数の制限酵素クローニング部位のために、上記で調製したｐＣｏｍｂファー ジミド発現ベクターは、本発明の発現ベクターの調製の修飾に用いうる有用なク ローニングビヒクルである。この目的のために、ｐＣｏｍｂをＥｃｏＲＩおよび ＳｐｅＩで消化し、 次いでホスファターゼ処理をして直鎖状ｐＣｏｍｂを作製した。 （ｉ）ｐＣｏｍｂVIIIの調製 繊維状バクテリオファージコートタンパク質VIII（ｃｐVIII）膜アンカードメ インと、付着ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ末端とを規定するヌクレオチド配列をも つＰＣＲ産物を、直鎖状ｐＣｏｍｂと混合して連結混合物を形成した。ｃｐVIII 膜アンカーをコードするＰＣＲ断片を、対応する付着末端でｐＣｏｍｂファージ ミド発現ベクター中に方向性をもって連結し、ｐＣｏｍｂVIII（ｐＣｏｍｂ８と も呼ぶ）を作製した。ｐＣｏｍｂVIIIは、ｃｐVIII膜アンカーと機能的に結合し たｐｅＩＢ分泌シグナルを含む。 ｐＣｏｍｂ２−VIIIまたはｐＣｏｍｂ２−８と命名する本発明で使用する好ま しいファージミド発現ベクターは、上述したように、ｃｐVIII膜アンカーをコー ドするＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端を介してｐＣｏｍｂ２ ファージミド発現ベクター中に方向性をもって連結することにより調製した。ｐ Ｃｏｍｂ２−８は、１つのＳｐｅＩ制限部位のみをもっていた。 （ii）ｐＣｏｍｂIIIの調製 バクテリオファージｃｐIII膜アンカードメインをコードする配列を用いて、 別のファージミド発現ベクターを構築した。Ｌ鎖発現のための膜アンカーの３’ にあるＬａｃＺプロモーター領域配列と、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端と を含むｃｐIII膜アンカーを規定するＰＣＲ産物を調製した。次いでｃｐIII由来 のＰＣＲ産物を、ただ１つのＳｐｅＩ部位をもつ直鎖状ｐＣｏｍｂ２ベクター中 に連結し、ベクターｐＣｏｍｂ２−３（ｐＣｏｍｂ２−IIIとも呼ぶ）を作製し た。 制限酵素クローニング部位をさらに有する本発明で使用する、より好ましいフ ァージミド発現ベクター（ｐＣｏｍｂ２−III’またはＰＣｏｍｂ２−３’と命 名する）は、Ｓｈｏｒｔら（Nuc．Acid Res．16:7583-7600，1988）によって記 載され、また、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 由来の５１塩基対断片をさらに付加して、ｐＣｏｍｂ２−３について上述したよ うに調製した。ｐＣｏｍｂ２−３’を調製するためには、ｐＣｏｍｂ２−３をま ずＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で消化して直鎖状ｐＣｏｍｂ２−３を作製し た。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを同じ酵素で消化して、ＳＩＩ、ＡｃｃＩ 、ＨｉｎｃII、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄIII，ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩおよ びＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む５１塩基対の断片を取り出した。この５１塩基 対断片をＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ付着末端を介して直鎖状ｐＣｏｍｂ２−３ベク ター中に連結し、ｐＣｏｍｂ２−３’を作製した。実施例２ ＲＳＶ特異的モノクローナル抗体の単離リンパ球ＲＮＡの調製およびライブラリー構築 ＨＩＶ−１血清陽性の骨髄リンパ球からのＲＮＡの調製、ならびにｐＣｏｍｂ ３系を用いるファージ表面上のＩｇＧｌκ Ｆａｂライブラリーの構築は、文献 記載の方法（Burton et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:10134，1991）に より行った。抗原結合性ファージ選択のためのライブラリーのパンニング、可溶性Ｆａｂの調 製、ならびにＦａｂ上清のＥＬＩＳＡスクリーニング 上掲のＢｕｒｔｏｎらの記載するＨＩＶ−１血清陽性ドナーの血清のＥＬＩＳ Ａ分析により、ＲＳＶ ＦＧ糖タンパク質に対して約１：３０００の力価を示し たので、ＥＬＩＳＡウエルにコーティングした組換えＦＧ糖タンパク質（１μｇ ／ウエルのバキュロウイルス発現ＦＧ融合糖タンパク質）に対して同じライブラ リーをパンニングした。ライブラリーのパンニングは文献記載の方法（Barbas e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 33:7978，1991）により行った。パンニン グ４回により溶出ファージ中で約５００倍の増幅をもたらし、特異的抗原結合性 クローンの豊富なことを示唆した。溶出ファージを用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ ｅ細胞を感染した。細胞からのＤＮＡ調製およびファージコートタンパク質遺伝 子III断片のＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ切り出しとそれに続く再連結により、可溶性Ｆ ａｂを作製した。再構築されたファージミドを用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形 質転換して、可溶性Ｆａｂ断片を分泌するクローンを作製した。上掲のＢｕｒｔ ｏｎらによって記載されるように、ペレット化細胞の音波処理によってＦａｂ上 清を調製した。簡単に述べると、カルベニシリン５０μｌ／ｍｌおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含むＳＢ（スパーブロス：１リットル当たりトリプトン３０ｇ、 酵母エキス２０ｇ、ＭＯＰＳ１０ｇ、ｐＨ７）１０ｍｌ中、３７℃でＯＤ₆₀₀が ０．２になるまでクローンを増殖した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍＭを加えて、３７℃で一晩培養物を増殖した。Ｂｅｃ ｋｍａｎ ＪＡ１０ローター中、４℃で４０００ｒｐｍ、１５分遠心することに より細胞をペレット化した。０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを 含むＰＢＳ３ ｍｌ中に細胞を再懸濁し、氷上での音波処理により溶解した（２−４分）。ＪＡ −２０ローター中、１４，０００ｒｐｍ、４℃で数分遠心することにより破片を ペレット化した。上清をＥＬＩＳＡ分析に直接用いた。音波処理の代わりに、凍 結−解凍溶解プロトコルによりＦａｂ上清を調製した。増殖条件は、音波処理に ついて上述したものと同じであるが、ＩＰＴＧ添加後に細胞を２５℃から３９℃ で一晩増殖した。細胞をマイクロヒュージ管中のＰＢＳ１ｍｌに再懸濁し、ドラ イアイスで凍結し、３７℃の水浴で解凍した。