JPH08506007A - 多能性の休止状態の幹細胞集団 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 幹細胞マーカーCD34を有する細胞を含有し、小さいサイズであり、そしてほとんど顆粒を持たない細胞集団が、サイズにより低密度単核造血細胞を分離し、次に最小サイズの画分中CD34⁺細胞を選別することによって得られる。細胞集団のサイズは、900×ｇで回転させたBeckman JE 5.0に相当するローターを使用する向流溶離で流速25〜29ml/分で得られるサイズに対応する。この細胞集団は、本質的に非常に初期の前駆細胞からなり、そしてこの細胞は、骨髄移植および遺伝子治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 多能性の休止状態の幹細胞集団発明の分野 本発明は、細胞選別および細胞サブ集団の分野に関する。さらに詳しくは、本 発明は多能性でかつ比較的休止状態の幹細胞集団に関する。背景技術 幹細胞は、赤血球、リンパ球、および多核細胞を含む種々の血液細胞の比較的 未分化の前駆体として、成人骨髄で製造されると考えられている。幹細胞はまた 、末梢血液中および臍帯血液中に存在している。それらの発達および分化の中の いくつかの時点で、個々の細胞が特定の細胞の目的に方向づけられる（committe d）ようになると考えられている。従って、任意のある時に被験体の骨髄中で見 られる幹細胞の集団は、分化および発達の種々の段階の幹細胞を含有する。 ネズミモデルでは、この造血系は、３つの機能的に異なったサブ集団に分割さ れている：最も若いものは、自己再生およびさらに分化し得る方向づけられてい ない多能性幹細胞集団であり；これらはさらに方向づけられた多能性前駆体集団 に分化し；次にこれらは最終的に方向づけられた単能性前駆体になる。ヒト系で は、これらのすべての幹細胞集団はCD34抗原を発現し；分化とともにCD34発現が 減少するようである。 方向づけられていない全幹細胞集団のサブセットを入手する試みを行い、そし て移植のための最も多才な集団を提供し、そして、このことは、遺伝子療法にお ける遺伝的改変のための最高の能力を有する。SyStemixへの米国特許第5,061,62 0号は、細胞表面マーカーを利用して、ヒト幹細胞中の所定のサブ集団を提供す る。ネズミサブ集団はまた、系列への方向づけられた細胞の除去、続いてThy-1^{1 cw} 、幹細胞抗原（Sca-1）、および小麦胚芽アグルチニン（WGA）⁺表現型を有す る細胞のポジティブ選択によって単離される（Visserら、J Exp Med（1984）59: 1576）。ネズミ幹細胞はまた、サイズに基づいて分離され、比較的多能性前駆体 を含まない多能性細胞を得た（Jonesら、Nature（1990）78:403a）。 それぞれの前述の分離方法により、特定の特性を有するサブ集団を得る；これ らの特性のすべてが、移植または遺伝子療法での使用のために所望されることは 確実ではない。 現在では、ヒト幹細胞のサブセットが、低密度単核骨髄細胞（または他の起源 の幹細胞）を向流溶離させて、次に最小のサイズの細胞を含有する画分からCD34⁺ 細胞を回収することにより得られ得ることが知られている。このサブ集団は、 非常に原始的な幹細胞に対して期待される特性を有し、そして移植および遺伝子 療法に特に有用であり得た。 向流溶離に続くヒト低密度単核骨髄細胞のCD34⁺分離の結果を記述している要 旨は、Blood （1991）78:第1603号に1991年11月15日に出版された。発明の開示 本発明は、休止状態および多能性のヒト幹細胞のサブ集団を提供する。これら の細胞は細胞表面上でCD34⁺マーカーを有する小さい寸法の細胞である。この集 団は、CD33、CD38、HLA/DR、CD19、およびCD3を発現する細胞中で涸渇する。こ れらの細胞はまた、高密度のMIP1α、スチール（Steel）因子（幹細胞因子、SCF ）、IL-6、IL-3、IL-1α、およびG-CSFレセプターを有している。 従って、１つの局面では、本発明は、単核低密度造血細胞からなるヒト造血幹 細胞の集団に関し、これは、Beckman JE5.0に等しいサイズのローター中で900× ｇで回転させた、25〜29ml/分の流速画分の細胞のサイズに対応し、そしてそれ はCD34⁺である。