JPH03500005A - 組換えｄｎａタンパクの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′本発明は組換えＤＮＡタン白の製造法、特に組換えＤＮＡ技術により抗体Ｆｖ 断片を製造する方法に関する。

以下の記述では、多くの文献に言及する。これらは名前と番号ヲ〔〕にて示す。

文献の完全な情報は末尾に番号順に示す。

天然の抗体分子の構造は周知である。即ち、４個の鎖、２個の重鎖および２個の 軽鎖から成り、そのＮ　−末端は整列している。抗体の重鎖は比較的フレキシブ ルなアミノ酸配列により他のドメインに結合した多くのドメインを形成する。軽 鎖はＣ−末端不変ドメインに結合したＮ−末端可変ドメインから成る。重鎖はＮ −末端可変ドメインと３個以上の不変ドメインから成る。６対の軽鎖と重鎖可変 ドメインは共同して、抗原結合領域を形成する。

抗体の抗原結合（又は可変）領域（各々は軽鎖と１鎖可変ドメインから成る）１ 注意深くタン自分解的消化により、残りから分離できることは２・３の単離例に て報告された。この分離領域は一般にＦｖ領領域して知られている。単離された 重鎮又は軽鎖可変ドメインはダイマー化して擬−Ｆｖ領領域得ることが出来るこ とも公知である。

Ｆｖ領領域は擬−１１’ｖ領域（以下Ｆｖ断片とまとめて呼ぶ）は診断薬又は治 療剤として使用できることも示唆された。例えば、放射能標識したＦｖ断片は身 体中の腫瘍を探すのに使われた。Ｆｖ構造に結合されているａ胞律剤は化学治療 剤として使用できる。Ｆｖｗ′ｒ片は全抗体分子即ちＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２ 断片と比べて比較的小さ込から、この断片はそのターゲットに容易に達すること ができ、ターゲットに多量結合でき、かつ患者から速かに除くことができること も推測された。

タン自分解的切断によりＦｖ領領域つくるのは実験室条件下でも難しく、実際上 工業的見地から実施不能である。組換えＤＮＡ技術を使ってＦｖ断片を微生物に つくらせることはムーブとデ７アロニ〔１〕により提案された。しかし、Ｆｖ断 片を生産するのに必要な遺伝情報を含むように形質転換された微生物は必要なタ ン白を合成しうるが、活性Ｆｖ断片を得るのは非常に難しいことが分った。合成 されたタン白は微生物中の不溶性封入体に通常見られる。Ｆｖ断片を得るために 、フィールド等〔２〕に記載されるように、微生物構造を破壊し、タン白を分離 しついでタン白を再変性する必要がある。しかし、このような方法により得たＦ ｖ断片の収量は低い。

スクラとブラックサン〔６〕が確認していることは、バクテリア宿主細胞を使っ て組換えＤＩＣＡ技術により機能的Ｆｖ断片を生産することは不可能であると信 じられていた。しかし、彼等は、Ｅ、　ｃｏｌｉ中に機能的抗−ホスホリルコリ ン？ｖ断片を生産できる特定の発現系を開発した。はんの少量のタン白Ｃ０，２ １９／ＩＩ培養物）がこの発現系により得られた。即ち、この開発された系が工 業的生産を可能とするかどうかの問題は残っている。特定の発現系が別のバクテ リア系の他の抗体から誘導されたＦ’ｖ断片を得るのに使用できるかどうかも未 解決である。

したがって、組換えＤＮＡ技術によりＰｖ断片を好収率で生産可能なことが望ま しい。

本発明によれば、以下の工程から成るＦｖ断片を製造する方法が提供される。即 ち、 抗体軽鎖又は重鎮の可変ドメインのみをコードするＤＮＡ配列を有するオペロン を含む真核発現ベクターで真核宿主細胞を形質転換し、 この形質転換した宿主細胞ｔ”、ＤＮＡ配列によりコードされたタン白を合成さ せる条件下で培養し、ついで合成されたタン白を集取する工程である。