凍結−解凍工程を３回繰り返し、 マイクロヒュージ管中で１０分遠心した後、上清を回収した。上清をＥＬＩＳＡ 分析に直接用い、−２０℃で貯蔵した。 Ｆａｂ上清のＥＬＩＳＡスクリーニングは文献記載の方法（Barbas et al.，M ethods:A Comparison to Methods in Enzymol.，Lerner，R．and Burton，D．編 集，2:119，1991）で行った。ＥＬＩＳＡウエルを、ＦＧ−融合糖タンパク質ま たは精製Ｆ糖タンパク質のいずれか０．１μｇでコーティングした。３０クロー ンが増殖し、Ｆａｂ断片を含む上清をＦＧとの反応性について、ＥＬＩＳＡアッ セイでスクリーニングした。これらの陽性クローンのすべてがＦ糖タンパク質と も反応した。ウイルス中和アッセイ ＨＥｐ−２細胞培養物およびプロトタイプサブグループＡ（Ａ２株）ウイルス とサブグループＢ（１８５３７株）ウイルス、ならびに各種起源のサブグループ ＡおよびＢ単離物を用いて、補体−増強プラーク減少法（Coates et al.，J．Ep id.，83:299，1966）により中和活性を測定した。中和抗体の力価はプラーク数 を ６０％減少したＦａｂの最高希釈度として計算した。 プラークアッセイにおいてサブグループＡ ＲＳＶを中和する能力について２ ８個の陽性上清をスクリーニングした。クローン１３と１９のＦａｂ上清がこの ウイルスを高効率で中和し、高濃度のＦａｂがウイルスを完全に中和した（表３ ）。各クローンの３つの別々の上清調製物が、０．９〜２．８ｎＭ、すなわち０ ．０４〜０．１４μｇ／ｍｌのＦａｂがＲＳＶプラーク力価を６０％減少する効 率で、再現性よくＲＳＶを中和した。その他の上清はウイルスを中和するやや弱 い能力をもっていたが、多少のバラツキがあった。これらのクローンの中で最も 一貫した中和作用はクローン１１に観察された。このクローンはＲＳＶを完全に は中和せず、中和効率はクローン１３および１９よりも約１０倍少なかった（表 ３）。Ｆａｂの精製 カルベニシリン５０μｇ／ｍｌおよび２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含むスーパーブ ロスの１リットル培養物を適当なクローンに播種し、７時間後に２ｍＭ ＩＰＴ Ｇで誘導し、３０℃で一晩増殖した。細胞ペレットを音波処理し、上清を５０ｍ ｌに濃縮した。濾過した上清を２５ｍｌのタンパク質Ｇ−抗−Ｆａｂカラムにの せ、緩衝液１２ｍｌで洗浄し（３ｍｌ／分）、クエン酸ｐＨ２．３で溶出した。 次いで中和画分を濃縮し、５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０中に交換し、１ｍｌ／ 分で２ｍｌのＭｏｎｏ−Ｓカラムにかけた。１ｍｌ／分で０−５００ｍＭ Ｎａ Ｃｌの勾配にかけ、２００−２５０ｍＭ ＮａＣｌの領域にＦａｂが溶出した。 濃縮後、そのＦａｂはＥＬＩＳＡによりＦＧに対して滴定すると陽性であ り、１０−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより５０ｋＤに単一バンドを与えた。１． ３５の吸光係数（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて２８０ｎｍで吸光度を測定することに より濃度を決定した。 大腸菌溶菌物からアフィニティクロマトグラフィーにより精製、濃縮したクロ ーン１１、１３および１９のＦａｂも、粗溶解物で観察された効率と同等である がそれよりもやや低い比較的高効率でＲＳＶを中和した。精製、濃縮したＦａｂ がパラインフルエンザ型３ウイルスを中和しなかったという知見により、クロー ン１１及び１９によって示される中和活性の特異性が得られた（表３）。さらに 、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０に対する特異性をもつ精製、濃縮したＦａｂ調製物（ ＥＬＩＳＡ力価１：１５００）はＲＳＶを中和しなかった（表３）。 実施例３ 各種ＲＳＶ単離物に対するＦａｂの中和活性 さらに別の９つのサブグループＡウイルス単離物および９つのサブグループＢ ウイルス単離物に対して試験することによりクローン１９の中和活性の幅を試験 した。これらのウイルスは３１年にわたって各地から集めたものであった。実施 例２に記載の方法でウイルス中和を行った。精製Ｆａｂ１９調製物は高効率でこ れらの調製物のそれぞれを中和した（表４）。さらに研究を行ったところ、クロ ーン１１はサブグループＡプロトタイプと同様の効率でサブグループＢのＲＳＶ プロトタイプを中和し、またサブグループＡおよびＢウイルスに対する広範な中 和活性をもつので、クローン１１も広範な反応性をもつことが示された。 実施例４ RSV特異性モノクローナル抗体クローン間の核酸配列分析の比較 核酸配列決定を、シーケナーゼ1.0（USB）とＣγｌ ドメイン（SEQGb:5'-GTC GTTGACCAGGCAGCCCAG-3'）またはＣκドメイン（SEQKb:5'-ATAGAAGTTGTTCAGCAGGC A-3'）中の配列にハイブリッドを形成する適当なプライマーとを使用して二本鎖 DNAにつき行った。また、配列決定は一本鎖DNAとT3プライマー（5'-ATTAACCCTCA CTAAAG-3'，Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Ma-nual，第二編， Cold Spring Harbor Press，ニューヨーク，1989）またはＣκドメイン中の配列 にハイブリッドを形成するプライマー（KEF：5'-GAATTCTAAACTAGCTAGTTCG-3'） を使用した。 クローン間の関係を明らかにするために、クローン13及び19（有効に中和した クローン）、クローン11、及び４つのその他のクローン（ランダムに選択した） を配列決定した。図５に示されるように、クローン13および19はＨ鎖可変ドメイ ンおよびＬ鎖可変ドメインの両方で同一であり、明らかにその他の５つのクロー ンと異なっていた。それにもかかわらず、クローン19およびクローン11は、これ らの二つのFabをそれぞれの成分につき等しい中和活性を生じるように調節され た混合物として試験した場合に相乗作用の証拠を示さなかった。クローン11およ びランダムに選択されたクローンのＨ鎖は全て同一であり、またこの組のＬ鎖の ４つが同一であり、一つが異なっていた。結合配列のこの非常に制限された多様 性は、同じライブラリーから同定されたHIV-1 gp120結合クローンにつき観察さ れたかなりの多様性と対称的であるが、 gp120およびFGに対するドナーの血清力価は類似していた。例えば、Ｈ鎖および Ｌ鎖の体細胞変異体はgp120に結合するFabの中で同定されたが、一方、これはこ こでは真相ではなかった。これは、RSVの場合の時折の剌激と比較してHIV-1 gp1 20の場合の慢性抗原剌激を反映し得る。 競合ELISA 見掛結合親和性を記載されたようにして（Zebedeeら，Proc.Natl. Acad.Sci．USA，89:3175，1992）Fab断片につきELISAウェルに被覆されたFGと遊 離FG-糖タンパク質の競合により評価した。 被覆FGにつきFab断片とマウスモノクローナル抗Ｆ抗体の間の競合を実質的に 記載されたようにして（Perssonら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA，88:2432，1991 ）評価した。