被験体のCD34⁺ヒト造血細胞の集団は、7%±3%より多いCD2⁺；3% ±1%より少ないCD19⁺；および1%より少ないCD33⁺の表面リガンド構成（makeup） を有する細胞を含有し得る。より詳細には、１つの実施態様において、この集団 は30%±0%のCD2、0%±0%のCD19、0%±0%のCD33、9%±2%のCD38、および18%±4% のHLA-DR細胞を含有し得る。短期骨髄培養では、これらの細胞はCFU-GM、BFU-E 、またはCFU-GEMMを提供しない。この集団の90%以上は、SCFおよびMIP-1αに対 するレセプターを含有するが、その集団は、SCFの存在または不在において標準 的な長期培養で増殖しない。しかし、適切な条件下では、細胞はエクスビボ（ex vivo）で増殖できる。 他の局面では、本発明は，本発明の細胞集団を得るための方法、およびこの集 団を使用する方法に関する。図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｄは、向流溶離からの種々の画分中のCD34⁺細胞の分布を示す。 図２は、種々のCD34⁺画分からのCFU-GMを示すグラフである。 図３は、種々のCD34⁺画分の増殖を示すグラフである。 図４は、FITC蛍光強度（Ｘ軸）−細胞数（Ｙ軸）をプロットしているヒストグ ラムを示す。分析された細胞は、溶離によってR/O、33/37および25/29画分に分 離された正常ボランティアからの骨髄サンプルに由来し、そして続いてCD34⁺細 胞を単離した。濃い実線はコントロールサンプルを示し、そして薄い点線は成長 因子で染色される細胞を示す。しかし、画分33、IL-6については、濃い実線は成 長因子に染色される細胞を示し、そして薄い点線はコントロールサンプルを示す 。本発明を実施する形態 本発明は、遺伝子療法および移植に特に有用となり得る細胞の集団を提供する 。その細胞は非常に原始的であると思われる。細胞は、代表的な表面リガンド発 現パターンによって集合的に特徴づけられ、そしてこれらのマーカーに対して集 合的にポジティブまたはネガティブである。特に、この集団は、CD33、CD38、HL A/DR、CD19およびCD3を発現する細胞で涸 渇するが、高密度のマクロファージ抑制性タンパク質MIP1α、幹細胞因子（SCF ）、IL-6、IL-3、IL-1α、およびGM-CSFレセプターを有する。 この集団は、骨髄または末梢血液起源の細胞の低密度（LD）単核画分の初期サ イズ分離によって従来法により調製されるので、回収される細胞は、無顆粒であ り、小さく、そして０〜１の核小体を有する。この集団は、分離をBeckman JE 5 .0ローターを用いて900×ｇで行う時、流速25〜29ml/分（FR 25/29）で表される 画分中に以下に述べる向流溶離で得られるものと同じサイズである。以下の実施 例は、特定の向流溶離（CE）手順を使用してこのサイズの細胞の回収を説明して いる。しかし、サイズに従って細胞を分離するための任意の方法を、同等の画分 を集めるために使用し得る（すなわち、濃度勾配沈降で置換し得る）。 次に、適切なサイズ分布のこのサブ集団は、さらに２工程（それらの１つは任 意である）で分画される。任意の工程は、大豆アグルチニンが親和性リガンドと して結合される固体支持体で、この集団を処理する工程を包含する。非付着細胞 は、回収される。代表的には、接触は、室温で約１時間、非振動表面上で行われ る。大豆アグルチニンに結合した適切な固体支持体は、Applied Immune Science s、 Santa Clara、CAから入手し得る。 大豆アグルチニンで誘導体化した支持体と接触させた細胞の非付着画分、また はサイズ分離からの初期FR 25/29細胞を、 次にCD34マーカーと特異的に反応するリガンドに結合されている固相基質と接触 させる。例えば、CD34に対して特異的な抗体またはそのフラグメントで、誘導体 化した支持体は、当該技術分野で公知の方法で得られ得、そして、例えば、Appl ied Immune Sciences、Santa Clara、CAから市販で入手可能である。この支持体 は、CD34マーカーを含有している細胞が支持体に付着している条件下で、小細胞 画分を用いて処理される。代表的には、インキュベーションは、室温で１時間〜 数時間、非振動表面上で行われる。非付着細胞を取り除き、所望ならば表面を洗 浄し、そして次に付着細胞を回収する。回収した細胞は、本発明の休止状態の多 能性の細胞集団を構成する。 