ＦｖＶＴ片の鎖を引き出しそして十分機能的なＦｖ断片を培養上澄液に生産され るように、宿主細胞により正しく組立てることが望ましｂｏ 望ましｈ別法として、宿主細胞をそれぞれ相補的重鎮又は軽鎖可変ドメインをコ ードするＤＮＡ配列をもつオペロンを含む第２の真核発現ベクターで形質転換す るものである。第２の望ましい別法では、第１の発現ベクターはそれぞれ相補的 重鎖又は＠鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む第２のオペロンを有す る。

どちらの場合でも、翻訳産物は＠鎖とＸ鎖可変ドメインのダイマーから成るＦｖ 断片である。

必要なら、各可変ドメインは９−末端に融合した薄紫、リガンド又はトキシンの 如きエフ千りタータン白を有する融合タン白として発現させることができる。

このエフエフ−タータン白は、イメージ用の放射活性又はフルオレラセン分子を 結合し、又は治療用細胞毒剤を結合するのに使用することができる。この場合、 各オペロンは読み枠中、可変ドメインコード配列に連結した工７エクタータ／白 をコードするＤＮＡ配列を含む。

この各可変ドメインが別個に翻訳される場合、生産された？ｖ断片は非共有結合 によってのみ一緒に保持される。したがって、Ｆｖ断片は例えばＰＩ（を下げる ことにより解離し易い。Ｆｖ断片の安定性を改善するために、各ＤＮＡ　ｔ−コ ードする配列をその３′末端で変えることができ、１つ以上のシスティン残基は 各可変ドメインのＣ−末端で生産される。このような改変を行なうと、ダイマー 中の可変ドメインはＳ−Ｓ結合により連結するようになり得る。このことはｌｌ ’ｖ断片の組立ても促進しうる。

別法として、Ｆｖ７ラグメントは第一可変ドメインをコードする第−ＤＮＡ配列 および第二可変ドメインをコードする第二ＤＮＡ配列をオペロン中に有するベク タ−の使用により安定化させることができる。この第一配列および第二配列は結 合ペプチド配列をコードする第三ＤＮＡ配列により連結されて込る。この方法に 類似する提案はＬａｎａｅｒおよびＢｉｒｄにより記載されている〔４〕。これ らのドメインをコードする配列は、翻訳産物におりて、第一可変ドメインが、第 二可変ドメインの正常Ｎ−末端に、結合ペプチド配列により連結された、そのＣ −末端を有するように配列させることができる。この場合に、結合ペプチド配列 は、妥当な長さと柔軟性とを有する必饗がある。

第一および第二のドメインをコードする配列は、同一ドメインをコードすること ができるが、好ましくは相補的軽鎖ドメインと重鎖ドメインとをコードする。

この場合に、所望により、１個だけのエフェクタータンパク質ｉＦｖフラグメン トに融合させることができる。

ＤＮＡをコードする配列（１つまたはそれ以上）はｃＤＮＡ、ｒツムＤＮＡまた はその混合物を含有することができる。好ましくは、これらのコード配列は、モ ノクローナル抗体、有利には、マウスモノクローナル抗体に由来するものである 。これらのコード配列は「天然」配列であることができ、ある論は「ヒューマナ イズ化」配列であることができる。このヒューマナイズ化配列は一つの種からの モノクローナル抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ５）が別の種からのフレーム ワークＱ域（ＦＲｓ）上にグラフトされたものである。「ヒューマナイズ化」抗 体に使用することができる技術はＲｓｉｃｈｍａｎｎ等により記載されている〔 ５〕。

本発明の第二の態様に住込、ドメインの一方または両方がそのＮ−末端部位に可 変ドメインを有し、かつまた、そのＣ−末端部位に、騨素、リガンｒまたはトキ シンを有する融合タンパク質よりなる、Ｆｖ槽構造提供される。

これらのドメインをコードする配列は、オペロンでプロモーターの制御の下にあ る。好ましくは、このプロモーターはヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ　） メジャーイメデイエートアーリイ（Ｍ工Ｅ）遺伝子からのプロモーターのような 強力なプロモーターである。

