JPH08505761A

JPH08505761A - 組換え特異的結合タンパク質

Info

Publication number: JPH08505761A
Application number: JP6509777A
Authority: JP
Inventors: ジョセフハリス，ウィリアム; チャールズエメリー，スティーブン; ポールウィンター，グレゴリー; ジョセフカー，フランシス; パトリックマクグレガー，ダンカン
Original assignee: スコットゲンリミティド
Priority date: 1992-10-15
Filing date: 1993-10-15
Publication date: 1996-06-25
Also published as: GB9221657D0; WO1994009131A1; AU5283793A; CA2146854A1

Abstract

(57)【要約】標的物を特異的に認識し、そしてそれに結合する第１及び第２結合領域、たとえば抗体Ｆ_vフラグメントを有する特異的結合タンパク質が供給され、ここで前記結合領域がそれぞれ第１及び第２ポリペプチド鎖上に少なくとも一部含まれ、前記鎖がさらに、お互いに結合でぎる第１及び第２の会合ドメイン、たとえば抗体ＶH及びＶ_Lドメインをそれぞれ組込み、前記第１及び第２ポリペプチド鎖の組合せを引き起こし、それによって、前記第及び第２の結合領域の結合特異性を組込む単一タンパク質を提供することを特徴とする。前記第１及び第２結合領域は異なった標的物を認識でき、複特異的結合タンパク質を付与する。好ましくは、前記会合ドメインはヒトタンパク質（すなわち、ヒト免疫系に暴露されている）に由来し、その結果、タンパク質は、治療的に投与される場合、ヒト免疫系をほとんど剌激しない傾向がある。前記結合タンパク質は適切には、組換えDNA発現により生成される。

Description

【発明の詳細な説明】組換え特異的結合タンパク質本発明は組換え複特異的（ヘテロダイマー）及び／又はモノダイマー性二価特異的結合タンパク質、たとえば抗体に関する。 1975年にモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法（文献１）の開発以来、研究、治療及び産業手段として広く使用されて来た多くの特異的抗体を生成することが可能である。しかしながら、一般的な実験は、ネズミモノクローナル抗体が、ヒト免疫系による誘発された免疫グロブリン応答に寄与する減じられた治療効能、又は防御機構、たとえばヒトエフェクター細胞の補足的な活性化又は補充の不良な開始を示し、又はインビボで不適切な薬理学的運動学を有することを示唆する。それらの制限を回避するためのアプローチが、ヒト化されたモノクローナル抗体（文献２）、抗体フラグメント（文献３及び４）及び“複特異的（bispecific ）”抗体（一価の複特異的試薬）（文献５及び６）の使用により達成された。複特異的抗体は、２つの異なった抗体部位を結合できる組換え抗体として記載され、そして従って、２つの異なった源に由来する抗原結合ドメインを含み、そしてこれは抗体分子内の相補的相互作用ドメインにより会合される。モノ特異的性質の二価抗体はハイブリドーマ、及び同様に、異なった特異性を有する抗体を発現する２種のハイブリドーマ系の融合による複特異体（bispecif ics）に由来する。しかしながら、この技法を用いて、複特異体の適用は、そのような分子を効果的に生成し、そして精製することにおいての困難性により制限され、そしてさらに、完全な抗体分子に固有のエフェクター機能（たとえばレセプター及び補足的結合）は所望しない相互作用を導びく。モノクローナル抗体及びタンパク質工学の分野における最近の進歩に連結する組換えDNA技法は、広範囲の種類の異なった抗原のためのモノ特異的認識及び結合性質を有する多くの選択的抗体及び抗体フラグメントへの接近を可能にした。血管系からの組織中に効果的に侵入する免疫グロブリンFab，Fv及び一本鎖Fv（s cFv）フラグメントの能力及びエフェクター機能の欠乏は、それらの分子を薬物供給システム及びイメージング手段のための卓越した候補体にした（文献７）。しかしながら、完全な抗体とは異なって、それらのフラグメントは、単一の抗原結合部位をそれぞれ担持する一価のものである。二価の複合体の形成（又は複数価の複合体の形成さえ）を促進する二量体化技法は、従って、たとえばFv又はFabフラグメントの構造体を考慮する場合、ひじょうに重要なものであり、ここで前記生成物の単価性が抗原に結合する多価性を妨げ、結合活性因子を提供する。さらに、ほとんどの細菌的に生成されたFv，Fab及びsvFuフラグメントは、それらの前駆体モノクローナル抗体よりも低い結合活性を示した（文献８及び９）。完全な抗体の場合におけるように、他のドメインの会合により提供される特別な安定性は存在しないので、Fv'Sの安定性はＨ及びＬ鎖可変ドメイン会合に実質的に依存する。そのＨ及びＬ鎖ドメイン会合安定性はドメイン界面で示される残基に依存するので（CDR領域に属する残基により部分的に形成される）、Fv及び類似する構造体のための解離定数は抗体から抗体にひじょうに変化する。従って、不良に会合する可変領域を有する抗体は、小さなフラグメントの形態における場合、それらの親分子に対して低い結合親和性を示す傾向がある。従って、追加のドメイン会合のために二価の結合及び／又は追加の安定性を通して特定の抗体の結合親和性を高める二量体抗体の生成のための方法論を開発する良好な理由が存在する。二価の抗体の生成の他に、分子の二量体化の主な適用は、会合が定義により“ ヘテロ二量体”（それぞれのサブユニットは異なったＶドメインを含む）である、“複特異的”又は“二官能価”抗体の生成にある。インビトロ実験は、複特異的抗体が標的細胞への細胞毒性エフェクター細胞を架橋することにおいて効果的であり、そしてその細胞毒性破壊機構を剌激することを示した。同様に、複特異的抗体は、個々の結合ドメインの特定の認識及び結合を通して、一定の分子、たとえば薬物又は毒素、放射性ラベルされたハプテン又は他の存在物に対する不活性化タンパク質、たとえば特定のタンパク質又は細胞型に連結し、そして隣接せしめるために使用され得る。さらに、そのような“ 二官能”抗体はまた、新規のイムノアッセイ及び／又は診断アノセイを開発するためにも使用され得る。複特異的抗休は２種の異なった抗原に結合できるので、それらは化学的な変性の必要性を伴わないで酵素、治療剤、放射性ラベル又は細胞を標的に結合するように企画され得る。