これらの試験を試みで行って、Fabが誘導されるRSV Fの抗原部位を 同定した。RSV FG抗原を0.1μg/mlで４℃で一夜にわたってELISAウェルに被覆し た。ウェルをブロックし、4x最高結合レベル（間接ELISAにより測定してOD₄₉₀=2 .5）でFab上澄みで37℃で１時間インキュベートし、次にRSV F特異性モノクロー ナル抗体（1142、1153、1112または1243；Beelerら，J.Virol.，63:2941，1989 ）を産生する４つのハイブリドーマ細胞系の一つからのマウス腹水でOD₄₉₀=2.5 を生じる濃度で37℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、HRP接合抗 マウスF（ab'）₂で発色させた。抑制率を、100−（［実験OD／対称OD（初期競合 体を含まない）］ｘ100］として計算した。相互アッセイにつき、４倍過剰のマ ウス抗体を４倍過剰のFG被覆プレートでインキュベートし、そして2.5のODを生 じるヒトFabを添加し、ヤギ抗ヒトFabで検出した。 クローン11、13および19Fabを抑制ELISAにより更に試験し、これらは10⁸M^-1の オーダーの見掛結合親和性を生じた。また、FGの部位につき競合するFab11およ び13並びにマウスモノクローナル抗体の能力を競合ELISAにより研究した。この 目的に使用したマウスモノクローナル抗体は、中和に重要であることが明らかで あるＦ糖タンパク質の三つの部位を規定する。表５に示されるように、Ｂ部位の 抗体はFab11と競合するが、Fab13とのマウス抗体による競合は殆どなく、または 全くない。この最後の結果は親和性の相違を示し得るが、Fab13またはマウスmAb を過剰に使用した場合には、競合が殆どまたは全く観察されなかった。別の説明 は、ヒトの抗体中和応答が、一部、マウスにより見られる抗原部位とは異なる抗 原部位に対しつくられ得ること、または三つの部位が全抗体を使用して規定され たので、その結果がFab断片の更に小さいサイズを反映し得ることである。 これらのFabの中和活性は、最近記載されたヒト化マウスRSV Fモノクローナル抗体（Tempestら，Bio/Technology，9:266，1991）の中和活性 に等しく、これは細胞培養中（0.4μg/mlがウイルスプラークを50％減少するの に充分であった）そしてマウス中（5mg/kgが感染の高さで肺ウイルス力価を10⁵ だけ減少するのに充分であった）の両方で非常に活性であった。完全長２価IgG 分子のFcエフェクターセグメントを欠いた本発明のこれらの１価Fabは中和機能 において均等であった。 実施例５ 組換えヒト抗体の産生 免疫グロブリンレパートリークローニングに関する結合性ファージライブラリ ーアプローチが、最近、特異性抗原に対する高親和性によりヒト免疫グロブリン Gl Fab結合をコードする遺伝子断片を単離することを可能にした（Barbasら，上 記文献）。これらの遺伝子断片の一つに基く完全ヒト抗RSV抗体をコードする遺 伝子の構築およびウイルストランスアクチベータータンパク質を構成的に発現す るチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系への別々のＨ鎖ベクターおよびＬ 鎖ベクターの同時トランスフェクションによるこれらの構築物の有効な発現が、 以下に記載されるように可能である。この系は一般にレパートリークローニング に由来する組換え抗体の迅速な分析に有益である。 株、プラスミドおよびDNA操作 E．coli株XL-1ブルー（F）proAB，lac1⁹ZDM15 ，Tn10（tet'）（ストラタゲン）を全てのクローニング実験に使用する。ベクタ ーpEE6hCMVneo、pEE6hCMVBgIII、pEE6hCMVの誘導体、およびpE1001はセルテク社 （Celltech Ltd，Slou-gh UK）からのものである。 DNA操作を通常の技術（Sambrookら，上記文献）に従って行い、オリゴヌクレ オチドをアプライド・バイオシステムズDNA合成装置380Aでb-シアノエチルホス ホルアミジト化学により合成し、変性PAGEにより精製する。制限酵素はニュー・ イングランド・バイオラブズからのものである。全ての構築物をSangerの上記文 献に記載のDNA配列決定により確認する。 細胞培養およびDNAトランスフェクション CHO L761h細胞をDMEM、10％のFCS 、1x NEAA（非必須アミノ酸、GIBCO-BRL）および２mMのグルタミン中で増殖させ る。DNAのトランスフェクションを、既に記載されたようにして行う（Stephens ら，Nucl.AcidsRes.，17:7110，1989）。安定なトランスフェクタントの選択の ために、G418（ゲネチシン、GIBCO-BRL）を１mg/ml添加する。細胞を96ウェルマ イクロタイタプレート中で限界希釈によりクローン化する。 タンパク質の放射能標識および免疫沈殿 24ウェルマイクロタイタプレートの 一つのウェル中のトランスフェクトされたCHO細胞の培地をトランスフェクショ ンの24時間後に１mlのDMEM（メチオニンを含まない）、10％のFCS、1x NEAA、２ mMのグルタミン、10mMのNaブチレートおよび4.62MBqトランスS³⁵標識（ICNフロ ー）で置換する。37℃で３日間のインキュベーション後に、培養上澄みを14000g で５分間の遠心分離により回収し、その後の試験まで-20℃で貯蔵する。必要と される場合、ツニカマイシンを10mg/mlの最終濃度で添加する。 IgG1の免疫沈殿のために、上澄み200mlを予備膨潤されたプロテインＡセファ ロース（ファーマシア）と２時間混合し、続いて 7000gで15秒間遠心分離し、溶解緩衝液（10mMのトリス、pH7.4、１mMのEDTA、１ ％のノニデットP-40）/0.5MのNaCl中で洗浄する。溶解緩衝液/0.1％のSDSおよび 10mMのトリス、pH7.4/0.1％のノニデットP-40中で更に２回洗浄した後、ビーズ を還元性または非還元性SDS-PAGE試料緩衝液中で沸騰させることにより抽出し、 そして14000gで５分間の遠心分離からの上澄みを10％のゲルでSDS-PAGEにより分 析する。運転後に、ゲルを1MのNaサリチレート中に30分間浸漬し、真空乾燥器中 で80℃で２時間乾燥させ、オートラジオグラフィーフィルムに-70℃で露出する 。 ELISA RSV抗体産生クローンを、PBS中のRSV-FG50μｌ（0.1mg）で被覆したEL ISA96マイクロタイタプレートを使用して検出した。結合された抗体を抗ヒトカ ッパーＬ鎖ペルオキシダーゼ接合体（シグマ、no.A7164）により検出した。抗体 およびFabの結合親和性を競合ELISAにより評価する。 CHO細胞培養上澄み中の抗体量の評価をプロテインＡ被覆マイクロタイタプレ ートにつき競合ELISAにより行う。標準曲線を、アルカリ性ホスファターゼ標識 ヒトIgGlカッパー（HarlowおよびLane，抗体：実験マニュアル，CSH Laboratoy ，CSH，NY，1988に従って調製した）の一定の飽和量を種々の量のヒトIgGlカッ パー（シグマ、13889）と混合し、PBSで洗浄した後、プロテインＡ結合免疫グロ ブリンアルカリ性ホスファターゼ接合体を測定することにより作成する。 