JPH08506021A

JPH08506021A - クラブラン酸生合成用調節遺伝子

Info

Publication number: JPH08506021A
Application number: JP6517764A
Authority: JP
Inventors: ウォルターズ，ニコラ・ジェーン; バートン，バリー; アール，アリソン・ジェーン
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1993-02-02
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 1996-07-02
Also published as: DE69420253D1; DE69420253T2; GB9302041D0; US6361982B1; EP0682706B1; WO1994018326A3; ATE183776T1; ES2134927T3; WO1994018326A2; EP0682706A1

Abstract

(57)【要約】クラブラン酸生合成用調節遺伝子よりなるＤＮＡ。ＤＮＡは７kb以下の長さであり、図１に示す制限部位の立体配置またはその断片を有する。宿主中でのクラブラン酸の製造法におけるＤＮＡの使用。

Description

【発明の詳細な説明】クラブラン酸生合成用調節遺伝子本発明は組換えＤＮＡ分子、特に、クラブラン酸（clavulanic acid）生合成およびセファマイシン生合成の調節に関連した１以上の遺伝子を運ぶ挿入断片を含有する、微生物宿主の形質転換に用いる組換えベクターに関する。共通の制御機構がエス・ケリコロール（S．coelicolor）における二次代謝のスィッチを入れることが認められているが、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）のような微生物により産生される二次代謝物の調節過程の理解の進歩は遅い。エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）中に産生される２個の二次代謝物であるクラブラン酸およびセファマイシンＣは抗生物質として重要であるが、全く無関係な経路を有しているようであり、現在、これらの経路がどのようにして調節されているかについては何も知られていない。特に、クラブラン酸は、ベータラクタマーゼ阻害剤でありベータラクタマーゼに不安定なベータラクタム抗生物質を分解から防ぐため、臨床的に非常に価値がある。従って、発酵方法でクラブラン酸の収量（力価）を増加させる方法は商業的に非常に重要である。クラブラン酸の収量の改良についての問題に対する１つのアプローチとしては、エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）を宿主細胞として用いる組換えＤＮＡ技術の使用などが挙げられる。幾つかの酵素がクラブラン酸生合成に関与していると考えられており、１つのクラブラン酸中間体であるプロクラバミン酸（ proclavaminic acid）をもう１つの中間体であるクラバミン酸（clavaminic aci d）に変換するクラバミン酸シンターゼをコードする単数または複数の遺伝子がクローニングされている（欧州特許出願公開第０３４９１２１号）。しかしながら、酵素の調節に関与する遺伝子はこれまで同定されていない。本発明を明確に定義するため、以下の添付図面を参照する。図１は、約７kbのＢclＩＤＮＡ断片（Ｉ）の制限地図である。図２は、約１．７kbのＢamＨＩ−ＢglIIＤＮＡ断片（II）の制限地図である。図３は、図１のＤＮＡ断片をプラスミドpＩＪ６８０にサブクローニングすることにより作成されるpＷＯＲ３０と称される組換えプラスミドの制限地図である。図４は、pＷＯＲ３０５と称され、図１のＤＮＡ断片をプラスミドpＩＪ２９２５中にサブクローニングすることにより作成されたpＷＯＲ３０５と称される組換えプラスミドの制限地図である。図５は、pＷＯＲ３２２と称され、図２のＤＮＡ断片をプラスミドpＩＪ６９９中にサブクローニングすることにより作成されたpＷＯＲ３２２と称される組換えプラスミドの制限地図である。図６は、組換えプラスミドpＢＲＯＣ３２２（ＯＲＦは２９６〜１０８２位にわたり、これは大文字で示されている）中に含有されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列およびフランキングＤＮＡである。pＢＲＯＣ３２２中の挿入は１位で始まり１７５１位で終わる。図７は、図６のＯＲＦによりコードされた推定アミノ酸配列である。図中、略語ＢclＩ、ＢglIIなどは、制限エンドヌクレアーゼの通常の略語であり、アガロースゲル電気泳動で行われるサイズ測定実験により決定されたＤＮＡのキロベース（kb）単位のおよその長さを示す。図面は例示されたＤＮＡ断片上のすべての制限部位を示すものではないと理解されるべきである。本発明によれば、クラブラン酸生合成用調節遺伝子よりなるＤＮＡであって、約７kb以下の長さであり、図１に示す制限部位の立体配置を有するＤＮＡ（Ｉ）の一片よりなるＤＮＡまたはその断片が提供される。