従って、複特異的存在物は、細胞毒性剤に直接的に結合される抗体よりも一層、効果的且つ特異的な細胞殺害を示し、そしてさらに、化学的に変性された抗体より誘発され得るいづれかの逆の免疫応答を回避できる。複特異的抗体はまた、会合された／二量体の状態で存在する場合、それ自体シグナル、エフェクター又はレセプター機能を有する他の分子の会合／二量体化を促進するために有用であることもわかっている。従って、二官能抗体はまた、“ 分子スイッチ（molecular switches）”及び“クロスリンカー”、並びに二重の結合特異性が適用できる多くの他の用途（診断又は治療の両者）として重要な役割を有する。複特異的抗体が好都合である可能な役割は数多いけれども、複特異的抗体のための臨床学的用途及び他の用途は、そのような分子を効果的に生成し、そして精製することにおける困難性により制限される。複特異的又は他の二量体抗体をアセンブルするために使用される方法は、化学的架橋、ジスルフィド交換、又はハイブリッド−ハイブリドーマ又はヘテロトランスフェクトマス（heterotrans fectomas）の利用を包含する。それらの方法は、好結果をもたらす構成のために必要とされる生成物の純度、異種及び不十分に定義された生成物の生成及び特に、Fabフラグメントの場合、お互いのバートナー（Fd，Ｖ_L Ｃ_L）の低い親和性によりまだ不十分であるものとして知られている。それらの問題を解決するために、ヘテロ二量体Ｆ（ab）₂分子の生成のための最近の開発は、Fos及びJun転写因子のロイシンジッパー領域に対応するペプチド配列のＣ−末端融合を用いている（Kostelng et al.，J．Immunol．148，1547-1 553，1992）（文献１０）。それらの配列は好ましくは、ヘテロ二量体を形成し、そして従って、２種の異なったFabフラグメントに融合される場合、複特異的形成の促進において効果的である。二価性（すなわち、１つの抗体基材の存在物内に同じ特異性を有する２つの結合部位）を達成するために、Pack and Pluckthun（1992）（文献11）は、柔軟なヒンジ領域、及び抗休フラグメントのＣ−末端に融合される両親媒性ヘリックスを有する一本鎮Fvフラグメントに基づくミニ抗体を企画した。彼らは、そのような分子が完全な抗休とほぼ同一の抗原結合特性を有することを示した。異なったアプローチが、FabのＥ．コリにおける発現及び（Fab'）₂を合成するために遊離チオールの続く化学結合に基づいてCarter et al.，（1992）（文献12）により記載されている。本発明の１つの観点によれば、標的存在物を特異的に認識し、そして結合する第１及び第２結合領域を有する特異的結合タンパク質が供給され、ここで前記結合領域はそれぞれ第１及び第２ポリペプチド鎖上に少なくとも一部含まれ、前記鎮はさらに、お互いに結合できる第１及び第２の会合ドメインをそれぞれ組込み、前記第及び第２のポリペプチド鎖の組合せを引き起こし、それによって、前記第１及び第２の結合領域の結合特異性を組込む単一のタンパク質を供給する。好ましくは、前記第１及び第２の結合領域は異なった標的存在物を認識する。適切には、前記会合ドメインは、抗体（たとえばAgA，IgD，IgE，IgG，IgM）に由来し、そして続く記載の多くは例示手段により抗体ドメインを用いる。しかしながら、それらは、会合できる他の分子、たとえば“天然のリガンド／レセプターの組合せ又は天然の二量体タンパク質の結合領域に由来できる。好ましくは、それらの会合ドメインは、ヒトタンパク質（たとえぽ、ヒト免疫系に暴露されたタンパク質）に由来する。前記会合ドメインは、それらが通常、天然において会合しない場合でさえ、会合できる２種の同一のドメインであり得る。便利には、前記会合ドメインは下記から選択される：抗体Ｖ_H及びＶ_L領域、抗体Ｃ_H１及びＣ_L領域、抗体Ｖ_H・Ｃ_H１及びＶ_L・Ｃ_L領域。好ましくは、前記第１及び第２の結合領域は、たとえばFabフラグメント又は一本鎖Fvフラグメントに含まれるＶ_H及びＶ_L領域を含んで成る抗体抗原−結合ドメインである。しかしながら、結合ドメインのいづれか又は両者は、抗体のＶ_H又はＶ_L領域のたった１つに、最とも適切には、抗体のＶ_H領域に由来する（文献13）。本発明はまた、そのような特異的結合タンパク質のポリペプチドをコードする DNA；場合によっては、１又は複数の発現ベクターに含まれるDNA；特異的結合タンパク質のポリペプチドを生成するために、そのような組換えDNAを含み、そして前記DNAを発現できる宿主細胞を包含する。本発明は、また組換えDNAを、それによりコードされるポリペプチドを生成するためにそのような宿主細胞に発現し、そして必要なら、特異的結合タンパク質を生成するために、翻訳後操作を行ない又はポリペプチドをプロセッシングすることを含んで成る方法を提供する。本発明はさらに、上記に示されるような特異的結合タンパク質を生成するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ｉ）前記第１及び第２の結合領域をコードするDNAをクローン化し又は合成し、（ii）前記第１及び第２の会合ドメインをそれぞれコードするDNAを前記第１及び第２の結合領域のDNAに読取り枠を整合して連結し、（iii）（ｉ）及び（ii）の前記融合されたDNA構造体を含む１又は複数の発現ベクターを供給し、（iv）前記発現ベクターを宿主生物中に挿入し、（ｖ）前記コードされたポリペプチドを発現するために前記宿主生物を培養し、そして（vi）前記特異的結合タンパク質を形成するために前記第１及び第２の会合ドメインの組合せを引起こし、又は可能にすることから成る。従って、一般的には、本発明は、組換え複特異的（ヘテロ二量体性）及び／又はモノ二量体性二価特異的結合タンパク質、たとえば抗体を供給し、ここで前記成分モジュールの特異的会合は、さらに融合された会合ドメインの認識及び天然のホモ−又はヘテロ−二量体化を用いることによって達成される。前記の複特異的及び／又は二量体（及びその変異体）の生成方法がまた開示される。特にことわらない限り、用語“抗体”及び““抗体フラグメント”はこの後、同意的に使用される。同様に、用語抗体“及び”免疫グロブリンは、同様の態様で処理されるべきである。第１図は、二価及び複特異的抗体形成のための一般的スケムを示し、第２図は、二価の組換え抗体形成のための実験例を示し、第３図は、最小形態の複特異的組換え抗体形成の例を示し、そして第４図〜第９図は、複特異的組換え抗体形成の例を示す。第10図は、Ｅ．コリにおける抗体フラグメント発現のために使用される種々のベクターにおける遺伝子の配置を示す。すべてのコード領域は、pUC19においてl acプロモーターから下流にクローン化された。