JPH08506479A

JPH08506479A - Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患の治療のための組成物および方法

Info

Publication number: JPH08506479A
Application number: JP6507055A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン，ケビン・ピー; ハネカック，ロニー・シー; 和哉星子; 周英野崎; 司西原; 博中武; 福三郎濱田; 辰男衛藤; 真一古川
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Mochida Pharmaceutical Co Ltd; Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Mochida Pharmaceutical Co Ltd; Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1992-09-10
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 1996-07-16
Also published as: US6284458B1; DE69330372T2; NZ286209A; WO1994005813A1; AU4983793A; US20040033978A1; DE69330372D1; NZ255578A; EP0662157A1; ATE202383T1; CA2143678A1; EP0662157B1; AU680435B2; DK0662157T3

Abstract

(57)【要約】ＨＣＶＲＮＡの少なくとも一部に相補的で特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。これらオリゴヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでＣ型肝炎ウイルスの複製を阻害するため、およびＣ型肝炎ウイルス関連疾患を治療するために投与することができる。これら化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスに伴う疾患の重篤度を予防的または治療的のいずれかにて軽減するのに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患の治療のための組成物および方法発明の技術分野この発明は、インビボまたはインビトロでＣ型肝炎ウイルスの複製を阻止しＣ型肝炎ウイルス関連疾患を治療するための投与することのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および合成に関する。これら化合物は、予防的かまたは治療的に用いてＣ型肝炎ウイルスに関連する疾患の重篤度を減少させることができる。ＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが開示される。発明の背景輸血の結果として現在認められている肝炎の主要な形態は、これまでに特徴付けられているＡ型肝炎ウイルスともＢ型肝炎ウイルスとも関係せず、非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼ばれている。ＮＡＮＢＨは、現在、輸血後肝炎の症例の９０％以上を占めている。輸血を受ける人におけるＮＡＮＢＨの頻度の推定値は、ボランティアの血液では５％〜１３％、市販の血液では２５〜５４％である。急性のＮＡＮＢＨはＡ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスによって引き起こされる急性疾患に比べてしばしば重篤ではないが、時折重篤なまたは劇症の肝炎に導く。一層懸念されることには、慢性肝炎への進行はＮＡＮＢＨ後ではＡ型肝炎またはＢ型肝炎のいずれかの感染後よりもはるかに一般的である。慢性ＮＡＮＢＨは、感染個体の１０％〜７０％で報告されている。この形態の肝炎は無症候性の患者からでさえも伝播し、しばしば肝硬変や肝細胞癌などの悪性の疾患へと進行する。慢性活動性肝炎（肝硬変を伴うまたは伴わない）は、輸血後肝炎症例の４４％〜９０％で認められる。肝硬変をきたした患者のうち約１／４が肝不全のために死亡する。慢性活動性ＮＡＮＢＨは、血液製剤に依存する血友病患者にとって深刻な問題である；５％〜１１％の血友病患者が慢性の末期肝臓疾患で死亡している。血液または血液製剤を原因とする以外のＮＡＮＢＨの症例は、しばしば病院に置かれること、誤って注射針を剌すこと、またはいれずみに伴うものである。親密な個人的接触によっても伝播は起こるが、これはＢ型肝炎に比べればＮＡＮＢＨでは一般的ではない。ＮＡＮＢＨの大部分の病原因子は最近になって同定され、現在、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と呼ばれる。ヒュートン（Houghton）ら、ＥＰ公開３１８，２１６号；チュー（Choo）ら、Science１９８９、２４４、３５９〜３６２。組換えＤＮＡ法により作製した抗原を用いた血清学的研究によって、いまやＨＣＶが輸血後ＮＡＮＢＨの殆どの症例の病原因子であることが明らかである。濃縮ウイルス粒子から単離した核酸から調製したｃＤＮＡのクローンは、もともとＮＡＮＢＨ患者の血清と反応するポリペプチドをコードする能力に基づいて単離されたものである。これらクローンは、感染した肝臓組織から単離したＲＮＡとはハイブリダイズするがＤＮＡとはハイブリダイズせず、ＲＮＡゲノムの存在を示していた。これらｃＤＮＡクローンのハイブリダイゼーション分析およびシークエンシングにより、感染した肝臓および粒子中に存在するＲＮＡが該ｃＤＮＡのコード鎖と同じ極性を有することが明らかとなった；言い換えれば、このウイルスのゲノムはポジティブまたはプラス鎖ＲＮＡゲノムである。ＥＰ公開３１８，２１６号（ヒュートンら）は、ＨＣＶ−１の部分ゲノム配列を開示しており、ＨＣＶ配列およびＨＣＶポリペプチドのクローニングおよび発現の組換えＤＮＡ法、ＨＣＶ免疫診断の技術、ＨＣＶプローブ診断法、抗ＨＣＶ抗体、および新規ＨＣＶ配列の単離法を教示している。ヒュートンらはまた、別のＨＣＶ配列をも開示しており、これら配列およびポリペプチドの免疫診断法、プローブ診断法、抗ＨＣＶ抗体の製造、ＰＣＲ法および組換えＤＮＡ法における応用を教示している。ウイルス複製のインヒビターとしてのアンチセンスポリヌクレオチドの使用の概念が開示されているが、特定の標的については何ら教示されていない。開示された配列に基づくオリゴマープローブおよびオリゴマープライマーもまた提供されている。ＥＰ公開４１９，１８２号（ミヤムラ（Miyamura）ら）は、新規なＨＣＶ単離物であるＪ１およびＪ７、およびＨＣＶ−１配列とは異なる配列のスクリーニングおよび診断への使用を開示している。慢性ＮＡＮＢＨの治療のために有効であることが示されている唯一の治療戦略は、インターフェロン−αである。殆どのＮＡＮＢＨ患者でインターフェロン療法の間の臨床兆候の改善が示されているが、治療を中断したときに患者の少なくとも半分で再発が観察されている。それゆえ、抗ウイルス療法における有意な改善が大いに期待されている。発明の目的ＨＣＶのＲＮＡとハイブリダイズして該ＲＮＡの合成または機能を阻害しうるオリゴヌクレオチドを提供することがこの発明の目的である。ＨＣＶのＲＮＡとハイブリダイズして該ウイルスの複製を阻害しうるオリゴヌクレオチドを提供することがこの発明の別の目的である。ウイルスＲＮＡとのアンチセンス相互作用によりＨＣＶの発現を調節しうるオリゴヌクレオチドを提供することがこの発明の他の目的である。急性または慢性のＨＣＶ感染の予防、診断および治療法を提供することがこの発明のさらに別の目的である。この発明の他の目的は、ＨＣＶ関連疾患の予防、診断および治療法を提供することである。ＨＣＶまたはＨＣＶＲＮＡを含有していると思われる試料中の該ＨＣＶまたはＨＣＶＲＮＡの存在または不在を検出するための方法、材料およびキットが本発明の他の目的である。これらおよび他の目的は、本明細書および添付の請求の範囲を参照すれば当業者には明らかとなるであろう。図面の簡単な記載図１は、全５'−非翻訳領域（ヌクレオチド１〜３４１）および１４５−ヌクレオチドのコア領域配列を含むヌクレオチド１〜６８６の配列である。図２は、ＨＣＶＲＮＡのヌクレオチド１〜３５０からの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、ＨＣＶコアタンパク質翻訳の阻害を示す棒グラフである。図３は、２'−Ｏ−メチル化したアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび同配列の選択した非修飾オリゴヌクレオチドによる、ＨＣＶコアタンパク質翻訳の阻害を示す棒グラフである。図４は、インビトロにおけるＨＣＶコアタンパク質翻訳に対するオリゴヌクレオチドＩＡ−８０、ＩＡ−１１０、ＩＡ−１４０、ＩＡ−２６０、ＩＡ−３００およびＩＡ−３６０の阻害活性を示すオートラジオグラフである。図５は、ＨＣＶＲＮＡのヌクレオチド１〜３７１からの領域に相補的なオリゴヌクレオチドによる、改変インビトロ翻訳アッセイにおけるＨＣＶコアタンパク質翻訳の阻害を示す棒グラフである。図６は、ループＣ領域およびＡＵＧコドン／コアタンパク質コード領域の周辺の２'−Ｏ−メチル／Ｐ＝ＯアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＣＶ翻訳の阻害を示す棒グラフである。図７は、ＩＡ−３４０のＰ＝Ｏ、Ｐ＝Ｓ、Ｐ＝Ｏ／２'−Ｏ−ＭｅおよびＰ＝Ｓ／２'−Ｏ−Ｍｅ態様による、ＨＣＶコアタンパク質翻訳の用量依存性の阻害を示す折れ線グラフである。図８は、ＲＮアーゼＨで処理した後のインビトロ翻訳アッセイによる、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのスクリーニングの結果を示す棒グラフである。図９は、２'−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドおよび２'−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの阻害活性を示す棒グラフである。発明の要約本発明によれば、ＨＣＶ感染の効果を調節する（modulating）ための組成物および方法が提供される。ＨＣＶＲＮＡの選択された配列に相補的で特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドが提供される。ＨＣＶの５'末端ヘアピンループ、５'末端６塩基対繰り返し、５'末端非翻訳領域、ポリタンパク質翻訳開始コドン、コアタンパク質コード領域、ＯＲＦ３翻訳開始コドン、３'非翻訳領域、３'末端パリンドローム領域、Ｒ２配列および３'末端ヘアピンループが好ましい標的である。ＨＣＶ関連疾患を有すると思われる動物に、単独または薬理学的に許容しうる担体とともにオリゴヌクレオチドを投与することによる疾患状態の診断または治療方法も提供される。標的ＲＮＡと該標的の少なくとも一部に相補的で特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドとの関係を一般に「アンチセンス」と表示している。これらオリゴヌクレオチドは、ウイルスＲＮＡの複製、ｍＲＮＡへの転写、タンパク質への翻訳、ウイルス粒子へのパッケージングまたは全体的な生物学的機能に必要な他の活性を妨害することにより該ウイルスＲＮＡの機能を阻害することができる。ＲＮＡがその機能をすべてまたは一部行うことができないと、ウイルスの正常なライフサイクルのすべてまたは一部が行えない結果となる。ウイルスを標的として設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドはウイルス感染を減少させるのに有効であることがわかっている。オリゴヌクレオチドは約５〜約５０ヌクレオチドユニットを有するのが好ましい。これらオリゴヌクレオチドはまた、ＨＣＶの５'末端ヘアピンループ、５'末端６塩基対繰り返し、５'末端非翻訳領域、ポリタンパク質翻訳開始コドン、コアタンパク質コード領域、ＯＲＦ３翻訳開始コドン、３'非翻訳領域、３'末端パリンドローム領域、Ｒ２配列および３'末端ヘアピンループと特異的にハイブリダイズしうることも好ましい。オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する耐性を高め、その有効性を高めるために修飾することができる。好ましい態様によれば、ウイルスＲＮＡはＨＣＶ感染および／またはＨＣＶ複製を阻害するに充分な程度に妨害される。それゆえ、ＨＣＶＲＮＡの一部と相互反応しうるオリゴヌクレオチドが包含される。ＨＣＶ関連疾患を有すると思われる動物を本発明に従って調製したオリゴヌクレオチドと接触させる。とりわけ、本発明は、急性および慢性のＨＣＶ感染およびＨＣＶ関連疾患の処置に予防および治療の両面で有効であると思われる。異なる株および株内の異なるタイプからのＨＣＶのＲＮＡにおいて差異が存在することが予測される。それゆえ、たとえば、種々のＨＣＶ株の領域はそれぞれの株に対して本質的に同じ機能を果たし、遺伝情報の発現に対する妨害は種々の株において同様の結果をもたらすであろうと思われる。このことは、株間でヌクレオチド配列に差異が存在する場合でもそうであると思われる。