JPH06296492A - 抗ｃ型肝炎ウイルスオリゴヌクレオチド - Google Patents
抗ｃ型肝炎ウイルスオリゴヌクレオチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するアンチ
センス核酸配列を有するＣ型肝炎治療剤を提供する。 【構成】 Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域中の
特定の核酸配列を標的としたアンチセンス核酸を有する
ことを特徴とするＨＣＶのウイルス複製阻害活性が極め
て高いアンチセンス化合物を調製することにより、効果
的なＣ型肝炎治療剤を得る。
センス核酸配列を有するＣ型肝炎治療剤を提供する。 【構成】 Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域中の
特定の核酸配列を標的としたアンチセンス核酸を有する
ことを特徴とするＨＣＶのウイルス複製阻害活性が極め
て高いアンチセンス化合物を調製することにより、効果
的なＣ型肝炎治療剤を得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗Ｃ型肝炎ウイルスオ
リゴヌクレオチドに関する。さらに詳細には、本発明
は、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸に特異的にハイブリダイズ
するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するＣ型肝炎
治療に有効なアンチセンス核酸治療剤に関する。
リゴヌクレオチドに関する。さらに詳細には、本発明
は、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸に特異的にハイブリダイズ
するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するＣ型肝炎
治療に有効なアンチセンス核酸治療剤に関する。
【０００２】
【発明の背景及び従来技術】ウイルス性肝炎にはＡ型肝
炎(伝染性肝炎)とＢ型肝炎(血清肝炎)の２種類があるこ
とは古くから知られていた。これは主として感染経路の
相違に基づいたもので、Ａ型肝炎は経口感染で流行を起
こし、Ｂ型肝炎は主として血液を介して伝播されるもの
であることが確認された。これらの２つの肝炎の原因ウ
イルスは既に分離同定され、Ａ型肝炎ウイルスはピコル
ナウイルスに属する直径27nmのＲＮＡウイルスであり(F
inestone, S.M. et al., Science 182 p.1026(1973))、
一方、Ｂ型肝炎ウイルスはヘパドナウイルスに属する直
径42nmのエンベロープを有するＤＮＡウイルスであるこ
とが突き止められた(Dane, O.S., et al., Lancet,I p.
695(1970))。現在ではこれらの肝炎ウイルスの免疫血清
学的診断方法が確立され、その予防対応策もほぼ確立さ
れている。
炎(伝染性肝炎)とＢ型肝炎(血清肝炎)の２種類があるこ
とは古くから知られていた。これは主として感染経路の
相違に基づいたもので、Ａ型肝炎は経口感染で流行を起
こし、Ｂ型肝炎は主として血液を介して伝播されるもの
であることが確認された。これらの２つの肝炎の原因ウ
イルスは既に分離同定され、Ａ型肝炎ウイルスはピコル
ナウイルスに属する直径27nmのＲＮＡウイルスであり(F
inestone, S.M. et al., Science 182 p.1026(1973))、
一方、Ｂ型肝炎ウイルスはヘパドナウイルスに属する直
径42nmのエンベロープを有するＤＮＡウイルスであるこ
とが突き止められた(Dane, O.S., et al., Lancet,I p.
695(1970))。現在ではこれらの肝炎ウイルスの免疫血清
学的診断方法が確立され、その予防対応策もほぼ確立さ
れている。
【０００３】これらの２つの肝炎ウイルスの確定診断方
法が確立されるに従い、このいずれにも属さない非Ａ非
Ｂ型肝炎の存在が明らかになってきた(Prince,A.M.,et
al.,Lancet I p.241(1974))。輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原(HBsAg)のスクリーニングの導入によ
り大幅に減少したがゼロにはならず、しかも、発生した
肝炎患者からは、Ａ型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られ
なかった。このことから、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれた。この種の肝炎は、わが国では散発性肝
炎の約50％、輸血後肝炎の約90％以上にのぼり、さらに
慢性肝炎、肝硬変、肝癌の50％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に
起因すると推定されており大きな社会問題となってい
る。
法が確立されるに従い、このいずれにも属さない非Ａ非
Ｂ型肝炎の存在が明らかになってきた(Prince,A.M.,et
al.,Lancet I p.241(1974))。輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原(HBsAg)のスクリーニングの導入によ
り大幅に減少したがゼロにはならず、しかも、発生した
肝炎患者からは、Ａ型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られ
なかった。このことから、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれた。この種の肝炎は、わが国では散発性肝
炎の約50％、輸血後肝炎の約90％以上にのぼり、さらに
慢性肝炎、肝硬変、肝癌の50％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に
起因すると推定されており大きな社会問題となってい
る。
【０００４】これとは別に、インド、ミャンマー、アフ
ガニスタン、または北アフリカなどで経口感染で流行す
る第２のウイルス性非Ａ非Ｂ型肝炎が存在することが明
らかになった(Khuroo,M.S. Am.J.Med., 68 p.818(198
0))。これは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれている。わが国では、この肝炎の流行は観
察されていないが、渡航者による流行地からの肝炎の輸
入は若干観られるようである［福原ら、第２５回日本肝
臓学会総会講演要旨集(1989)］。
ガニスタン、または北アフリカなどで経口感染で流行す
る第２のウイルス性非Ａ非Ｂ型肝炎が存在することが明
らかになった(Khuroo,M.S. Am.J.Med., 68 p.818(198
0))。これは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれている。わが国では、この肝炎の流行は観
察されていないが、渡航者による流行地からの肝炎の輸
入は若干観られるようである［福原ら、第２５回日本肝
臓学会総会講演要旨集(1989)］。
【０００５】本発明は、上記で言う前者の主に血液を介
して感染する血液型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関するも
のであり、本明細書中ではこのウイルスをＣ型肝炎ウイ
ルスと呼ぶ。
して感染する血液型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関するも
のであり、本明細書中ではこのウイルスをＣ型肝炎ウイ
ルスと呼ぶ。
【０００６】Ｃ型肝炎は、患者血清中のウイルス濃度が
102〜103と低いこと、同じ接種材料で再感染を起こした
チンパンジーが存在するなど抗体の存在が疑わしいこ
と、感染実験モデルがチンパンジー、マーモセットに限
られることなどの問題点のため、その研究に困難を来た
している。
102〜103と低いこと、同じ接種材料で再感染を起こした
チンパンジーが存在するなど抗体の存在が疑わしいこ
と、感染実験モデルがチンパンジー、マーモセットに限
られることなどの問題点のため、その研究に困難を来た
している。
【０００７】このため、Ｃ型肝炎については未だウイル
ス本体の分離同定はなされておらず、また、この種類の
