JPH08506723A - アポリポ蛋白質ａｉ−ｍを製造するための発現方式 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は大腸菌を使用するアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ（ミラノ）の高い細胞外製造を付与する発現方式に関しそして複製原点を支持するプラスミド、誘起可能なプロモーターシーケンス、信号ペプチド用のＤＮＡシーケンス符号化、アポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ用のＤＮＡシーケンス符号化、および転写終了暗号からなる。本発明はまたその発現方式を使用するアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍを製造する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 アポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍを製造するための発現方式 技術分野 本発明はアポリポ蛋白質ＡＩミラノ（Ａｐｏ Ａｉ−Ｍ）を製造するために大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培地中に高いレベルの蛋白質を生じる発現方式に関する 。その製品はアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療に使用され得る 。 発明の背景 高められたレベルの血清コレステロールと冠状動脈心臓疾患（ＣＨＤ）の発生 との間の明瞭な相互関係が、疫学的かつ長期的な研究に基づいて、繰り返し確認 された。しかしながら、プラズマ中のコレステロール搬送の複雑なメカニズムの 定義はＣＨＤの危険を決定することにおいて循環リポ蛋白質の選択的な機能の確 認を与えた。 事実上、４つの主要な循環リポ蛋白質、すなわち、キロミクロン（ＣＭ）、非 常に低い密度（ＶＬＤＬ）、低い密度（ＬＤＬ）および高い密度（ＨＤＬ）リポ 蛋白質がある。ＣＭは腸脂肪吸収の短命な製品を構成するが、ＶＬＤＬおよびＬ ＤＬはそれらの間に対して、組織に、また動脈壁に対してコレステロール搬送の 原因となる。これに反して、ＨＤＬは周辺組織からのコレステロールの除去に直 接関連しており、「逆コレステロール搬送」（ＲＣＴ）として知られるメカニズ ムにより、肝臓また は他のリポ蛋白質にコレステロールを運び戻す。 ＨＤＬの「保護的」役割は多くの研究において確認された（例えば、ミラー氏 等著、（１９７７年）、ランセツト、第９６５頁乃至第９６８頁およびホワイン 氏等著、（１９８１年）、アテローム性動脈硬化症、第３９巻第４１１頁乃至第 ４１９頁）。これらの研究において、ＶＬＤＬのものより少ない、高められたＬ ＤＬのレベルは増加された心臓血管疾患の危険と関連付けられるが、高いＨＤＬ レベルは心臓血管疾患の保護を付与すると思われる。ＨＤＬの保護的役割はさら に、ラビツトへのＨＤＬ注入がコレステロール誘起の動脈障害の発生を妨げ得る ことを（バデイモン氏等著、（１９８９年）、実験研究論文、第６０巻、第４５ ５頁乃至第４６１頁）および／またはこれらの逆行を誘起し得ること（バデイモ ン氏等著（１９９０年）、臨床研究論文、第８５巻、第１２３４頁乃至第１２４ １頁）を示す生体内研究により強力に支持された。 ＨＤＬの保護メカニズムの研究における最近の関心はアポリポ蛋白質ＡＩ（Ａ ｐｏ ＡＩ）、即ちＨＤＬの主要蛋白質成分に焦点が合わせられている。Ａｐｏ ＡＩの高いプラズマレベルは減少されたＣＨＤの危険および冠状動脈障害の存在 と関連付けられている（マシジユコ氏等著、（１９８３年）、イギリス国内医療 ジャーナル、第３０９巻、第３８５頁乃至第３８９頁、セドリス氏等著、（１９ ８６年）、サーキユレーシヨン、第７３巻、 第９７８頁乃至第９８４頁）。 ヒトアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ）はＡｐｏ ＡＩの天然 の変異体である（ワイスグレーバー氏等著、（１９８０年）、臨床研究ジャーナ ル、第６６巻、第９０１頁乃至第９０７頁）。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍにおいてアミノ 酸Ａｒｇ１７３はアミノ酸Ｃｙｓ１７３に置き換えられる。