本発明のＤＮＡはその「天然の」状態（すなわち、エス・クラブリゲルス（S. clavuligerus）染色体ＤＮＡ中に見られるもの）にあるのではなく、それをフランキングＤＮＡから単離するために精製単離されていると理解される。１つの好ましい態様においては、本発明のＤＮＡは、約７kbの長さおよび実質的に図１に示される制限部位の立体配置を有するＤＮＡ（Ｉ）である。さらに別の態様においては、本発明のＤＮＡは（Ｉ）の断片、特に約１.７kb の長さおよび実質的に図２に示される制限部位の立体配置を有するＤＮＡ（II）である。さらに、好ましい態様においては、本発明のＤＮＡは、図６（配列番号１）に示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列を有するか、または、実質的に図７（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列よりなる。もう１つの態様においては、本発明のＤＮＡは組換えＤＮＡである。好ましくは、本発明の組換えＤＮＡは、組換えベクター、より好ましくはクラブラン酸生成微生物中で形質転換および自律複製する能力を有するベクター、または、相同的組換えを介してクラブラン酸生成微生物の染色体中に挿入ＤＮＡを組み込むことができるベクターよりなる。１つの態様においては、本発明の組換えＤＮＡは高発現ベクターである。本発明のいずれかの態様によるＤＮＡは、当該分野でよく知られた方法、例えば付着末端の直接組み合わせ、ホモポリマーテーリングにより、またはリンカーまたはアダプター分子を用いることにより、いずれかの適当なベクター中に導入されてもよい。かかる適当なベクターの具体例としては、（１）ジャンセン，ジー・アール（Janssen，G．R.）およびビブ，エム・ジェイ（Bibb，M．J.）（１９９３）ジーン（Gene）、１２４、１３３−４に記載されている高コピー数イー・コリ（E．coli）ベクターであるpＩＪ２９２５、（２）キーザー，ティー（Kieser，T.）およびメルトン，アール・イー（Melt on，R．E.）（１９８８）ジーン（Gene）６５：８３−９１に記載に記載されている、ストレプトマイセス（Streptomyces）中の挿入の直接選択についての陽性ベクターであるpＩＪ６９９、（３）ホップウッド（Hopwood）ら（１９８５）、ジェネティック・マニピュレーション・オブ・ストレプトマイセス（Genetic Manipulation of Streptomyc es）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション（The John Innes Foundation）に記載のpＩＪ６８０などが挙げられる。上記方法により調製される組換えベクターは、２つの可能な配向のうちの１つの配向で挿入ＤＮＡを含有していてもよいと理解される。両方の配向を含有する組換えベクターは本発明の範囲内に包含される。本発明の範囲内の個々の組換えベクターには、図１のＤＮＡ断片をプラスミド pＩＪ６８０（図３）中にサブクローニングすることにより作成されるpＷＯＲ３０；図１のＤＮＡ断片をプラスミドpＩＪ２９２５（図４）中にサブクローニングすることにより作成されるpＷＯＲ３０５および図２のＤＮＡ断片をプラスミドpＩＪ６９９（図５）中にサブクローニングすることにより作成されるpＷＯＲ３２２と称されるものが含まれる。本発明のＤＮＡおよび組換えベクターを調製する１つの方法は、欧州特許出願公開第０３４９１２１号の図１に記載されているエス・クラブリゲルス（S．cla vuligerus）染色体ＤＮＡの６０kbセグメントよりなるプラスミドを調製することである。ついで、該プラスミドＤＮＡを１またはそれ以上の適当な制限酵素で消化することにより本発明のＤＮＡを得てもよい。以下pＢＲＯＣ３７１と称されるコスミドを調製し、ついで以下に記載のとおりＢclＩで消化することにより、ＤＮＡ（Ｉ）が便宜に得られる。当該分野でよく知られている方法によりＤＮＡ（Ｉ）から、ＤＮＡ（Ｉ）の断片、例えばＤＮＡ（II）または図６に示されるＯＲＦを有する配列を得てもよい。例えば、ＤＮＡ（Ｉ）を適当なベクター中にサブクローニングし、１またはそれ以上の適当な制限酵素で消化してもよい。図７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、例えば図６に示されるＯＲＦまたはそれに対する遺伝暗号の結果縮重している配列を有するＤＮＡを調製する他の方法は、オリゴおよびポリヌクレオチド合成のよく確立された方法を用いる合成法により、好ましくは自動ＤＮＡ合成機を使用することにより所望のＤＮＡを調製することである。ＤＮＡ（II）よりなる本発明のＤＮＡのより長い断片、すなわちＤＮＡ断片（Ｉ）またはその断片よりなる本発明のＤＮＡのより長い断片を得るために、こうして調製されたＤＮＡまたはその断片を、所望により、エス・クラブリゲルス（ S．clavuligerus）染色体ＤＮＡ（ＥＰ０３４９１２１に記載のとおりに調製されたもの）をプローブするためのプローブとして用いてもよい。適切なプロービング技術は当該分野においてよく知られている。