形質転換させる、真核宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞であり、たとえば ＣＨＯ細胞を使用することができる。しかしながら、宿主細胞はミニロイド細胞 、特に、形質転換される前には、完全抗体または軽鎖を分泌しないミエローマ細 胞は最も好ましい。このような細胞系は充分に知られており、広く入手すること が本発明で使用するのに適する発現ベクターを製造することができ、そして宿主 細胞中にトランス７オームすることができる技術は、当技術でよく知られており 、たとえばＭａｎｉａｔｉｓにより開示されている〔６〕。

形質転換された宿主細胞によって製造されたＦｖフラグメントは、現在利用でき る、方法のいずれによってても採取することができる。−例として、抗原はクロ マトグラフィメジウム上に不動化させることができ、培養上澄液をこのメジウム 上に通す。これにより、Ｆｖ７ラグメントは上澄液中の残りの成分から分離され る。

本発明はまた、本発明の方法で使用するための真核細胞発現ベクター、このベク ターで形質転換された真核宿主細胞、および本発明の方法により製造されるＦｖ 　７ラグメントを包含するｔ 微生物における組換えＤＮＡ技術を使用して容易に採取できる量の官能性’Ｆｖ 構造体を製造することには失敗していたことから（５ｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃ ｋｔｈｕｍの特別の発現系〔３〕を使用する場合を除＜）、Ｉ’Ｖを真核細胞内 で、培養培地中に分泌される安定な産物として、良好な収率で製造できることは 驚くべきことである。

約１０ダ／培養物１１のＦｖの収率が得られ、この改良された収率はこの真核細 胞発現系がさらに発展することを予想させる。従って、本発明は、組換えＤＮＡ 技術によって、Ｆｖ構造体を商業的に有用な量で製造することを可能にするとい う、予想外の利益を提供する。

さらに、真核宿主細胞を使用する利点には、分泌されたＦｖ構遺体が代表的に、 細菌発熱物質の不存在の下に製造されることにある。

もう一つの驚くべき特徴は、Ｆｖフラグメントを、Ｂ工Ｐ　（重鎖結合部位〕の ための結合部位がＰｖフ２グメント中に存在しなくても、適当に組立てることが できることにある。Ｂ工Ｐの結合が抗体の正しい組立てを確実にするために必須 であるものと推測されていた。

本発明の方法は、いずれのＦｖ　７　”）グラフトにも一般的に適用することが でき、従って、所望の特異性を有するＦ’ｖ　７ラグメントを容易な方法で製造 することを可能にするものと信じられる。さらにまた、７７７ラグメントを哺乳 動物で製造することができるので、インビボにおいてそれらを使用するための調 節を容易にうろことができる。

ここに、本発明の若干の態様を、図面を引用して例示だけの目的で示す。

これらの図面において、 第１図は、とューマナイズ化抗−リゾチームＦｖ　７ラグメントの産生に使用す るためのベクターの構築を示すものである； 第２図は、第１図のベクターに使用されたりシエイゾ化ＨｕＶＬＩ、Ｙ８遺伝子 のヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列を示すものである； 第３図は、抗−ＴＡＧ　７２　Ｆｖ　７ラグメントの製造に使用するためのベク ターの構築を示すものである；そして 第４図は、Ｂ　７２．３　ＰｖのＳＤＢポリアクリクリミドｒルのフルオログラ フを示すものである。

抗体Ｄ１．３（リゾチームに特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｖｓｒｈｏｅ ｙｅｎ　ａｔ　ａｌ、　（７）　）の重鎖可変領域を、ヒトミニｏ　−？　ｙｚ ｖｔ　（５ａｕｌ　ａｔ　ａｌ、　（３）　）によって産生されるモノグローナ ル抗体のＦＲｆ：コードするＤＮＡ配列にそのＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を グラフトすることによってヒューマナイズした。Ｂｏｎｅθ：０ｎ８Ｂ蛋白ＲＥ 工配列（Ｅｐｐ　ａｔ　ａｌ、　（：１０）　）に似たヒトカッパ釧コンセンサ ス配列のＦ　Ｒ（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、［９：ｉ）をコードするＤＮＡ配列 にそのＣＤＲをコードするＤＮＡ配列をグラフトすることによってＤｌ、３の軽 鎖可変領域もヒューマナイズした。Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ　ａｔ　ａｌ、　（４） の方法に従って、長ｂオリゴヌクレオチドについての部位特異的突然変異を用い てグラフトを実施した。