所望の細胞集団を得るために、低密度単核骨髄細胞の分画を包含する２または ３工程は、上述のとおりの順序で最も便利に行われる；しかし、順序が変更され 得ることは、本発明の範囲内である。しかし、親和性リガンド誘導体化支持体と 接触させた細胞の数を最小化することが、このような支持体を調製することおよ びリガンドそれ自体の支出を考慮して、最も便利である。 得られるCD34⁺細胞集団は、小さいサイズによって特徴づけられる。代表的な サイズの分布を図１に示し、さらに以下の実施例１で述べる。示すように、CD34⁺ 細胞は、元の骨髄中で、顆粒度（Ｘ軸、SSC）およびサイズ（Ｙ軸、FSC）の広 い範囲わたって分布している（図１Ａ）。しかし、FR 25/29画分は、よ り小さいサイズおよび顆粒の少ないCD34⁺細胞を含有する（図１Ｃ）。FR 33/37 （流速33〜37ml/分で収集される）およびR/O（ローターオフ）画分のCD3⁺細胞は 、広がっている（図１Ｄおよび１Ｂ）。 FR 25/29 CD34⁺集団の細胞はまた、高密度のMIP1αおよびSCF表面レセプター を含有し、これは原始的な細胞を特徴づけ、そして増殖を調節するための機構を 提供すると理解されている。従って、本発明の細胞は、MIP1αレセプターを阻止 または抑制するアナログがレセプターに付着される条件下で、培養され得た。あ るいは、SCFレセプターを活性化させるアナログを、SCFレセプターに付着させ得 る。従って、これらの細胞上のレセプターに存在する他の成長因子の添加により 促進し得るのと同様に、SCFの添加は、増殖を促進させ得る。 本発明の細胞集団の他の特性は、短期および長期骨髄培養の両方において、SC Fレセプターの活性化調節またはMIP1αレセプターの抑制調節なしで、標準的条 件下で、休止状態の性質を含む。従って、このような培養調整なしで、これらの 細胞は、CFU-GM、BFU-E、またはCFU-GEMMアッセイでポジティブな結果を与えな い。これらはまた、代表的な表面マーカーパターンで特徴づけられ、CD33、CD38 、HLA/DR、CD19およびCD3における涸渇を含む。涸渇によって、この細胞集団中 のマーカーの密度は、由来する低密度単核造血細胞の全CD34⁺細胞集団より、少 なくとも３倍未満、好ましくは５倍未満、そして最も好ましくは10倍未満である ことを示す。 一方、これらは、上記のように、IL-6、IL-3およびGM-CSFに対するレセプター と同様に、MIPαおよびSCFレセプターの発現を増強した。発現を増強したことに よって、この細胞集団中のマーカーの密度が、由来する低密度単核造血細胞の全 CD34⁺細胞集団より、少なくとも３倍以上、好ましくは５倍以上、最も好ましく は10倍以上であることを示す。 上述の特性を有する細胞の集団は、このような細胞移植片の必要な被験体に細 胞移植を行うのに有用である。細胞は、例えば、化学治療または放射線治療のよ うな治療を通して涸渇した被験体の幹細胞を補充するための自己移植片を包含す るプロトコールで、それ自体を使用し得る。その細胞はまた、例えば、遺伝子欠 損を修復するために、または所望のタンパク質の組換え体発現を提供するために 、相同の組換えまたはレトロウイルス感染を通して、遺伝学的に改変され得、そ して被験体に遺伝学的に改変した形で投与し得る。このような細胞の投与のため の技法は、当該技術分野で公知の従来の方法を使用して通常に実施される。 実施例 以下の実施例は、本発明を例示することを意図し、限定するものではない。 実施例１ 方向づけられていない幹細胞の調製 骨髄サンプルを、22人の健康成人ボランティアのドナーの後腸骨稜から少量吸 い出した。インフォームドコンセントを、ミネソタ大学でのthe Committee on t he Use of Human Subjectsによって承認されたガイドラインに従って得た。 低密度骨髄単核細胞を、Histopaque-1077（Sigma Chemical Co.、St．Louis、 MO）および密度勾配遠心分離（400×ｇで45分間）を使用して単離し、RPMI-1640 （Gibco、Grand Island、NY）で２回洗浄し、そして10mlの溶離培地で再懸濁し た。 向流溶離（CE）のために、洗浄した低密度単核細胞（2.7〜7.8×10⁸）を、サ ンプリング部位連結器を経て、JE-5.0ローターおよび標準チャンバーを装備した Beckman J6M/E遠心機（Spinco Division、Beckman Instruments、Palo Alto、CA ）の注入口流中へ注入した。