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍは １つのＣｙｓ残留物／ポリペプチド鎖を含むので、単量体または二量体形状で存 在する。これら２つの形状は化学的に交換可能で、そして用語Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ は本明細書中において、これら２つの形状間で区別しない。ＤＮＡレベルに関し て変化はＣ−＞Ｔ遷移のみであり、すなわちコドンＣＧＣがＴＧＣに変化した。 しかしながら、このＡｐｏ ＡＩの変異体は、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ本体がＨＤＬコ レステロールレベルのかなりの減少により、しかも明らかに増加した動脈疾患の 危険なしに特徴付けられることにより、最も関心のある変異体の１つである（フ ランセシニ氏等著、（１９８０年）、臨床研究ジャーナル、第６６巻、第８９２ 頁乃至９００頁）。系統樹の検査により、これらの主体はアテローム性動脈硬化 症から「保護」されたと思われる。ヒト成熟Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ− Ｍは２４３個のアミノ酸からなる。それらは先駆蛋白質、２６７個のアミノ酸か らなるプレプロＡｐｏ ＡＩおよびプレプロＡｐｏ ＡＩ−Ｍとして合成されて いる。１８個のアミノ酸ペプチドが６個のアミノ酸の延長を有 する先駆蛋白質を残す分泌組織において切り裂かれる。プロＡｐｏ ＡＩおよび プロＡｐｏ ＡＩ−Ｍは次いでプラズマ蛋白質分解活性により成熟した形状に変 換される。 組み換えＤＮＡ技術によつてヒトＡｐｏ ＡＩを製造することが試みられてい る。ヨーロツパ特許第０２６７７０３号明細書には、大腸菌からのＡｐｏ ＡＩ の製造が記載されている。その方法はＡｐｏ ＡＩの１部分がβガラクトシダー ゼのＮ−端末アミノ酸残留物にまたは蛋白質Ａの１またはそれ以上のＩｇＧ−結 合領域に、またはヒトＡｐｏ ＡＩの先駆プロシーケンスに溶解される空想的な ポリペプチドを記載している。イースト菌株中のＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ Ａ Ｉ−Ｍの発現およびアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療における 製造された成分の使用は国際特許出願公開第ＷＯ９０／１２８７９号公報に開示 されている。 Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ−Ｍを符号化する遺伝子はイーストを認知し 得る分泌（変性されたＭＦアルファ−１リーダーシーケンスを包含する）を符号 化しかつ成熟した蛋白質用の遺伝子の上流に溶解された信号を処理するＤＮＡシ ーケンスを備えた。 Ａｐｏ ＡＩを製造する大腸菌方式はホツペ氏等著、（１９９１年）、生物化 学ジャーナル、第３７２巻、第２２５頁乃至第２３４頁に記載されている。この 方式に記載された発現レベルは０．３〜４．８ｍｇ／リツトル 培地の間の範囲にある。その方法は細胞内発現に基礎を置いている。 Ａｐｏ ＡＩはまた細胞内発現方式においてβ−ガラクトシダーゼへの融解蛋 白質として製造された（ロレンツエツテイ氏等著、（１９８６年）、ＦＥＢＳ通 信、第１９４巻、第３４３頁乃至第３４６頁）。生産レベルは約５ｍｇ／１バク テリア培養であつた。この研究において大腸菌中の発現の効率への遺伝子の５’ 端の影響が分析された。ｌａｃｚ遺伝子が大腸菌中のＡｐｏ ＡＩ発現の分析用 マーカーとして使用された（イサツチ氏等著、（１９８９年）、遺伝子、第８１ 巻、第１２９頁乃至１３７頁）。 アポリポ蛋白質Ａ１およびアポリポ蛋白質Ａ１−Ｍに関する約５ｍｇ／リツト ル成長媒体の以前に開示された生産レベルはそれらを経済的に引き付けるには余 りにも低い。 アポリポ蛋白質Ｅの分泌製造に関する発現方式はヨーロツパ特許第３４５１５ ５号明細書に記載されている。 この方法においてアポリポ蛋白質Ｅが大腸菌中で製造され、その後ペリプラズム 中に回収され得る。０．１５〜０．４５ｇ／リツトルまでの収率が予想されるが しかし立証されていない。 