従って、本明細書に開示するヌクレオチド配列は、記載した特定の株の代表として理解されるであろう。ＨＣＶの異なる株に対する相同または類似配列はこの発明の範囲に包含される。好ましい態様の詳細な記載アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くのヒト疾患の治療のための治療剤として大いに有望である。殆どの場合、特定のＲＮＡ標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基対形成により前駆体ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡに結合し、ＤＮＡからタンパク質への遺伝情報の流れを阻害する。ＨＣＶなどのＲＮＡウイルスの場合は、オリゴヌクレオチドはウイルスのゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または複製性中間体ＲＮＡに特異的にハイブリダイズするように設計され、該ＲＮＡの機能を妨害してウイルスの複製またはタンパク質の発現が変調されるようにする。数多くの最近の研究は、標的タンパク質を研究するための生化学的手段としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用性の証拠を提示している。ローゼンバーグ（Rothenberg）ら、J．Natl．Cancer Inst．１９８９、８１、１５３９〜１５４４；ゾン（Zon）、G．Pharmaceutical Res．１９８７、５、５３９〜５４９。オリゴヌクレオチド化学の最近における進歩、ヌクレアーゼ抵抗性のオリゴヌクレオチドの合成、および増加した細胞取り込みを示すタイプのオリゴヌクレオチドを利用できることのため、今や新たな形態の治療薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を考慮することが可能である。治療薬として、ＨＣＶ感染またはＨＣＶ関連疾患を有すると思われる動物にこの発明によるオリゴヌクレオチドを投与して処置する。オリゴヌクレオチドは医薬組成物として処方することができ、該組成物には該オリゴヌクレオチドに加えて担体、増量剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤などが含まれていてよい。医薬組成物にはまた、オリゴヌクレオチドに加えて、たとえば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などの１または２以上の活性成分が含まれていてもよい。上記医薬組成物は、局所処置かまたは全身処置を希望するかによって、および処置する部位によって、多くの仕方で投与することができる。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻内を含む）、経口、吸入、または非経口、たとえば静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射によるものであってよい。局所投与のための処方物としては、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、噴霧剤、液剤および散剤が挙げられる。通常の医薬担体、水性、粉末もしくは油状の基剤、増量剤などが必要もしくは望ましい。コーティングしたコンドームもまた有用である。経口投与のための組成物としては、散剤または顆粒剤、水中または非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、サシェ剤（sachets）、または錠剤が挙げられる。増量剤、香料、希釈剤、乳濁化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい。非経口投与のための処方物としては、滅菌水溶液（緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤を含有していてよい）が挙げられる。投薬は処置しようとする病的状態の重篤度および応答性（responsiveness）に依存するが、通常、１日当たり１または２以上投与であり、処置は数日から数カ月または治癒が現れるか疾患状態が軽減されるまで続ける。投与量および頻度は、たとえば患者の体重および投与経路に応じて変わるであろう。個々の投与量は、通常、約０.００１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であるが、それより高くても低くてもよい。当業者であれば最適の投与量、投与法および反復度（repetition rat e）を容易に決定することができる。本発明では、ＨＣＶのアンチセンス阻害のためにＨＣＶＲＮＡの特定の領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いる。この発明に関しては、「オリゴヌクレオチド」なる術語は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーをいう。この術語には、天然に存在する塩基、糖および糖間（バックボーン）結合からなるオリゴマー並びに同様に機能する天然に存在しない部分を含むオリゴマーを包含する。そのような修飾したまたは置換したオリゴヌクレオチドは、たとえば細胞取り込みの促進やヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの特性のため、天然形態のものよりもしばしば好ましい。この発明で考えられる幾つかの好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例としては、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、直鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環状糖間結合が挙げられる。最も好ましいのは、ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）− Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂およびＯ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂バックボーン（ホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂である）を有するものである。モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。サマートン（Summ erton，J．E．）およびウエラー（We11er，D．D．）、ＵＳ５,０３４,５０６号。タンパク質−核酸（ＰＮＡ）バックボーンなどの他の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンをポリアミドバックボーンで置換してよく、塩基は該ポリアミドバックボーンのアザ窒素原子に直接または間接に結合していてよい。ニールセン（P．E．Nielsen）、エグホルム（M．Egho lm）、ベルグ（R．H．Berg）、ブヒャルト（O．Buchardt）、Science １９９１、２５４、１４９７。他の好ましいオリゴヌクレオチドには、２'位に以下の一つを有するアルキル、ハロゲンまたはその他で置換された糖残基を含有していてよい：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂またはＯ（ＣＨ₂ ）_nＣＨ₃（式中、ｎは１〜約１０）；Ｃ₁〜Ｃ₁₀低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール（alkaryl）またはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ₃；ＯＣＦ₃；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ₃；ＳＯ₂ＣＨ₃；ＯＮＯ₂；ＮＯ₂；Ｎ₃；ＮＨ₂；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ開裂基；結合体（conjugate）；レポーター基；挿入剤（intercalator）；オリゴヌクレオチドの薬物動力学的特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基および同様の特性を有する他の置換基。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖疑似物（mimetics）を所有していてもよい。修飾したまたは異常な塩基を用いることもできる；これらのうち最も好ましいのはイノシンであり、これはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれともワトソン−クリック対を形成できる「普遍塩基（universal base）」である。他の普遍塩基も好ましい。それゆえ、この発明のオリゴヌクレオチドは、一つの態様において、ＨＣＶＲＮＡ中のＨＣＶ株間で変化するヌクレオチドに相補的な位置に普遍塩基を有する。ＨＣＶＲＮＡと有効にハイブリダイズするように機能する限り、そのようなオリゴヌクレオチドはすべてこの発明に包含される。この発明によるオリゴヌクレオチドは、約５〜約５０核酸塩基ユニットを含むのが好ましい。そのようなオリゴヌクレオチドは、約８〜３０核酸塩基ユニットを含むのが一層好ましく、約１４〜２６核酸塩基ユニットを含むのがさらに一層好ましい。理解されるであろうように、核酸塩基ユニットは、ホスホジエステル結合または他の結合によって隣接する核酸塩基ユニットに適切に結合した塩基−糖の組み合わせである。好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶＲＮＡの５'非翻訳領域のループＢ領域またはループＣ領域の少なくとも一部に相補的でありハイブリダイズすることができる。特に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、およびＳＥＱＩＤＮＯ：４５を包含する。好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のループＦ領域の少なくとも一部に相補的でありハイブリダイズすることができる。特に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２を包含する。好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶゲノムの５'非翻訳領域に存在する下記ヌクレオチド配列（Ａ）、または該ヌクレオチド配列（Ａ）と１または２の塩基ユニットのみが異なる該ヌクレオチド配列に非常に相同なヌクレオチド配列とハイブリダイズしうる：（Ａ）GCCUCCAGGACCCC. そのようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも１４ヌクレオチドの長さであり、好ましくは１４〜２６ヌクレオチドの長さである。それゆえ、これらオリゴヌクレオチドは、該ヌクレオチド配列（Ａ）に対するアンチセンスヌクレオチド配列を少なくとも含有している。さらに好ましいオリゴヌクレオチドは、該ヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を有し、さらに、ＨＣＶゲノムに由来するＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のヌクレオチド１０４〜１２９を包含する下記ヌクレオチド配列（Ｂ）に相補的な、または該ヌクレオチド配列（Ｂ）内の約２０ｍｅｒの連続したヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含有する：（Ｂ）CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC （太字で示した領域は上記配列（Ａ）に等しい）。他の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、ポリタンパク質翻訳開始コドンの少なくとも一部またはコアタンパク質コード領域の少なくとも一部とハイブリダイズしうる。さらに好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、ＨＣＶのゲノムのヌクレオチド配列ＡＵＣＣ（ポリタンパク質翻訳開始コドンの近傍のコアタンパク質コード領域中のヌクレオチド３５２〜３５５に存在する）またはその近傍に特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスヌクレオチド配列ＧＧＡＴを含有する。ポリタンパク質翻訳開始コドンの少なくとも一部とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドの適当な例は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：７９、およびＳＥＱＩＤＮＯ：８０であり、ＨＣＶＲＮＡのコアタンパク質コード領域の少なくとも一部とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドの適当な例は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８９、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０、およびＩＤＮＯ：９１である。