肝炎の治療法、及び予防法は確立されてはいない。従
来、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。す
なわち、患者の血清について診断方法が確立されている
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行ない、これらの肝炎であるこ
とを否定し、さらに全身感染の一部の症状として肝炎様
症状を示すヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバー
ウイルス感染の可能性を否定し、また薬物性やアルコー
ル性肝炎、自己免疫性肝炎を否定してＣ型肝炎として診
断されていた。
ス本体の分離同定はなされておらず、また、この種類の
肝炎の治療法、及び予防法は確立されてはいない。従
来、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。す
なわち、患者の血清について診断方法が確立されている
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行ない、これらの肝炎であるこ
とを否定し、さらに全身感染の一部の症状として肝炎様
症状を示すヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバー
ウイルス感染の可能性を否定し、また薬物性やアルコー
ル性肝炎、自己免疫性肝炎を否定してＣ型肝炎として診
断されていた。
【０００８】この肝炎の病因ウイルスが感染性を有する
ことは、1978年アメリカの研究グループにより、チンパ
ンジーを用いた感染実験で証明された(Tabor,E.,et a
l., Lancet I p.463(1978))。しかし、世界中の多くの
努力にもかかわらず、10年以上経た現在も、病因ウイル
スの実態は判明していない。感染チンパンジーの血液や
肝組織を材料として、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向
流法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法など
のＡ型及びＢ型肝炎の研究で用いられた殆どすべてのア
プローチにより、ウイルスや関連する抗原抗体系の探索
が行なわれてきたが、いまだ確実といわれるものを得る
には至っていない。
ことは、1978年アメリカの研究グループにより、チンパ
ンジーを用いた感染実験で証明された(Tabor,E.,et a
l., Lancet I p.463(1978))。しかし、世界中の多くの
努力にもかかわらず、10年以上経た現在も、病因ウイル
スの実態は判明していない。感染チンパンジーの血液や
肝組織を材料として、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向
流法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法など
のＡ型及びＢ型肝炎の研究で用いられた殆どすべてのア
プローチにより、ウイルスや関連する抗原抗体系の探索
が行なわれてきたが、いまだ確実といわれるものを得る
には至っていない。
【０００９】最近になって、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）のcDNAを捕えたという報告が米国のカイロン社（欧
州特許公開 EP 388232A）、及び自治医科大学の岡本ら
［VOROLOGY 188, P321-341 (1992)］によって発表さ
れ、このウイルス遺伝子の全容が明らかにされつつあ
る。このような状況の中、本発明者らも単一種HCVゲノ
ムを確立するために、単一の日本人血漿を出発材料とし
てHCV-cDNAのクローニングを行った。その結果、HCV−R
NAの全長アミノ酸をコードすると考えられるcDNAをクロ
ーニングすることに成功した（特願平3-203884）。
Ｖ）のcDNAを捕えたという報告が米国のカイロン社（欧
州特許公開 EP 388232A）、及び自治医科大学の岡本ら
［VOROLOGY 188, P321-341 (1992)］によって発表さ
れ、このウイルス遺伝子の全容が明らかにされつつあ
る。このような状況の中、本発明者らも単一種HCVゲノ
ムを確立するために、単一の日本人血漿を出発材料とし
てHCV-cDNAのクローニングを行った。その結果、HCV−R
NAの全長アミノ酸をコードすると考えられるcDNAをクロ
ーニングすることに成功した（特願平3-203884）。
【００１０】このようにHCVの遺伝子が捕えられたこと
により、治療薬開発の方法の新しい可能性の道が開かれ
ることになった。例えば、HCVの機能蛋白を活性を持っ
た形で遺伝子組換え技術を用いて発現させ、この機能を
阻害するような物質のスクリーニングを行うことにより
抗HCV化合物を調製することも可能になろう。また、別
の例としては遺伝子配列情報をもとに、近年注目されて
いる、遺伝子レベルでの制御をかける、アンチセンス核
酸によるウイルス増殖阻止という可能性も考えられる。
により、治療薬開発の方法の新しい可能性の道が開かれ
ることになった。例えば、HCVの機能蛋白を活性を持っ
た形で遺伝子組換え技術を用いて発現させ、この機能を
阻害するような物質のスクリーニングを行うことにより
抗HCV化合物を調製することも可能になろう。また、別
の例としては遺伝子配列情報をもとに、近年注目されて
いる、遺伝子レベルでの制御をかける、アンチセンス核
酸によるウイルス増殖阻止という可能性も考えられる。
【００１１】このアンチセンス核酸とは、ウイルスが増
殖する際に合成するメッセンジャーRNA (mRNA)の特定な
領域と相補的な配列を持つ核酸のことで、これをmRNAが
翻訳されている場に与えることによって、mRNAそのもの
またはその成熟に至る中間体の適当な領域とハイブリダ
イズさせることにより、リボソームの結合、転移の阻害
あるいはRNA分解酵素による分解などの効果を与え、当
核mRNAの発現を阻止することを可能とするものである。
(渡辺信元ら、実験医学713 p138 (1990))
殖する際に合成するメッセンジャーRNA (mRNA)の特定な
領域と相補的な配列を持つ核酸のことで、これをmRNAが
翻訳されている場に与えることによって、mRNAそのもの
またはその成熟に至る中間体の適当な領域とハイブリダ
イズさせることにより、リボソームの結合、転移の阻害
あるいはRNA分解酵素による分解などの効果を与え、当
核mRNAの発現を阻止することを可能とするものである。
(渡辺信元ら、実験医学713 p138 (1990))
【００１２】これらアンチセンス配列を持つオリゴヌク
レオチドは、核酸分解に対する抵抗性は増大しているが
培養細胞の原形質膜に侵入して相補的なDNA配列またはR
NA配列と特異的にハイブリダイズする能力は保持される
ような形で修飾され、(TS’O, P.O.P. et al. in
Development of Target-Oriented Antisencer Drug
s, eds. Cheng, Y.C., et al. (Raven Press,
NewYork) p189 (1983) ; Miller, P.S. et al.
Biochimie, 67, p769 (1985))ウイルス阻止に対して
インビトロで活性であることが明らかにされているが、
ウイルス阻止活性を示すためには実際に治療薬として用
いるには不適当な程の高い濃度が要求された。今後、ア
ンチセンス技術を治療薬の分野に応用していくためには
ウイルス阻止活性を示すために要求される濃度をより低
くできるような方法を求めていかなければならない。そ
のための手段として、生体内に投与した核酸が分解され
るのを防ぐ、あるいは膜透過性を高めるべく、核酸の効
果的な修飾法が開発されている。
レオチドは、核酸分解に対する抵抗性は増大しているが
培養細胞の原形質膜に侵入して相補的なDNA配列またはR
NA配列と特異的にハイブリダイズする能力は保持される
ような形で修飾され、(TS’O, P.O.P. et al. in
Development of Target-Oriented Antisencer Drug
s, eds. Cheng, Y.C., et al. (Raven Press,
NewYork) p189 (1983) ; Miller, P.S. et al.