VH及びVK並びにCH及びCKはそれぞれ抗体フラグメントの可変（Ｖ）及び不変（Ｃ）ドメインであり、PbはPel Bリーダー配列を示し、そしてTag遺伝子は第二抗体による抗体フラグメント検出のためのペプチドをコードする。Tag遺伝子生成物はそれらの研究に使用されなかった。リンカー及び終結シグナルが、材料及び方法に記載されるようにベクター中に構築された。pSW1−Fab／PaはWard et al.（19 89）により記載されるpSW1−VHD1.3−VKD1.3−TAGIベクターと同一であり、但し、VH及びVKドメインは抗−リゾチーム結合ドメインよりもむしろ抗−Ｐ．アエルギノサ（P．aeruginosa）をコードする。pDM1はpSW1−Fab／Paの誘導体である。第11図は、親和性精製された抗−Ｐ．アエルギノサFab（レーン２）及びScFv^* （レーン３）の変性SDS−PAGEを示す。それぞれ２〜５mgのサンプルが、標準の変性10％SDS−PAGEゲルを通して電気泳動処理された。第12図は、親和性精製された抗−Ｐ．アエルギノサFab（■）、ScFv^*（●）及び元のキメラ性抗体（○）の相対的抗原結合能力を示す。第13図は、多くのGramve細菌と抗−Ｐ．アエルギノサとの交差反応性を示すウエスターンブロットを示す。第14図は、抗−Ｐ．アエルギノサScFv^*及びFabの異なったコンホメーション形を示す。（ａ）ScFv^*（レーン１−３）の多量体形（Ｉ−III）及びFab（レーン４）の単一の単量体形を示す7.5％非変性ポリアクリルアミドゲル。ScFv^*の単量体（III）、二量体（II）及び三量体（Ｉ）のHPLC精製。第15図は、HPLC精製された単量体ScFv^*（■）、二量体ScFv^*（□）及び元のキメラ性抗体（○）のＰ．アエルギノサへの結合能力の比較を示す。複特異的ヘテロダイマー又は単純なホモダイマー二価形成の会合に関して、存在する技法よりも卓越する本発明の利点は、この目的のために利用される融合ドメインの一定の性質にある。化学的変性又はJun／Fosタイプのアプローチの主な欠点の１つは、ヒト治療に使用される場合、“外来性”の化学構成成分及びペプチド配列に対する免疫応答を誘発するそれらの能力に関する。抗体成分の二量体化を達成するためへの抗体ドメインの技法は、特に、抗体ドメインが天然のヒト抗体から再形状化（ヒト化され）され、又は由来する場合、ヒトにおいて免疫応答を誘発すべきでない天然の抗体ドメインを用いることによってこの問題を回避する。そのような二量体性抗体は、天然のヒト抗体の免疫原性特徴を密接に近づけるべきであり、そして従って、これまで論ぜられたように他の手段により調製された複特異物に比較して、循環系において拡張された半減期を有すべきものである。特定の分子間認識を通しての二量体化を促進する他に、融合されたＣ−末端ドメイン（既知の二量体化性質を有する）の使用は、疎水性界面相互作用の分野においての少なくとも上昇により生成される二量体の構造体の安定化を導びく傾向がある。たとえば、Ｈ及びＬ鎖の会合（Ｋ_A＞10¹⁰／Ｍ）は、比較的弱いＶ_H−Ｖ_L （Ｋ_A約10⁶／Ｍ）及びＣ_H１−Ｃ_L（Ｋ_A約10⁷／Ｍ）の相互作用の組合せに由来し、これは２種のドメイン対の会合が少なくとも付加的であることを有す（文献 14）。本発明は、特に治療への使用又はインビボ診断のために二価及び他の二量体抗体の開発に関する。くり返しての投与に基づいての疾患の部位への抗体分子の成功した標的決定は、ほとんど又はまったく免疫反応を剌激しないそれらの抗体に依存する。複特異的抗体中の天然のヒト抗体配列含有率の最大化は、慢性疾患の処置においてそれらの抗体の長期の返復投与のための見込みをあらかじめ増強するであろう。これにもかかわらず、モノー、ビー、又は多−特異的抗体／抗体フラグメント（本発明に記載される会合の手段を通して生成された）が適用され得る、まだ未決定であり又は本発明に記載されていないような他の用途がまた、この特許により包含されるであろう。本発明に適用できる特異的結合鎖の会合の一般的な概念は、第１図に例示される。この図においては、実在物は、本発明の方法の論議を単純化するために４種の成分Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤに分割された。これまでに論ぜられたように、広範囲の種類の抗体（及びそのフラグメント）は容易に入手できる。従って、本発明のパラメーター内で生成され得る構造体の多くの組合せが存在する。Fab，Fv，scFv，Fd，Ｖ_L／Ｃ_L，Fc又はＦ（ab）′フラグメント、又は個々のドメイン、たとえばＣ_H３，Ｃ_H２，Ｃ_H１，Ｃ_L，Ｖ_H又はＶ_L（又はそれらのドメインの種々の組合せ）のような実在物にさまざまに由来するような特異的結合領域又は会合ドメインをだれでも考慮できる。その特異的結合領域及び会合ドメインはお互いに、直接的に又は種々の長さのペプチドリンカー（そのリンカー配列組成物及び長さは、特定の抗体形態及び予知される用途に適合されている）を通して融合される。成分Ｂ及びＤは、さらに融合されたドメインとして名目上見られ得るが、但し、一定の形態において、それらはそれら自体、Ａ及びＣが由来する同じ抗体の一部であり得る。そのフラグメント又はドメインは、特定の構成の選択されたフォーマット及び予知される用途に再び依存して１又は複数の源に由来する。本発明でまた予知される追加の増強は、特定の分子形態及び予定された用途に関して、その構造体をさらに安定化するためにドメイン間ジスルフィド架橋を創造するために存在するシステイン残基を導入し又は使用することが好都合であることである。それらの共有結合の生成の低下は、構造物に依存して及びこの追加の方法の相対的利点に依存してインビボ又はインビトロで行なわれ得る。いづれか特定タイプの抗体又は抗体フラグメントの選択は本明細書に記載される発明概念に必須ではないことは当業者に明らかであろう。同様に、所望する特異性を提供するいづれかの免疫グロブリンが使用され得る。本発明の拡張はまた、免疫系に暴露され、そして前記系内でほとんど又はまったく免疫原性を示さない特定の会合物（たとえば細胞表面レセプター及びそれらのリガンド）を形成するいづれかの天然の分子（又はそのフラグメント）の使用を予知する。本発明の価値ある態様は、さらに融合された抗体ドメイン（又は他の免疫−サイレント分子）のホモダイマー会合を通して構成パートナーの二量体化を予知する。そのような手段は、二量体抗体を生成するために使用され得る。この態様は、ホモダイマー性二価抗体を形成するために単一の抗体種の二量体化に対してより適合されるように思われる。