加えて、ＨＣＶＤＮＡのヌクレオチドＮｏ．３５２〜３５５（ＡＵＣＣ）のヌクレオチド配列またはその近傍にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドの適当な例は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：７９、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６およびＳＥＱＩＤＮＯ：８７である。この発明に従って用いるオリゴヌクレオチドは、よく知られた固相合成法により都合よく日常的に調製することができる。そのような合成のための装置は、アプライド・バイオシステムズ（App1ied Biosystems）を含む幾つかの販売者によって売られている。そのような合成のための他のいかなる手段も用いることができるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は充分に型どおりの仕事をする人の能力の範囲である。ホスホロチオエートやアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することもよく知られている。この発明によれば、当業者は、メッセンジャーＲＮＡが３文字遺伝コードを用いてタンパク質をコードするための配列情報のみならず、５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、および５'キャップ領域として当業者に知られる領域を形成する関連リボヌクレオチド、並びに種々の二次構造を形成するリボヌクレオチドをも包含することを理解するであろう。それゆえ、コードリボヌクレオチドと同様にこれら関連リボヌクレオチドの全体または一部を標的とするオリゴヌクレオチドをこの発明に従って処方することができる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、ＨＣＶの５'末端ヘアピンループ、５'末端６塩基対繰り返し、ＯＲＦ３翻訳開始コドン（すべて５'非翻訳領域中に含まれる）、ポリタンパク質翻訳開始コドン、コアタンパク質コード領域、３'非翻訳領域、Ｒ２領域、３'ヘアピンループまたは３'末端パリンドローム領域に特異的にハイブリダイズしうる。ＨＣＶゲノムのサイズは約９４００ヌクレオチドであり、その後プロセシングを受けて幾つかの構造または非構造タンパク質となるポリタンパク質をコードする単一の翻訳読み取り枠を有する。ＨＣＶゲノムの幾つかの領域が、本発明においてアンチセンス標的として同定されている。配列の利用性およびヌクレオチドの番号付け方式は株毎に異なることに注意すべきである。ＨＣＶの５'非翻訳領域は、ポリタンパク質翻訳開始コドンの上流の約３５０ヌクレオチドからなる。ゲノム（ＨＣＶ−１）の５'末端のヌクレオチド１〜２２に存在するヘアピンループ（本明細書において「５'末端ヘアピンループ」として同定される）は、ウイルスレプリカーゼまたはヌクレオキャプシドタンパク質の認識シグナルとして機能していると思われる。ハン（ Han）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．１９９１、８８、１７１１〜１７１５。５' 非翻訳領域は、ループＡ〜Ｆとして示される６つのステムーループ構造を含む二次構造を有すると思われる。ループＡはおよそヌクレオチド１３〜５０に存在し、ループＢはおよそヌクレオチド５１〜８８に存在し、ループＣはおよそヌクレオチド１００〜１２０に存在し、ループＤはおよそヌクレオチド１４７〜１６２に存在し、ループＥはおよそヌクレオチド１６３〜２１７に存在し、ループＦはおよそヌクレオチド２１８〜３０７に存在する。ツキヤマ−コハラ（Tsukiyama −ｋohara）ら、J．Virol．１９９２、６６、１４７６〜１４８３。これら構造は、２つの主要なＨＣＶグループ間でよく保存されている。３つの小さな（各１２〜１６アミノ酸）読み取り枠（ＯＲＦ）が、ＨＣＶＲＮＡの５'非翻訳領域中に位置している。これらＯＲＦは翻訳の制御に関与しているかもしれない。本明細書において示すＯＲＦ３翻訳開始コドンは、ハンら（ Proc．Natl．Acad．Scｉ．１９９１、８８、１７１１〜１７１５）の方式によればヌクレオチド２１５〜２１７において認められ；チューら（Proc．Natl．Acad ．Sci．１９９１、８８、２４５１〜２４５５）の方式によればヌクレオチド− １２７〜−１２５において認められる。本明細書において示すポリタンパク質翻訳開始コドンは、ハンら（Proc．Natl ．Acad．Sci．１９９１、８８、１７１１〜１７１５）によればＨＣＶ−１のヌクレオチド３４２〜３４４に位置し、チューら（Proc．Natl．Acad．Sci．１９９１、８８、２４５１〜２４５５）のＨＣＶ−１番号付け方式に従えばヌクレオチド１〜３に位置するＡＵＧ配列である。ポリタンパク質ＡＵＧから下流方向（３'末端の方へ）に広がるのは、コアタンパク質コード領域である。本明細書において示す３'非翻訳領域は、ポリタンパク質翻訳終止部位（チューらによればヌクレオチド９０３７で終止し；ハンおよびインチャウスプ（Inch auspe）の方式によればヌクレオチド９３７７で終止する）の下流にあるヌクレオチドからなる。３'非翻訳領域内のゲノムの３'末端におけるヌクレオチド９６９７〜９７１６（ＨＣＶ−Ｈに対するインチャウスプの番号付け方式）は、本明細書において３'ヘアピンループとして同定される安定なヘアピンループ構造に構成され得る。該３'ヘアピンのすぐ上流にあり（ＨＣＶ−Ｈのヌクレオチド９６９１〜９６９６）本明細書において「Ｒ２配列」として示される短いヌクレオチドの広がり（Ｒ２）は、おそらくヌクレオチド２３〜２８および３８〜４３にある同じ配列の５'末端６塩基対繰り返しと共同してウイルスＲＮＡの環形成において役割を有すると思われる（インチャウスプら、Proc．Natl．Acad．Sci．１９９１、８８、１０２９２〜１０２９６；本明細書で「５'末端６塩基対繰り返し」として同定される）。ゲノムの３'末端近くに存在するパリンドローム配列（タカミザワ（Takamizawa）ら（J．Virol．１９９１、６５、１１０５〜１１１３）によればヌクレオチド９３１２〜９３４２）は、安定な二次構造を形成することができる。これは、本明細書では３'末端パリンドローム領域と称する。本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶＲＮＡに相補的である。それゆえ、表１に配列を示したオリゴヌクレオチドがＨＣＶに対して有用であると思われる。これらオリゴヌクレオチド、または上記のようにその有効な部分、またはＨＣＶ感染の調節のための好ましいアンチセンス標的に関する知見から当業者が調製することのできる同様なオリゴヌクレオチドのいずれを用いることも好ましい。この発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療において、および研究試薬およびキットとして用いることができる。この発明のオリゴヌクレオチドはＨＣＶからのＲＮＡにハイブリダイズするので、この事実を探求するためにサンドイッチアッセイや他のアッセイを容易に構築することができる。ＨＣＶまたはＨＣＶＲＮＡを含有すると思われる試料中に存在するＨＣＶまたはＨＣＶＲＮＡとのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するための手段の提供も日常的に達成できる。そのような提供には、酵素の結合、放射性標識または他のあらゆる適当な検出系が含まれていてよい。ＨＣＶの存在または不在を検出するためのキットも調製することができる。以下の特定の実施例は、例示の目的のためにのみ与えられるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。実施例実施例１オリゴヌクレオチドの合成：ヨウ素によって酸化する標準ホスホロアミダイト化学を用い、非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズモデル３８０Ｂ）で合成した。β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトをアプライド・バイオシステムズ（フォスターシティー、カリフォルニア州）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、亜リン酸エステル結合の段階的硫黄化（thiation）のために標準酸化ボトルをアセトニトリル中の３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン１,１−ジオキシドの０.２Ｍ溶液で置換した。硫黄化サイクル待機（wait）工程を６８秒まで延ばし、ついでキャッピング（capping）工程を行った。２'−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの合成は、テトラゾールおよび塩基のパルスデリバリー（pulse delivery）の後の待機工程を３６０秒に延ばした他は、２'−Ｏ−メチルβ−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロアミダイト（ケムジェンズ（Chemgenes）、ニーダム、マサチューセッツ州）および非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを用いて行った。合成の開始に使用した３'−塩基は２'−デオキシリボヌクレオチドであった。２'−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドは、スプロート（B．S．Sproat）ら（N ucleic Acids Research１８：４１〜４９（１９９０））およびイノウエ（H．In oue）ら（Nucleic Acids Research １５：６１３１〜６１４８（１９８７））によって記載された文献記載の方法の変法により調製した核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）、およびＣの２'−デオキシ−２'−Ｏ−プロピルリボシドから調製した。ＣＰＧ（controlled pore glass）カラム（アプライド・バイオシステムズ）から開裂し、濃水酸化アンモニウム中、５５℃で１８時間脱ブロッキングした後、２.５容量のエタノールを用いた０.５ＭＮａＣｌから２回沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを精製した。分析的ゲル電気泳動を、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７.０）中で行った。実施例２遺伝子操作した細胞中でのＨＣＶＲＮＡの転写および翻訳：哺乳動物細胞中でＨＣＶ遺伝子を発現しうる組換えＤＮＡベクターを標準遺伝子工学法を用いて構築する。ＨＣＶｍＲＮＡまたはゲノム転写産物を示すｃＤＮＡ断片を、ＨＣＶｃＤＮＡの転写が適当なヌクレオチド位置で始まるような仕方でマウス哺乳動物腫瘍ウイルスからのＬＴＲなどの誘導性真核プロモーターの後ろに置く。該遺伝子の３'末端には適当なヌクレオチド位置で終止することを確実にするためにポリ（Ａ）シグナルが導入されている。インフレームのレポータードメイン（たとえば、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子の酵素的に活性なドメイン）の挿入によりコード配列を修飾するのが有利であるかもしれず、かかるレポータードメインは、融合タンパク質の発現の検出手順を簡単にすることができる。ベクターにはまた、ネオマイシン耐性などの１または２以上の選択遺伝子マーカーが含まれていてよい。上記ベクターを標準塩化カルシウムトランスフェクション法を用いて哺乳動物細胞中に導入する。トランスフェクションしたＤＮＡを含有する細胞は、ネオマイシンなどの選択剤の存在下で増殖させることによって同定され、限界希釈法によりクローニングする。クローニングしたトランスフェクション体中でのＨＣＶＲＮＡの発現は、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ複製連鎖反応またはヌクレアーゼ保護などの多くのアッセイの一つを用いて確かめることができる。タンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングまたは特異的なＨＣＶ抗体を用いた免疫沈降を用い、またはアッセイしうるレポータードメインの導入の結果得られる検出可能な酵素活性の存在についてモニターすることにより確かめることができる。ＭＭＴＶＬＴＲなどの誘導性プロモーターを用いてベクターを構築した場合には、遺伝子発現を誘導するためにアッセイ前にトランスフェクションした細胞にデキサメタゾンなどのグルココルチコイドインデューサーを添加すべきである。実施例３遺伝子操作した細胞からのＨＣＶ遺伝子発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の評価：実施例２に記載したものなどの発現ベクターでトランスフェクションした哺乳動物細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する培地中で一夜インキュベートする。