本発明のＤＮＡの１つの有用性は、エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus ）の経験的に誘導されるある種の非生成突然変異体、特に以下dclＸおよびdclＺ突然変異体（特にdclＸ６８、dclＺ１２４およびdclＺ１３９）と称するもの（これらは「調節突然変異体」であると、すなわち、クラブラン酸生合成の調節に関与する１以上の遺伝子において阻止されていると考えられている）におけるクラブラン酸合成を回復させることである。本発明の調節ＤＮＡの別の有用性は、既にクラブラン酸を生成している生物に導入された場合に力価を増大させることである。クラブラン酸産生生物には、エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）ＡＴＣＣ２７０６４およびその誘導体エス・ジュモンジネンシス（S．jumonjinensi ）ＡＴＣＣ２９８６４およびエス・カトルラハマヌス（S，katrurahamanus）Ｔ −２７２が含まれる。また、クラバム（clavam）産生生物、例えばエス・リプマニ（S．lipmanii）におけるクラバムの合成を刺激するために本発明によるＤＮＡを用いてもよい。従ってさらに別の態様において、本発明は、本発明による組換えベクターにより形質転換された宿主を提供する。宿主は、ホップウッド，ディー・エイ（Hopwood，D．A.）ら（１９８５）、ジェネティック・マニピュレーション・オブ・ストレプトマイセス（Genetic Mani pulation of Streptomyces）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory M anual）、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション（The John Innes Foundation ）またはベイリー，シー・アール（Bailey，C．R.）ら（１９８４）バイオテクノロジー（Biotechnology）２；８０８−８１１に記載されているような標準的な技術により形質転換してもよい。好ましい宿主は、適当な培地で培養する場合のクラブラン酸の天然の生産体であるもの、またはクラブラン酸合成を回復させ好ましくは増大させるように本発明のＤＮＡが修復する上記定義のとおりの調節突然変異体である。さらに本発明は、天然でクラブラン酸の生産体である宿主中での、または該宿主の適当な非生成調節突然変異体からのクラブラン酸の製造法であって、（ａ）該宿主またはその非生成突然変異体を本発明による組換えベクターで形質転換し、（ｂ）クラブラン酸の生成が起こるように、こうして形成された形質転換体を適当な条件下で培養することよりなるクラブラン酸の製造法を提供する。クラブラン酸を得るようにクラブラン酸産生生物を培養する一般的な方法、こうして得られたクラブラン酸を精製する方法は、英国特許明細書第１，５０８，９７７号に記載されている。上記方法においては、宿主は好ましくはエス・クラブリゲルス（S．clavulige rus）ＡＴＣＣ２７０６４またはそれ由来である。以下、実施例により本発明を例示する。実施例１．dclＺ突然変異体およびエス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）ＡＴＣＣ２７０６４からの染色体ＤＮＡの調製およびpＢＲＯＣ３７１によるプロービング dclＺ１２４およびdclＺ１３９は共に、クラブラン酸およびセファロスポリン生合成経路の生成物の非生産体である。これらの突然変異体は、エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）の高力価のクラブラン酸生産体についてのランダムスクリーニング操作の間に単離した。それらは、共合成試験において密接させて増殖させた場合、クラブラン酸を生成せず、従ってクラブラン酸生合成に関与している同一の遺伝子において欠陥があると考えられる。これら両方の株および野生型エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）２７０６４から、以下の方法により染色体ＤＮＡを調製した。トリプトン・ソヤ・ブロス＋マルトース増殖培地（３０ml／２５０mlのスプリング振とうフラスコートリプトン・ソヤ・ブロス３０g／ｌ、マルトース１０g／ｌ）の２個の振とうフラスコに両方の株の胞子を接種し、２６℃で４８時間インキュベート（２４０rpmで振とうしながら）した。１，５００gで遠心分離することにより菌糸体を収穫し、１０％ショ糖中で洗浄した。上清画分を注ぎ出し、ペレットを５mlリゾチーム溶液（２５mＭトリスpＨ７．５，２５mＭＮa₂ＥＤＴＡ pＨ８.０、１０％ショ糖、リゾチーム１０mg／ml）に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。１０分の１容量の溶菌溶液（１％ＳＤＳ、２０mＭＮa₂ＥＤＴＡ）を加え、該溶液を広口径ピペットで完全に混合した。塩化セシウム（１．０５g×溶液重量）を該溶液に溶解し、清澄回転（１，５００g）を行っていずれかの沈殿タンパク質を除去した。該上清に臭化エチジウムを、最終濃度が２５０ug／mlとなるように加え、該溶液を高速遠心分離チューブに分注した。該チューブを高速遠心分離機中で５５Ｋrpmで２０時間遠心分離して密度勾配を作り、チューブに針を刺し最高密度の臭化エチジウムを含有する帯を除去することにより染色体ＤＮＡを含有する画分を除去した。