Ｆｖｓ造の発現については、ヒニーマナイズ化軽鎖及び重鎖可変領域のコード配 列の３′末端にストップコドンを導入した。

最初の構築では、イムノグロブリン重鎖プロモーター　／　ｘ　７　／％　ｙサ ー配列（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｍ、　（７）　）のコントロール下とは 独立に、シングルベクター中にコード配列を挿入した。第２の構築では、ＨＣＭ Ｖ−Ｍ工１遺伝子プロモーター／エンハンサ−配列（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ　ｅｔａ ｌ、　（１１）とＢｏｓｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１２：］　）のコントロー ル下にそれぞれのコード配列を挿入した。ＨＣＭＶ配列のＲＮＡスタート部位を 利用して、可変領域コード配列の５′末端でシグナル配列の５′７ランキング配 列にＨＣＭＶ−Ｍ工Ｅ遺伝子プロモーター／工ンノ・ンサー配列を融合すせた。

第２の構築体ｐＬＲ□は第１図に示した。

リシエイゾ化軽鎖可変領域ＨｕＶＬＬＹＳ及びリシエイプ化重鎖可変領域Ｅｕ） アＨＬＹＳ（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ａｔ　ａｌ、（７）　）をそれぞれＭ１３中 にＨｉｎｄ　ｌ［−ＢａｍＨ：［フラグメントとしてクローン化した。リシエイ プ化ＨｕＶＬＬＹＳ遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ駿配列を第２ 図に示した。それぞれのコード配列の３′末端にＸ２つのストップコドン次いで Ｅｌａｃ　１部位を部位特異的突然変異により導入した。

それぞれの遺伝子のリーダー配列の翻訳スタート部位とＲＮＡスタート部位との 間に、第２図に示したように１（ｉｎｄ　［１部位を導入した。得られる可変領 域遺伝子をｐｓＶｇｐ　ｔベクター（峠ユｌｉｇａｎとＢｅｒｇ　（１４）　） にＨｌｎｄ　ｌｌ　−ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローン化した。

このベクターは、リンカ−（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｈ　（１５）　）と して工ｇ−重鎖エンハンサー（工ｇ　Ｈｅｎｈ　）のＥｃｏＲ■−Ｈｌｎｄ　［ １７ラグメントを有してｈた。それぞれの遺伝子の５’　Ｓａｃ　ｌ　−Ｂａｍ ＨＩ７．７グメントを次りで、ヒトカッパ定常領域（３′末端Ｃｋ　）　（Ｒｌ ｏｔｅｒ　ａｔ　ａｌ、　（１３）　）のＳａｃ　ｌ’　−ＢａｍＨｌ　７ラグ メントと交換し、ポリアゾニレ−ジョンシグナルを得た。それぞれのベクターの Ｈｌｎａ　ｍ　部位Ｋ　、エンハンサ−、フロモーター及Ｑ［Ｇ１非翻訳化エク ソン（ＨＣＭＶ　ｅｎｈ−ｐｒｏ　）　ｆ含有するＨＣＭ　−Ｍ工Ｅ遺伝子のＨ ｌｎｄ　ｍフラグメン）　（ｓｔｅｎｂｅｒｇｓｔ　ａｌ、　（１１）とＢｏａ ｈａｒｔ　ａｔ　ａｌ、　［１２）　）　ｔ−クローン化した。次いで、完全’ Ｖ　Ｌ−遺伝子（Ｉｇ−エンハンサ−１ＨＣＭＶ−プロモーター、ＶＬ−コード 領域及びポリアデニル化シグナルを含有する）をｐＢＧｓ　１８（５ｐｒａｔｔ 　ａｔ　ａｌ、　（１６）　）に１ｊｉｃｏＲｌフラグメントとしてサブクロー ン化し、得られるベクターｐＢＧｓ−Ｊｖ■屈を第１図に示すようにＢａｍＨｌ 　−７７グメントとしてｐＢＶｇｐｔ　−ＨｖＶＨＬＹＳベクターにクローン化 シタ。最終プラスミドｐＬＲｌは、更に、゛薬剤アンピシリン（ａｍｐＲ）、カ ナマイシン（’Ｋａｎ　）及びマイコフェノール酸（Ｋｃｏ　ｇｐｔ　）の耐性 遺伝子、２つのｃｏｌＥ　ｌ複製オリジン（ｃｏｘＫ　ｌ　ｏｒｉ　）及び５ｖ ４（１エンハンサ−（Ｓ　Ｖ　４　Ｑ　ｅｎｈ−ｐｒｏ　）を含んでいた。クロ ーニングに用いたＢａｍ１ｌｉｌ　（Ｂ）　、］１ｉｉｎｃｌｌ［（Ｅ）　、Ｉ ＣｃｏＲｌ　（Ｋ）及び５ａａｌ　（Ｓ）を示した。