抗体精製およびＮ末端配列決定 抗体を、臭化シアン活性化セファロース（シ グマ）を使用して調製したセファロースRSV-FGカラムでアフィニティー精製する 。ビーズに吸着された抗体を、還 元性試料緩衝液中で沸騰させることにより放出させ、そしてＨ鎖およびＬ鎖をSD S-PAGEにより分離する。配列決定のために、タンパク質をブロッティング緩衝液 として10mMのCAPS/10％のMeOHを使用してイモビロン膜にブロットする。Ｈ鎖お よびＬ鎖をポンソーＳ染色により検出し、エドマン分解により配列決定する。 発現構築物の設計 その概念は、CHO細胞中のＨ鎖およびＬ鎖の発現のための 別個のベクターを生成することである。開始点として、pEE6（Whittleら，Prote in Engineering，1:499，1987）の二つの誘導体（この場合、転写がヒトサイト メガロウイルス（hCMV）プロモーター／エンハンサー要素により誘導される）が 選択される。全抗体として発現されるように選択されるFabは、例えば、高親和 性RSVバインダー、クローン19である。CHO細胞中の二つの免疫グロブリンの分泌 発現のために、Ｌ鎖（LC）およびＨ鎖（HC）のFd断片をコードするDNAは適当な シグナルペプチドと組み合わされるべきであり、これらは免疫グロブリン間で顕 著な相違を示す。そのDNA配列から、どのサブグループにクローン19のFdおよびL Cが属するのかが明らかであり、それ故、これらの遺伝子ファミリーからのシグ ナルペプチドが選択される。それ故、HCシグナルペプチドをコードするオリゴヌ クレオチドをクローンVH-26（Matthysensら，Steinberg，C.およびLefkovits，I .編集，免疫系，ニューヨーク：S.Karger，132，1981）中のそれぞれのDNA配列 に従って合成し、LCシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをクロー ンEVJK11（Staveznerら，Nucl.Acids Res.，13:3495，1985）のリーダーペプチ ドに従って設計する。E.coli発現ベクターおよびPCRプライマーの設計のために 、ヒト免疫グロブリンの 最初の３つ（LC）、および５つ（Fd）のアミノ酸を最初にクローン化しなかった 。それ故、それらを、VH-26およびEVJK11骨格１（FR1）配列に従って、シグナル ペプチドをコードするリンカーにとり込んだ。Ｈ鎖ベクターにつき、Ｌ鎖構築の ために5'Xholクローニング部位を維持することが可能である。しかしながら、Sa cl部位の保存はグルタミン酸を天然に見られるグルタミンではなく成熟タンパク 質の３位に導入する。更に、それは既に存在する+1のグルタミン酸と組み合わせ てＮ末端の負の電荷の非常に異常なクラスター形成を生じる。それ故、二つの異 なるＬ鎖構築物、グルタミン酸をコードする構築物と、クローニングに使用され るSacI部位を破壊する+3位の真正グルタミンをコードするその他の構築物がつく られる。失われたFc部分をFdに付加するために、相当するDNA断片を、ゲノムIg ガンマ１クローン（Takahashiら，Cell，29:671，1982）のサブクローンを有す るプラスミドpE1001から切除する。FdおよびFcの融合のために、γ１ドメインを コードするDNＡ中の特異なBstEII部位を使用した。有効な翻訳開始を可能にする ために、使用した二つのシグナルペプチドの天然コザック配列をリンカーの5'末 端の設計に入れた。完全HC構築物を哺乳類発現ベクターpEE6HCMVneo（Whittleら ，上記文献）にクローン化して翻訳開始のためのhCMVプロモーター／エンハンサ ー要素、ポリアデニル化のためのSV40シグナルおよびネオマイシン耐性遺伝子を 得、安定なトランスフェクタントの選択を可能にする（図５）。二つのLC構築物 をベクターpEE6hCMVBgIII（Stephensら，上記文献）にそれぞれ別々にクローン 化し、これは同じ転写調節シグナルを与えるが、真核細胞中の選択のための抗生 物質耐性遺伝子を有 しない（図５）。IgＨ鎖単独の高レベルの発現は哺乳類細胞につき致死性であり 、それ故、Ｈ鎖ベクターの選択はＬ鎖の同時合成につき同時選択する。 CHO-L761h細胞中の一過性発現 hCMVプロモーターをトランスアクチベートす る変異体アデノウイルスE1A遺伝子を構成的に発現するCHO細胞系CHO L761h（Coc kettら，Nucl.Acids Res.，19:319，1991）の開発は、一過性でトランスフェク トされた細胞を用いる研究に充分な発現レベルを可能にする。 LC発現ベクターおよびHC発現ベクターで一過性で同時トランスフェクトされた CHO L761h細胞の培養上澄みからの放射能標識タンパク質のプロテインＡ−セフ ァロースによる免疫沈殿は、非還元性SDS PAGE条件下でヒトIgGlにつき予測され るように、約150kDのバンドを明らかにすべきである。 還元性条件下で、これらのバンドは、IgＨ鎖およびＬ鎖につき予測された分子 量である約50kDおよび25kDの二つのタンパク質に分解する。Ｎ末端で二つのグル タミン酸を有するカッパー鎖は、大半が天然グルタミンを含むＮ末端を有するカ ッパー鎖の後に遅れている広いバンドの形態で移動する。 IgGlエフェクター機能の表示につき、Ｃ_H２ドメインは正確にN-グリコシル化 されることが重要である。Ｈ鎖のグリコシル化を調べるために、ツニカマイシン を含み、またはそれを含まない培地中のその後の培養のための平行なトランスフ ェクションを行う。相当する免疫沈殿は、Ｈ鎖がCHO細胞によりN-グリコシル化 されることを示すべきである。 安定なトランスフェクトされたCHO細胞によるIgGl/19の分泌 この系により産生し得る抗体の収率を調べるために、安定なトランスフェクタ ントをG418の添加そして続いて細胞の限界希釈により選択する。クローンを調べ てどの細胞系が検出可能な量の抗RSV抗体を産生するのかを示す。これらのうち で、最高の産生クローンを生産性の更なる分析のために増殖する。抗体分泌のレ ベルは2-10⁵の細胞から24時間で約200-300ng/mlであるべきである。 分泌抗体の分析 抗体を培養上澄みからRSVアフィニティークロマトグラフィ ーにより精製し、最初の５つのＮ末端アミノ酸をエドマン分解により測定する。 全ての抗体鎖につき、シグナルペプチダーゼによる正確かつ確実なプロセシング が示されるべきであり、得られた配列は正確に予測されたとおりである。二つの 抗体のRSVに関する見掛結合親和性を競合ELISAにより評価し、最初のFabの見掛 結合親和性との比較を可能にする。抗体は、高親和性抗体に典型的な約10⁸M^-1の 見掛親和性でRSVを結合すべきである。 実施例６ ヒトFabモノクローナル抗体を使用するRSV感染の生体内の回復 ３つのFabを、RSVで感染されたマウスの治療効力につき試験した。RSV Fabを 上記のようにして産生した。RSV Fab 19はHEp-２細胞培養液中でプラーク減少中 和技術により試験した場合ウイルスに対し高い中和活性（258μg/mlで力価1552 ）を示し、一方、別のRSV Fab126は細胞培養液中で中和活性を有しないことが明 らかであった。