１つのぜん動ポンプ（Masterflex、Co1e Palmer In struments、Chicago、IL）は、溶離培地の連続流を提供した。この培地は、100m g/dlのD-グルコース、0.3mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）ニナトリウムおよ び50mg/dlウシ血清アルブミン（BSA、Boehringer Mannheim、FRG）を有する0.9% の通常生理食塩溶液であり、pHを7.20に調整した。この培地を使用する前に減菌 した。 細胞を、15ml/分（FR 15）の全流速、900×ｇのローター速度および25℃の温 度で送り出した。100mlの溶出液を収集した後、流速を25ml/分（FR 25）に増加 させた。ローター速度を一定に 維持して、流速を、29ml/分（FR 29）、33ml/分（FR 33）、そして37ml/分（FR 37）に連続して増加させ、それぞれの増加分で200ml収集した。チャンバーに残 った細胞を、ローターを止めて（R/O画分）、チャンバーを100mlの溶離培地で流 すことによって捕獲した。それぞれの細胞画分を洗浄し、そして300×ｇで10分 間遠心分離した。 次に、FR 25および29（FR 25/29）ならびにFR 33および37（FR 33/37）を合わ せた。生存率をトリパンブルー色素排除で測定し、そして細胞回収率をZBI Coul ter計数器（Coulter Electronics、Hialeah、FL）で測定した。 それぞれのFR 25/29、FR 33/37およびR/O画分を溶離培地で洗浄し、そして0.1 mM EDTAおよび0.5% Gammimune（Miles Laboratory、Eickert、IN）を含む１mMダ ルベッコのリン酸緩衝液（DPBS）中で、30分間インキュベーションして再懸濁し た。それぞれの画分からの細胞を、大豆アグルチニンで共有結合で被覆したAIS T-25 MicroCELLector装置（Applied Immune Sciences、Santa Clara、CA）上に 充填し、2.0×10⁷標的細胞／フラスコの密度の細胞で、非振動表面上で１時間室 温でインキュベートした。非付着細胞を収集し、そしてフラスコを２回洗浄して 、フラスコ表面からすべての非付着細胞を取り除いた。 それぞれの画分から1.5×10⁷細胞を、共有結合でICH3（抗CD34）で被覆した個 々のAIS T-25 MicroCELLector装置上に充填し、１時間、室温で非振動表面上で インキュベートした。非 付着細胞を収集し、そしてフラスコを２回洗浄して、すべての非付着細胞を取り 除いた。付着細胞を、DPBS＋10%ウシ胎児血清（FBS、Hyclone）を添加し、そし てしっかりとフラスコを叩くことにより収集した。得られた集団を、FR 25/29 C D34⁺、FR 33/37 CD34⁺、およびR/O CD34⁺と命名した。 大豆アグルチニンでの処理およびCD34についての選択の前ならびに後のCE-サ イズ画分中の細胞の分布を、表１に示す。 表１に示すとおり、分画していない細胞の元の数の約１%を、３つのCD34⁺画分 のすべての中に回収した。低密度単核細胞の約1/9をFR 25/29中に回収し、約1/4 をFR 33/37中に、そして約半分をR/O画分中に回収した。大豆アグルチニン（SBA ）の涸渇により、すべての画分に対して処理した細胞の70〜90%の損失を生じ、 そしてSBA^-細胞の約３〜５%をCD34ポジティブ選択により回収した。LD単核骨髄 画分中のCD34⁺細胞の約25〜55%をこの方法によって回収した。 CD34⁺細胞の形態は、３つの画分の間で変化する。FR 25/29から回収したCD34⁺ 細胞は、ほとんど無顆粒の細胞質および０〜１の核小体を有する小さいリンパ球 のような細胞である。FR 33/37からのCD34⁺細胞は、ほとんど無顆粒の細胞質お よび１〜５核小体を有する、わずかに大きいリンパ芽球のような細胞である。R/ O画分からのCD34⁺細胞は、少数の核小体および顆粒を含有するしばしば顕著な量 の細胞質を有する著しく大きい骨髄（myelo）／赤芽球であった。これらの結果 を、図１Ａ〜１Ｄで示すように、水平および垂直光散乱で確かめた。Ｘ軸は水平 側方散乱（SSC）を測定し、そして細胞の顆粒度を測定する。