発明の概要 本発明の目的は、以前に得られた収率よりかなり高い収率において、組み換え ＤＮＡ技術によるアポリポ蛋白 質ＡＩ−Ｍ（ミラノ）、以下Ａｐｏ ＡＩ−Ｍと呼ぶ、の製造を提供することに ある。本発明によればＡｐｏＡＩ−Ｍ／リツトルより約１０００倍までの、すな わち少なくとも４．５ｇ／リツトルまでのＡｐｏ ＡＩ−Ｍが、従来の生物化学 方法により純化され得るバクテリア培地に分泌されている大腸菌中に誘起し得る 発現方式により得られることが見出された。 本発明の特徴はペプチドを成長媒体中に分泌させ得る信号シーケンスにより率 いられるＡｐｏ ＡＩ−Ｍ用遺伝子からなる構造遺伝子を調整する誘起可能なプ ロモーターである。誘起後に該方式はまた、１．５ｇ〜４．５ｇＡｐｏ ＡＩ− Ｍ／成長媒体のリツトルの範囲において、異常に高い発現レベルを特徴とするも のである。最適な製品品質を達成するために、しかしながら、採収は最大収率が 達成される前に行われ得る。 生物化学分析は製造された蛋白質のＮ−およびＣ−端末アミノ酸シーケンスお よび合計アミノ酸組成がプラズマから分離されたヒトＡｐｏ ＡＩ−Ｍと同一で あることを示した。円形二色スペクトル分析は組み換えＡｐｏ ＡＩ−Ｍおよび ヒトＡｐｏ ＡＩの同様のシワを示唆する。 本発明の１つの態様はしたがつて大腸菌を使用するＡｐｏ ＡＩ−Ｍの細胞外 製造を付与する新規な発現ベクトルに関し、該ベクトルが適切な複製原点を支持 するプラスミド、誘起可能なプロモーターシーケンス、信号ペ プチド用のＤＮＡシーケンス符号化、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ用のＤＮＡシーケンス符 号化、および転写終了暗号からなっている。 本発明にしたがつて変性されような適切な基本プラスミドは以前に記載されか つ組み換え方法に使用される良く知られたプラスミドから選択され得る。 本明細書で使用されるような用語Ａｐｏ ＡＩ−Ｍは広い意味において解釈さ れるものとしかつまたＡｐｏＡＩ−Ｍ蛋白質の機能的変異体および断片を含むも のを意味する。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ用のＤＮＡシーケンス符号化はプレプロ蛋白質 、プロ蛋白質または好ましくは成熟した蛋白質用のｃＤＮＡシーケンス符号化で あつても良い。 強力な誘起可能な大腸菌プロモーターはそれ自体従来技術において良く知られ ている。例として記載することができるのは、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ −チオガラクトシド）により誘起されるｌａｃプロモーター、トリプトフアンに より抑えられかつ３−インドリル酢酸により誘起されるｔｒｐプロモーター、Ｉ ＰＴＧにより誘起され得るｔｒｃまたはｔａｃプロモーター（ｔｒｐとｌａｃと の間の混成物）、および感温ラムダ抑制体ｃＩ８５７と組み合わせて、３０℃以 上の温度で誘起され得るラムダ−Ｐ_LまたはラムダＰ_Rプロモーター、ならびにこ れらのプロモーターの機能的派生物である。現在好適なプロモーターはｔｒｃプ ロモーターである。 本発明において使用可能である信号ペプチドは当該技術において良く知られか つ本発明がいつたん知らされれば当該技術に熟練した者により容易に選択され得 る。例としてｏｍｐＡ信号シーケンスの派生物を記載することができる。 本発明に使用され得る終了暗号は当該技術において良く知られた終了暗号から 熟練者によつて容易に選択され得る。 本発明の他の態様は発現ベクトル、すなわち発現方式により変換される大腸菌 寄生微生物に関する。適切な大腸菌菌株は熟練者には容易に明らかである。 本発明のさらに他の態様は、 成長媒体中に変換された寄生微生物を培養し、 固定相が達成される前に対数成長相中にＡｐｏ ＡＩ−Ｍの発現を誘起し、そ して 成長媒体から製品を分離する工程からなる、ＡｐｏＡＩ−Ｍを製造する方法に 関する。 誘起に適切な時間、最適温度変化および採収は以下で記載されるように選ばれ る。 １実施例において、培養を約２９から約３１℃の低い温度で、好ましくは約３ ０℃で開始し、そして温度をその場合に固定成長相が達成される前に約３７℃に 上昇させる（対数成長相において）。この温度上昇は発現ベクトルの誘起に関連 して行われ得るが、また、誘起前または後に、すなわち誘起前または約３時間で 行うことがで きる。 