対称として研究された、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のエンベ ロープ糖タンパク質に対し誘導された第三のヒト モノクローナルFabは、細胞培養液中でRSVに対し中和活性を示さなかった。アッ セイの独立の組において、RSV Fab 19はまた非常に高い融合抑制（FI）活性を示 すことが示された。RSV Fab 19のFI力価は、その中和抗体力価の約1/3であった 。 生後15〜32週の雌の平均体重25gのBalb/cマウスを使用した。マウスに組織培 地100μｌ中に含まれた10^6.3プラーク形成単位（pfu）のRSV株A2を鼻内接種した 。マウスをメトキシフルランで麻酔した後に、接種を行った。これらの条件下で 、鼻内接種された物質は肺に直接送出される。６匹のマウスを、研究したそれぞ れのグループに入れた。ウイルス接種の３日後に、Fab懸濁液100μｌをメトキシ フルラン麻酔下で鼻内に点滴注入した。ウイルス接種の４日後に、マウスを犠牲 にし、それらの肺を回収した（Murphyら，Vaccine，8:497-502，1990およびPrin ceら，Am.J.Path.，93:771-792，1978）。肺ホモジネートを５％のCO₂インキュ ベーター中で37℃で半固体培地オーバーレイの下に維持されたHEp-2細胞に関し てプラークアッセイによりRSVにつき滴定した（Princeら，1978）。プラークを イムノペルオキシダーゼ標識操作（Murphyら，1990）により検出した。 表６に示されるように、細胞培養液中で高レベルの中和活性を既に示したRSV Fab 19はまたBalb/cマウスのRSV感染の高さでそれらの肺中のRSVのレベルを低下 するのに有効であった。3.2μｇ程度の少量のFab 19がマウスの治療上活性であ った。これは体重１kg当たり129μｇのFab 19を投与したマウスの事例であった 。Fab 12.9μg（または体重１kg当たり516μg）を投与したマウスは更に有効な 治療結果を示し、この場合、肺中のRSVの力価は5000分の１に減少された。対照 的に、細胞培養液中でRSVに対し中和活性を示さなかったRSV Fab126またはHIV F ab DL 21はまた感染したマウスの肺中のRSVの力価を減少できなかった。加えて 、RSV Fab 19はインフルエンザA/ウドルン/1972ウイルスで感染されたマウスで 治療効果を示さず、インビボのRSV感染に対するこのFabの治療効果の特異性に関 する付加的な証拠を与えた（表６）。次に、RSV感染に対するFab 19の治療効果 の期間を、Fabの鼻内点滴注入後の種々の時間でマウスの肺中に存在するRSVの量 を測定することにより調べた（表７）。 治療の24時間後に肺中のウイルスの量のかなりの減少を生じるFab 19の能力を 確認した。重要なことに、クローンFab 19の治療効果は、かなりの中和活性を有 するJECヒトポリクローナル血清の治療効果よりも大きかった。しかしながら、 ２日後に、ウイルス力価の反動が観察された。こうして、治療３日後（これは感 染の６日後であった）、治療マウス中の肺ウイルスの力価は対照グループ、即ち 、HIV Fabを投与したマウスまたは治療を受けなか ったマウスの力価と有意に異ならなかった。 これらの観察は、回復が起こるまでウイルス複製を含むためにFabによる成功 した治療が反復投与を必要とし得ることを示唆した。このアプローチの実施可能 性を、表８に要約した研究において調べた。 マウスの一つのグループは感染の３日後にRSV Fab 19のみを受け、別のグルー プは感染の３日後および４日後に治療され、一方、マウスの残りのグループは感 染の３日後、４日後および５日後にFabを受けた。先の実験のように、Fab 19の 単一の点滴注入はマウス中の肺RSVを2500分の１に減少したが、高レベルへの反 動が24時間後に起こった。それにもかかわらず、その時点のウイルスの力価は、 対照マウスの力価と比較して、100分の１に減少された。次の２日中に、肺ウイ ルスの力価は、RSV複製の高さで存在する高レベル、即ち、感染４日後の10^6.5pf uに接近しなかった。感染６日後および７日後に、肺ウイルスのレベルは感染の 切迫した消散の特徴的なレベル、即ち、10^4.2〜10^4.3pfu（これは未治療グルー プの感染７日後の力価に類似する）に留まった（表８）。 連続２日または連続３日の治療は肺ウイルス力価の更に大きな減少を生じた（ 表８）。RSVは治療の停止の１日後に後者のグループのマウスの肺中で検出され ず、一方、非常に適度の反動が１日後に観察された。この発生は重要ではないか もしれない。なぜならば、ウイルスは試験した４匹マウスのうちの２匹の肺のみ で検出でき、そして回収したウイルスの量は対照グループよりも依然としてかな り少なかったからである（表８）。これらの観察は、Fab 19の如きRSV Fabが高 リスクの乳児および幼児だけでなく、遺伝的疾患、臓器移植の抑制治療またはHI V感染にかかりやすいような免疫不全である全年齢の個人において重度の低RSVの 呼吸道疾患の治療に有効であることを示唆する。加えて、これらの観察は、Fab 19の如きFabの直接の呼吸道投与がまた病院滞在中または外来診療所への訪問中 に感染に晒される高リスクの個人の重 度のRSV疾患の予防に有効であることを示唆する。 インビボの抗体Fab断片の治療活性を実証したこれらの観察は、全く予測され なかった。なぜならば、従来技術はこれらの結果を教示または示唆していなかっ たからである。実際に、本発明者らが最もよく知る限りでは、抗体Fabの生体内 の治療効果は先に報告されていなかった。実際に、生体内の治療効果を全く見込 みがないようにする幾つかの理論的な考察がある。Fabは１価であり、こうして 一つの部位にのみ付着でき、それにより別個のウイルス粒子の抗原部位の架橋を 排除する。この事実のために、２価の抗体分子またはF（ab'）₂による架橋がウ イルス中和の前提条件であると多くの研究者により考えられていた。また、Fab は有効ではないと考えられているようである。なぜならば、Fabは抗体のエフェ クター機能、例えば、補体カスケードの活性化および抗体依存性細胞毒性（ADCC ）の多くの原因である免疫グロブリン分子のFc部分を欠いているからである。そ れにもかかわらず、RSVFab19はRSVで感染した肺中に存在するウイルスの量を減 少するのに非常に活性であり、それ故、粘膜ウイルス感染、例えば、RSVだけで なく、その他の呼吸道ウイルス病原体、例えば、インフルエンザウイルス、パラ インフルエンザウイルス、ライノウイルス、およびコロナウイルス（インビボ内 のこれらの増殖は呼吸道の内腔表面に制限される）により引き起こされる粘膜ウ イルス感染の免疫治療の新しい時期の開始のきっかけとなり得る。 試料の寄託 下記の細胞系統を1992年9月16日以前に米国、MD、ロックビル・パークローン ・ドライブ1301にあるザ・アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託した。 