Biochimie, 67, p769 (1985))ウイルス阻止に対して
インビトロで活性であることが明らかにされているが、
ウイルス阻止活性を示すためには実際に治療薬として用
いるには不適当な程の高い濃度が要求された。今後、ア
ンチセンス技術を治療薬の分野に応用していくためには
ウイルス阻止活性を示すために要求される濃度をより低
くできるような方法を求めていかなければならない。そ
のための手段として、生体内に投与した核酸が分解され
るのを防ぐ、あるいは膜透過性を高めるべく、核酸の効
果的な修飾法が開発されている。
【００１３】しかしながら、このような核酸の効果的な
修飾法の前に、対象となるウイルスのどの遺伝子領域の
アンチセンス核酸をいかに調製するかということを決定
しなければならない。アンチセンス核酸を細胞に対して
働かせようとした場合、膜透過性とハイブリッド形成能
の兼合いから15-30merの長さ、好ましくは20mer程度が
適当とされている。従って、対象となるウイルスの遺伝
子の配列から20mer程度のターゲット領域（アンチセン
ス核酸をハイブリッドさせる標的配列）を選び出す必要
があるが、どこを選んでも同じというわけではない。な
ぜならば、mRNAの配列上の任意の連続する20merの果た
す機能は場所によって異なるので、その領域に相補的な
アンチセンス核酸がmRNAの全体の機能に与える影響も当
然異なってくる。したがって、ウイルスの増殖機能によ
り効果的な阻害を与えるようなウイルス遺伝子上のター
ゲット領域を見いだすことが重要な意味を持つことにな
る。
修飾法の前に、対象となるウイルスのどの遺伝子領域の
アンチセンス核酸をいかに調製するかということを決定
しなければならない。アンチセンス核酸を細胞に対して
働かせようとした場合、膜透過性とハイブリッド形成能
の兼合いから15-30merの長さ、好ましくは20mer程度が
適当とされている。従って、対象となるウイルスの遺伝
子の配列から20mer程度のターゲット領域（アンチセン
ス核酸をハイブリッドさせる標的配列）を選び出す必要
があるが、どこを選んでも同じというわけではない。な
ぜならば、mRNAの配列上の任意の連続する20merの果た
す機能は場所によって異なるので、その領域に相補的な
アンチセンス核酸がmRNAの全体の機能に与える影響も当
然異なってくる。したがって、ウイルスの増殖機能によ
り効果的な阻害を与えるようなウイルス遺伝子上のター
ゲット領域を見いだすことが重要な意味を持つことにな
る。
【００１４】
【本発明が解決しようとする課題】このように、Ｃ型肝
炎ウイルスに対するアンチセンスを調製する際には、ア
ンチセンス核酸のターゲット領域となる、HCV-RNA中の2
0mer程度の有効な核酸配列部位を見いだすことが極めて
重要な要件となる。しかしながら、Ｃ型肝炎に関しては
アンチセンスのターゲット領域となるような特に有効な
部位に関する報告はこれまでのところ一切なされていな
い。
炎ウイルスに対するアンチセンスを調製する際には、ア
ンチセンス核酸のターゲット領域となる、HCV-RNA中の2
0mer程度の有効な核酸配列部位を見いだすことが極めて
重要な要件となる。しかしながら、Ｃ型肝炎に関しては
アンチセンスのターゲット領域となるような特に有効な
部位に関する報告はこれまでのところ一切なされていな
い。
【００１５】
【課題を解決するための手段】ウイルス遺伝子上のアン
チセンス核酸のターゲット部位を探索するという目的の
ためには通常はインビトロのウイルス増殖系を使用して
いるがHCVの場合現時点ではこのような系は存在しな
い。そこで本発明らは、ウサギ網状赤血球抽出液と人工
的に合成したHCV-mRNAの5'非翻訳領域からコアのN端側
までの部分を用いた無細胞翻訳系を用いることによっ
て、アンチセンス治療薬のターゲットとなるHCV-RNA中
の核酸配列について特に有効な領域を見いだすことに成
功した。
チセンス核酸のターゲット部位を探索するという目的の
ためには通常はインビトロのウイルス増殖系を使用して
いるがHCVの場合現時点ではこのような系は存在しな
い。そこで本発明らは、ウサギ網状赤血球抽出液と人工
的に合成したHCV-mRNAの5'非翻訳領域からコアのN端側
までの部分を用いた無細胞翻訳系を用いることによっ
て、アンチセンス治療薬のターゲットとなるHCV-RNA中
の核酸配列について特に有効な領域を見いだすことに成
功した。
【００１６】発明者らが構築した上記無細胞翻訳系はHC
Vの生活環にとって重要な過程である翻訳開始の段階を
試験管内で模擬していると考えられる。翻訳開始の段階
においてはmRNAとリボゾームの結合、開始コドンの位置
での複合体の形成といった一連の反応が行われ、HCV-mR
NAの5'非翻訳領域とコア領域のN端側がこの過程に関与
していると考えられる。しかし、この領域は約300塩基
の長さがあり、全体をアンチセンスによってカバーする
ことは極めて困難である。本発明者らは、この領域のう
ちどの部分の塩基配列をアンチセンス核酸のターゲット
とすることが、他の部分に較べて強く翻訳開始が阻害さ
れるかについて鋭意研究を進めた結果、他の部分に較べ
て極めて強く翻訳開始を阻害する部分を見いだした。
Vの生活環にとって重要な過程である翻訳開始の段階を
試験管内で模擬していると考えられる。翻訳開始の段階
においてはmRNAとリボゾームの結合、開始コドンの位置
での複合体の形成といった一連の反応が行われ、HCV-mR
NAの5'非翻訳領域とコア領域のN端側がこの過程に関与
していると考えられる。しかし、この領域は約300塩基
の長さがあり、全体をアンチセンスによってカバーする
ことは極めて困難である。本発明者らは、この領域のう
ちどの部分の塩基配列をアンチセンス核酸のターゲット
とすることが、他の部分に較べて強く翻訳開始が阻害さ
れるかについて鋭意研究を進めた結果、他の部分に較べ
て極めて強く翻訳開始を阻害する部分を見いだした。
【００１７】すなわち、本発明に従えば、Ｃ型肝炎ウイ
ルスゲノムの塩基配列中の5'非翻訳領域に存在する下記
の塩基配列（Ａ）もしくはこの核酸配列に極めて相同性
の高い塩基配列（塩基配列（Ａ）と比較し、１ないし２
個の塩基のみが異なる塩基配列）とハイブリッドするよ
うなアンチセンス塩基配列を有することを特徴とするア
ンチセンス化合物を調製することにより、Ｃ型肝炎治療
にきわめて効果的なアンチセンス核酸治療剤を調製する
ことが可能となる。 （Ａ）GCCUCCAGGACCCC
ルスゲノムの塩基配列中の5'非翻訳領域に存在する下記
の塩基配列（Ａ）もしくはこの核酸配列に極めて相同性
の高い塩基配列（塩基配列（Ａ）と比較し、１ないし２
個の塩基のみが異なる塩基配列）とハイブリッドするよ
うなアンチセンス塩基配列を有することを特徴とするア
ンチセンス化合物を調製することにより、Ｃ型肝炎治療
にきわめて効果的なアンチセンス核酸治療剤を調製する
ことが可能となる。 （Ａ）GCCUCCAGGACCCC
【００１８】そのようなアンチセンス化合物とは、少な
くとも１４merの塩基を有するオリゴヌクレオチドまた
はその化合物であり、好ましくは１４〜２６merのオリ
ゴヌクレオチドを有する化合物をいう。また、さらに好
ましくは、上記の14個の塩基からなる塩基配列もしくは
この配列に極めて相同性の高い塩基配列に相補的な塩基
配列を有し、さらに、HCVゲノム由来の下記の塩基配列
（Ｂ）もしくはHCVゲノムの、この配列からなる領域に
相当する塩基配列中の連続した約２０mer程度の塩基配
列に相補的な塩基配列からなる化合物を言う。 （Ｂ）CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC
くとも１４merの塩基を有するオリゴヌクレオチドまた
はその化合物であり、好ましくは１４〜２６merのオリ
ゴヌクレオチドを有する化合物をいう。また、さらに好
ましくは、上記の14個の塩基からなる塩基配列もしくは
この配列に極めて相同性の高い塩基配列に相補的な塩基
配列を有し、さらに、HCVゲノム由来の下記の塩基配列
（Ｂ）もしくはHCVゲノムの、この配列からなる領域に
相当する塩基配列中の連続した約２０mer程度の塩基配