エレクトロボレーシ＝ｉ　ン（Ｐｏｔｔｅｒ　ａｔ　ａｌ、　（１７：）　）に よって、プラスミドを非産生ミエローマセルライン（ｙｓｏ　Ｇａ１ｆｒｅ　ｓ ｔ；　ａｘ、　（１８）　）にトランスフェクトした。得られるトランスフェク ト体をマイコフェノール酸（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ　（１４）　）で選択 した。

トランスフェクト細胞クローン’ｆｃ、”８−メチオニン取り込み、リゾチーム セファロースを用いた培養上清のアフィニティー精製及び５ＤＳ−アクリルアミ ドデル分析によりスクリーニングした。

ＨＣＭＶプロモーターを用いた場合には、１ｇプロモーターを用いた構築体に比 べて分泌Ｆｖ　７ラグメントは約Ｉ　ＤＯ−１０００倍多かった。Ｆｖ　７ラグ メ／トの調製に用いたクローン化セルラインは、ローラーボトル中で生育させた 時は約８ｑ／Ｊを分泌した。かくして、インタクト抗体の組換え体と同様の収率 で、ミエローマ細胞中にてＦｖ　７ラグメントを産生ずることが可能となる。

８ＤＳデル分析により、Ｆｖ７ラグメントは約１２ｋＤ（計算値：ＶＨ−１２， ７４９、ＶＬ−１１，８７５）の２つのチェインを有していた。それはりゾチー ムセ７アロースにより培養上清から容易に精製されたので、機能的形態で分泌さ れている。精製Ｆｖ　７ラグメントを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ　）中 のＨＰＬＣサイズカンム（Ｂｉｏｇｏｒｂａｘ　Ｇ　Ｂ　２５０　）で調べた所 、シングルビークが観察され、その保持時間は濃度７０及び０．３ｍ９／ｌでは 変化はなかった。

ＦｖフラグメントｔｐＨ７，５でネイティブアクリルアミドゲルで分析した。Ｆ ｖ　７ラグメンドは単一バンドを示し、そこにはＳＤＳデルで分析した所、ｖＨ 領領域ＶＬ領領域が含まれていた。このバンドは、リゾチーム存在下ではネイテ ィブゲル上でシフトした。シフトバンドにはりゾチームとＶＨ及びＶＬ領領域含 まれていた。更に、単離したＶＬ領領域、Ｆｖ７：）グメントとは相違する移動 性を示した。単離ＶＨはグルでは移動しなかった。これらの結果から、ＦＪ（７ ，５でのＦｖ）ラグメントのプレドミナント体は関連ＶＨ−ＶＬヘテロダイマー であることが強く示唆される。