Ｙ軸は前方光散乱 （FSC）を測定し、そして細胞サイズの測定である。図１Ａは元の集団の分布を 示し、図１ＢはR/O画分を示し、図１ＣはFR 25/29、および図１ＤはFR 33/37を 示す。 25〜29ml/分（FR 25/29）の流速で収集した細胞に関しては、細胞のサイズは8 〜8.5μmの間であった。33〜37ml/分の流速で収集したローター画分に関しては 、集団は9〜9.5μmの間の細胞のサイズを有していた。（ローターオフ（R/O画分 ）にして捕獲した）チャンバーに残っていた細胞に関しては、細胞のサイズは15 μmより大きかった。これらの細胞のサイズは、標準的な方法によって確認され た。 実施例２ 分画された細胞の表現型マーカー 表現型の分析によって、85%以上の細胞を、モノクローナル抗体8Gl2（Becton Dickinson）（CD34抗原に特異的に結合する抗体）によって認識した。分画して ない（UNF）細胞およびそれぞれの細胞画分を、個々に0.5% Gammimuneでプレイ ンキュべートして、次に0.1%アジ化ナトリウム（Sigma Chemical Co.）を含有す るリン酸緩衝化食塩水（PBS、Gibco）で洗浄した。フィコエリトリン複合抗CD2 、CD19、CD33、CD38、または抗HLA-DR（Becton Dickinson、Sunnyvale、CA）を 細胞ペレットに添加し、そして４℃で30分間インキュベートした。この細胞を、 ２回PBS-アジドで洗浄し、そして１%パラホルムアルデヒド（Electron Microsco py Science）で、１週間以内の分析のため再懸濁した。細胞を、Becton Dickins on Concert 40ソフトウエア（Becton Dickinson、Sunnyvale、CA）を使用してVA CSコンピュータに接続したFACS Star Plus（Becton Dickinson）で分析した。ポ ジティブ結合を、コントロール細胞上の蛍光を越えた、抗体反応させた細胞上の 蛍光として定義した。 結果を表２に示す： R/O画分中のCD34⁺細胞の多数は、CD38およびHLA-DR、ならびにわずかに少量の CD33を発現するが、あるとすれば少数の細胞は、CD2またはCD19を発現した。FR 25/29中のほとんどのCD34⁺細胞は、CD19、CD33、CD38またはHLA-DRを発現しなか ったが、約30%のCD2（４実験で21〜40%の範囲）を発現した。CD38およびHLA-DR を発現するFR 33/37からのCD34⁺細胞の頻度は、 他の画分の間でCD38およびHLA-DRを発現する細胞の約40%に低下する。CD19⁺/CD3 4⁺細胞の、多数をFR 33/37中で回収する。 実施例３ 前駆体についてのアッセイ それぞれの画分の一部を、1.32%メチルセルロース（1,500CP、Sigma）、30% F BS（Hyclone Laboratories Inc.、Logan、UT）、5×10^-4mol/L 2-メルカプトエ タノール、5%フィトヘマグルチニン−白血球ならし培地（PHA-LCB）、1% BSA、1 0^-6mol/Lのコハク酸メチルプレドニソロンナトリウムエステル、および１ U/ml の組換えヒトエリトロポエチン（Amgen、Thousand Oaks、CA）で培養した。培養 物を、1×10³および1×10⁵細胞／mlで1mlの培養皿（Nunc）中に三連で播種し、 そして37℃、5% CO₂加湿雰囲気中に維持した。プレートを、BFU-EおよびCFU-GM について14日で倒立顕微鏡を使用して、スコアした。これらの結果を表３に示す 。 溶離後の任意の画分中で、コロニー形成細胞（CFU-GM、CFU-GEMMまたはBFU-E ）の顕著な富化はなかったが、R/O CD34⁺のサブ集団を、これらのコロニー形成 細胞中で20〜59倍富化した。FR 25/29 CD34⁺は、CFU-GM、BFU-EまたはCFU-GEMM を産生しなかった。 実施例４ 長期骨髄培養 通常の同種間のストロマ（stromal）層をT-25フラスコ（Corning Glass Works 、Corning、NY）中で14〜28日間培養し、次に、MARK I セシウム照射器（Shepar d and Associates、Glendale、 CA）を用いて1000cGyで照射した。