列に相補的な塩基配列からなる化合物を言う。 （Ｂ）CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC
【００１９】上記の本発明の最も好ましい化合物の具体
的な例としては、下記の(A1)〜(A4)の核酸配列からなる
２０merのアンチセンス化合物が挙げられる。 (A1) GGGGTCCTGGAGGCTGCACG (A2) GGGGGGTCCTGGAGGCTGCA (A3) AGGGGGGGTCCTGGAGGCTG (A4) GGAGGGGGGGTCCTGGAGGC 上記(A1)〜(A4)においては、アンチセンス核酸としてＤ
ＮＡを用いた例を示しているが、ＤＮＡの代わりにＲＮ
Ａを用いた場合でも同様のアンチセンス化合物を調製す
ることができる。そのような場合には、上記T（チミ
ン）をU（ウラシル）に代えることにより調製される。
的な例としては、下記の(A1)〜(A4)の核酸配列からなる
２０merのアンチセンス化合物が挙げられる。 (A1) GGGGTCCTGGAGGCTGCACG (A2) GGGGGGTCCTGGAGGCTGCA (A3) AGGGGGGGTCCTGGAGGCTG (A4) GGAGGGGGGGTCCTGGAGGC 上記(A1)〜(A4)においては、アンチセンス核酸としてＤ
ＮＡを用いた例を示しているが、ＤＮＡの代わりにＲＮ
Ａを用いた場合でも同様のアンチセンス化合物を調製す
ることができる。そのような場合には、上記T（チミ
ン）をU（ウラシル）に代えることにより調製される。
【００２０】HCVの5'非翻訳領域の塩基配列はウイルス
株間での相同性が他の領域と比較して高いが、それでも
株間で塩基の変異率の高い箇所が5'非翻訳領域全体で数
十箇所報告されている。上記配列A中にもそのような株
間での変異率の高い塩基が一箇所あり、塩基番号119
（配列A中では5'側より10番目）のアデニンがそれであ
る。また、上記配列B中では塩基番号107（配列B中では
5'側より４番目）のグアニン、塩基番号104(配列B中で
は5'側より１番目）のシトシンが変異率が高い。
株間での相同性が他の領域と比較して高いが、それでも
株間で塩基の変異率の高い箇所が5'非翻訳領域全体で数
十箇所報告されている。上記配列A中にもそのような株
間での変異率の高い塩基が一箇所あり、塩基番号119
（配列A中では5'側より10番目）のアデニンがそれであ
る。また、上記配列B中では塩基番号107（配列B中では
5'側より４番目）のグアニン、塩基番号104(配列B中で
は5'側より１番目）のシトシンが変異率が高い。
【００２１】15-20mer程度の鎖長のオリゴヌクレオチド
に対しその相補鎖をハイブリダイズさせる際に両鎖間に
一箇所塩基対のミスマッチがあると全体の結合能が著し
く落ちることが知られているが、この事実に拠れば今回
の実験に用いたHCV株の塩基配列に基づいて作製したア
ンチセンス化合物は上記の位置の塩基に変異を有する他
のHCV株に対しては著しく活性が低下する可能性が想定
される。そこで我々は上記の119の位置のアデニンに対
応するアンチセンスDNA配列中のチミンをイノシンに置
換したアンチセンスDNAを作製した。イノシンとは、オ
リゴヌクレオチドプローブを調製する際に変異の可能性
のある位置に本来の塩基対を形成する塩基の替わりに入
れるというような使い方をされているプリン類似化合物
で、配列中にイノシンが入っているオリゴヌクレオチド
はそれと相補的なオリゴヌクレオチドでイノシンの位置
に対応する塩基がＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）のどれであって
もその部分の塩基対がミスマッチである場合に比較して
はるかに高いハイブリッド形成能を持つという性質を持
つ。この塩基番号119の位置をイノシンに置換したアン
チセンスDNAを上記の系にて評価した結果、完全に相補
的な場合とほぼ同等の活性を示した。このことから、上
記の位置の塩基をイノシンに置換したアンチセンス治療
薬はHCVの複数の株に対して有効であることが示され
た。
に対しその相補鎖をハイブリダイズさせる際に両鎖間に
一箇所塩基対のミスマッチがあると全体の結合能が著し
く落ちることが知られているが、この事実に拠れば今回
の実験に用いたHCV株の塩基配列に基づいて作製したア
ンチセンス化合物は上記の位置の塩基に変異を有する他
のHCV株に対しては著しく活性が低下する可能性が想定
される。そこで我々は上記の119の位置のアデニンに対
応するアンチセンスDNA配列中のチミンをイノシンに置
換したアンチセンスDNAを作製した。イノシンとは、オ
リゴヌクレオチドプローブを調製する際に変異の可能性
のある位置に本来の塩基対を形成する塩基の替わりに入
れるというような使い方をされているプリン類似化合物
で、配列中にイノシンが入っているオリゴヌクレオチド
はそれと相補的なオリゴヌクレオチドでイノシンの位置
に対応する塩基がＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）のどれであって
もその部分の塩基対がミスマッチである場合に比較して
はるかに高いハイブリッド形成能を持つという性質を持
つ。この塩基番号119の位置をイノシンに置換したアン
チセンスDNAを上記の系にて評価した結果、完全に相補
的な場合とほぼ同等の活性を示した。このことから、上
記の位置の塩基をイノシンに置換したアンチセンス治療
薬はHCVの複数の株に対して有効であることが示され
た。
【００２２】また、このようなアンチセンス核酸を有す
ることを特徴とする本発明のＣ型肝炎治療剤を調製する
際には、核酸を公知の方法で一部化学修飾することによ
り、生体内に投与した際に安定な医薬品として有用な核
酸改変体を調製することができる。このようなアンチセ
ンス核酸の安定性を高める修飾としては、ホスホジエス
テル結合を形成するリン酸基をメチル基に置換する方法
［C.Smithら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, p2787
(1986)］あるいは、イオウに置換する方法［松倉ら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p7706 (1987)］、また
3'末端にアクリジン［J.Toulmeら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83, p1227 (1986)］やポリジン［M.Lemait
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p1648 (1987)］
を共有結合させる方法などがその一例として挙げられ
る。また最近では、骨格部分の核酸構造を他の化合物に
置き換える試みもなされている。このような修飾は、標
的臓器への移行性、ｍＲＮＡとの結合能またはウイルス
に作用後の代謝性など、治療薬として使用する際に要求
される種々の事項に対応すべく必要に応じて行われる。
特にホスホジエステル結合を形成するリン酸基の酸素原
子をイオウ原子に置換する方法は、本発明の治療剤調製
の上で有用な好ましい手法と考えられる。
ることを特徴とする本発明のＣ型肝炎治療剤を調製する
際には、核酸を公知の方法で一部化学修飾することによ
り、生体内に投与した際に安定な医薬品として有用な核
酸改変体を調製することができる。このようなアンチセ
ンス核酸の安定性を高める修飾としては、ホスホジエス
テル結合を形成するリン酸基をメチル基に置換する方法
［C.Smithら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, p2787
(1986)］あるいは、イオウに置換する方法［松倉ら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p7706 (1987)］、また
3'末端にアクリジン［J.Toulmeら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83, p1227 (1986)］やポリジン［M.Lemait