なぜならば、生成物集合体の混合物が、この技法がヘテロダイマー性複特異的抗体を形成するために２種の異なった抗体種の同時発現及び会合のために使用される場合に生じることが認識されるからである。次の特定の記載は、本発明がいかに実施され得るかを示す。“参考例”は、特異的結合及び会合フラグメントが融合され、そして会合を引き起こされ得る基本的技法の例示を提供し、そして次く例１及び２は本発明の特定態様を提供する。参考例二価の種の形成を可能にするために融合されたドメインの二量体会合を用いる概念が、二価のホモダイマー（scFv）₂抗体の生成のために企画された次の例により単純に例示され得る。第１図に関して、この態様においては、成分Ａ及びＤは、同種のＶ_L及びＶ_Hドメインにリンカーを通してそれぞれ融合されるＶ_H及びＶ_Lドメインである（同様に成分Ｂ及びＣ）。ホモダイマー性二価抗体の生成のためのこのフォーマットは、抗−プリイドモマスアエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）抗体のＶ_H及びＶ_Lドメインがリンカーペプチドを通して融合されている単純なモデルシステム（第２図を参照）を用いて実験的に試験された。Ｅ．コリにおいて発現され、そして続いて精製される場合、この構造体は、HPLC及び非変性PAGEにより分析される場合、モノマー、ダイマー及びマルチマー形で存在することが見出された。このダイマー形が最も有力であり、そして親抗体に類似する抗原結合プロフィールを有することが見出され、さらに、二価形が自発的に生成されることが見出された。実験この研究に関しては、抗−Ｐ．アエルギノサ（PSV）抗体のＨ及びＬ鎖可変領域遣伝子をコードする、pUCに基づくpSW1−VHD1.3−VKD1.3−TAG1発現ベクター（Ward et al.，1989）（文献13）が使用された。新規の一本鎖抗体構造体が、元のFabをコードするベクターの変性により、（Chaudhary et al.，（1990）（文献15）により記載される14個のアミノ酸リンカーから生成された。この新規の scFv^*構造体は、検出目的のためにVKドメインの３′端に融合されるヒトカッパ鎮ドメインを有する。結果は、発現される場合、このscFv^*構造体が多価生成物を自発的に形成したことを示唆した。細菌株すべてのベクターは、Ｅ．コリ株XL−１−Blue（supE44 hsdR17）recA1 endA1 gyrA46 relA1 lacF′［proAB⁺lac19 lacZ M15 Tn10（tet^r）］）において形質転換され、そして発現された。テトラサイクリン選択性Ｆ′ピラス（F′pilus）は、pUCに基づくベクターの発現の完全な制御を可能にする。ベクターの構成 PSV scFv^*発現ベクターを、Higuchi（1989）（文献16）のポリメラーゼ鎖反応（PCR）変異誘発方法を用いてpSW1−VHD1.3−VKD1.3−TAG1ベクター誘導体（pSW1−Fah／Pa）から構成した。リンカーを２段階工程を用いて導入した。２種の異なった増幅を、プライマー、VHBAK：５′−AGGT（C／G）（C／A ）A（G／A）CTGCAG（G／C）AGTC（T／A）GG、及び LINKFOR：５′-CGATGTCATCCACTTTAGATTCAGAGCCAGAGCCAGAAGATT TGCCTTCTGAGGAGACGG 並びに VKFOR：５′-GTTTGATCTCGAGCTTGGTGCC 及び LINKBAK：５′-GTCACCGTCTCCTCAGAAGGCAAATCTTCTGGCTCTGGCTC TGAATCTAAAGTGGATGACATCGAGCTGにより行った。抗−Ｐ．アエルギノサ（pSW1−Fab／Pa）を発現するベクターpSW1−VHD1.3−V KD1.3−TAG1を鋳型DNAとして使用した。 PCRは、２つのユニットのTagポリメラーゼ（BCL，Lewes，East Sussex，Engla nd），1.25mMのdNTPs，１mMのVHBAK及びLINKFOR又はVHFOR及びLINKBAK，50ngのp SW1−Fab／Pa、及び50μｌまでの脱イオン水から製造された５μｌのI0Ｘ反応緩衝液（BCL）を含んだ。すべての反応を、ポリメラーゼ及び鋳型の添加の前、10 分間、UV処理し、そして次に、鉱油により被覆した。PCRを、次のバラメーターにより、Techne PHC−２熱サイクラー（Scotlab，Aherdeen，Scotland）を用いて行なった：94℃、１分、60℃、１分、72℃、１分、30サイクル。それらの反応の精製された生成物を混合し、そしてPCRの７回のサイクルをプライマーを用いないで行なった（94℃、１分；72℃、１分）、次に、この反応を94℃で維持し、同時にVHBACK及びVKFORプライマーを添加した。さらに30サイクルのPCRを行なった（94℃、１分；65℃、１分；72℃、１分）。反応生成物を２％（W／V）アガロース−TAWゲルを通して電気泳動処理し、そして650bpの生成物をPrep-a-遺伝子方法（Bio−Rad Ltd，Hemel Hempsted，Herts.，England）により10μｌの脱イオン水中に精製した。その生成物をPstＩ及びXhoＩにより消化し、そして標準条件下で、Pstｌ／XhoＩ消化されたpSW1−Fab／Pa中に連結し、pDM 1ベクター（第１０図）を構成した。抗体フラグメントの発現抗−Ｐ．アエルギノサscFv^*抗体フラグメントをコ−ドする発現ベクターpDM1 及び同等のFabフラグメントをコードするpSW1−Fab／Pa（それぞれ検出目的のために融合されたＬ鎖不変領域ドメインを有する）を評価した。発現条件をWard e t al，（1989）（文献13）から変性した：上記ベクターの１つにより形質転換されたXL1−blueを、１％グルコース、100μｇ／mlのアンピシリン及び12.5μｇ／ mlのテトラサイクリンを含む５mlの２xTY培地において37℃で一晩、増殖した。前記培養物１μｌを用いて、抗体フラグメントの発現のために新鮮な培地を接種した。発現を26℃で６〜18時問、0.1mMのIPTG，100μｇ／mlのアンピシリン及び 12.5μｇ／mlのテトラサイクリンを含むTerrificブイヨン又は２xTYにおいて行なった。抗体フラグメントをELISAにより培養上清液において検出し、又は下記のようにして細胞ペレットから直接的に精製した。抗体フラグメントの親和性精製抗−Ｐ．アエルギノサscFv^*及びFabフラグメントを、親和性クロマトグラフィーにより精製した。抗−Ｐ．アエルギノサFab又はscFv^*のいづれかを生成する細菌の培養物500mlを、4000rpmで20分間、遠心分離した。