該サンプルをブタノールで抽出して臭化エチジウムを除去し、過剰容量のＴＥ（１０mＭトリスpＨ８．０，１mＭＮa₂ＥＤＴＡ）中で透析して塩化セシウムを除去した。０．１容量の３ＭＮaアセタートpＨ５．０、２容量のエタノールでＤＮＡを沈殿させ、遠心分離後に２mlＴＥに再溶解させた。５〜１０ugの２７０６４の染色体ＤＮＡ、dclＺ１３９およびdclＺ−１２４を、標準的な条件を用いて全容量３０または５０ulの制限酵素ＢamＨＩ、ＢclＩ、Ｅco ＲＩおよびＢglIIで消化した。アガロースゲル電気泳動（０．８％ゲル）上の反応混合物の試料の検査が消化が完了したことを示すまで、反応をインキュベートした。ついで各試料の残りを０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、標準的なサザンブロッティング技術を用いてナイロン膜上にＤＮＡを移した［サムブルック，ジェイ（Sambrook，J）、フリチュ，イー・エフ（Fritsch，E．F.）およびマニアティス，ティー（Maniatis，T.）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、第２版（１９８９）］。この膜を、イー・コリベクターpＨＣ７９に挿入されている欧州特許公開第０２３３７１５号の図１に示す４０kbＤＮＡ断片を含有するコスミドp ＢＲＯＣ３７１でプローブした。標準アルカリ溶菌調製的方法により、このプラスミドで形質転換されたイー・コリ宿主からＤＮＡを単離し、塩化セシウム勾配により精製した［サムブルック，ジェイ（Sambrook，J）、フリチュ，イー・エフ（Fritsch，E．F.）およびマニアティス，ティー（Maniatis，T.）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、第２版（１９８９）］。１００ngのプラスミドを³²Ｐで放射活性標識し（アマシャム・マルチプライム・キット・プロトコール（Amersh am Multiprime Kit protocol））、分離されたＤＮＡを運ぶ膜をプローブするのに用いた。６％ＰＥＧ、１％ＳＤＳ、３×ＳＳＣおよび１００ug／mlの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中、同じ緩衝液（該プローブを除いたもの）中で前ハイブリッド形成を一夜行った後、７０℃で２０時間ハイブリッド形成を行った。フィルターを２×ＳＳＣ（１０'室温）、２×ＳＳＣ（１５'、７０℃）で２回、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（３０'、７０℃）で順次洗浄し、Ｘ線フィルムにさらした。オートラジオグラフの分析は、２個の突然変異体、dclＺ１２４およびdclＺ１３９が、pＢＲＯＣ３７１が由来する染色体の範囲内に、野生型２７０６４と比較して約５．５kbの欠失を有することを示した。２．ＤＮＡ（Ｉ）の調製アガロースゲル上で電気泳動した試料が消化が完了したことを示すまで、標準的条件下で約１０μgのpＢＲＯＣ３７１プラスミドＤＮＡをＢclＩで消化した。ついで、０．８％アガロースゲル上で試料の残りを電気泳動し、７kbの断片を含有するアガロースの細片をかみそり刃で除去した。ＩＢＩ電気溶出機（製造者プロトコール）を用いて該ゲル細片からＤＮＡを溶出し、エタノール沈殿させ、２０ulＴＥに再溶解させた。アガロースゲル電気泳動により、正しい断片が得られたことが確認された。３．pＷＯＲ３０の調製 pＩＪ６８０を含有するエス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）株の胞子を振とうフラスコ内のＴＳＢ／マルトース培地に接種し、増殖させて調製１におけると同様のプラスミド調製用菌糸体を得た。５ug／mlの濃度になるまでチオストレプトンを加えてプラスミドの安定性を維持した。キーゼル（Kieser）法（ティー・キーゼル（T．Kieser、１９８４、プラスミド（Plasmid）１２：１９−３６））の変法で該菌糸体からプラスミドを単離した。５mlのリゾチーム溶液（０．３Ｍショ糖、２５mＭトリス（pＨ８）、２５mＭＮa₂ＥＤＴＡ（pＨ８）、２mg ／mlリゾチーム）に菌糸体を再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。２．５mlの０.３ＭＮaＯＨ、２％ＳＤＳを激しく混合しながら加え、溶菌するまで該溶液を７０℃で２０分間インキュベートした。溶菌液を８００ul酸フェノール／クロロホルムで２度抽出し、非緩衝酢酸ナトリウム（３Ｍ）およびイソプロパノールで該ＤＮＡを沈殿させた。１，５００gでの遠心分離後に得られたペレットを５００ulＴＥに再懸濁させ、一夜再沈殿させ、最後に５０ulＴＥに溶解させた。１ugのpＩＪ６８０プラスミドＤＮＡをＢamＨＩで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した［サムブルック，ジェイ（Sambrook，J）、フリチュ，イー・エフ（Fritsch，E．F.）およびマニアティス，ティー（Maniatis，T.）