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p1648 (1987)］
を共有結合させる方法などがその一例として挙げられ
る。また最近では、骨格部分の核酸構造を他の化合物に
置き換える試みもなされている。このような修飾は、標
的臓器への移行性、ｍＲＮＡとの結合能またはウイルス
に作用後の代謝性など、治療薬として使用する際に要求
される種々の事項に対応すべく必要に応じて行われる。
特にホスホジエステル結合を形成するリン酸基の酸素原
子をイオウ原子に置換する方法は、本発明の治療剤調製
の上で有用な好ましい手法と考えられる。
【００２３】本発明においては、ウサギ網状赤血球抽出
液を用いた無細胞翻訳系において、HCV-RNAよりHCVコア
蛋白を発現させ、この反応系に本発明のアンチセンスＤ
ＮＡ等を加えてＨＣＶ由来の蛋白発現に阻害がかかるか
どうかをみた結果、上記に示した GCCUCCAGGACCCCに対
するアンチセンス核酸を有するアンチセンス化合物が他
の領域に対するアンチセンス核酸に比較し、極めて高い
翻訳阻害活性を示すことが確認された。以下、実施例に
沿って本発明を詳細に説明する。
液を用いた無細胞翻訳系において、HCV-RNAよりHCVコア
蛋白を発現させ、この反応系に本発明のアンチセンスＤ
ＮＡ等を加えてＨＣＶ由来の蛋白発現に阻害がかかるか
どうかをみた結果、上記に示した GCCUCCAGGACCCCに対
するアンチセンス核酸を有するアンチセンス化合物が他
の領域に対するアンチセンス核酸に比較し、極めて高い
翻訳阻害活性を示すことが確認された。以下、実施例に
沿って本発明を詳細に説明する。
【００２４】
【実施例】1. In vitro translationに用いるためのＣ型肝炎ウイ
ルス（HCV）RNAの調製 HCV遺伝子配列の塩基番号1-686と相同な配列を持つRNA
を、In vitro translation に用いるため3'末端に終
止コドン（TGA）を付加させた形で以下の方法により調
製した。
ルス（HCV）RNAの調製 HCV遺伝子配列の塩基番号1-686と相同な配列を持つRNA
を、In vitro translation に用いるため3'末端に終
止コドン（TGA）を付加させた形で以下の方法により調
製した。
【００２５】(1) Polymerase Chain Reaction（PCR）
用鋳型のHCV-cDNAの調製 本発明者らが一人の日本人Ｃ型肝炎患者血清よりクロー
ニングしたHCV全長アミノ酸をコードしていると考えら
れるcDNAの塩基配列をもとに、既知の方法を用いて341
塩基のHCV遺伝子5'非翻訳領域全長と本研究に必要な145
塩基のコア領域5'端側が連続する686塩基を含むcDNAを
クローニングして、下記(3)で行ったPCRの鋳型とした。
用鋳型のHCV-cDNAの調製 本発明者らが一人の日本人Ｃ型肝炎患者血清よりクロー
ニングしたHCV全長アミノ酸をコードしていると考えら
れるcDNAの塩基配列をもとに、既知の方法を用いて341
塩基のHCV遺伝子5'非翻訳領域全長と本研究に必要な145
塩基のコア領域5'端側が連続する686塩基を含むcDNAを
クローニングして、下記(3)で行ったPCRの鋳型とした。
【００２６】(2) PCR用プライマーの調製 5'末端より、EcoRI切断部位を含む7塩基、T7プロモータ
ーとして機能する20塩基、HCV配列の1-14までの14塩
基、の順に並んだ41塩基をセンスのプライマーとして、
5'末端より、EcoRI切断部位を含む9塩基、終止コドン
（TGA）の相補鎖である3塩基、HCV配列の672-686の部分
の相補配列である15塩基の順に並んだ27塩基をアンチセ
ンスのプライマーとして、それぞれMilliGen / Biosear
ch 社製 Cyclone Plus DNA Synthesizer を用いて
固相化ホスホアミダイト法により合成した。得られたセ
ンス及びアンチセンスのプライマーをそれぞれ Sy-NC-
1及びSy-CR-1と命名した。図１にその配列を示す。
ーとして機能する20塩基、HCV配列の1-14までの14塩
基、の順に並んだ41塩基をセンスのプライマーとして、
5'末端より、EcoRI切断部位を含む9塩基、終止コドン
（TGA）の相補鎖である3塩基、HCV配列の672-686の部分
の相補配列である15塩基の順に並んだ27塩基をアンチセ
ンスのプライマーとして、それぞれMilliGen / Biosear
ch 社製 Cyclone Plus DNA Synthesizer を用いて
固相化ホスホアミダイト法により合成した。得られたセ
ンス及びアンチセンスのプライマーをそれぞれ Sy-NC-
1及びSy-CR-1と命名した。図１にその配列を示す。
【００２７】(3) PCRによるRNA合成鋳型DNAの調製 上記(1)に記されたcDNAを鋳型とし、上記(2)に記された
Sy-NC-1及びSy-CR-1のプライマーにてPCR（20サイク
ル）を行った。PCRは変性：94℃1分、アニール：55℃2
分、ポリメラーゼ反応：72℃2分の反応組成にて行っ
た。得られたDNA断片をEcoRIにて処理し、pUC19のEcoRI
サイトに挿入して大腸菌JM109株を常法によりトランス
フォームした。コロニーとして得られた複数のクローン
より調製した組換えプラスミドの挿入部位をジデオキシ
法にてシークエンスを行って、すべてのクローン由来の
プラスミドにて挿入された686塩基のHCV由来の配列が鋳
型としたcDNAの対応する領域と一致することを確認し
た。それらのうちのひとつのクローンよりプラスミドを
pUIA1と名付けた。
Sy-NC-1及びSy-CR-1のプライマーにてPCR（20サイク
ル）を行った。PCRは変性：94℃1分、アニール：55℃2
分、ポリメラーゼ反応：72℃2分の反応組成にて行っ
た。得られたDNA断片をEcoRIにて処理し、pUC19のEcoRI
サイトに挿入して大腸菌JM109株を常法によりトランス
フォームした。コロニーとして得られた複数のクローン
より調製した組換えプラスミドの挿入部位をジデオキシ
法にてシークエンスを行って、すべてのクローン由来の
プラスミドにて挿入された686塩基のHCV由来の配列が鋳
型としたcDNAの対応する領域と一致することを確認し
た。それらのうちのひとつのクローンよりプラスミドを
pUIA1と名付けた。
【００２８】(4) HCV遺伝子配列の一部を持つRNAの調製 pUIA1を大量調製して挿入されたフラグメントをEcoRIに
て切り出し、これを鋳型として、MEGAscript in vitr
o Transcription Kit(Ambion社)を用いてRNA合成を行
い、5'側よりHCV配列の1-686の部分、終止コドン（UG
A）、EcoRI切断部位を含む９塩基、の順に並んだ698塩
基のRNA断片を得た。この断片をR-IA-1と命名した。R-I
A-Iの配列の内、HCV由来の686塩基の配列を図２に示
す。
て切り出し、これを鋳型として、MEGAscript in vitr
o Transcription Kit(Ambion社)を用いてRNA合成を行
い、5'側よりHCV配列の1-686の部分、終止コドン（UG
A）、EcoRI切断部位を含む９塩基、の順に並んだ698塩
基のRNA断片を得た。この断片をR-IA-1と命名した。R-I
A-Iの配列の内、HCV由来の686塩基の配列を図２に示
す。
【００２９】2. 無細胞翻訳系によるHCVコア蛋白の合成 R-IA-1より、ウサギ網状赤血球抽出液を用いてHCVコア
蛋白を以下の方法により無細胞的に翻訳し、発現をELIS
Aにより確認した。
蛋白を以下の方法により無細胞的に翻訳し、発現をELIS
Aにより確認した。
【００３０】(1) HCVコア蛋白を定量するためのELISA系
の構築 HCVのコア領域を従来法にて大腸菌で直接発現させた。
得られた発現蛋白をマウスに免疫し、従来法にてIgM型
であるRJC4-1、IgGであるRJC4-2の二種類のモノクロー
ナル抗体を得た。RJC4-1を10mMPBSに希釈しマキソープ
イモビュランプレートの各ウェルに50μg/mlの濃度で50
μl加え、4℃に一夜放置して固相化した後、ウェルより