オリゴヌクレオチド処理の後、ＨＣＶ遺伝子産物の発現を誘導するために細胞をデキサメタゾンで処理する。適当なインキュベーション期間（４〜２４時間）の後、細胞を回収し、特定のＨＣＶポリペプチドの発現を、ウエスタンブロッティングにおいて特異的な抗血清を用いて免疫学的にまたは免疫沈降アッセイにより検出することができる。ＨＣＶポリタンパク質にインフレームで融合したホタルのルシフェラーゼなどのようなレポータードメインを含むベクターを細胞が含有している場合には、細胞抽出物を回収し、該レポータードメインの酵素活性について評価することができる。実施例４細胞質ウイルスベクターからのＨＣＶＲＮＡの転写および翻訳：ＨＣＶｍＲＮＡまたはゲノム転写産物を表示するｃＤＮＡ断片を、該ＨＣＶｃＤＮＡの転写が適当なヌクレオチド位置で開始されるような仕方でワクシニアウイルスプロモーターの後ろに置く。該遺伝子の３'末端には、適当なヌクレオチド位置での終止が確実となるように、ポリ（Ａ）シグナルを導入する。幾つかの場合にはインフレームのレポータードメイン（たとえば、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子の酵素的に活性なドメイン）の挿入によりコード配列を修飾するのが有利であり、該レポータードメインは、融合タンパク質の発現のための検出手順を簡単にすることができる。ワクシニアなどの細胞質複製性ＤＮＡウイルスのゲノム中への発現ユニットの導入は、該発現ユニットの上流および下流に該ワクシニアウイルスゲノムに相同な配列を含めることによって容易になる。ワクシニアウイルス感染した哺乳動物細胞中へのコトランスフェクションの結果、ワクシニアとのベクターの相同組換えが起こり得る。該ウイルス中の適当な組換え部位にβ−ガラクトシダーゼなどの適当な酵素マーカーが存在しておれば、適当な基質条件下での発色の欠如により組換えプラークを同定することができる。クローニングしたウイルスは適当な宿主哺乳動物細胞株中で増殖し、ＨＣＶ遺伝子産物の発現は実施例２と同様にして確かめることができる。実施例５哺乳動物細胞中での細胞質ウイルスベクターからのＨＣＶ遺伝子の発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の評価：哺乳動物細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する培地中で一夜インキュベートする。オリゴヌクレオチド処理の後、ＨＣＶ遺伝子産物を発現する組換えワクシニアウイルスで細胞を感染させる。適当なインキュベーション期間（４〜２４時間）の後、細胞を回収し、特定のＨＣＶポリペプチドの発現をウエスタンブロッティングにおいて特異的な抗血清を用いてまたは免疫沈降アッセイにより免疫学的に検出することができる。ＨＣＶポリタンパク質にインフレームで融合したホタルのルシフェラーゼなどのようなレポータードメインを含むベクターを細胞が含有している場合には、細胞抽出物を回収し、該レポータードメインの酵素活性について評価することができる。実施例６ＨＣＶ遺伝子でトランスフェクションしたまたはＨＣＶ遺伝子を発現する細胞質ウイルスベクターを感染させた細胞におけるＨＣＶ粒子集合に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の評価：ＨＣＶゲノムＲＮＡおよびタンパク質は、ＨＣＶｃＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクションした細胞中、またはＨＣＶｃＤＮＡを発現するワクシニアウイルスベクターを感染させた細胞中で発現される。ＲＮＡゲノムおよびタンパク質は会合してＨＣＶ様粒子を形成するであろうと思われる。これら粒子の存在は、電子顕微鏡を用いて確かめることができる。粒子集合に対する該ウイルスＲＮＡの推定パッケージングシグナルに相補的なオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、ＨＣＶ核酸とタンパク質との両方を含有する細胞外粒子の出現を測定するための特定の生化学的アッセイを開発することができる。実施例２に記載したような発現ベクターでトランスフェクションした哺乳動物細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する培地中で一夜インキュベートする。オリゴヌクレオチド処理の後、ＨＣＶ遺伝子産物の発現を誘導するために細胞をデキサメタゾンで処理する。適当なインキュベーション期間（４〜２４時間）の後、処理細胞からの細胞外流体を回収し、超遠心分離でペレット化することにより粒子を濃縮する。タンパク質および核酸をペレットから抽出し、実施例４および５に記載するように、それぞれノーザンブロッティング分析およびウエスタンブロッティング分析により定量する。ＨＣＶポリタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスによる細胞の感染の結果としてのウイルス粒子の集合に対するオリゴヌクレオチド処理の効果をモニターするためにも、同様の手順を用いることができた。実施例７インビトロ翻訳アッセイによるオリゴヌクレオチドのスクリーニング：１．インビトロでの翻訳に用いるためのＨＣＶＲＮＡの調製：ＨＣＶ遺伝子ヌクレオチド配列の塩基番号１〜６８６に相同な配列を有するＲＮＡを以下の仕方で調製した。その際、終止コドン（ＴＧＡ）を３'末端に付加した。（１）複製連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型ＨＣＶ−ｃＤＮＡの調製：Ｃ型肝炎の日本人患者の血清からクローニングすることにより本発明者らが調製したｃＤＮＡヌクレオチド配列（該ｃＤＮＡは、おそらく完全長のＨＣＶアミノ酸配列をコードすると思われる）に基づき、ＨＣＶ遺伝子の完全長の５'非翻訳領域（３４１ヌクレオチド配列）とそれに続くコア領域（３４５ヌクレオチド配列）を含む６８６ヌクレオチド配列を含有するｃＤＮＡを公知方法によりクローニングし、該クローンを下記（３）のＰＣＲ手順の鋳型として用いた。このｃＤＮＡ配列のヌクレオチド番号は、ハンらのヌクレオチド番号（Proc．Natl．Ac ad．Sci．１９９１、８８、１７１１〜１７１５）とよく対応することがわかった。（２）ＰＣＲのためのプライマーの調製：ＥｃｏＲＩ開裂部位を含む７塩基、Ｔ７プロモーターとしての機能を有する２０塩基およびＨＣＶヌクレオチド配列の１４塩基（ヌクレオチド番号１〜１４）を５'末端からこの順序で含有する４１ヌクレオチド配列を含むセンスプライマー、およびＥｃｏＲＩ開裂部位を含む９塩基、終止コドン（ＴＧＡ）に相補的な３塩基およびＨＣＶヌクレオチド配列の塩基番号６７２〜６８６の領域に相補的な１５塩基を５'末端からこの順序で含有する２７ヌクレオチド配列を含むアンチセンスプライマーを、サイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン／バイオサーチ（MilliGen／Biosearch）製）を用いて固相ホスホアミダイト法により調製した。（３）ＰＣＲによるＲＮＡの合成のための鋳型ＤＮＡの調製：上記（１）で得たｃＤＮＡを鋳型として用い、上記（２）のプライマーを用いてＰＣＲ（２０サイクル）を行った。ＰＣＲは、変性：９４℃で１分間、アニーリング：５５℃で２分間、ポリメラーゼ反応：７２℃で２分間の条件で行った。かくして得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで処理し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、得られた組換えプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を常法により形質転換した。かくして得られたコロニー中の複数のクローンに関して組換えプラスミドが挿入された部分をジデオキシ法によりシークエンシングすることにより、すべてのクローンからのプラスミドにより挿入されたＨＣＶ由来の６８６ヌクレオチド配列が鋳型ｃＤＮＡの対応領域とよく適合することが確認された。これらクローンの一つから得られたプラスミドを「ｐＵＩＡ１」と称した。（４）ＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列の一部を有するＲＮＡの調製：ｐＵＩＡ１をＥｃｏＲＩで処理することにより上記ヌクレオチド配列が挿入された断片をｐＵＩＡ１から取り出し、該断片を鋳型として用いることにより、ME GAscriptインビトロ転写キット（アンビオン（Ambion）製）でＲＮＡを合成し、それにより、ＨＣＶヌクレオチド配列の１〜６８６ヌクレオチド配列部分、終止コドン（ＵＧＡ）およびＥｃｏＲＩ開裂部位を含む９塩基を５'末端からこの順序で含有する６９８ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ断片を得た。この断片を「Ｒ−ＩＡ−１」と称した。該Ｒ−ＩＡ−１中のＨＣＶ由来の６８６塩基のヌクレオチド配列を添付の図１に示す。２．無細胞翻訳系におけるＨＣＶコアタンパク質の合成：ウサギ網状赤血球溶解液を用いることにより、ＨＣＶコアタンパク質をＲ−ＩＡ−１から無細胞系において翻訳し、発現をＥＬＩＳＡにより以下のようにして確認した。（１）ＨＣＶコアタンパク質の定量的決定のためのＥＬＩＳＡ系の構築：ＨＣＶのコア領域を常法により大腸菌中で直接発現させた。かくして得られた発現タンパク質でマウスを免疫し、常法で処理することにより２種のモノクローナル抗体（ＲＪＣ４−１（ＩｇＭタイプ）およびＲＪＣ４−２（ＩｇＧタイプ））を得た。該モノクローナル抗体ＲＪＣ４−１を１０ｍＭＰＢＳで希釈し、希釈したＲＪＣ４−１（濃度５０μｇ／ｍｌ、５０μl）をマクシソープ（MaxiSorp ）Ｆ８プレート（ヌンク）の各ウエルに加え、４℃で一夜放置することにより固定し、その後、ウエルから吸入することにより残留する抗体溶液を除去した。１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（１５０μｌ）を各ウエルに加え、４℃ で一夜放置して抗体のブロッキングを行い、ついで洗浄に供した。ウサギ網状赤血球抽出物を用いて上記で調製した試験すべきコアタンパク質を、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで適当な濃度に希釈し、希釈したコアタンパク質（５０μｌ）を各ウエルに加え、混合物を室温にて２時間反応させ、ついで洗浄に供した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗体ＲＪＣ４−２（５０μｌ）を各ウエルに加え、混合物を３７℃で１時間反応させ、ついで洗浄に供した。最後に３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンの水溶液（５０μｌ）を各ウエルに加え、混合物を室温で１５分間反応させ、ついで反応液を１Ｎ硫酸で冷却した。直ちに反応混合物の吸光度を４５０ｎｍで測定した。その結果、ＨＣＶコアタンパク質はＥＬＩＳＡにより定量的に測定できることがわかった。（２）ウサギ網状赤血球溶解液を用いたＨＣＶコアタンパク質の発現：ＴＥ（１０μｌ）中のＲ−ＩＡ−１（２０ピコモル）の溶液およびＲＮＡを含有しないＴＥ（１０μｌ）をそれぞれメチオニンの水溶液（２μｌ）（メチオニンの最終濃度、１０μＭ）と混合した。各混合物（１２μｌ）にウサギ網状赤血球溶解液（インビトロトランスレーションキット、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）製、２０μｌ）を加え、混合物を３０℃で２時間インキュベートした。反応混合物を倍希釈し、ついでコアタンパク質をＥＬＩＳＡにより定量的に測定した。その結果、ＨＣＶコアタンパク質は陽性コントロールでは合成されるが陰性コントロールではＨＣＶコアタンパク質が認められないことが確認された。３．アンチセンス化合物の標的領域の探索：ＨＣＶコアタンパク質のインビトロでの翻訳を阻害する能力について、５'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドを以下のようにしてスクリーニングした。（１）合成アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成：実施例１と同様の固相ホスホアミダイト法により（「ＩＡ−」と表示するオリゴヌクレオチド）またはサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン／バイオサーチ製）（「ＣＡＳ−」と表示するオリゴヌクレオチド）を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製した。かくして得られた生成物をフェノール処理し、エタノール沈殿に供した。この沈殿を以下の手順に用いるために１０ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ８.０）−１ｍＭＥＤＴＡ溶液に溶解した。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さがそれぞれ２０ヌクレオチドであった。