また、超遠心沈降分析による見かけの分子量は約２３．０５±０．３５　ｋＤ（ ０，７３の部分特異的容量）であった。

ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーの形成は、蛋白濃度０．５Ｗ／ｌでの３．７％ホルム アルデヒド／ＰＢＳでの架橋により確立された。約２５ｋＤの架橋化ＶＨ−ＭＬ ヘテロダイマーが形成された。このようなヘテロダイマーはりゾチームセ７アロ ースに結合する。架橋化物質をＳＤＳデルに過剰に負荷した所、わずかに低分子 量の小分画（５％以下）が現われた。ＶＢホモダイマーと考えられる高分子量バ ンドは観察されなかった。

それにもかかわらず、ＦｖフラグメントはＰＨ４，５でネイティブアクリルアミ ドデル上で溶解した。ＶＨとＶＬとはそれぞれ単一バンドを示した。その蛋白分 解消化を促進するために、歴史的には低…での抗体のインキュベーショ／が行な われている。

中性−では、Ｆｖ７ラグメントが主に関連している場合は、動的平衡である。精 製生合成ラベル化ＶＨ領域は、非ラベル化ＷＥ−ＶＬヘテロダイマーとインベー トシた時にはこの非ラベル化ＶＨ領域と交換した。

ラベル化ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーはホルムアルヒトによる架橋によりトラップ できた。試薬の非存在下でのブレインキュベーションなしに架橋化法により１晩 で平衡に到達するに十分にこの交換は早い。

本発明方法により得られるタイプの蛋白は、構造研究及び臨床研究に極めて有用 である。異なる抗原結合部位について同じβ−シートフレームワークを周込るこ とができるので、Ｆｖ７ラグメントはＮＭＲスペクトルシグナルのアサイ／メン トヲ簡単化する。臨床応用については、元のＦｖ　−７ラグメントのフレームワ ークに応答するプライマリ−抗イムノグロブリンを克服するために新たな７レー ムワークでのノ・イパー可変領域の再使用（それによりその特異性）が役に立つ 。架橋はある場合には有利であるが、Ｆｖフ２グメントの溶解は診断及び治療用 にお込て問題とはならない。

ＶＨとＶＬ領領域架橋は、遺伝子レベルでペゾチドリンカーを導入することによ り、この場合にはインタードメインのジスルフィド結合を形成するための例えば システィンを含み、あるいは本明細書で示す化学的方法により可能である。

抗体Ｂ７２．３、抗腫瘍モノクローナル抗体のＬ鎖およびＨｉ遺伝子（Ｃｏ１ｃ ｈｅｒ他（１９）およびＷｈｉｔｔｌｅ他（２０）’）　’ｅ部位指向（５ｉｔ ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｃＬ　）変異誘導に処して（Ｋｒａｍｅｒ他（２１）　）、 ＩｃｏＲｌ制限部位と可変ドメインの３′末端に翻訳停止部位を導入した。加え て、可変遺伝子配列の操作を促進するため、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄ　ｌ１部 位をまたＶＬに導入し、ＶＨ中の天然のＰｖｕ　ｌおよびＢｇｌ　１部位とマツ チさせた。これらの遺伝子を、別々にまたはタンデムで、Ｓ　Ｖ　−４０ｐｏ１ ｙ人付加配列を有するＨＣＭＶプロモーターの制御下に発現ベクター中に騒れて クローン化した。タンデムに配置した遺伝子での構築物を第２図に示す。これら の構築物”１ｃＯ８Ｊ細胞中で一時的に発現させて試験した。

可変ドメインの合成および分泌は、トランスフェクションした細胞を３５Ｂ−メ チオニン（１００μＣ１／１Ｑ’細胞／ゴ、４８時間）で生合成的に標識して検 定した。

細胞上清を、ＶＬまたはＶＢのフレームワークエｆトーゾと反応させる抗血清で のイムノゾレシピテーションに処した。

ｖＨ／　Ｖ　Ｉ、　構築物をエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ ｔｉｏｎ　）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣａＯ）中にトランスフ ェクションした。