抗体溶液を吸引除去した。次に、1%牛血清アルブミンの
溶解したPBSを各ウェル150μl加えて4℃に一夜放置して
ブロッキングを行った後、洗浄操作を行った。次に被験
物質であるウサギ網状血球抽出液にて合成した上記コア
蛋白を1%牛血清アルブミンの溶解したPBSにて適当な濃
度に希釈して50μl加え、室温で2時間反応させた後、洗
浄操作を行った。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼを
結合させたRJC4-2抗体を50μl加え、37℃で1時間反応さ
せた後、洗浄操作を行った。次に、3,3',5,5'-テトラメ
チルベンジジン溶液を50μl加え、室温にて、暗所で15
分反応させた後、1N硫酸で反応を止め、直ちに450nmの
吸光度を測定した。その結果、上記ELISAの系にてHCVコ
ア蛋白の定量が可能であることが示された。
の構築 HCVのコア領域を従来法にて大腸菌で直接発現させた。
得られた発現蛋白をマウスに免疫し、従来法にてIgM型
であるRJC4-1、IgGであるRJC4-2の二種類のモノクロー
ナル抗体を得た。RJC4-1を10mMPBSに希釈しマキソープ
イモビュランプレートの各ウェルに50μg/mlの濃度で50
μl加え、4℃に一夜放置して固相化した後、ウェルより
抗体溶液を吸引除去した。次に、1%牛血清アルブミンの
溶解したPBSを各ウェル150μl加えて4℃に一夜放置して
ブロッキングを行った後、洗浄操作を行った。次に被験
物質であるウサギ網状血球抽出液にて合成した上記コア
蛋白を1%牛血清アルブミンの溶解したPBSにて適当な濃
度に希釈して50μl加え、室温で2時間反応させた後、洗
浄操作を行った。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼを
結合させたRJC4-2抗体を50μl加え、37℃で1時間反応さ
せた後、洗浄操作を行った。次に、3,3',5,5'-テトラメ
チルベンジジン溶液を50μl加え、室温にて、暗所で15
分反応させた後、1N硫酸で反応を止め、直ちに450nmの
吸光度を測定した。その結果、上記ELISAの系にてHCVコ
ア蛋白の定量が可能であることが示された。
【００３１】(2) ウサギ網状赤血球抽出液によるHCVコ
ア蛋白の発現 20pmolのR-IA-1が10μlのTEに溶解している溶液、なら
びに全くRNAの溶解していない10μlのTE溶液に最終濃度
10μMの メチオニン溶液を2μl加え、さらにこの12μl
の混合溶液に20μlのウサギ網状赤血球抽出液（In vit
ro translationkit : STARATAGENE社）を加えて30℃で
2時間インキュベイトした。この反応液を段階希釈し、
上記ELISAにてコア蛋白量を定量したところ、陽性コン
トロールではHCVコア蛋白が合成されていることを確認
したが、陰性コントロールではHCVコア蛋白は見出され
なかった。
ア蛋白の発現 20pmolのR-IA-1が10μlのTEに溶解している溶液、なら
びに全くRNAの溶解していない10μlのTE溶液に最終濃度
10μMの メチオニン溶液を2μl加え、さらにこの12μl
の混合溶液に20μlのウサギ網状赤血球抽出液（In vit
ro translationkit : STARATAGENE社）を加えて30℃で
2時間インキュベイトした。この反応液を段階希釈し、
上記ELISAにてコア蛋白量を定量したところ、陽性コン
トロールではHCVコア蛋白が合成されていることを確認
したが、陰性コントロールではHCVコア蛋白は見出され
なかった。
【００３２】3. アンチセンス化合物のターゲット領域
の探索 HCV-RNAの5'非翻訳領域のうち、アンチセンス化合物が
結合することにより蛋白合成に他の領域に較べて強く阻
害がかかると考えられるような領域を以下に述べる方法
にて探索した。
の探索 HCV-RNAの5'非翻訳領域のうち、アンチセンス化合物が
結合することにより蛋白合成に他の領域に較べて強く阻
害がかかると考えられるような領域を以下に述べる方法
にて探索した。
【００３３】(1) 合成アンチセンスDNAの調製 アンチセンスDNAは、MilliGen / Biosearch 社製 Cyclo
ne Plus DNA Synthesizer を用いて固相化ホスホア
ミダイト法により合成した。得られたDNA溶液中のRNA分
解酵素を失活させるためにフェノール処理を行い、エタ
ノール沈殿法により沈殿させた後、10mM Tris-HCl(pH
8.0) , 1mM EDTA溶液（TE）に適当な濃度に溶解させ使
用した。今回合成したアンチセンスDNAは長さがそれぞ
れ20merで、対応するRNA領域の5'端の塩基の図２での塩
基番号の前にCAS-という文字を入れ、そのアンチセンス
DNAに対する命名とした。
ne Plus DNA Synthesizer を用いて固相化ホスホア
ミダイト法により合成した。得られたDNA溶液中のRNA分
解酵素を失活させるためにフェノール処理を行い、エタ
ノール沈殿法により沈殿させた後、10mM Tris-HCl(pH
8.0) , 1mM EDTA溶液（TE）に適当な濃度に溶解させ使
用した。今回合成したアンチセンスDNAは長さがそれぞ
れ20merで、対応するRNA領域の5'端の塩基の図２での塩
基番号の前にCAS-という文字を入れ、そのアンチセンス
DNAに対する命名とした。
【００３４】(2) 阻害度の評価法 20pmolのR-IA-1及び100pmolの評価対象となるアンチセ
ンスDNAを最終容積10μlのTE中で混合して室温で10分放
置する。この溶液に2μlの10mM メチオニンを加え、さ
らにこの12μlの混合溶液に20μlのウサギ網状赤血球抽
出液（In vitrotranslation kit : STARATAGENE社）
を加えて30℃で2時間インキュベイトした。反応終了
後、溶液中にて合成されたコア蛋白量を上記ELISAにて
定量し、アンチセンスDNAが最初のTE中に存在しなかっ
た場合のコア蛋白合成量に対する比を求め、この比を1
より減じて得られた数値を%で表示して阻害度とする。
ンスDNAを最終容積10μlのTE中で混合して室温で10分放
置する。この溶液に2μlの10mM メチオニンを加え、さ
らにこの12μlの混合溶液に20μlのウサギ網状赤血球抽
出液（In vitrotranslation kit : STARATAGENE社）
を加えて30℃で2時間インキュベイトした。反応終了
後、溶液中にて合成されたコア蛋白量を上記ELISAにて
定量し、アンチセンスDNAが最初のTE中に存在しなかっ
た場合のコア蛋白合成量に対する比を求め、この比を1
より減じて得られた数値を%で表示して阻害度とする。
【００３５】(3) 阻害領域の大まかな探索 HCV-RNAの塩基番号1-20までの配列と相補的な20merの合
成DNAであるCAS-1を合成し、次に対応領域を3'側に9塩
基ずらした塩基番号10-29までと相補的なCAS-10を合成
した。以下同様にして対応領域を3'側に10塩基ずつずら
して相補的な20merのアンチセンス合成DNAをCAS-320ま
で合計33種類合成しそれぞれの阻害効果を評価したとこ
ろ、CAS-110が70％以上の阻害度を示し、他と比較して
非常に高かった。
成DNAであるCAS-1を合成し、次に対応領域を3'側に9塩
基ずらした塩基番号10-29までと相補的なCAS-10を合成
した。以下同様にして対応領域を3'側に10塩基ずつずら
して相補的な20merのアンチセンス合成DNAをCAS-320ま
で合計33種類合成しそれぞれの阻害効果を評価したとこ
ろ、CAS-110が70％以上の阻害度を示し、他と比較して
非常に高かった。
【００３６】(4) 塩基番号110-129付近の詳しい解析 阻害効果の高かったCAS-110と相補的な塩基番号110-129
付近について詳しく解析するため、CAS-100とCAS-110の
対応領域の間を2塩基ずづに区切ってCAS-102、CAS-10
4、CAS-106、CAS-108の4種類の20merのアンチセンスDNA
を合成し、さらにCAS-110とCAS-120の対応領域の間につ