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、第２版（１９８９）］。このＤＮＡ２５０ng とＤＮＡ（Ｉ）２００ngとを全容量１０ul中で混合し、標準的な技術を用いて連結させた。５ulの連結混合物を、標準的な方法［ホップウッド，ディー・エイ（ Hopwood，D．A.）ら（１９８５）ジェネティック・マニピュレーション・オブ・ストレプトマイセス（Genetic Manipulation of Streptomyces）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション（The John Innes Foundaion）］に従いエス・リビダンス（S．lividans ）１３２６プロトプラスト（４×１０⁹／ml）中に形質転換した。形質転換後、該プロトプラストを１０^-2以下の希釈にてＲ２ＹＥ寒天上にプレーティングした［ホップウッド，ディー・エイ（Hopwood，D．A.）ら（１９８５）ジェネティック・マニピュレーション・オブ・ストレプトミセス（Genetic Manipulation of Streptomyces）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション（The John Innes Foundaion）］。３０℃で２４時間インキュベートした後、５００ug／mlの最終濃度でチオストレプトン抗生物質を含有する２mlの軟栄養ブイヨン寒天（ＳＮＡ；８gオキソイド・ニュートリエント・ブロス（Oxoid Nutrient Broth）／１，３g寒天／ｌ）で該プレートを重層してプラスミド含有コロニーについて選択した。３０℃で３日間インキュベートした後、形質転換プレート上に１９個のコロニーが現れ、ネオマイシン遺伝子中に挿入を有するプラスミドを含有するそれらのコロニーを検出するために、５０ug／mlでチオストレプトンを含有するＲ２ＹＥ培地およびチオストレプトン（５０ug／ml）およびネオマイシン（１０ug／ml）を含有するＲ２ＹＥに該コロニーを移した。後者のプレート上では９個のコロニーは増殖せず、これはネオマイシン遺伝子が分断していることを示すものである。上記のとおりに増殖させた５個のチオストレプトン耐性、ネオマイシン感受性エス・リビダンス（S．lividans）１３２６コロニーからの５００ulの菌糸体からプラスミドＤＮＡを調製した。５００ulリゾチーム溶液中、各コロニーからの菌糸体をインキュベートし、２％ＳＤＳで溶菌した。中性フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出することにより該溶液を清澄化し、ついで該ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。染色体ＤＮＡをガラス棒に巻きつけることにより除去し、遠心分離によりプラスミドＤＮＡをペレット化した。後者を５０ulＴＥに再溶解させた。各プラスミド調製物２０ulをＸhoＩ制限酵素で消化し、試料のゲル電気泳動により、単離物の４個がおよそ予想された大きさ（pＩＪ６８０（５．３kb）に７kbの挿入を加えたものを表す）の直線断片を含有することが示された。ＢclＩによる制限消化およびＢamＨＩ／ＸhoＩによる二重消化によりプラスミトＤＮＡをさらに分析して、pＢＲＯＣ３７１からのＤＮＡ（Ｉ）がpＩＪ６８０中にクローニングされていることが確認された。この構築物をpＷＯＲ３０（図３）と称した。４．dclＺ１２４およびdclＺ１３９のpＷＯＲ３０との相補性 pＷＯＲ３０プラスミドＤＮＡを用いて、エス・クラブリゲルス（S．clavulig erus）dclＺ１２４およびdclＺ１３９を形質転換した。これは、該ＤＮＡの添加直前にプロトプラストを４５℃で１０分間インキュベートしたことを除きベイリー，シー・アール（Bailey，C．R.）ら（１９８４）バイオテクノロジー（Biotechnology）２：p８０８−８１１に記載のとおりに行った。チオストレプトン耐性形質転換体を得、Ｍ５Ｄ（欧州特許出願公開第０３４９１２１号）培地（チオストレプトン（５μg／ml）を加えたもの）上に線状に塗った。プレートバイオアッセイにより、クラブラン酸の修復について、dclＺ１２４およびdclＺ１３９のpWＯＲ３０による形質転換体を試験した。各形質転換体の細胞をＭ５Ｄ上に穿剌し、２６℃で６日間インキュベートした。ついで該バイオアッセイプレートを、リーディング，シー（Reading，C.）およびコレ，エム（C ole，M.）（１９７７）アンチミクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Antimicrob．Agents Chemother.）１１：８５２−７に記載のクレブシエラ・アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）の株、０．０２％テトラゾリウム塩および５μg／mlペニシリンＧを含有する軟血液寒天（オキソイド（Oxoid））で重層した。２６℃で一夜インキュベートした後、形質転換されたコロニーの周辺に阻止域が形成され、これは形質転換されていない対照（本質的にはゼロ）の周辺のものより大きかった。