ＷＥおよび”１７Ｌドメインは、ＣＯ８細胞上清中で還元および非還元ＳＤＳポ リアクリルアミドデルの両方で１４ＫＤ（参照、計算分子量１２．６ＫＤ）およ び１２ＩＣＤＣ参照、計算分子量１１．８ＫＤ）ポリペプチドとして検出された 。両ドメインのより高レベルの発現は明らかに単−ＶＨまたはＶＩ、プラスミド に比ベデュアルＶＨ／ＶＩ、シラスミドから得られた。ｖＨは両方の標識ＣＯＳ 細胞メジウムからドメインのある程度の会合を含んでＶＬに特異的な抗血清によ りＶＬと共沈殿させた。しかし、抗原結合競合検定において推定のＦｖフラグメ ントの作用を試験するにはいずれのＣＯＳ細胞によっても十分量の物質は得られ なかった。

Ｂ　７２．３可変ドメインがインビボで作動しうるように組立てられているかど うかを調べるにはより高レベルの発現が必要である。この為、ＶＥ／ＶＬ単一お よびデュアルプラスミドをＣＨＯ細胞に導入した。これらのプラスミドの場合、 ＣＯ８細胞よりＣＨＯ細胞の方が組換え抗体の収率がよさそうである。

第４図はＢ　７２．６Ｆｖ日のＳＤＳ　＆リアクリルアミドデルのフルオログラ フを示す。第１図のベクターでトランフエクションを行なったＣＨＯ細胞を３３ Ｂメチオニン（１００μｃｘ　／ｍｌ、　４８　ｈ−）で標識し、細胞上清をＢ 　７２．３　Ｖ　Ｌドメインに特異的なラット抗血清を用いてイムノゾレシピテ ーションに処した。試料を還元条件下に１５％ＳＤＳポリアクリルアミドデルで 分析した。

トラック１〜５は五つの独立ＣＦＩＯ細胞系の結果を示す。

左側の数字は大きさのマーカーである。

Ｂ　７２．３　Ｆｖポリペプチドはムチン−セファロースマトリックスアフィニ ティークロマトグラフィーによりこれらの細胞系の一つの培養上清（Ｆｖ３、） ラック３、第４図）がら単離した。ムチンはＢ　７２．５抗原によく似ているこ とが知られている（２２）。用いたムチン−セファロースは５ダ／ゴのゲルで標 準法によりＣＮＢｒ活性化セファロースにウシ下顎ムチンを結合させることによ り製造した。

ＣＥＯ細胞系Ｆｖ　３からの上清１ＱＯｍｌｆｉｙｌのムチン−セファロース５ ０％懸ｆｆ１ｉ　トー夜４℃テｏ−２−ミキサー中でインキュベートした（　５ ０　ｍＭ　）　ＩＪス、ｐＨ８，０）。次いで、ムチンーセ７アロースヲ、イン キュベーション混合物をカラムに注ぐことによって採取した。保持されたムチン −セファロースをカラムからの溶出液中に２８０　ｎｍでの吸収がみられなくな るまで５　Ｑ　ｍＭ　トリスｐＨ８，０で洗浄した。次いで、０．１Ｍクエン酸 １ｄでＦｖを溶出した。吹込で、この酸溶出液の−を５．５に調整し、！ＬｌＳ Ａ法により抗原結合活性を測定した。

５μ９　ｍｌのウシ顎下腺ムチンを被覆したミクロタイタープレート中で試料を 連貌希釈し、４℃で５０時間インキュベートした。０．２％トウイーン２０含有 リン酸緩衝塩溶液、ｐＨ７，２で洗浄後、Ｂ　７２．３　（Ｆａｂ’）２まで高 めたウサギポリクロナール抗血清を各ウェルに２０００中１の希釈率で加えた。