上清液を捨て、そして細胞ペレットをPBS10mlにおいて１分間、音波処理し、ペリブラズム抗体フラグメントを放した。この溶液を、製造業者の指針に従って調製されたCentrico n−10カラム（Amicon，Stonehouse，G1os，England）において１mlに遠心分離し、そして抗−ヒトFAb親和性カラム（Pierce，Warriner，Cheshire England）上に負荷した。７mlの画分を0.1Ｍのグリシン緩衝液（pH2.8）に溶離した。画分を PBSに対して一晩透析し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。サンドイッチELISAについての抗体フラグメントの検出細胞ペレットから精製された細菌上清液及び抗体フラグメント（FAb及びscFv^* ）を、96ウェル平底ポリスチレンブレート（Nunc，Denmark）において分析した。プレートをリン酸緩衝溶液（PBS）50μｌ中、１μｇの親和性精製されたヤギ抗−ヒトIgG抗体（Sigma Chomical Co.，Poole，Dorset，England）により４℃ で一晩、被覆した。プレートを、PBS中、２％（W／V）のBSA（画分V，Sigma）20 0μｌにより37℃で１時間ブロックし、そして200μｌのPBSにより二度洗浄した。培養上清液又は精製された抗体フラグメント50μｌを個々のウェルに添加し、そしてペレットを37℃で１時間インキュベートした。この後、ペレットをPBS中、0.05％（V／V）のTween20（Tw20／PBS）200μｌにより４度洗浄した。１：200 0にTw20／PBSにより希釈された、ホースラディシュペルオキシダーゼ接合のヤギ抗−ヒトIgG Fab抗体（Sigma）50μｌを個々のウェルに添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを200μｌのTw20／PBSにより６度洗浄し、そしてそのアッセイを、0.1Mのシトレートーホスフェート緩衝液（pH6.0）中、１mg／mlのＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩50μｌ及び１μｌ／mlの30％（ V／V）の過酸化水素（Sigma）により進行せしめた。反応を0.5Mのクエン酸100μ ｌにより停止し、そして450nmでの光学密度をBio−Rad M450プレートリーグーを用いて読取った。陽性の対照の抗−Ｐ．プセイドモナスマウス−ヒトキメラ性Ig G₁抗体をScotgen Ltd，Aberdeenにより供給した。この抗体は、Fab及びscFv^*可変ドメインが得られる元のネズミ親免疫グロブリンに由来した。ELISAの抗原結合の検出このアッセイを上記ELISAのようにして実質的には行なったが、但し、次の変法が行なわれた。Ｐ．アエルギノサをLuriaブイヨンにおいて一晩増殖し、ペレット化し、そして元の培養物の体積の半分を示す体積としてPBSにおいて再懸濁した。次に細胞を65℃で10分間、熱処理した。96ウェルのポリスチレンプレートを熱により殺害されたＰ．アエルギノサ50μｌにより一晩被覆した。Tw20／PBS によりプレートをブロックし、そしてPBSにより洗浄した後、50μｌの細菌上清液、精製された抗体フラグメント又はマウス／ヒトキメラ性抗−Ｐ．アエルギノサ抗体上清液を個々のウェルに添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。ペレットをPBSにより４度洗浄した後、アッセイを前記セクションに記載されるように進行せしめた。ウェスターンブロット発現されたscFv^*の特異性をウェスターンブロットにより調査した。100万個のＰ．アエルギノサ、Ｐ．フルオレスセンス、Al．キシロシダンス、Ac．カルコアチカス及びＯ．アントロピを、Rainbowサイズマーカー（Amersham Int.，Aylesb nry，Bucks，England）により標準の10％SDSポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動処理した。そのゲルを、Immobilion-Ｐ膜（Millipure Corp.，Bedfurd，M ass，USA）上にHoeffer T7Oセミドライブロッターにより0.8mA／cm²で電気プロットした。膜をPBS中、５％（W／V）ミルク粉末により一晩ブロックした。scFv^* （１μｇ／ml）を、PBS中、0.1％（V／V）のTween20において１時間インキュベートし、続いてPBS中、１％（V／V）のTween20により３度洗浄した。次に、膜を PBS中、５％（W／V）ミルク粉末、１％（V／V）Tween20においてオースラディシュペルオキシダーゼに接合された抗−ヒトカッパ鎖又は抗−ヒトFab抗体の１：5000 希釈溶液と共に37℃で30分間インキュベートした。scFv^*結合を、ECL化学螢光システム（Amersham，Int.）を用いて検出した。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動親和性精製されたFab及びscFv^*を、Ornstein（1964）（文献17）の方法を用いて7.5％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その分子のコンホメーションを決定した。scFv^*画分のHPLC精製 scFv^*のサンプル40μｇを、モデル302ポンプ、802Lモノマーモデュール、811 ダイナミックミキサー、116UV検出器、及びGilson710ソフトウェアにより制御された201画分コレクターを備えたGilson HPLC上でZorbax GF250サイズ排除カラムを用いて分析した。分析を、PBS及び0.2Mのリン酸ナトリウム緩衝液の両者を用いて１ml／分の流速で行なった。溶離物を280nmでモニターし、0.1AUFS及び0.5m lの画分を集め、そしてELISA及び非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。scFv^*及びFab精製及び抗原結合Ｌ鎖不変領域の存在が、Ｐ．アエルギノサに対して向けられたFab及びscF^*の両者の精製を可能にした。類似する量（２〜５mg）の両タンパク質を、一晩のIP TG誘発された培養物500mlに由来するペリプラズム細胞抽出物が親和性カラム上に負荷された場合に得た。溶離されたタンパク質の純度を、クーマシーブル染色を用いて変性SDS−PAGEにより評価した（第11図）。