照射の５〜７日後、それぞれのCD34⁺画分（10⁵ 〜10⁶）からの細胞を、12.5%FCS、12.5%ウマ血清（Hyclone Laboratories）、2 mM L-グルタミン、0.07%重炭酸ナトリウム溶液、1%（v/v）MEM非必須アミノ酸溶 液、1%（v/v）MEMビタミン溶液、1%（v/v）ピルビン酸ナトリウム溶液、1000ユ ニット/mLペニシリン、100ユニット/mLストレプトマイシン、および10^-7Mヒドロ コルチゾン（A-Hydrocort、Abbott Laboratories、Chicago、IL）を含む5mL McC oyの5A培地中で、それぞれのフラスコ中に播種した。培養を、37℃、5% CO₂加湿 雰囲気中に維持した。１週間の間隔で、培養物を、上清の半分を除去し、新しい 培地で置換することによって供給した。非付着細胞を計数し、０、２、５、６、 ７および８週でのメチルセルロースアッセイでCFU-GMおよびBFU-Eの存在をアッ セイした。 CFU-GMについての結果を図２に示す。FR 33/37またはR/O CD34⁺細胞のいずれ かで開始された培養に関して、いくつかの時点で非付着層中の全細胞数の増加お よび／または維持があった。同様に、クロノジェン（clonogenic）細胞を、８週 と同じくらい遅く、FR 33/37およびR/O CD34⁺細胞の両方から回収した。しかし 、４実験で、ほとんど核形成しない細胞ならびにCFU-GM、BFU-EまたはCFU-GEMM のない細胞を、FR 25/29 CD34⁺細胞で播種した長期骨髄培養物の非付着層からい つも回収した（図２および図３）。これらのデータは、このCD34⁺細胞集団の非 常に原始的な性質を示し、そして長期骨髄培養で増 殖するCD34⁺細胞の他のサブ集団からの集団を対比させることに用いる。 実施例５ サイトカインレセプターに対するアッセイ それぞれのCD34⁺画分からの細胞を、スチール因子（SCF）、顆粒球−マクロフ ァージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、イン ターロイキン-1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-6、マクロファージ抑制性タンパク質 MIP1αに対するレセプターの存在についてアッセイした。サンプルをヘペス緩衝 化食塩水（150mM NaCl、25mM ヘペス、pH7.4）で２回洗浄し、次に100ngビオチ ン化組換えヒトSCF（rhSCF）（R＆D Systems、Minneapolis、MN）で、60分間氷 上でインキュベートした。その後、細胞を2ml RDF1洗浄緩衝液（R＆D Systems） で２回洗浄し、次に100ngアビジンカルボキシフルオレセイン（R＆D Systems） で、30分間氷上で、暗所でインキュベートした。この細胞を2ml RDF1緩衝液で洗 浄し、そしてフローサイトメトリー分析用の300μLのヘペス緩衝化食塩水中に再 懸濁した。 染色した細胞サンプルを、EPICS Profile IIまたはEpics752フローサイトメー ター（Coulter Electronics、Hialeah、FL）のいずれかで蛍光強度について分析 した。ポジティブサンプルを、アビジン−カルボキシフルオレセインのみで染色 したサンプルと比較した。ビオチン化したサイトカインに対す る結合親和性を、完全な阻害によって、または10モル倍過剰の非標識サイトカイ ンの存在中で結合することによって確認した。この結果を表４に示す。 実質的にすべての（＞90%）CD34⁺細胞は、SCFに対するレセプターを発現する が、蛍光強度は、FR 25/29 CD34⁺細胞に対して最も大きかった。明るいおよび薄 暗い細胞集団は、この画分中で通常に観測された。単一の細胞集団のみが、薄暗 い細胞のみを持つR/O CD34⁺サブ集団を有するFR 33/37およびR/O CD34⁺細胞であ ることに留意した（図４）。 図４に示すように、正常ボランティアの骨髄サンプルを溶離によってR/O、33/ 37および25/29画分に分離した。続いてCD34⁺細胞を単離した。次に精製したCD34⁺ 細胞を、指示したビオチン化した成長因子で染色し、そしてアビジン複合フル オレセインイソシアネート（FITC）で対比染色した。コントロールとして、細胞 を、アビジン-FITC複合体を用いて単独で染色した。図４において、ヒストグラ ムは、FITC蛍光強度（Ｘ軸）−細胞数（Ｙ軸）プロットを示している。サンプル のカラムは、指示されたサイズ画分由来である。