各配列を称するのに用いる「ＣＡＳ−」または「ＩＡ−」番号は、添付の図１に示す対応ＨＣＶＲＮＡ標的配列の最も５'側のヌクレオチドの番号を示す。（２）アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性の評価：Ｒ−ＩＡ−１（２０ピコモル）および試験しようとするアンチセンスＤＮＡ（１００ピコモル）をＴＥ（最終容量、１０μｌ）中で混合し、混合物を室温で１０分間放置した。この溶液に１０ｍＭメチオニン水溶液（２μｌ）を加え、この混合物（１２μｌ）にさらにウサギ網状赤血球溶解液（インビトロトランスレーションキット、ストラタジーン製、２０μｌ）を加え、混合物を３０℃で２時間インキュベートした。反応完了後、反応混合物で製造されたコアタンパク質をＥＬＩＳＡにより定量的に測定し、アンチセンスＤＮＡを含有しないＴＥで製造されたコアタンパク質の量に対する該反応混合物中のコアタンパク質の量の比を計算した。阻害活性（％）は、上記で得た比を１から差し引き、得られた結果をパーセントで表示することにより計算した。（３）ＨＣＶの増殖の阻害に有効な標的領域のスクリーニング：ＨＣＶＲＮＡの５'非翻訳領域中のヌクレオチド１〜３３９から１０ヌクレオチド間隔で位置する標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。ＣＡＳ−１からＣＡＳ−３２０までのこれらオリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。ＨＣＶインビトロコアタンパク質翻訳アッセイを用い、これらアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性を試験した。ループＣの部分に相補的なオリゴヌクレオチドＣＡＳ−１１０は８０％以上の阻害を起こし、最も好ましい。これらの結果を図２に示す。（４）塩基番号１００〜１３０付近での一層詳細な分析：ＨＣＶＲＮＡのヌクレオチド１００〜１４０（ループＣ領域を含む）からの領域に相補的なオリゴヌクレオチドをさらに合成し、上記と同様に試験した。これらオリゴヌクレオチドを表２に示す。図２に示すように、オリゴヌクレオチドＣＡＳ−１０４、ＣＡＳ−１０６、およびＣＡＳ−１０８はＨＣＶコアタンパク質翻訳をインビトロで７０％またはそれ以上阻害し、好ましい。ヌクレオチド１０４〜１２９からのＨＣＶＲＮＡの２６塩基領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５'非翻訳領域の他の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べてＨＣＶ−ＲＮＡの翻訳に対して強い阻害活性を示した。それゆえ、この領域とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが好ましい。（５）塩基番号１１９がイノシンで置換されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの評価：ループＣ領域中の位置１１９にあるヌクレオチドはＨＣＶ株間で高い変異率を示すので、この位置のアデノシンを「普遍塩基」イノシンで置換した種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製し、これら置換オリゴヌクレオチドが種々のウイルス株の阻害に有効かどうかを以下のようにして評価した。ＣＡＳ−１１０のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド番号１１９のアデノシンに対応するチミジンをイノシンで置換してＣＡＳ−１１０−Ｉ−１１９を得た。参照のため、該チミジンをグアノシンで置換して人工的なミスマッチを作製したＣＡＳ−１１０−Ｇ−１１９も調製した。これらの配列を表２に示す。これらオリゴヌクレオチドの阻害活性を上記のようにして評価した。その結果、ＣＡＳ−１１０−Ｉ−１１９はＣＡＳ−１１０と同様に７０％以上の阻害活性を示したが、ＣＡＳ−１１０−Ｇ−１１９は遥かに低い活性を示した。それゆえ、ＣＡＳ−１１０−Ｉ−１１９が好ましい。この結果から、チミジンをイノシンで置換することにより得られる化合物は、位置１１９のアデノシンが他のヌクレオチドで置換された他のウイルス株に対しても有効であると思われる。（６）２'−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドの評価：アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列に対する結合アフィニティーは、該アンチセンスオリゴヌクレオチド中の糖残基の２'−位のメトキシ化により高められる。表２に示す配列を有する２'−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド（イノシンで置換された２つのもの以外に）を調製し、その阻害活性を評価した。たいていの場合、２'−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドは非修飾の対応物と阻害活性が同様であった。幾つかのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳ−８０）ＣＡＳ−３６０）では２'−Ｏ−メチル化したときに活性が落ちるように思われるが、ループＦにハイブリダイズするＣＡＳ−２６０は２'−Ｏ−メチル化したときに有意に活性が上昇したと思われ、７５％以上の阻害を示した。それゆえ、この配列が好ましい。幾つかの試験したオリゴヌクレオチドの活性を図３に示す。実施例８ポリタンパク質翻訳開始コドンの周辺にありコアタンパク質コード領域に隣接するヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性の評価：（１）ＨＣＶ−ＲＮＡの翻訳開始コドン（ヌクレオチド番号３４２〜３４４）の周辺にありコアタンパク質コード領域に隣接するヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性を評価するため、ヌクレオチド３２０からヌクレオチド３７９の領域に相補的な一連の２０ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製した。これらのうち、ＣＡＳ−３２４〜ＣＡＳ−３４４は、ＡＵＧ終止コドン自体に相補的な配列ＣＡＴのすべてまたは一部を含有している。これらアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を下記表３に示す。これら２１のアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性を、４０ピコモルのアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度にて上記と同様の仕方で評価した。表３に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドＣＡＳ−３２８、ＣＡＳ−３３６、ＣＡＳ−３３８、ＣＡＳ−３４０、ＣＡＳ−３４２、ＣＡＳ−３４４、ＣＡＳ −３４６、ＣＡＳ−３４８、ＣＡＳ−３５０、ＣＡＳ−３５２、ＣＡＳ−３５４、ＣＡＳ−３５６、ＣＡＳ−３５８およびＣＡＳ−３６０は７０％以上の阻害活性を示し、好ましい。これらのうち、ＣＡＳ−３３６、ＣＡＳ−３３８、ＣＡＳ −３４０、ＣＡＳ−３４２、ＣＡＳ−３４４、ＣＡＳ−３４６、ＣＡＳ−３４８、ＣＡＳ−３５０およびＣＡＳ−３５２は９５％以上の極めて高い阻害活性を示し、最も好ましい。これらのうち、ＣＡＳ−３４６〜ＣＡＳ−３６０は、翻訳開始コドンのすぐ隣のコアタンパク質コード領域にハイブリダイズするがＡＵＧ自体には相補的ではなく、それでも極めて高い阻害活性を示した。一方、６つのアンチセンスオリゴヌクレオチドＣＡＳ−３２４、ＣＡＳ−３２６、ＣＡＳ−３２８、ＣＡＳ−３３０、ＣＡＳ−３３２、およびＣＡＳ−３３４は翻訳開始コドンに相補的であるが、上記９つの最も活性なアンチセンス配列よりも低い阻害活性を示した。上記９つの最も活性なアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的なＨＣＶ標的配列領域は、ポリタンパク質翻訳開始コドンの近くのコアタンパク質コード領域中に番号３５２〜３５５の４つのヌクレオチドを共通に有する。それゆえ、翻訳を阻害するにはこれら４つの塩基ユニットを含ませることが有用であると示唆される。従って、配列ＧＧＡＴを含むオリゴヌクレオチドは本発明の好ましい態様である。（２）株間で変異することが知られているヌクレオチドをイノシンで置換したアンチセンスオリゴヌクレオチドの評価：翻訳開始コドンの近くのコアタンパク質コード領域中のヌクレオチド配列で、株間の変異がヌクレオチド３５０、３５１、３５２、３５６および３６２でしばしば起こることが知られている。この知見に基づき、これら塩基を「普遍塩基」イノシンで置換することが種々のウイルスの阻害に有効であるかどうかを研究した。ＣＡＳ−３４４中の塩基番号３５０の塩基をイノシンで置換することによりアンチセンスＤＮＡを調製し、これをＣＡＳ−３４４−ｉ１と称した。同様に、塩基番号３５０、３５６および３６２の３つの塩基をイノシンで置換することによりアンチセンスＤＮＡを調製し、ＣＡＳ−３４４−ｉ３と称し、塩基番号３５０、３５１、３５２、３５６、および３６２の５つの塩基をイノシンで置換することによりアンチセンスＤＮＡを調製し、ＣＡＳ−３４４−ｉ５と称した。これらオリゴヌクレオチドの阻害活性を上記（１）と同様にして評価した。その結果、ＣＡＳ−３４４−ｉ１およびＣＡＳ−３４４−ｉ３は高い阻害活性を示し、配列ＣＡＳ−３４４のおよそ３つまでのイノシン置換を有するオリゴヌクレオチドは高い阻害活性を示すことが示唆された。これらのオリゴヌクレオチドは好ましい。これらの阻害活性は表３に示してある。実施例９ＨＣＶコアタンパク質発現細胞中でのアンチセンスＤＮＡの評価：（１）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの調製：配列ＣＡＳ−１１０、ＣＡＳ−２６０、およびＣＡＳ−３４４がホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）としてインビトロ翻訳試験において高い阻害活性を示したので、対応するホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）オリゴヌクレオチドを調製した。これらオリゴヌクレオチドは、「ＣＡＳ−１１０Ｓ」、「ＣＡＳ−２６０Ｓ」などのように、各親オリゴヌクレオチドの名前の後に「Ｓ」を付加することにより称した。陰性コントロールとして、ランダム配列を有するオリゴヌクレオチドを調製した。（２）肝細胞形質転換体の調製：発現プラスミドの調製は、ＨＣＶ遺伝子の５'ＮＣＲ−コア−ｅｎｖ領域をコードする遺伝子（１.３ｋｂｐ）を挿入することにより常法により行った。かくして調製した発現プラスミドを、リポフェクチン法によりヒト肝細胞株（Ｈ８Ａｄ１７）中にトランスフェクションした。該発現プラスミド中に挿入した化学耐性マーカー遺伝子（Ｇ４１８）に基づいて化学耐性株を選択し、それにより、ＨＣＶコアタンパク質を発現する所望の肝細胞形質転換体が得られた。（３）肝細胞形質転換体によって発現されたコアタンパク質の検出系：抗ＨＣＶコア−マウスモノクローナル抗体を固相抗体として；抗ＨＣＶヒトポリクローナル抗体を一次抗体として；およびＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体を二次抗体として用い、肝細胞形質転換体によって発現されたコアタンパク質をＥＬＩＳＡ法により検出した。この検出系を用いることにより、肝細胞形質転換体によって発現されたコアタンパク質を測定した。（４）アンチセンスオリゴヌクレオチドの評価：肝細胞形質転換体（２.５×１０⁵細胞）を６−ウエルプレート上に接種し、細胞を固定した。各プレートに上記で得た５つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（各濃度は５μＭ）を加えた。２日後、細胞を回収し、カウントした。細胞を１回洗浄し、細胞溶解剤で溶解し、ついで阻害活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。阻害率０％がアンチセンス化合物を添加しなかった場合のコアタンパク質の量に対応するとして、上記５つのＰ＝Ｓアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性を計算した。その結果、ＣＡＳ−１１０Ｓ、ＣＡＳ−２６０Ｓ、ＣＡＳ−３４４ＳおよびＣＡＳ−３４５Ｓのすべてがこのインビボアッセイにおいて約３０〜４５％の阻害活性を示した。これらアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞毒性についても調べた。その結果、これらアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれにおいても細胞毒性は認められなかった。実施例１０改変インビトロコアタンパク質翻訳アッセイにおけるオリゴヌクレオチドの評価：Ｔ７−ＨＣＶ−コア−ｅｎｖ融合プラスミドを構築することにより、実施例７に記載したアッセイを改変してＰＣＲ増幅工程を省いた。