細胞系統 ATCC受託番号 クローン11 ATCC 69071 クローン19 ATCC 69072 この寄託を特許手続の目的のための微生物の寄託の国際認可に関するブタベス ト条約の条項およびその規則（ブタベスト条約）のもとに行った。これは寄託の 日から30年にわたる生存可能な培養物の維持を確保する。生物はブタベスト条約 の条項のもとにATCCにより利用可能にされ、この条約は関連米国特許の発行後ま たは米国特許出願もしくは外国特許出願の公開後（いずれか最初に公開されたも の）に公衆への培養物の子孫の永久かつ無制限の利用可能性を確保し、また35 U SC§122およびそれに従う米国特許庁の規則（特に886 OG 638を参考とする37CFR §1.14を含む）に従って米国特許庁によりその権利が与えられると定められた者 への子孫の利用可能性を確保する。 本件特許出願の譲受け人は、培養寄託物が適当な条件下で培養された場合に死 滅し、または喪失もしくは分解される場合、それが同培養物の生存可能な標本で 連絡後速やかに交換されることを同意した。寄託株の利用可能性はあらゆる政府 の権威のもとにその特許法に従って付与された権利に反する発明の実施のライセ ンスと見なされるべきではない。 以上に記載された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに 充分であると考えられる。本発明は寄託された細胞系統により範囲を限定される べきではない。なぜならば、寄託実施態様は本発明の一局面の単なる例示として 意図されており、 機能上均等であるあらゆる細胞系統が本発明の範囲内にあるからである。試料の 寄託は、本明細書に含まれる記載が本発明のあらゆる局面（その最良の様式を含 む）の実施を可能にするのに不充分であるという承認を構成するものではなく、 またそれは請求の範囲をそれが表す特定の例示に限定するものと見なされるべき ではない。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えて本発明の種々の 改良が以上の記載から当業者に明らかになるであろうし、これらは請求の範囲内 に入る。 配列の要約 配列番号1は、RSVを中和するヒトモノクローナル抗体のＨ鎖のアミノ酸配列で ある。 配列番号２は、RSVを中和するヒトモノクローナル抗体のＨ鎖のアミノ酸配列 である。 配列番号３は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号４は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号５は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号６は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号７は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号８は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号９は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号10は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号11は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号12は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド 配列である。 配列番号13は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号14は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号15は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号16は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号17は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号18は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号19は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号20は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。 配列番号21は、クローンrsv6H、11H、21H、22H、および23H（図４）のＨ鎖可 変ドメインおよびＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。 配列番号22は、クローンrsv13Hおよび19H（図４）のＨ鎖可変ドメインおよび Ｌ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。 配列番号23は、クローンrsv6L、11L、21L、および22L（図４）のＨ鎖可変ドメ インおよびＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。 配列番号24は、クローンrsv23L（図４）のＨ鎖可変ドメインおよびＬ鎖可変ド メインのアミノ酸配列である。 配列番号25は、クローンrsv13Lおよび19L（図４）のＨ鎖可変ドメインおよび Ｌ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。 配列番号26は、Ｌ鎖リンカー（図５、上部）のヌクレオチド配列（および推定 アミノ酸配列）である。 配列番号27は、配列番号26のＬ鎖リンカー（図５）の推定アミノ酸配列である 。 配列番号28は、Ｈ鎖リンカー（図５、下部）のヌクレオチド配列（および推定 アミノ酸配列）であり、および 配列番号29は、配列番号28のＨ鎖リンカー（図５）の推定アミノ酸配列である 。 配列表 （２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１０ （xi）配列の記載：配列番号１： （２）配列番号２の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１９ （xi）配列の記載：配列番号２： （２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３２ （xi）配列の記載：配列番号３： （２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３６ （xi）配列の記載：配列番号４： （２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３２ （xi）配列の記載：配列番号５： （２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．２９ （xi）配列の記載：配列番号６： （２）配列番号７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．