正確な力価評価のために、対照培養より大きい域を示す形質転換体を振とうフラスコ培養に移した。チオストレプトン（５μg／mlの最終濃度）を添加しながら、各コロニーからの細胞を２０mlの種培地に接種し（欧州特許公開第０３４９１２１号）、振とうしながら２６℃で３日間増殖させた。ついで、５μg／ml チオストレプトンを含有する最終段階の培地（欧州特許出願公開第０３４９１２１号）に１mlの種培養を接種し、４日以下の間２６℃で増殖させた。３または４日の増殖の後、最終段階のブロスの試料を取り、ハード，エイ・イー（Bird， A．E.ら（１９８２）アナリスト（Analyst）１０７：１２４１−１２４５およびフォールストーン，エム（Foulstone，M.）およびリーディング，シー（Reading ，C.）（１９８２）アンチミクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Antimicrob．Agents Chemother.）２２：７５３−７６２）に記載のとおりにクラブラン酸生産性について検定した。試験した単離物のうち、すべてにおいて力価の修復が示され、最大増加はクラブラン酸非生産体の親の８０％までになった。５．pＷＯＲ３０によるdclＸ６８の相補性 dclＸ６８は、共合成試験において密に増殖させた場合にクラブラン酸を生産しないエス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）の高力価クラブラン酸生産体についてのランダムスクリーニングの間に単離されたクラブラン酸のいくつかの非生産体の代表である。これらの突然変異体は、実施例１に記載のＤＮＡの５．５kb領域について欠失されていない点で、dclＺ１２４およびdclＺ１３９と異なる。pＷＯＲ３０プラスミドＤＮＡを用いて、実施例４に記載のとおりにエス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）dclＸ６８を形質転換させた。チオストレプトン耐性形質転換体を得、Ｍ５Ｄ培地（チオストレプトン（５μ g／ml）を加えたもの）上に線状に塗った。実施例４に記載のプレートバイオアッセイによるクラブラン酸の修復について、dclＸ６８のpＷＯＲ３０による形質転換体を試験し、形質転換されていない対照、dclＸ６８と比べて阻止域の増大が示された。振とうフラスコ発酵（実施例４に記載のもの）においては、試験した単離物のうちの１１個において、チオストレプトンの存在および非存在下で共に力価の修復が示され、最大増加はクラブラン酸非生産体の親の２９０％までになった。６．pＷＯＲ３０５の構築さらにサブクローニングするために、ＤＮＡ（Ｉ）として記載されている７kb のＢclＩ断片を高コピー数イー・コリベクター、pＩＪ２９２５中に連結した。アガロースゲル上で電気泳動された試料が消化の完了を示すまで、標準的な条件下で２μgのpＩＪ２９２５ＤＮＡをＢamＨＩで消化した。該ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により清澄化し、エタノールで沈殿させた。最終ペレットを３０μlのＴＥに溶解した。約５０ngのＢamＨＩ−消化pＩＪ２９２５ＤＮＡを全容量１０μl中、２００ng のＤＮＡ（Ｉ）と混合し、標準的なプロトコールを用いて連結した。得られた連結混合物を用いて、標準的な方法によりイー・コリＤＨ５αＦ’を形質転換した。挿入を有するpＩＪ２９２５プラスミドを含有するコロニーの可視選択を可能にする５０μg／mlアンピシリン、１２．５μg／mlイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および４０μg／mlの５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ガル）で補足したＬ−寒天プレート上に形質転換体をプレーティングした。２０個の白色のアンピシリン耐性コロニーを得、アンピシリン（５０μg／ml ）を含有するＬ−寒天プレート上に当てた。これらのすべてのコロニーからの細胞を、アンピシリン（５０μg／ml）を含有するＬ−ブロス中に接種し、３７℃ で一夜増殖させ、標準的なアルカリ溶菌法［サムブルック，ジェイ（Sambrook， J）、フリチュ，イー・エフ（Fritsch，E．F.）およびマニアティス，ティー（M aniatis，T.）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、第２版（１９８９）］により一夜培養物の１．５mlアリコートからプラスミドＤＮＡを調製した。ＫpnＩおよびＢamＨＩによる制限消化分析により、１個の単離物がpＩＪ２９２５中のpＢＲＯＣ３７１からの７kbのＢclＩ断片を含有することが確認され、この構築物をp ＷＯＲ３０５（図４）と称した。７．ＤＮＡ（II）の単離標準的な技術により１リットルのイー・コリＤＨ５αＦ’培養からpＷＯＲ３０５プラスミドＤＮＡを単離し、塩化セシウム勾配により精製した。アガロースゲル上で電気泳動された試料が消化の完了を示すまで、同じ緩衝液中でＢamＨＩおよびBglIIで５μgを消化した。反応混合物の残りをアガロースゲル上で走らせ、１．７kbのＢamＨＩ／ＢglII断片（ＤＮＡ（II））を表すＤＮＡを実施例２に記載の通りに単離した。