ＨＣＶの５'非コード領域−コア配列を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＧＥＭ４Ｚ中に挿入してＴ７発現プラスミドを構築した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで線状にし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写した。³⁵Ｓ−標識したインビトロ翻訳産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。翻訳アッセイに用いるＴ７ＲＮＡ転写産物の最適量は、反応当たり約２.２ピコモルのＲＮＡと決定した。異なるサイズのＨＣＶＲＮＡのインビトロ翻訳によっても、期待されるサイズの生成物が得られた。実施例７に記載したようにしてすでに評価したものと等価ないくつかのホスホジエステル（非修飾）オリゴヌクレオチドを改変インビトロ翻訳アッセイで評価した。オリゴヌクレオチドを再合成し、２０：１のモル比で試験した。図４に示すように、オリゴヌクレオチドＩＡ−８０、ＩＡ−１１０、ＩＡ−１４０およびＩＡ−３６０（それそれ、すでに試験したＣＡＳ−８０、ＣＡＳ−１１０、ＣＡＳ−１４０およびＣＡＳ−３６０と同じ；「ＩＡ」または「ＣＡＳ」なる接頭辞は異なる装置で合成した異なるロットを示す）は、上記実施例に記載したものに匹敵する活性を改変アッセイにおいて示した。オリゴヌクレオチドＩＡ−１４０、ＩＡ−２６０およびＩＡ−３００（上記で試験したＣＡＳ−１４０、ＣＡＳ− ２６０およびＣＡＳ−３００配列と同じ）は、このアッセイでは良好な阻害を示さなかった。ＩＡ−１１０およびＩＡ−３６０は最良の活性を示し、ＩＡ−８０配列もこのアッセイにおいて阻害を示したが、このオリゴヌクレオチドで認められた阻害の程度はアッセイで使用したＲＮＡ鋳型の影響を受けた。２'−Ｏ−メチル修飾を有するオリゴヌクレオチド：上記で非修飾ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）化合物として試験したオリゴヌクレオチド配列を均一な２'−Ｏ−メチル／Ｐ＝Ｏとして合成し、改変インビトロ翻訳アッセイにおいて試験した。結果を図５に示す。オリゴヌクレオチドＩＡ−１１０、１１２、２６０、３２５および３４０は、Ｐ＝Ｏオリゴヌクレオチドで得られた上記結果と一致する阻害活性を示し、好ましい。もともとのアッセイ系を用いて認められたように、オリゴヌクレオチド２６０は、非修飾ホスホジエステルとしてよりも２'−Ｏ−メチル／Ｐ＝Ｏ形態において一層活性であった。ループＣ配列に相補的な均一に２'−Ｏ−メチル化したホスホジエステルオリゴヌクレオチドのパネルを修飾インビトロ翻訳アッセイを用いて評価し、最大の阻害活性を有するオリゴヌクレオチドを同定した。ポリタンパク質開始コドン領域に相補的な２'−Ｏ−メチル化ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの第二のパネルについても試験した。これらアッセイの結果を図５および６に示す。これら結果から、ループＣ（ヌクレオチド１１０の周辺）およびポリタンパク質翻訳開始コドン（ヌクレオチド３４０の周辺）に相補的でコアタンパク質コード領域に隣接するアンチセンスオリゴヌクレオチドが良好な阻害活性を示すことが確認された。そのようなオリゴヌクレオチドが好ましい。ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）オリゴヌクレオチドの評価：ともに２'−Ｏ−メチル修飾したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＡ −１１０およびＩＡ−３４０を改変インビトロ翻訳アッセイを用いて評価した。ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、２'−Ｏ−ｍｅ／Ｐ＝Ｓおよび２'−Ｏ−ｍｅ／Ｐ＝Ｏオリゴヌクレオチドの阻害活性の比較も行った。ランダム化したオリゴヌクレオチド（Ｐ＝ＳＲ）２'−Ｏ−Ｍｅ／Ｐ＝ＳＲ、２'−Ｏ−Ｍｅ／Ｐ＝ＯＲ）もアッセイに含めて特異性を調べた。すべてのＩＡ−１１０オリゴヌクレオチドが、修飾にもかかわらずＨＣＶコアタンパク質の翻訳を阻害する同様の能力を示した。ランダム化した１１０配列も匹敵しうる阻害活性を示したが、この配列中の２０ヌクレオチドのうち１３がＧであったのでランダム化は絶対的なものではなかった。ランダム化した３４０オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べてかなり低い阻害活性を示したので、オリゴヌクレオチド３４０はＨＣＶコアタンパク質の翻訳に対して配列特異的な阻害を示した。Ｐ＝Ｏ、２'−Ｏ−Ｍｅ／Ｐ＝Ｏまたは２'−ＯＭｅ／Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチド（３４０配列）は、図７に示すように、ＨＣＶコアタンパク質の翻訳に対して同様のほぼ完全な減少（濃度依存性である）を示した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは上記アッセイにおいてインビトロ翻訳のある程度非特異的な阻害を示す傾向があるので、幾つかのホスホロチオエートをアッセイにおいて再スクリーニングし、その際、インビトロ翻訳の前にＲＮアーゼＨ処理を行った。２.２ピコモルのＲＮＡ、４.４ピコモルのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび０.２３単位のＲＮアーゼＨを、ＲＮアーゼＨ緩衝液（４０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.０、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、２００ｍＭＫＣｌ、および１０％ショ糖からなる）中で全容量４μｌに混合した。３７℃で３０分間反応を行った。インビトロ翻訳およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記実施例と同様にして行った。ＲＮアーゼＨは、オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡとハイブリダイズしている場合にのみ活性化されて該標的ＲＮＡを開裂する。Ｐ＝ＯおよびＰ＝Ｓの両方のオリゴヌクレオチドがＲＮＡのＲＮアーゼＨ開裂を活性化することができるが、２'−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドは活性化することができない。開裂されたＲＮＡはタンパク質に翻訳されない。それゆえ、このアッセイにおける翻訳の阻害は、オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡに首尾よく結合したことを示していた。ランダム化したＰ＝Ｓコントロール配列はこのアッセイにおいて活性を示さず、これら配列がＲＮＡ標的に結合しないことを示していた。結果を図８に示す。実施例１１２'−Ｏ−プロピルおよび他の別のオリゴヌクレオチド：表４に示すＰ＝Ｓ、Ｐ＝Ｏおよび２'−修飾したオリゴヌクレオチドをさらに合成した。２'−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドを修飾インビトロ翻訳アッセイにおいて試験し、同じ配列を有する２'−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドと比較した。図９に示すように、殆どの場合において、２'−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル対応物とおよぼ同じ程度にＨＣＶコアタンパク質の翻訳を阻害した。最も活性な配列はＩＡ−１１０、ＩＡ−２６０およびＩＡ− ３４０であった；これらは本発明の好ましい態様である。ＩＡ−３４０の場合は、２'−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル態様よりも高い阻害活性を有していた。配列表配列番号：１配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＧＴＣＧＣＣＣＣＧＴＣ２１配列番号：２配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＧ２１配列番号：３配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧ２１配列番号：４配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡ２１配列番号：５配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＣ２１配列番号：６配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＧＧＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＣ２１配列番号：７配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣ２１配列番号：８配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＧＴＣＧＣＣＣＣ２１配列番号：９配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴＴ２１配列番号：１０配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＡＣＴＡＡＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＣＧ２１配列番号：１１配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧ２１配列番号：１２配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧ２１配列番号：１３配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣ２１配列番号：１４配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡ２１配列番号：１５配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧ２１配列番号：１６配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣ２１配列番号：１７配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ２１配列番号：１８配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡ２１配列番号：１９配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ２１配列番号：２０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＡ２０配列番号：２１配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴ２１配列番号：２２配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＡＧＴＧＧＴＴＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡ２１配列番号：２３配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＴＡＧＣ２１配列番号：２４配列の長さ：２１配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＧＧＧＡＡＴＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＧ２１配列番号：２５配列の長さ：６８６配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｎｏ配列：配列番号：２６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＣＣＣＣＧＡＡＴＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣ２０配列番号：２７配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＧＡＧＴＧＴＣＧＣＣＣＣＣＡＡＴＣＧ２０配列番号：２８配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＧＴＣＧ２０配列番号：２９配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧ２０配列番号：３０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧ２０配列番号：３１配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列；ＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴ２０配列番号：３２配