好ましくは、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ製品の発現を誘起し、そして温度を、少なくと も５０の最適密度（Ｏ．Ｄ）、例えば約５０ないし約１００の範囲において、Ｏ ．Ｄ．が達成されるとき上昇させる。本明細書において、これは誘起および温度 上昇が培養の開始から約１５時間ないし２０時間で行われることを通常意味して いる。 他の実施例において、醗酵を一定温度において、例えば約２５から約３７℃の 範囲において行う。 採収は好ましくは最適細胞培養状態で行われる。 成長媒体は好ましくはトリプトンにより適切に補われた、イースト抽出物から なる。最適には、製造媒体は抗生物質がない。 図面の簡単な説明 第１図はバクテリア信号シーケンスを符号化するＤＮＡ断片へのＡｐｏ ＡＩ −Ｍ遺伝子のｃＤＮＡ複写の溶解に使用される２つのオリゴヌクレオチドを示す 図である。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドシーケンス、独特な制限酵素分裂 場所Ｅｃｏ ＲＩ，Ｂｂｃ ＩおよびＮｃｏ Ｉおよび仮定された大腸菌信号ペ プチド分裂場所（−１＋１）のまわりの導出されたアミノ酸シーケンスが同様に 示されている。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍのアミノ酸端末は＋１により示されている。 第２図はプラスミドｐＫＰ７６４用の新規な停止コドンの構成に使用される２ つのオリゴヌクレオチドを示す 図である。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの導出されたカルボキシル端末アミノ酸を有するヌ クレオチドシーケンスおよび２つの新規な停止コドンＴＡＡ，ＴＡＡが示されて いる。 第３図は導出されたアミノ酸シーケンスおよび変形された蛋白質Ａｐｏ ＡＩ −Ｍの分子量を有するプラスミドｐＫＰ６８３の９５７ｂｐＤＮＡ断片（Ｎｏｔ −１−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）を示す図である。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍのアミノ端末アミ ノ酸は＋１で示されている。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの二量重合に必須である独特なシ ステイン（Ｃｙｓ１７３）に下線を施してある。 第４図は変形された蛋白質Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの導出されたアミノ酸シーケンス および分子量を有するプラスミドｐＫＰ７６４の８５６ｂｐＤＮＡ断片（Ｎｏｔ −１−ＨｉｎｄＩＩＩ）を示す図である。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍのアミノ端末アミノ 酸は＋１で示されている。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの二量重合に必須である独特なシス テイン（Ｃｙｓ１７３）には下線を施してある。 第５図は発現ベクトルｐＫＰ６８３を示す図である。重要な構造および調整要 素はボツクスとして輪郭が描かれ、矢印はそれぞれ変換および複製の方向を示す 。独特な制限酵素場所の幾つかがプラスミド円の外部に示されている。またＮｒ ｕ Ｉの２つの場所が示されている。ボツクス内部の略号はＳ、信号シーケンス ；Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ、アポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ；Ｔ１およびＴ２、バクテリ オフアージｆｄからのＲｈｏ独立終了暗号の直 列複製；Ｋｍ、トランスポゾンＴｎ９０３から生じるカナマイシン抵抗マーカー ；Ｏｒｉ、複製の原点；ｌａｃＩＱ，（ｌａｃＩ ^q）構造的に製造されたｌａｃ −抑制体用遺伝子；Ｐｔｒｃ、ハイブリツドｔｒｐ／ｌａｃプロモーターｔｒｃ である。 第６図は発現ベクトルｐＫＰ７６４を示す図である。 重要な構造および調整要素はボツクスとして輪郭が描かれ、矢印はそれぞれ変換 および複製の方向を示す。