親和性精製されたFab（pSW1−FAb／Pa）、scFv^*及びキメラ性抗体の相対的抗原結合能力を比較した。キメラ性抗体及びscFv^*は類似する結合プロフィールを付与し、これは、scFv^*がそのモノクローナル抗体に類似する親和性を有したことを示唆する。Fab結合性は、キメラ性抗体又はscFv^* の結合性よりも２〜３倍弱かった。ウェスターンブロットを用いて、scFv^*タンパク質の特異性を試験した（第12図）。約21Kdの１つのバンドを、scFv^*をＰ．アエルギノサ抗原に対して試験する場合に観察した（第13図）。Al．キシロシダンス及びAc．カルコアチカス（但し、Ｏ．アントロピ、Ｆ．マルチボラン又はＰ．フルオレスセンスを除く）との交差反応性が注目された（第13図）。それらはすべてグラム陰性細菌である。scFv^*の分析細菌により生成されたFab及びscFv^*分子のコンホメーションの差異が、ELISA で観察される変えられた親和性を担当すると思われた。非変性ゲル電気泳動は、 Fab（pSW1−Fab／Pa）が単一ユニットと同一であり、そしてscFv^*が一連のマルチマー形として存在することを示した（第14ａ図）。scFv^*のモノマー及びダイマー形が優先しているように見えた。サイズ排除によるHPLC精製は、モノマー及びダイマー性scFv^*形の分離を可能にした。溶離時間と分子量マーカータンパク質の溶離時間との比較は、scFv^*のモノマー及びダイマー形の存在を確証した（第14ｂ図）。ELISAを用いて、Ｐ．アエルギノサのモノマー及びダイマー性scFv^* フラグメントへの結合能力を決定し、そしてこれは、そのダイマー形がキメラ性抗体に類似する親和性を有し、そしてモノマー形が低い親和性を有することを示した（第15図）。従って、二価の成分は、損なわれていない抗体に類似する結合特性を示し、ところがモノマーフラグメントはひじょうに低められた結合性を示す。ダイマー及びモノマー形はゲル濾過により容易に分離され得、これは純粋なダイマー抗体を調製するための単純な方法を提供する。 scFv^*ダイマーは非還元SDSゲルにおいてモノマーに解離し、そして従って、ジスルフィド結合により結合されていないように見える（データは示されていない）。データの解釈は、（scFv^*）₂のダイマー形成が非共存分子間Ｖ_H／Ｖ_Lドメイン会合によるものであり；その会合は第２図に示されるように異なったscFv^*ポリペプチドのドメイン間で生じる。得られるダイマーは二価であり、そしてＰ．アエルギノサ抗原のためにキメラ性抗体への結合親和性を示す゜複特異性組換え抗体形成のための追加の方法本発明は、構成パートナーの二量体化が、付加的に融合された天然の抗体ドメインのヘテロダイマー性会合を通して達成される新規の複特異的抗体を開示する。たとえば、抗体は、遺伝子融合によりＶ_H又はＶ_Lポリペプチドのいづれかに連結された２種の異なったFab又はscFv抗体フラグメント（又はいづれか他の抗体／抗体フラグメントの組合せ）から成る。従って、所望する複特異的抗体は、融合されたＶ_H又はＶ_Lドメインの認識及び天然のヘテロダイマー（ヘテロニ量体）化により特異的に会合される。本発明はまた、新規の複特異的抗体の生成方法を開示する。複特異的抗体の生成のために予測される単純な型は、２種の一本鎖抗体scFv１及びscFv２の会合である。１つが第１図に示される一般的なスケムに関する場合、ドメインＡ及びＣはそれぞれＶ_H１及びＶ_L２であり、そしてドメインＢ及びＤはそれぞれＶ_L１及びＶ_H２である（第３図）。この最小形態においては、個々のそれぞれのペプチド鎖の２種のドメインの両者が通常のscFvSを形成するために会合し、そしてさらに、２種のペプチド鎖のヘテロダイマー（及び多分、大きなマルチマー性会合）が分子間ドメイン会合により生成されることが明らかである。本発明の好ましい態様は、１つのscFv抗体フラグメント（成分Ａ）へのＶ_H又はＶ_L抗体ドメイン（成分Ｂ）及び第２のscFv（成分Ｃ）へのその対応するパートナー（成分Ｄ）のＣ−末端融合により形成される複特異的抗体である。そのような種は第４図に示される。同様に、複特異的F（ab）₂ヘテロダイマーに関しては、Ｖ_H又ばＶ_L（成分Ｂ及びＤ）のいづれかが、Fabフラグメント（成分Ａ及びＣ）のＶ_H／Ｃ_H１ポリペプチド鎖にＣ−末端融合により付加され得る。このアプローチを用いれば、複特異的抗体を形成するためへのFab二量体化は、結合されるＶ_H及びＶ_Lドメインの自発的且つ特異的会合により促進されるべきである（第５図）。本発明の他の態様の例は、第６〜９図に示されるＣ−末端融合（成分Ｂ及びＤ）のように異種性（ダイマー、たとえばＶ_H・Ｃ_H１／Ｖ_L・Ｃ_L又はＣ_H１／Ｃ_L）である他の天然に存在する抗体ドメインの使用を包含する。この及び他の可能なコンホメーションは前で言及されている。いづれか特定型の抗体又は抗体フラグメントの選択は本発明の概念に対して基本的ではないが、しかし選択されるＣ−末端ドメインの特異性及び親和性が最終生成物にひじょうに影響を及ぼすであろうことが明らかであることは当業者に明らかであろう。所望される二量体化及び必要とされる認識特異性を提供するいづれかのドメインが使用され得る。しかしながら、たとえば特定のＶ_Hドメインが他のものよりも一定のＶ_Lドメインとより効果的に会合することが認識され（Ｆ_v のためのＫ_D値は10^-4Mから10^-7Mに変化する）（文献18）、そして従って、特定の二官能価のＶ_H／Ｖ_L結合対がヘテロダイマーの形成を促進するために最適化されるべきであり、そしてまた、ホモダイマーの形成を最少化するためにも最適化されるべきである（特に、複特異物を生成する場合）。同様に、分子がその分子の特異性及び／又は結合親和性をお互いのために改良するために、及び従って、それらの二量体化性質を改良するために変性され得ることが予測される（文献19）。たとえば、これはドメイン間疎水性接触の構築、たとえば変異誘発又は化学的変性、会合を安定化するためにドメイン間に金属（又は他の分子結合部位）の導入、シスルフィド橋を形成するために重要なシステイン残基の導入、等により達成され得る。補足的なＦ_vドメインが、二価又は複特異的抗体の生成の際に創造される場合（融合体としてＶ_H／Ｖ_Lドメインの組合せを用いる場合のように）、抗体は実際、三価であり得る。この特別な抗原結合部位はそれ自体有用である。結合部位が他の部位以外の種々のタイプの抗原又はリガンドを認識する場合、この性質は、精製（マトリックスに結合されるリガンド）、安定性（部位に付加され、そして結合されるリガンド、それによりＦ_vの２種のドメインが“架橋”する）のために、又はラベル（付加されるリガンド−レセプター複合体）として使用され得る。