４０ （xi）配列の記載：配列番号７： （２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３８ （xi）配列の記載：配列番号８： （２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．４０ （xi）配列の記載：配列番号９： （２）配列番号１０の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３８ （xi）配列の記載：配列番号１０： （２）配列番号１１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１１： （２）配列番号１２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．２８ （xi）配列の記載：配列番号１２： （２）配列番号１３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３４ （xi）配列の記載：配列番号１３： （２）配列番号１４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３６ （xi）配列の記載：配列番号１４： （２）配列番号１５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３１ （xi）配列の記載：配列番号１５： （２）配列番号１６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．３０ （xi）配列の記載：配列番号１６： （２）配列番号１７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．４８ （xi）配列の記載：配列番号１７： （２）配列番号１８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．４０ （xi）配列の記載：配列番号１８： （２）配列番号１９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．２７ （xi）配列の記載：配列番号１９： （２）配列番号２０の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１．．２４ （xi）配列の記載：配列番号２０： （２）配列番号２１の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：rsv 6H;11H;21H;22H;および23H （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１２９ （xi）配列の記載：配列番号２１： （２）配列番号２２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：rsv 13Hおよび19H （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１２０ （xi）配列の記載：配列番号２２： （２）配列番号２３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：rsv 6L;11L:21L;および22L （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１０９ （xi）配列の記載：配列番号２３： （２）配列番号２４の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：rsv 23L （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１０９ （xi）配列の記載：配列番号２４： （２）配列番号２５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：rsv 13Lおよび19L （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１０８ （xi）配列の記載：配列番号２５： （２）配列番号２６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１５．．８６ （Ｄ）他の情報：注−ヌクレオチド８１がＣである場合、アミノ酸 ２３はグルタミン（Gln）であり、ヌクレオチド８１がＧである場合、アミノ酸 ２３はグルタミン酸（Glu）である （xi）配列の記載：配列番号２６： （２）配列番号２７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号２７： （２）配列番号２８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA（genomic） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：１５．．８９ （xi）配列の記載：配列番号２８： （２）配列番号２９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号２９：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 9/08 ＡＣＤ Ｆ 9455−4Ｃ 39/395 ＡＤＹ Ｓ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 16/08 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 15/09 ＺＮＡ // Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 バーバス，カルロス エフ．ザ サード アメリカ合衆国 92123 カリフォルニア 州 サンディエゴ，ウェラー ストリート 7081番地 (72)発明者 チャノック，ロバート エム. アメリカ合衆国 20817 メリーランド州 ベセスダ，ロングウッド ドライブ 7001番地 (72)発明者 マーフィー，ブライアン アール. アメリカ合衆国 20816 メリーランド州 ベセスダ，タスカラワス ロード 5410 番地 (72)発明者 クロウ，ジェイムズ イー．，ジュニア アメリカ合衆国 メリーランド州 シェヴ ィー チェイス，プレストン プレイス 8754番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびサブグループ Ｂの両方を中和することのできるヒトモノクローナル抗体。 ２．抗体が糖タンパク質Ｆ上に存在するエピトープと結合する請求項１に記載の ヒトモノクローナル抗体。 ３．Ｆａｂ断片である請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体。 ４．モノクローナル抗体がＡＴＣＣ６９０７１またはＡＴＣＣ６９０７２によっ て産生されるＦａｂ断片の結合特異性をもつ請求項３に記載のヒトモノクローナ ル抗体。 ５．モノクローナル抗体がＡＴＣＣ６９０７１またはＡＴＣＣ６９０７２によっ て産生されるＦａｂ断片である請求項３に記載のヒトモノクローナル抗体。 ６．