この抗血清はＢ　７２．３　Ｖ　ＨおよびＶＬ両釦を認識する抗体を含んでいる 。プレー）ｔ−１時間室温でインキュベートシ、再び洗浄し、そして１００μｌ のヤギ抗ウサギＩｇＧ　Ｆｃ　−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合物を各ウ ェルに５０００中１の希釈率で加えた。

室温でさらに１時間インキュベーション後、プレートを再び洗浄し、ＴＭＢ基質 を加え、６０５＋ｍで光学密度を測定して結合抗体を検出した。ＣＥＯＦｖ５上 滑試料はこの検定において固相ムチンと結合しうろことが示された。

ＶＨとＶＬとの会合に含まれる疎水性相互作用が組立てられた状態にＦｖフラグ メントを維持するのに十分強力であるということは不確かなことである。それ故 、Ｆｖフラグメン）を増やし、ある込は安定化させるのにドメインをさらに修飾 することが必要である。

たとえば、これは共有結合、たとえば、ジスルフィド結合の導入により達成しう る。

上記の態様は例示の為のみであり、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更 が可能であることは当業者にとり自明であろう。

（ｉ）　Ｍｏｏｒｓ　ａｎｄ　Ｚａｆｆａｒｏｎｉ、　ＵＳ−Ａ−４６４２３３ ４゜（２）　Ｆｉｅｌ　ａｔ　ｈｌ。’Ｖａｃｃｉｎｅｓ’８８’、　Ｃｏ１ｄ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　１９８８゜（３） 　５ｋｅｒｒａ　ａｎ４　Ｐ］ｕｃｋｔｈｕｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０＋ 　１０３８−１０４１、１９８８゜ （４）　Ｌａｄｎ＋ｓｒ　ａｎｄ　Ｂｉｒｄ、　Ｗｏ　８８１０１６４９−（６ ）　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ’１．、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ’ｌｏｎｉ ｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ：ｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　 ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

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Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗体のＬ鎖またはＨ鎖の可変ドメインのみをコードするＤＮＡ配列を有す るオペロンからなる真核細胞発現ベクターで真核宿主細胞を形質転換し、この形 質転換宿主細胞を上記ＤＮＡ配列がコードするタンパクを合成させる条件下に培 養し、そして合成されたタンパクを採取することを特徴とするＦＶフラグメント の製造方法。
2. （２）培養上清中に完全に作動するＦＶフラグメントが製造されるようにＦＶフ ラグメント鎖を宿主細胞により製造し、そして正しく組立てる請求の範囲第１項 の方法。
3. （３）宿主細胞をまた、それぞれ相補的Ｈ鎖またはＬ鎖可変ドメインをコードす るＤＮＡ配列を有するオペロンからなる第二の真核細胞発現ベクターで形質転換 する請求の範囲第１または第２項の方法。
4. （４）第一の発現ベクターがそれぞれ相補的Ｈ鎖またはＬ鎖可変ドメインをコー ドするＤＮム配列からなる第二のオペロンを有する請求の範囲第１または第２項 の方法。
5. （５）可変ドメインがそのＣ末端に融合した酵素、リガンドまたはトキシンのよ うなエフェクタータンパクを有する融合タンパクとして発現される請求の範囲第 ３または４項の方法。
6. （６）ＤＮＡコード配列が、各可変ドメインのＣ末端で１個以上のシステイン残 基をつくるようにその３′末端を変えられた請求の範囲第３〜５項のいずれか一 つの方法。
7. （７）Ｆｖフラグメントが、オペロン中に第一の可変ドメインをコードする第一 ＤＮＡ配列および第二の可変ドメインをコードする第二ＤＮＡ配列を有するベク ターの使用によって安定化され、この第一および第二配列は結合ペフチド配列を コードする第三ＤＮＡ配列に連結している請求の範囲第３〜５項のいずれか一つ の方法。
8. （８）コード配列がモノクローナル抗体由来のものである請求の範囲第ｌ〜７項 のいずれか一つの方法。
9. （９）ドメインの一方または両方が、そのＮ末端に可変ドメインを、そのＣ末端 に酵素、リガンドまたはトキシンを有する融合タンパクからなるＦｖ構造。