独特な制限酵素場所の幾つかがプラスミド円の外部に 示されている。第６図に使用された略号は第５図に使用されたものと同一である 。 第７図は大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３を使用する３．５リツトルのバ イオ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号：（開放円）、 ６００ｎｍでの光学濃度；（開放ボツクス）、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ濃度（ｇ／１成 長媒体）。誘起時間（ＩＰＴＧの追加による）が矢印で示されている。 第８図は大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４を使用する３．５リツトルのバ イオ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は第７図に使用 されたものと同一である。 第９図は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ６８３を使用する３．５リツトルのバイ オ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は第７図に使用さ れたものと同一である。 第１０図は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する３．５リツトルのバ イオ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は第７図に使用 されたものと同一である。 第１１図は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する７５リツトルのバイ オ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は第７図に使用さ れたものと同一である。 第１２図は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する３００リツトルのバ イオ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は第７図に使用 されたものと同一である。 第１３図は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する３．５リツトルのバ イオ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は第７図に使用 されたものと同一である。 第１４図は大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３を使用する３．５リツトルの バイオ反応器内でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は第７図に使 用されたものと同一である。 第１５図は組み換え型Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ（太い線）およびヒトＡｐｏ ＡＩ（ 細い線）の円形２色スペクトルを示す図である。 発明を実施するための最良の形態 実施例１ ベクトルの構造および大腸菌の変換菌株およびベクトル 以下の大腸菌Ｋ１２菌株が使用された。すなわちＨＢ１０１ Ｆ^-，ｈｓｄＳ ２０（ｒＢ ^- ，ｍＢ ^-）ｓｕｐＥ４４，ａｒａ１４，ラムダ^-，ｑａｌＫ２，ｌａ ｃＹ１ ，ｐｒｏＡ２，ｒｓｐＬ２０，ｘｙ１−５，ｍｔｌ−１，ｒｅｃＡ１３，ｍｃｒＡ （＋），ｍｃｒＢ（−），（ボイヤー氏等著、（１９６９年）、微分子 生物化学ジャーナル、第４１巻、第４５９頁乃至第４７２頁）；ＤＨ５アルフア Ｆ^-，Ｆ８０ｄｌａｃＺＤＭ１５，Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｑＦ）Ｕ１６９，ｒ ｅｃＡＩ ，ｅｎｄＡＩ，ｇｙｒＡ，ラムダ^-，ｔｈｉ−Ｉ，ｈｓｄＲ１７，（ｒ _k ^- ，ｍ _k ⁺），ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡＩ，（ＢＲＬ ＵＳＡ）；ＲＶ３０８Ｄｌ ｚｃＸ７４ ，ｇａｌＯＰ：：ＩＳ２（ｑａｌＯＰ３０８），ｓｔｒＡ，ラムダ^- （モーラー氏等著、（１９８０年）、微分子生物化学ジャーナル、第１３９巻、 第１４７頁乃至第１６１頁），およびＢＣ５０ ｘｙ１−７，ａｒａ−１４，Ｔ ４−Ｒ ，ラムダ^-（カビ・フアーマシア・エービー、スウェーデン）である。