Ｈ鎖が以下の群： ＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１）；および ＨＬＰＤＹＷＮＬＤＹＴＲＦＦＹＹＭＤＶ（配列番号２） からなる群から選択されるＣＤＲ３ポリペプチド配列を含む請求項２に記載の ヒトモノクローナル抗体。 ７．呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を中和することのできるヒトモノクローナル 抗体をコードするポリヌクレオチド配列。 ８．ポリヌクレオチドが以下の群： ＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１）；および ＨＬＰＤＹＷＮＬＤＹＴＲＦＦＹＹＭＤＶ（配列番号２） からなる群から選択される免疫グロブリンＨ鎖ＣＤＲ３ポリペプチド配列をコ ードする請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。 ９．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。 １０．請求項７に記載のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。 １１．請求項７に記載のポリヌクレオチド配列を含む生物学的機能性ベクター。 １２．ＲＳＶを含むことが疑われる試料を診断的有効量の請求項１に記載のモノ クローナル抗体と接触させ、モノクローナル抗体が試料と結合するか否かを決定 することを含む、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を検出する方法。 １３．検出がインビボである請求項１２に記載の方法。 １４．モノクローナル抗体を、放射性同位体および常磁性標識からなる群から選 択される標識で検出可能なように標識する請求項１３に記載の方法。 １５．検出がインビトロである請求項１２に記載の方法。 １６．モノクローナル抗体を、放射性同位体、蛍光物質、コロイド状金属、化学 発光物質、生物発光物質および酵素からなる群から選択される標識で検出可能な ように標識する請求項１５に記載の方法。 １７．モノクローナル抗体を固相に結合する請求項１５に記載の方法。 １８．ヒトに、免疫治療的有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体を投与 することを含む、ヒトの呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）疾患に受動免疫治療を提 供する方法。 １９．受動免疫治療を予防的に提供する請求項１８に記載の方法。 ２０．疾患が肺炎および細気管支炎からなる群から選択される請求項１８に記載 の方法。 ２１．投与を気道によりまたは非経口的に行う請求項１８に記載の方法。 ２２．気道投与を肺エアゾールによって行う請求項２１に記載の方法。 ２３．肺エアゾールが直径約５μｍより小さい粒子を含む請求項２２に記載の方 法。 ２４．物質を液体として投与する請求項２１に記載の方法。 ２５．液体を気管支鏡または人工通気管を用いて投与する請求項２４に記載の方 法。 ２６．非経口投与を皮下、筋肉内、腹腔内、洞内、経皮または静脈内注射により 行う請求項２１に記載の方法。 ２７．非経口投与を漸次灌流により行う請求項２１に記載の方法。 ２８．漸次灌流を静脈内または蠕動手段により行う請求項２７に記載の方法。 ２９．免疫治療的有効量が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇである請 求項１８に記載の方法。 ３０．免疫治療的有効量が約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇである請求 項１８に記載の方法。 ３１．免疫治療的有効量が約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである請求項 １８に記載の方法。 ３２．ヒト気道の管腔表面で増殖することのできるウイルスと特異的に結合し、 これを阻害する免疫治療的有効量のＦａｂ断片の肺 エアゾールを宿主に投与することを含む、宿主のウイルス粘膜疾患に受動免疫治 療を提供する方法。 ３３．ウイルスが、呼吸合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフ ルエンザウイルス、ライノウイルスおよびコロナウイルスからなる群から選択さ れる請求項３２に記載の方法。 ３４．宿主がヒトである請求項３２に記載の方法。 ３５．Ｆａｂ断片がＡＴＣＣ６９０７１またはＡＴＣＣ６９０７２によって産生 されるＦａｂ断片の結合特異性をもつ請求項３２に記載の方法。 ３６．Ｆａｂ断片がＡＴＣＣ６９０７１またはＡＴＣＣ６９０７２によって産生 されるＦａｂ断片である請求項３２に記載の方法。 ３７．Ｆａｂ断片のＨ鎖が以下の群： ＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１）；および ＨＬＰＤＹＷＮＬＤＹＴＲＦＦＹＹＭＤＶ（配列番号２） からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む請求項３２に記載の方法。 ３８．ヒトに、免疫治療的有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体に対す る抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、ヒトにおいて呼吸合胞体ウイル ス（ＲＳＶ）疾患に対する活発な免疫治療を誘導する方法。 ３９．薬剤学的担体中に免疫治療的有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗 体の少なくとも１投与量を含む医薬組成物。 ４０．ＲＳＶを含むことが疑われる試料中の呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の検 出に用いるキットであって、請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む容器を 含む１以上の容器をその中に密に 収納すべく区切られたキャリア手段を含むキット。 ４１．ＲＳＶに対する結合親和性が約４ｘ１０⁸Ｍ^-1である請求項１に記載のモ ノクローナル抗体またはその断片。 ４２．抗体が１本鎖抗体である請求項１に記載のモノクローナル抗体。 ４３．呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびサブグルー プＢの両方を中和することのできるヒト由来のエピトープ結合性ペプチド。 ４４．ペプチドが以下の群： ＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１）；および ＨＬＰＤＹＷＮＬＤＹＴＲＦＦＹＹＭＤＶ（配列番号２） からなる群から選択される請求項４３に記載の結合性ペプチド。 ４５．ペプチドが糖タンパク質Ｆ上に存在するエピトープと結合する請求項４３ に記載の結合性ペプチド。 ４６．請求項１、３、４１または４２に記載のヒト抗体をコードするＤＮＡを含 むベクター。 ４７．請求項４６に記載のベクターを含む宿主細胞。