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＡＣＧＣＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣ２０配列番号：３３配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状ァンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＣＧＣＴＴＴＣＴ２０配列番号：３４配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＣＡＴＡＣＴＡＡＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡ２０配列番号：３５配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＣＡＣＧＡＣＡＣＴＣＡＴＡＣＴＡＡＣ２０配列番号：３６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状ァンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＡＣ２０配列番号：３７配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣ２０配列番号：３８配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧ２０配列番号：３９配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡ２０配列番号：４０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧ２０配列番号：４１配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣ２０配列番号：４２配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧｉＣＣＴＧＧＡＧＧＣ２０配列番号：４３配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣ２０配列番号：４４配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧ２０配列番号：４５配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧ２０配列番号：４６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴ２０配列番号：４７配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＴＣ２０配列番号：４８配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧ２０配列番号：４９配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧ２０配列番号：５０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴ２０配列番号：５１配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣ２０配列番号：５２配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡ２０配列番号：５３配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣ２０配列番号：５４配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列ＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣ２０配列番号：５５配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣ２０配列番号：５６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣ２０配列番号：５７配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣ２０配列番号：５８配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡ２０配列番号：５９配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＡＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＣＣ２０配列番号：６０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴＣＴＣＧＣＧ２０配列番号：６１配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧ２０配列番号：６２配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴ２０配列番号：６３配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧ２０配列番号：６４配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧ２０配列番号：６５配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡ２０配列番号：６６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣ２０配列番号：６７配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴ２０配列番号：６８配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣ２０配列番号：６９配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣ２０配列番号：７０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ２０配列番号：７１配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡ２０配列番号：７２配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣ２０配列番号：７３配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴ２０配列番号：７４配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴ２０配列番号：７５配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧ２０配列番号：７６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡ２０配列番号：７７配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧ２０配列番号：７８配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧ２０配列番号：７９配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴ２０配列番号：８０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣ２０配列番号：８１配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴｉＧＴＧＣＴＣ２０配列番号：８２配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧｉＧＧＴＴＴｉＧＧＡＴＴｉＧＴＧＣＴＣ２０配列番号：８３配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧｉＧＧＴＴＴｉＧＧＡｉｉｉＧＴＧＣＴＣ２０配列番号：８４配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣ２０配列番号：８５配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴ２０配列番号：８６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣ２０配列番号：８７配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴ２０配列番号：８８配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧ２０配列番号：８９配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡ２０配列番号：９０配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴ２０配列番号：９１配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧ２０配列番号：９２配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡ２０配列番号：９３配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧ２０配列番号：９４配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＴＴＡＣＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴ２０配列番号：９５配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＴＧＧＴＧＴＴＡＣＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴ２０配列番号：９６配列の長さ：２０配列の種類：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列：ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＴＡＣＧＴＴＴＧＧＴＴ２０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ 1/70 9453−4Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ハネカック，ロニー・シーアメリカ合衆国92672カリフォルニア州サンクレメンテ、カレ・ベネジア904番 (72)発明者星子和哉熊本県菊池郡合志町幾久富建山1909―47 Ａ―102 (72)発明者野崎周英熊本県熊本市武蔵ケ丘１―444 (72)発明者西原司熊本県熊本市龍田町上立田1749―６ (72)発明者中武博熊本県菊池郡菊陽町津久礼2333―15 (72)発明者濱田福三郎熊本県菊池郡西合志町須屋2679―２ (72)発明者衛藤辰男アメリカ合衆国92024カリフォルニア州エンシニタス、ビア・モレーラ158番 (72)発明者古川真一熊本県菊池郡合志町豊岡2012―28