菌 株ＨＢ１０１およびＤＨ５アルフアはＤＮＡ断片のサブクローニングに使用され ている。 プラスミドｐＵＣ９（ヴイエイラ氏等著、（１９８２年）、遺伝子、第１９巻 、第２５９頁乃至第２６８頁）はイタリア国、エー・シドリ所在のミラノ大学か ら得られかつシヤープ氏等著、核酸研究、（１９８４年）、第 １２巻、第３９１７頁乃至３９３２頁に記載されたヒトＡｐｏ ＡＩ ｃＤＮＡ のｃＤＮＡ複製の８４７ｂｐＢａｍ ＨＩ断片のサブクローニングに使用された 。ヒトＡｐｏ ＡＩ ｃＤＮＡのヌクレオチドシーケンスは受入れ番号Ｘ０２１ ６２によりジエンバンクデータベースから得ることができる（ザイルハンマー氏 等著、（１９８４年）、ＤＮＡ３、第３０９頁乃至第３１７頁）。このベクトル はｐＫＰ５７５と呼ばれた。また、ヒトＡｐｏ ＡＩ−Ｍ ＤＮＡ（イタリア国 、エー・シドリに所在のミラノ大学から得られた、場所指定突然変異生成により Ａｐｏ ＡＩ−Ｍに変換されたＡｐｏ ＡＩのｃＤＮＡ複製）の８８２ ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ−ＰｓｔＩ断片はプラスミドｐＵＣ９にサブクーロニングされた。 この派生物はｐＫＰ５７６と呼ばれた。以下で調製されるようなプラスミドｐＫ Ｐ６８３およびｐＫＰ７６４はプラスミドｐＴｒｃ９９（アマン氏等著、（１９ ８８年）、遺伝子、第６９巻、第３０１頁乃至第３１５頁に記載され；フアーマ シアＰ−Ｌバイオケミカルズ社、アメリカ合衆国ミルウオーキーから獲得可能） の派生物およびｐＵＣ４−Ｋ（ヴイエイラ氏等著、（１９８２年）、遺伝子、第 １９巻、第２５９頁乃至第２６８頁、およびオカ氏等著、（１９８１年）、微分 子生物化学ジャーナル、第１４７頁乃至第２１７頁）からのトランスポゾン（Ｔ ｎ９０３）派生カナマイシン抵抗マーカーおよびｐＵＥＸ２（ブレツサン氏等著 、（１９８７年）、核酸研究、 第１５巻、第１００５６頁）からのバクテリオフアージｆｄの転写終了暗号（Ｔ １Ｔ２）を有するｐＵＣ派生物である。使用された方法 バクテリア菌株をプラスミドＤＮＡの製造のためにかつ小規模発現分析（サン ブルツク氏等著、（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト リー・プレス）のためにアンピシリン（Ａｐ）５０μｇ／ｍｌまたはカナマイシ ン（Ｋｍ）７０μｇ／ｍｌを有するローリア・ベルタニ媒体（ＬＢ）またはイー ストトリプトン媒体（２ｘｙＹＴ）中で成長させた。Ａｐ５０μｇ／ｍｌまたは Ｋｍ７０μｇ／ｍｌにより補足されたトリプトース血液寒天ベース（デイフコ、 アメリカ合衆国）が寒天プレート上で細胞を成長させるために使用された。組み 換えＤＮＡ技術がサンブルツク氏等著の（１９８９年）コールド・スプリング・ ハーバー・ラボラトリー・プレスにしたがつて実施された。制限エンドヌクレア ーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼはベリンガー・マンハイム（ドイツ）、ニユー ・イングランド・バイオラブス（アメリカ合衆国ビバリー）およびフアーマシア ・エルケービー・バイオテクノロジー・エービー（スウェーデン、ウプサラ）か ら得られた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）はシグマ（ アメリカ合衆国セントルイス）から得られた。低いゲル化および溶融温度アガロ ース（ヌシーブＧＴＧ，ＦＭＣバイオプロダクツ、 アメリカ合衆国）がＤＮＡ断片を分離するために使用された。ＰＣＲ拡大がパー キン−エルマー／シータス・インスツルメンツ（アメリカ合衆国ノーウオーク） のＤＮＡ熱サイクラーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われた。 オリゴヌクレオチド結合子およびプライマーが固体相についてのホスフアイトト リエステル方法を使用するフアーマシア・エルケービー・バイオテクノロジー・ エービー（スウェーデン、ウプサラ）のフアーマシア・エルケービー・遺伝子組 立て機プラスで合成された。