この考えはまた、複特異性のために価値あるものであり、すなわち１つのタイプの結合部位がリガンド結合のために使用される場合、それはトリマーについての上記と同じ目的のために使用され得る。本発明は、特定の分子、たとえば抗原を結合する能力を有する抗体を提供する適切なCDRを有する構造骨格をそれぞれ含んで成る最小の２種のＦ_vドメインを有する抗体を提供する。本発明は、抗原認識及び結合ドメイン（及びいづれか他の確認された配列、たとえば不変領域、等）がそれぞれＶ_H又はＶ_L抗体ドメインのような“会合”ドメインにＣ−末端で融合される形態で例示されるが、但し、これだけではない。構成パートナーの会合は、融合されたＶ_H及びＶ_L抗体ドメインの天然のヘテロダイマー化を通して達成される（第４及び５図）。そのような抗体及びそのような抗体をコードする遺伝子の生成方法はまた、本発明により提供される。本発明の好ましい方法に関して、複特異的（scFv）₂・Ｖ_H／Ｖ_L又はF（ab）₂ ・Ｖ_H／Ｖ_L実在物（第４図及び５図）、又はＣ_H１/Ｃ_L又はＶ_H−Ｃ_H１／Ｖ_L・Ｃ_L 融合ドメインによるそれらの誘導体（第６〜９図）を生成する方法が提供される。この方法は次の基本的スケムを含んで成る：（ｉ）所望する結合性質を示す抗体からの抗体Ｆ_v及び／又はFab遣伝子のクローニング又は合成。前記遺伝子は、増殖及び／又は遺伝子発現のために適切なプラスミド又はファージベクター中に挿入されるべきである。（ii）付加されるドメインの正しいヘテロダイマー化に基づいて、複特異的構成物が創造されるように、それぞれの抗体パートナーへのＣ−末端遺伝子によるＶ_H又はＶ_Lドメイン遺伝子の付加。（iii）適切な発現ベクター又は複数のベクター（前で実施されない場合）への完全な個々の遣伝子構成体のトランスファー及び宿主生物への続く導入。（iv）抗体生成を達成するために宿主生物の増殖及び前記導入された組換え遺伝子の発現。（ｖ）抗体／複数の抗体の精製、及び複特異的構造体を得るためへの生化学的操作の確保。天然においては、本発明の段階の詳細は生成されるべき複特異的抗体の形、たとえば（Ｆ_v）₂・Ｖ_H／Ｖ_L又はF（ab）₂・Ｖ_H／Ｖ_L（第４及び５図）（ここでそれらは同時又は個々に発現され）、及び使用される予定である宿主生物（たとえば原核生物又は真核生物）に依存するであろう。本発明は次の例により例示されるが、これは限定するものではない。例１この例は、Ｅ・コリにおいて発現される２種の異なったscFvフラグメントからの複特異的抗体の生成を例示する。（ａ）対象のモノクローナル抗体を生成するマウスハイブリドーマ細胞系による開始して、RNAにおけるハイブリドーマからのその対応するＨ及びＬ鎖可変配列の決定のための適切な方法が、Orlandi et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，86，3833−3837，1989により記載される。（ｂ）元のマウスモノクローナルに対応する再形状化されたヒト抗体をコードする遣伝子（必要なマウスCDR及び骨格残基を含んで成る）が、部位特異的突然変異誘発（Riechman et al．を参照）により生成され得る。他方、再形状化されたヒト抗体をコードする遣伝子は、遺伝子合成によりアセンブリーされ得る（Ju nes et al.）（文献２０）。（ｃ）それらの遺伝子は、Bird et al.，Science 242，423−426，1988（文献 21）又はHuston et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，5879−5883，1988（文献22）により記載されるようにscFvフラグメントを形成するために種々の分子生物学的技法を用いて操作され得る。完全なヒトＶ_H又はＶ_Lドメイン（天然においては対であるが、しかし好ましくは、利用される抗体に対して特異的結合を示さない）が、２種の成分scFv構成体のいづれか１つにＣ−末端遣伝子融合により付加され得る。（ｄ）次に、完全にされた遺伝子が、適切な発現ベクター中に、それらが単一のプロモーター下で１つのベクター上での２種のシストロンシステムにおけるように発現され、同時形質転換された宿主において一緒にそれ自体のベクター上にそれぞれ担持されるものから単独で発現され、又は異なった培養物においてそれぞれ個々に増殖されるかに依存してクローン化され得る。そのようなベクターの例は、次の文献から得られる：SRerra et al.，Science，240，103 8−1041，1988（文献３）、Ward et al.，Nature，341，544−546，1989（文献１３）、Bird et al.，Science 242，423−426，1988（文献21），Hoogenboom e t al.，Nuc．Acid Res．19，4133−4137，1991（文献23）.，等、複特異的生成の必要のために適合されるベクターを得るための追加の変化が必要である。（ｅ）複特異的形成がインビトロ又はインビボで及び形成される生成物の状態で行なわれることに依存して、所望する複特異的物を得るために精製された抗体フラグメントの追加の還元及び再酸化を組込むことが適切である（Bird et al. ，Science，242，423−426，1988（文献21），Sherra et al.，Science，240，1 038−1041，1988（文献３）、Koste1ny et al.，J.Immunol．148，1547−1553， 1992（文献10）。同様に、F（ab）₂・Ｖ_H・Ｖ_Lフラグメントは類似する手段によりＥ．コリにおいて生成され、そしてＶ_H／Ｖ_L会合技法は、他の抗体フラグメント及び他の二量体化目的のために利用され得る（第５図）。例２この例は、２種の異なったFabフラグメントを発現する哺乳類細胞系からの複特異的抗体の生成を例示する。初期方法は、例１におけるのと実質的に同じである（段階ａ及びｂ）。第５図に示される複特異的物の構成は、Kostelny et al.，J.Imm unol．148，1547−1553，1992（文献10）により記載されるようなF（ab）₂・Jun ．Fos・構成のために使用されるのと同じ技法により行なわれ得、ここで追加の二量体化ドメインの１つがＣ_H２イントロンの初めの少々の残基に、それがＶ_H遣伝子のＣ_H１にスプライスされ、従って通常のＣ_H２及びＣ_H３を置換するように融合される。Ｖ_L／Ｃ_L遣伝子は、Ｖ_H担持ブラスミドにより同時トランスフェクトされる別々のベクターから発現される。