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＣＶゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドは該ＲＮＡとハイブリダイズしうる。２．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端ヘアピンループ、５'末端６塩基対繰り返し、５'末端非翻訳領域、ポリタンパク質翻訳開始コドン、ＯＲＦ３翻訳開始コドン、３'非翻訳領域、３'末端パリンドローム領域、Ｒ２配列または３'末端ヘアピンループを含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３．薬理学的に許容しうる担体中にある請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。４．５〜５０ヌクレオチドからなる請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。５．表１に示す配列の一つを含む請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。６．Ｃ型肝炎ウイルスまたは該ウイルスに感染した細胞を、ＨＣＶＲＮＡの少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチド（該オリゴヌクレオチドは該ＲＮＡとハイブリダイズしうる）と接触させることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルスの活性を調節する方法。７．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端ヘアピンループ、５'末端６塩基対繰り返し、５'末端非翻訳領域、ポリタンパク質翻訳開始コドン、ＯＲＦ３翻訳開始コドン、３'非翻訳領域、３'末端パリンドローム領域、Ｒ２配列または３' 末端ヘアピンループを含む請求項６に記載の方法。８．該オリゴヌクレオチドが薬理学的に許容しうる担体中にある請求項６に記載の方法。９．該オリゴヌクレオチドが５〜５０ヌクレオチドからなる請求項６に記載の方法。１０．該オリゴヌクレオチドが表１に示す配列の一つを含む請求項９に記載の方法。１１．ＨＣＶ関連疾患を有すると思われる動物に、ＨＣＶＲＮＡの少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチド（該オリゴヌクレオチドは該ＲＮＡとハイブリダイズしうる）の治療学的有効量と接触させることを特徴とする、ＨＣＶ関連疾患の治療方法。１２．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端ヘアピンループ、５'末端６塩基対繰り返し、５'末端非翻訳領域、ポリタンパク質翻訳開始コドン、ＯＲＦ３翻訳開始コドン、３'非翻訳領域、３'末端パリンドローム領域、Ｒ２配列または３ '末端ヘアピンループを含む請求項１１に記載の方法。１３．該オリゴヌクレオチドが薬理学的に許容しうる担体中にある請求項１１に記載の方法。１４．該オリゴヌクレオチドが５〜５０ヌクレオチドからなる請求項１１に記載の方法。１５．該オリゴヌクレオチドが表１に示す配列の一つを含む請求項１２に記載の方法。１６．Ｃ型肝炎ウイルスゲノムのヌクレオチド配列中の５'非翻訳領域に存在する下記ヌクレオチド配列（Ａ）または該ヌクレオチド配列（Ａ）に非常に相同なヌクレオチド配列とハイブリダイズしうる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド：（Ａ）GCCUCCAGGACCCC. １７．少なくとも１４核酸塩基ユニットを有する請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。１８．少なくとも該ヌクレオチド配列（Ａ）に対する少なくともアンチセンスヌクレオチド配列を含有する請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。１９．該ヌクレオチド配列（Ａ）に対するアンチセンスヌクレオチド配列を含有する２０塩基ユニットを有する核酸である、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。２０．少なくとも該ヌクレオチド配列（Ａ）に対する少なくともアンチセンスヌクレオチト配列を含有し、さらに下記ヌクレオチド配列（Ｂ）中の１４〜２６の連続ヌクレオチド配列を有する核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。（Ｂ）CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC. ２１．化学的に修飾した化合物である請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。２２．ホスホロチオエート化合物である請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。２３．ＨＣＶＤＮＡのヌクレオチド番号３５２〜３５５（ＡＵＣＣ）のヌクレオチド配列またはその周辺とハイブリダイズしうる請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。２４．活性成分として請求項１〜５および１６〜２３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含有する、Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患の治療剤。２５．ＨＣＶ関連疾患を治療するための、請求項１〜５および１６〜２３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。２６．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のループＢ領域またはループＣ領域の少なくとも一部を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。２７．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のヌクレオチド１０４〜１２９を含む請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。２８．ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４またはＳＥＱＩＤＮＯ：４５を含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。２９．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のループＦ領域の少なくとも一部を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。３０．ＳＥＱＩＤＮＯ：６２を含む請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド。３１．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡのポリタンパク質翻訳開始コドンの少なくとも一部を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。３２．ＳＥＱＩＤＮＯ：８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：７９またはＳＥＱＩＤＮＯ：８０を含む、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。３３．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡのコアタンパク質コード領域の少なくとも一部を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３４．配列ＧＧＡＴを含む請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。３５．ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８９、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０またはＳＥＱＩＤＮＯ：９１を含む、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。３６．少なくとも一つのホスホロチオエート糖間結合を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３７．少なくとも一つの糖残基の２'位に−Ｏ−アルキル修飾を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３８．−Ｏ−アルキル修飾が−Ｏ−メチルまたは−Ｏ−プロピル修飾である請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド。３９．ＨＣＶの株間で変異しうるＨＣＶＲＮＡ中のヌクレオチドに相補的な位置に普遍塩基を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。４０．普遍塩基がイノシンである請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド。４１．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のループＢ領域またはループＣ領域の少なくとも一部を含む請求項７に記載の方法。４２．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のヌクレオチド１０４〜１２９を含む請求項４１に記載の方法。４３．該オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２Ｏ、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４またはＳＥＱＩＤＮＯ：４５を含む、請求項４１に記載の方法。４４．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のループＦ領域の少なくとも一部を含む請求項７に記載の方法。４５．該オリゴヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：６２を含む請求項４４に記載の方法。４６．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡのポリタンパク質翻訳開始コドンの少なくとも一部を含む請求項７に記載の方法。４７．該オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：７９またはＳＥＱＩＤＮＯ：８０を含む、請求項４６に記載の方法。４８．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡのコアタンパク質コード領域の少なくとも一部を含む請求項６に記載の方法。４９．該オリゴヌクレオチドが配列ＧＧＡＴを含む請求項４８に記載の方法。５０．該オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８９、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０またはＳＥＱＩＤＮＯ：９１を含む、請求項４８に記載の方法。５１．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのホスホロチオエート糖間結合を含む請求項６に記載の方法。５２．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの糖残基の２'位に−Ｏ−アルキル修飾を含む請求項６に記載の方法。５３．−Ｏ−アルキル修飾が−Ｏ−メチルまたは−Ｏ−プロピル修飾である請求項５２に記載の方法。５４．該オリゴヌクレオチドが、ＨＣＶの株間で変異しうるＨＣＶＲＮＡ中のヌクレオチドに相補的な位置に普遍塩基を有する請求項６に記載の方法。５５．普遍塩基がイノシンである請求項５４に記載の方法。５６．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のループＢ領域またはループＣ領域の少なくとも一部を含む請求項１２に記載の方法。５７．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のヌクレオチド１０４〜１２９を含む請求項５６に記載の方法。５８．該オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４またはＳＥＱＩＤＮＯ：４５を含む、請求項５６に記載の方法。５９．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡの５'末端非翻訳領域のループＦ領域の少なくとも一部を含む請求項１２に記載の方法。６０．該オリゴヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：６２を含む請求項５９に記載の方法。６１．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡのポリタンパク質翻訳開始コドンの少なくとも一部を含む請求項１２に記載の方法。６２．該オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：７９またはＳＥＱＩＤＮＯ：８０を含む、請求項６１に記載の方法。６３．該ＲＮＡが、ＨＣＶＲＮＡのコアタンパク質コード領域の少なくとも一部を含む請求項１１に記載の方法。６４．該オリゴヌクレオチドが配列ＧＧＡＴを含む請求項６３に記載の方法。６５．該オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８９、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０またはＳＥＱＩＤＮＯ：９１を含む、請求項６３に記載の方法。６６．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのホスホロチオエート糖間結合を含む請求項１１に記載の方法。６７．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの糖残基の２'位に−Ｏ−アルキル修飾を含む請求項１１に記載の方法。６８．−Ｏ−アルキル修飾が−Ｏ−メチルまたは−Ｏ−プロピル修飾である請求項６７に記載の方法。６９．該オリゴヌクレオチドが、ＨＣＶの株間で変異しうるＨＣＶＲＮＡ中のヌクレオチドに相補的な位置に普遍塩基を有する請求項１１に記載の方法。７０．普遍塩基がイノシンである請求項６９に記載の方法。