ヌクレオチドシーケンス決定は、アプライド・バイ オシステム社（アメリカ合衆国）のＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）終了暗号サ イクルシーケンスキツトを使用して、アプライド・バイオシステムズ３７３Ａ ＤＮＡで行われた。使用されたＤＮＡコンピユータプログラム マツキントツシユプログラムプラスミドｄＡＲＴＩＳＴ（バージヨン１．２） （クロンテツク、アメリカ合衆国）がプラスミドマツプを描くために使用されそ してＧＣＧシーケンス分析ソフトウエアパツケージ（ジエネテイクス・コンピユ ータ・グループ社、アメリカ合衆国ウイスコンシン州マジソン）がデジタルＶＡ ＸコンピユータでＤＮＡシーケンスを処理するために使用された。プラスミドｐＫＰ６８３の構造 オリゴヌクレオチドがバクテリア信号シーケンスを符号化するＤＮＡ断片にＡ ｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ −Ｍ ｃＤＮＡ複製を溶解するために合成された（第１図）。１４ ｂｐ Ｅｃ ｏ ＲＩおよびＮｃｏ Ｉ断片およびｐＫＰ５７５の４０ ｂｐ Ｎｃｏ Ｉが 合成３７ ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ−Ｎｃｏ Ｉ断片（第１図）によりｐＫＰ５８０ と呼ばれるプラスミドに置き換えられた。この合成ＤＮＡ断片中のＢｂｓ Ｉ分 裂場所はバクテリア信号シーケンスを符号化する種々の断片のクローニングを容 易にする、Ｍｌｕ Ｉと同一の分裂場所を付与する。プラスミドｐＫＰ６３１は ｐＫＰ５７５（Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ）の７０２ ｂｐＮｃｏ Ｉ−Ｄｒａ ＩＩＩ 断片によりｐＫＰ５７５（Ａｐｏ ＡＩ）の７０２ ｂｐ Ｎｃｏ Ｉ−Ｄｒａ ＩＩＩ断片を置き換えることにより構成された。プラスミドｐＫＰ６３１から ８４６ ｂｐ Ｂｂｓ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片が分離されかつｐＫＰ６８２ と呼ばれたプラスミドベクトルのＭｌｕ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ断片に挿入 された。このベクトルはｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）、ｏｍｐＡ信号シーケ ンスの派生物、２つの転写終了暗号およびカナマイシン抵抗マーカーを含んでい る。１５４１ｂｐ Ｎｒｕ Ｉ−Ｎｒｕ Ｉ断片がｐＫＰ６８２から分離されそ して同様なベクトルに挿入されたがＰｔａｃはＰｔｒｃプロモーターにより置き 換えられた。この発現ベクトルはｐＫＰ６８３と呼ばれた（第５図）。プラスミドｐＫＰ７６４の構造 プラスミドｐＫＰ７６４（第６図）は１４ ｂｐ合成 ＤＮＡ断片（第２図）により上記で製造されたプラスミドｐＫＰ６８３の１１５ ｂｐ Ｄｒａ ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を置き換え、より強力な変換終 了暗号を含みかつ３’端（第２図にＤｒａ ＩＩＩＤにより示される）に突出す るＤｒａ ＩＩＩの終わりでのＡの導入によりＤｒａ ＩＩＩ場所を破壊するこ とにより構成された。プラスミドｐＫＰ６８３およびｐＫＰ７６４による大腸菌の変換 上記で製造されたプラスミドｐＫＰ６８３およびｐＫＰ７６４はサンブルツク 氏等著の（１９８９年）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ スに記載されたように大腸菌菌株ＲＶ３０８およびＢＣ５０を変換するのに使用 された。バイオ反応器内での成長に使用されるような得られた大腸菌菌株ＲＶ３ ０８／ｐＫＰ６８３およびＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４は以下のように製造された 。細胞を３０℃でシエーカーフラスコ内でＫｍにより補足されたＬＢまたは２ｘ ＹＴ中で１晩成長させた。遠心分離後、その細胞をゲルゲン氏等著、（１９７９ 年）、核酸研究、第７巻、第２１１５頁にしたがつて１／２容量の強度の凍結貯 蔵媒体中に再び懸濁させた。