８．pＷＯＲ３２２の構築２０μgのpＩＪ６９９、すなわちストレプトマイセス（Streptomyces）中の挿入の直接選択についての陽性ベクターを、同じ緩衝液中でＢglIIおよびＥcoＲＩで消化した。ストレプトミセト（Streptomycete）機能を運ぶ５kbのＢglII断片をＤＮＡ（Ｉ）について実施例２に詳述のとおりに単離し、２０μlＴＥ中に溶解した。ｐＩＪ６９９からの２００ngのＢglII断片をpＷＯＲ３０５からの２００ngの１．７kbのＢamＨＩ、ＢglII断片と連結することによりプラスミドpＷＯＲ３２２を構築した。実施例３に記載のとおり、５μlの連結混合物をエス・リビダンス（S．lividans）１３２６のプロトプラスト中に形質転換し、最終濃度５０μg ／mlでチオストレプトンを含有するＳＮＡで重層することにより形質転換体を選択した。チオストレプトン耐性形質転換体を得、この形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡは、図５に示されるプラスミド構築物を有することが示された。９．dclＸ６８におけるセファロスポリンおよびクラブラン酸生合成経路のpＷＯＲ３２２による回復 pＷＯＲ３２２ＤＮＡを用いて、実施例４に記載のとおり、dclＸ６８のプロトプラストを形質転換した。５０μg／mlチオストレプトンを含有するＳＮＡで重層した後、形質転換体を選択し、重層が０．００３％アンピシリン、０．０２％テトラゾールを含有し、指示生物かイー・コリＪＴ３９Ｒ_TEM（フンター・ピー（Hunter P.）ら（１９８０）ジャーナル・オブ・アンチミクロバイアル・ケモセラピー（J．Antimicrobial Chemotherapy）６：p４５５−４７０）である以外は実施例４に記載のとおり、クラブラン酸生成の修復についてバイオアッセイで分析した。該形質転換体は陰性対照より大きな阻止域を示し、振とうフラスコ試験（実施例４に記載のとおり）による分析においてdclＸ６８のクラブラン酸生産親より大きな力価が得られることが判明した。ＨＰＬＣ分析を用いて、dclＸ６８は、セファロスポリン生合成経路からの生成物の生産において欠陥があることが証明された。Ｃ１８スティール・カートリッジ（ウォーターズ（Waters）３．９×１５０nm）カラムの付いたウォーターズ（Waters）ＨＰＬＣ／ダイオード・アレイ・ディテクター・システム（Diode Ar ray Detector system）を用いて室温で流速１ml／分［移動層１５％メタノール、８５％水、０．００５Ｍ硫酸水素テトラブチルアンモニウム（ピクＡ（PicＡ）、ウォーターズ・レジスタード（Waters Registered））］にてこの分析を行った。dclＸ６８／pＷＯＲ３２２形質転換体におけるファロスポリン生合成経路の回復を検出するために、４日目から振とうフラスコ発酵ブロスの試料を遠心分離して細胞破片を除去し、上清をＨＰＬＣで分析した。dclＸ６８の親には存在するがd cl Ｘ６８そのものには存在しないセファロスポリン経路の公知生成物の再出現により、dclＸ６８／pＷＯＲ３２２形質転換体におけるセファロスポリン経路の回復が証明された。１０．ＤＮＡ（II）のヌクレオチド配列標準的な技術を用いて、pＷＯＲ３０５から単離されたＤＮＡ（II）の異なるサブフラグメントを含有する幾つかのＭ１３mp１８および／またはＭ１３p１９ベクター構築物を作った。これらすべてのプラスミドからの標準的技術により一本鎖ＤＮＡを調製し、ファルマシアから得られるＴ７ポリメラーゼ・シークエンシング・キット（製造者のプロトコール）で配列決定した。０．８％尿素−ポリアクリルアミド配列決定ゲル上で配列決定反応物を分離し、得られた配列をDNASTARシークエンシング・パッケージで分析した。ＤＮＡ（II）の全配列を覆う両鎖上で１７５１塩基対の配列を得た。２６２個のアミノ酸のポリペプチドをコードする１つの全オープン・リーディング・フレームをこの配列内で同定した（図６）。該タンパク質（図７）は、二次代謝物の調節に関連する他のストレプロミセテ遺伝子との相同性を示す［例、actIIまたはf4、フェルナンンデズ−モレノ，エム・エイ(Fernandez-Moreno，M.A.)ら(199 1)、セル(Cell)66:p769-780dnrI，シュトゥッツマン−エングウォール，ケイ・ジェイ(Stutzman-Engwall，K.J.)ら(1992)ジャーナル・オブ・ハクテリオロジー (J.Bacteriology)174,1,p144-154afsRホリノウチ，エス(Horinouchi，S.)(1990) ジーン(Gene)95:p49-56 redD-またはfI、ナーバ，ケイ・イー(Narva，K．E.)およびジェイ・エス・フェイテルソン(J．S．Feitelson)(1990)，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J．Bacteriology)164: p 85-94］。このオープン・リーディング・フレームのもう１つの特徴は、ロイシンをコードする希有（ストレプトマイセテゲノム中）ＴＴＡコドンの存在であり、これもまたエス・ケリコロール（S.coelicolor）における二次代謝物の調節に関連している。