再び、発現及び複特異的生成のための種々の技法が、Ｅ．コリ発現のためにこれまで詳細に記載して来たように試みられる。参考文献次の参考文献は引用により本明細書にすべて組込まれる。１．Kohler G.，& Milstein C.，（1975）．Continuous cultures of fused cel ls secreting antibody of predefined specificity．Nature，265，495-497．２．Verhoeyen M.，Milstein C.，& Winter G.，（1988）．Reshaping human an tibodies：grafting an antilysozyme activity．Science，239，1098-1104．３．Skera A.，and Pluckthun A.，（1988），Assembly of ａ functional immu noglobulin Fv fragment in E.coli Science，240，1038-1041．４．Better M.，Chang C.P.，Robinson R.R.，and Horwitz A.H.，（1988）．E. coli 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者エメリー，スティーブンチャールズイギリス国，アバーディーンシャーエービー51 ０ディーダブリュ，オールドメルドラム，クロムレットプレイス 21 (72)発明者ウィンター，グレゴリーポールイギリス国，ケンブリッジシービー１４ユーティー，カベンディッシュアベニュ 64 (72)発明者カー，フランシスジョセフイギリス国，アバーディーンシャーエービー４０エックスユー，バルメディー, ザホールディングス，バーチリー（番地なし) (72)発明者マクグレガー，ダンカンパトリックイギリス国，アバーディーンシャーエービー51 ０エヌイー，エヌアールオールドメルドラム，バルケアン，コテージナンバー２

Claims

【特許請求の範囲】１．標的物を特異的に認識し、そしてそれに結合する第１及び第２結合領域を有する特異的結合タンパク質であって、前記結合領域がそれぞれ第１及び第２ポリペプチド鎖上に少なくとも一部含まれ、前記鎖がさらに、お互いに結合できる第１及び第２の会合ドメインをそれぞれ組込み、前記第１及び第２ポリペプチド鎖の組合せを引き起こし、それによって、前記第及び第２の結合領域の結合特異性を組込む単一タンパク質を提供することを特徴とする特異的結合タンパク質。２．前記第１及び第２結合領域が異なった標的物を認識する請求の範囲第１項記載の特異的結合タンパク質。３．前記会合ドメインが抗体に由来する請求の範囲第１又は第２項記載の特異的結合タンパク質。４．前記会合ドメインがヒトタンパク質、すなわちヒト免疫系に暴露されたタンパク質に由来する請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質。５．前記会合ドメインが、それらが天然においては通常、会合しない場合でさえ、会合できる２種の同一のドメインである請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質。６．前記会合ドメインが、抗体Ｖ_H及びＶ_L領域、抗体Ｃ_H１及びＣ_L領域、抗体Ｖ_H・Ｃ_H１及びＶ_L・Ｃ_L領域から選択される請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質。７．前記第１及び第２結合領域が抗体抗原−結合ドメインである請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質。８．前記抗原結合ドメインがＶ_H及びＶ_L領域を含んで成る請求の範囲第７項記載の特異的結合タンパク質。９．前記Ｖ_L及びＶ_H領域がFabフラグメントに含まれる請求の範囲第８項記載の特異的結合タンパク質。 10．前記Ｖ_L及びＶ_H領域が一本鎖Ｆ_vフラグメントに含まれる請求の範囲第８項記載の特異的結合タンパク質。 11．前記結合ドメインのいづれか又は両者が抗体のＶ_H又はＶ_L領域のたった１種に由来する請求の範囲第７項記載の特異的結合タンパク質。 12．前記結合ドメインのいづれか又は両者が、抗体のＶ_H領域に由来する請求の範囲第11項記載の特異的結合タンパク質。 13．請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質のポリペプチドをコードするDNA。 14．１又は複数の発現ベクターに含まれる請求の範囲の範囲第13項記載のDNA 。 15．請求の範囲第13項記載の組換えDNAを含み、そして前記特異的結合タンパク質のポリペプチドを生成するために前記DNAを発現できる宿主細胞。 16．前記ポリペプチドが、発現に基づいて、前記特異的結合タンパク質を形成するために会合する請求の範囲第13項記載の宿主細胞。 17．請求の範囲第15項記載の宿主細胞に前記組換えDNAを発現し、それによりコードされるポリペプチドを生成し、そして必要な場合、前記ポリペプチドの翻訳後操作又はプロセッシングを行ない、前記特異的結合タンパク質を生成することを包含する方法。 18．請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質の生成方法であって、（ｉ）前記第１及び第２の結合領域をコードするDNAをクローン化し、又は合成し、（ii）前記第１及び第２の会合ドメインをそれぞれコードするDNAを、前記第１及び第２の結合領域のDNAに読取り枠を整合して連結し、（iii）（ｉ）及び（ii）の前記融合されたDNA構造体を含む１又は複数の発現ベクターを供給し、（iv）前記発現ベクターを宿主生物中に挿入し、（ｖ）前記宿主生物を培養し、前記コードされるポリペプチドを発現し、そして（vi）前記第１及び第２の会合ドメインの組合せを引き起こし、又は可能にし、前記特異的結合タンパク質を形成することを含んで成る方法。 19．請求項１〜12のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質を包含する医薬製剤。 20．ヒト又は動物患者を処置するために請求の範囲第19項記載の製剤を使用することを包含する方法。 21．請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載の特異的結合タンパク質を包含する診断用試薬。 22．診断技法に請求の範囲第21項記載の試薬を使用することを包含する方法。