いても同様にしてCAS-112、CAS-114、CAS-116、CAS-118
の4種類を合成した。新しく合成したアンチセンスDNAに
ついて上記の方法にて阻害効果の評価を行った結果、対
応領域が連続するCAS-104、CAS-106、CAS-108の3種類の
アンチセンスDNAが70％以上の高い阻害度を示した。前
の結果と合わせると、CAS-104、CAS-106、CAS-108、CAS
-110の対応領域が連続する4種類の20merのアンチセンス
DNAが70％の高い阻害度を示したこととなり、塩基番号1
04から129の26塩基の範囲の連続する20塩基と相補的な
アンチセンスDNAは、5'NCRの他の領域と相補的なアンチ
センスDNAと比較してHCV-RNAに対し、強い翻訳阻害効果
を持つことが示された。
付近について詳しく解析するため、CAS-100とCAS-110の
対応領域の間を2塩基ずづに区切ってCAS-102、CAS-10
4、CAS-106、CAS-108の4種類の20merのアンチセンスDNA
を合成し、さらにCAS-110とCAS-120の対応領域の間につ
いても同様にしてCAS-112、CAS-114、CAS-116、CAS-118
の4種類を合成した。新しく合成したアンチセンスDNAに
ついて上記の方法にて阻害効果の評価を行った結果、対
応領域が連続するCAS-104、CAS-106、CAS-108の3種類の
アンチセンスDNAが70％以上の高い阻害度を示した。前
の結果と合わせると、CAS-104、CAS-106、CAS-108、CAS
-110の対応領域が連続する4種類の20merのアンチセンス
DNAが70％の高い阻害度を示したこととなり、塩基番号1
04から129の26塩基の範囲の連続する20塩基と相補的な
アンチセンスDNAは、5'NCRの他の領域と相補的なアンチ
センスDNAと比較してHCV-RNAに対し、強い翻訳阻害効果
を持つことが示された。
【００３７】(5) 塩基番号119をイノシンに置換したア
ンチセンスDNAの評価 塩基番号119のアデニンはHCV株間で変異率の高いことが
知られているので、この位置をイノシンに置換すること
で複数のウイルス株に効果を持つように出来ないかどう
かを以下に述べるような方法で調べた。CAS-110の配列
中、塩基番号119のアデニンに対応するチミンをイノシ
ンに置換したCAS-110-I-119と、対照として上記チミン
をグアニンに置換して人為的にミスマッチを導入したCA
S-110-G-119を合成し、この二つのアンチセンスDNAの阻
害度を評価したところ、CAS-110-I-119はCAS-110と同程
度の70%以上の高い阻害度を示したが、CAS-110-G-119で
は著しく減少した。この結果より上記チミンをイノシン
に置換することにより、今回実験に用いた配列をもつウ
イルス株と比較して119番のアデニンが他の塩基に置換
されている他のウイルス株に対しても効果を期待しうる
ことが示された。今回合成した43種類それぞれのアンチ
センスDNAの配列を図３に記す。
ンチセンスDNAの評価 塩基番号119のアデニンはHCV株間で変異率の高いことが
知られているので、この位置をイノシンに置換すること
で複数のウイルス株に効果を持つように出来ないかどう
かを以下に述べるような方法で調べた。CAS-110の配列
中、塩基番号119のアデニンに対応するチミンをイノシ
ンに置換したCAS-110-I-119と、対照として上記チミン
をグアニンに置換して人為的にミスマッチを導入したCA
S-110-G-119を合成し、この二つのアンチセンスDNAの阻
害度を評価したところ、CAS-110-I-119はCAS-110と同程
度の70%以上の高い阻害度を示したが、CAS-110-G-119で
は著しく減少した。この結果より上記チミンをイノシン
に置換することにより、今回実験に用いた配列をもつウ
イルス株と比較して119番のアデニンが他の塩基に置換
されている他のウイルス株に対しても効果を期待しうる
ことが示された。今回合成した43種類それぞれのアンチ
センスDNAの配列を図３に記す。
【００３８】
配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源、生物名：Ｃ型肝ウイルス 配列 GCCUCCAGGACCCC
【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源、生物名：Ｃ型肝炎ウイルス 配列 CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC
【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 ＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧ
【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 ＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡ
【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AGGGGGGGTCCTGGAGGCTG
【００４３】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GGAGGGGGGGTCCTGGAGGC
【図１】 HCV-RNAの塩基配列中の配列番号1-686に対応
するHCV-cDNAをクローニングし、あわせて5'側にT7プロ
モーター、3'側に終止コドン（TGA）を付加させるため
のPCRプライマー（センスとアンチセンス）の塩基配列
を示す。
するHCV-cDNAをクローニングし、あわせて5'側にT7プロ
モーター、3'側に終止コドン（TGA）を付加させるため
のPCRプライマー（センスとアンチセンス）の塩基配列
を示す。
【図２】 HCV-RNAの塩基配列中の配列番号1-686に対応
する塩基配列を表す。
する塩基配列を表す。
【図３】 実施例中で評価したアンチセンスオリゴヌク
レオチドの名前と配列を表す。
レオチドの名前と配列を表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ (72)発明者 星子 和哉 熊本県菊池郡合志町幾久富字建山1909−47 ベルテック武蔵野台Ａ−102 (72)発明者 野崎 周英 熊本県熊本市武蔵ケ丘１−444 (72)発明者 西原 司 熊本県熊本市龍田町上立田1749−６ (72)発明者 中武 博 熊本県菊池郡菊陽町津久礼2333−15 松本 ハイツ202号 (72)発明者 濱田 福三郎 熊本県菊池郡西合志町須屋2679−２
Claims (8)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの塩基配列のう
ち、5'非翻訳領域に存在する下記の塩基配列（Ａ）もし
くはこの塩基配列に相同性の高い塩基配列とハイブリッ
ドしうることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 （Ａ）GCCUCCAGGACCCC - 【請求項２】 該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１
４個の塩基を有する請求項１のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 該オリゴヌクレオチドが、上記の塩基配
列（Ａ）に対するアンチセンス塩基配列を少なくとも含
む請求項１のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 該オリゴヌクレオチドが、上記の塩基配
列（Ａ）に対するアンチセンス塩基配列を有する２０個
の塩基を有する核酸化合物である請求項３のオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項５】 該オリゴヌクレオチドが、少なくとも上
記配列（Ａ）に対するアンチセンス塩基配列を有し、さ