（レスキウ，ビー・ケイ(Leskiw，B．K.)、ビブ，エム・ジェイ（Bibb，M．J.）およびチャーター，ケイ・エフ（Chater，K．F）（1991）Mol．Microbiol.5:(12)p 2861-2867）。配列表（１）一般的情報（ｉ）出願人（Ａ）名前：スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミティッド・カンパニー（SmithKline Beecham p.l.c.）（Ｂ）通り：ニュー・ホライズンズ・コート（New Horizons Court）（Ｃ）市：ブレンフォード（Brentford）（Ｄ）州：ミドルセックス（Middlesex）（Ｅ）国：英国（England）（Ｆ）郵便番号(ZIP)：ＴＷ８９ＥＰ（Ｇ）電話番号：０７３７３６４１４７（Ｈ）テレファックス：０７３７３６４００６（Ｉ）テレックス：９１１４１５（ii）発明の名称：新規化合物（iii）配列の数：２（iv）コンピューター読み取り可能形式：（Ａ）媒体型：フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテント・イン・リリース#１．０、バージョン#１．２５（EPO）（２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１７５１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（vi）起源（Ａ）生物名：ストレブトマイセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavul lgerus) （Ｂ）株：エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）ＡＴＣＣ２７０６４（xi）配列：配列番号１（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：２６２アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：未知（ii）配列の種類：タンパク質（iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ（vi）起源：（Ａ）生物名前：ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces cla vuligerus）（Ｂ）株：エス・クラブリゲルス（S．clavuligerus）２７０６４（xi）配列:配列番号２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者バートン，バリーイギリス国ウエスト・サセックス・ビーエヌ14・８キューエイチ、ワージング、クラレンドン・ロード（番地の表示なし）スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ (72)発明者アール，アリソン・ジェーンイギリス国ウエスト・サセックス・ビーエヌ14・８キューエイチ、ワージング、クラレンドン・ロード（番地の表示なし）スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．約７kb以下の長さであり、図１に示す制限部位の立体配置を有する一片のＤＮＡ（Ｉ）よりなるクラブラン酸生合成用調節遺伝子よりなるＤＮＡまたはその断片。２．約７kbの長さおよび実質的に図１に示す制限部位の立体配置を有するＤＮＡ（Ｉ）。３．約１．７kbの長さおよび実質的に図２に示す制限部位の立体配置を有するＤＮＡ（II）であるＤＮＡ（Ｉ）の断片。４．図６（配列番号１）に示すオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列を有する、または実質的に図７（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列よりなる上記請求項のいずれか１項記載のＤＮＡ。５．上記請求項のいずれか１項記載のＤＮＡまたはその断片と高緊縮条件下でハイブリッド形成し、かつ、クラブラン酸生合成における調節遺伝子をコードするＤＮＡ。６上記請求項のいずれか１項記載のＤＮＡよりなる組換えＤＮＡベクター。７．pＷＯＲ３０、pＷＯＲ３０５およびpＷＯＲ３２２である請求項５記載のベクター。８．実質的に図７（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。９．宿主とＤＮＡとを適当な条件下で混合することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載のＤＮＡで宿主細胞を形質転換する方法。１０．請求項６または７記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。１１．天然でクラブラン酸の生産体である宿主中でのまたは該宿主の適当な非生産調節突然変異体からのクラブラン酸の製造法であって、（ａ）本発明に従い該宿主またはその非生産突然変異体を組換えベクターで形質転換し、（ｂ）クラブラン酸の生産が起こるように、形成された形質転換体を適当な条件下で培養することよりなるクラブラン酸の製造法。