列は、指示された成長因子由来 である。濃い実線はコントロールサンプルを表し、そして薄い点線は、成長因子 で染色した細胞を表す。しかし、画分33、IL-6に関しては、濃い実線は成長因子 で染色した細胞を表し、そして薄い点線はコントロールサンプルを表す。図４の データは、表５に要約されている。 非標識成長因子を用いた遮断実験（データは示していない）は、細胞への成長 因子結合の特異性を証明した。 実質的にすべてのCD34⁺細胞は、MIP1αに対するレセプターを有するが、FR 25 /29 CD34⁺細胞が、最も大きなレセプターの数を示した。R/O CD34⁺細胞は、最も 少ないレセプターの数を示した。 IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSFおよびG-CSFに対するレセプターは、CD34⁺細胞のす べてのサブ集団で見られた。３画分を比較すると、IL-3、IL-6およびGM-CSFのレ セプターが、FR 25/29 CD34⁺細胞上で最も高かった。 このレセプタープロフィルの分析によって、これら細胞に対する適切な培養プ ロトコールが考案される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ワグナー，ジョン イー. アメリカ合衆国 ミネソタ 55446，プリ マス，アーバンデイル レーン 3705 (72)発明者 レブコウスキ，ジェイン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94028, ポートラ バレイ，ガバーダ ウェイ 150

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本質的に低密度の単核造血細胞からなるヒト造血幹細胞の集団であって、該 単核造血細胞がCD34⁺であり、そして900×ｇで回転させたBeckman JE 5.0に相当 するローターを使用する向流溶離（CE）で流速25〜29ml/分で得られる画分のサ イズに対応する、集団。 ２．CD33、CD38、HLA/DR、CD19およびCD3表面リガンドで涸渇している請求項１ に記載の集団であって；ここで、前記細胞の90％以上はSCFに対するレセプター を含有し、そして該集団はSCFの存在中の長期骨髄培養で増殖せず；ここで該細 胞は、幹細胞因子（SCF）、IL-3、IL-1、GM-CSFおよびエリトロポエチンの組み 合せに応じて増殖せず、そしてこれらの因子に応じてメチルセルロース中でコロ ニーを形成せず；ここで該細胞は高密度のMIP1αレセプターを含有し；そして、 ここで該細胞は高密度のIL-6、IL-3、IL-1αまたはGM-CSFレセプターを含有する 、集団。 ３．被験体に細胞移植を行う方法であって、このような移植を必要とする被験体 に、請求項１に記載の細胞の有効量を投与する工程を包含する、方法。 ４．投与工程の前に前記細胞を遺伝学的に変化させる工程をさらに包含する、請 求項３に記載の方法。 ５．以下の工程を包含する、本質的に休止状態の幹細胞からなる集団を調製する 方法： 低密度単核造血細胞をサイズ分離して、細胞の第１画分を得る工程であって、 該細胞の第１画分が、900×ｇで回転させたBeckman JE 5.0ローターを使用する 向流溶離（CE）で流速25〜29ml/分で得られる画分のサイズに対応する、工程； 必要に応じて、該第１画分を大豆アグルチニンに結合した固体支持体に接触さ せる工程；および該固体支持体に付着していない細胞の第２画分を回収する工程 ： 該第１画分または任意の第２画分を、CD34に対する親和性リガンドが結合され ている該固体支持体に接触させる工程； 該固体支持体に付着している第３画分を回収する工程であって、該第３画分が 該休止状態の幹細胞集団を構成する、工程。 ６．前記造血細胞が骨髄から得られる、請求項５に記載の方法。 ７．前記造血細胞が末梢血液から得られる、請求項５に記載の方法。 ８．請求項５に記載の方法によって調製される細胞集団。 ９．被験体のCD34⁺ヒト造血細胞集団であって、該集団が7%よ り多いCD2⁺；3%より少ないCD19⁺；および1%より少ないCD33⁺から構成される表面 リガンドを有する細胞を含有する、集団 １０．前記集団が30%±0%のCD2、0%±0%のCD19、0%±0%のCD33、9%±2%のCD38、 および18%±4%のHLA-DRを含有する、請求項９に記載の集団。