らに下記の塩基配列（Ｂ）中の連続した１４〜２６個の
核酸に相補的なアンチセンス塩基配列を有する請求項３
のオリゴヌクレオチド。 （Ｂ） CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC （下線部は上記
配列（Ａ）） - 【請求項６】 該オリゴヌクレオチドが、化学修飾され
た化合物である請求項１のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 該オリゴヌクレオチドが、フォスフォロ
チオエート化された化合物である請求項６のオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴ
ヌクレオチドを有効成分とするＣ型肝炎治療剤。
Priority Applications (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5087195A JPH06296492A (ja) | 1993-04-14 | 1993-04-14 | 抗ｃ型肝炎ウイルスオリゴヌクレオチド |
| NZ255578A NZ255578A (en) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Antisense oligonucleotides complementary and hybridizable to a portion of hepatitis c virus and their use in treating hepatitis c virus associated diseases |
| DK93919644T DK0662157T3 (da) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Præparater og fremgangsmåde til behandling af Hepatitis C-virus-associerede sygdomme |
| US08/397,220 US6284458B1 (en) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Compositions and methods for treatment of hepatitis C virus-associated diseases |
| DE69330372T DE69330372T2 (de) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN FüR DIE BEHANDLUNG VON MIT HEPATITIS C VIREN ASSOZIIERTEN KRANKHEITEN |
| AT93919644T ATE202383T1 (de) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Zusammensetzungen und verfahren für die behandlung von mit hepatitis c viren assoziierten krankheiten |
| PCT/JP1993/001293 WO1994005813A1 (en) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Compositions and methods for treatment of hepatitis c virus-associated diseases |
| AU49837/93A AU680435B2 (en) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Compositions and methods for treatment of hepatitis C virus-associated diseases |
| EP93919644A EP0662157B1 (en) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Compositions and methods for treatment of hepatitis c virus-associated diseases |
| CA002143678A CA2143678A1 (en) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Compositions and methods for treatment of hepatitis c virus-associated diseases |
| NZ286209A NZ286209A (en) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Use of HCV RNA anti-sense nucleotide sequences for treating Hepatitis C virus related disease |
| JP6507055A JPH08506479A (ja) | 1992-09-10 | 1993-09-10 | Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患の治療のための組成物および方法 |
| US10/457,304 US20040033978A1 (en) | 1992-09-10 | 2003-06-09 | Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases |
| JP2004268347A JP3803354B2 (ja) | 1992-09-10 | 2004-09-15 | Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患の治療のための組成物および方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5087195A JPH06296492A (ja) | 1993-04-14 | 1993-04-14 | 抗ｃ型肝炎ウイルスオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06296492A true JPH06296492A (ja) | 1994-10-25 |
Family
ID=13908209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5087195A Withdrawn JPH06296492A (ja) | 1992-09-10 | 1993-04-14 | 抗ｃ型肝炎ウイルスオリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06296492A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008283975A (ja) * | 2002-02-20 | 2008-11-27 | Sirna Therapeutics Inc | 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 |
-
1993
- 1993-04-14 JP JP5087195A patent/JPH06296492A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008283975A (ja) * | 2002-02-20 | 2008-11-27 | Sirna Therapeutics Inc | 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 |
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|---|---|---|---|
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