部分標本を１ｍｌクリオガラス瓶に分配させかつ使 用されるまで−７５℃で貯蔵させた。プラスミドの分析 発現実験にかつＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造に使用するプ ラスミド構造を制限酵素マツピングを使用して分析させ、そしてＡｐｏ ＡＩ− Ｍの構造遺伝子をヌクレオチドシーケンス決定により確認させた。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの小規模製造 Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの小規模発現のためにＫｍで補足された２０ｍｌのＬＢまた は２ｘＹＴを２５０ｍｌのシエーカーフラスコ中で大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫ Ｐ６８３またはＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４に植え付けた。細胞を激しい振動によ り１晩３０℃で成長させた。これらの細胞を新鮮な媒体（２０ｍｌ）中に１／１ ００に希釈させそしてＩＰＴＧを０．５または１ｍＭの最終濃度に添加させたと き、約１の６００ｎｍでの光学濃度に３７℃で成長させた。細胞を追加の９０分 または１晩培養させた。細胞を遠心分離により成長媒体から分離しかつ媒体をＡ ｐｏ ＡＩ−Ｍの製造のために分析させた。媒体の部分標本をフイルタ装置に通 し、ニトロセルロースフイルタを除去しそしてＡｐｏ ＡＩ−Ｍの量が反−Ａｐ ｏ ＡＩ抗体を使用して決定された。また種々の構造から製造されたＡｐｏ Ａ Ｉ−Ｍが、細胞および媒体全体から得られた蛋白質を使用して、ＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタン吸い取り分析に より決定された。実施例２ バイオ反応器中でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造バイオ反応器中で成長させられた細胞用成長媒体 媒体Ａ：１６ｇ／１のトリプトン（デイフコ、アメリカ合衆国）、８ｇ／ｌの イースト抽出物（デイフコ、アメリカ合衆国）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、および０ ．０５ｇ／ｌのカナマイシン。 媒体Ｂ：２．５ｇ／ｌの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、３ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄、２ｇ／ｌ のＫ₂ＨＰＯ₄、０．５ｇ／ｌのＮａ₃−クエン酸塩、５ｇ／ｌのイースト抽出物 （デイフコ、アメリカ合衆国）。 殺菌後、媒体を１０ｇ／ｌの初期グルコース、０．０５ｇ／ｌのカナマイシン 、１ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏおよび０．０７ｇ／ｌのチアミン塩酸塩で補っ た。微量元素溶液（１ｍｌ／ｌ）およびビタミン溶液（０．６５ｍｌ／ｌ）が添 加された。微量元素は２７ｇ／ｌのＦｅＣＩ₃×６Ｈ₂Ｏ，４ｇ／ｌのＺｎＳＯ₄ ×７Ｈ₂Ｏ，７ｇ／ｌのＣｏＣｌ₂×６Ｈ₂Ｏ，７ｇ／ｌのＮａ₂ＭｏＯ₄×２Ｈ₂Ｏ ，８ｇ／ｌのＣｕＳＯ₄×５Ｈ₂Ｏ，２ｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₃，５ｇ／ｌのＭｎＳＯ₄ ×４Ｈ₂Ｏ，１１ｇ／ｌのＣａＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏおよび５０ｍｌ／ｌのＨＣｌを含 有していた。ビタミン溶液は０．５ｇ／ｌのカルシウムパントテン酸塩、０．５ ｇ／ｌのコリン塩化物、０．５ｇ／ｌの葉酸、１ｇ／ｌのイノシトール、０．５ ｇ／ｌのニコチンアミド、０．５ｇ／ｌのピリドキシン塩酸塩、０．０５ｇ／ｌ のリボフラビンおよび０．５ｇ／ｌのチアミン塩酸塩を含有していた。アデカノ ール（０．２ｍｌ／ｌ）が反気泡として使用された。 必要ならば、さらに他の反気泡の添加が培養中に行われた。醗酵媒体中でのＡｐｏ ＡＩ−Ｍの分析 醗酵媒体のサンプルが遠心分離されかつ上清中のＡｐｏ ＡＩ−Ｍの濃度が標 識免疫定量法（アポリポ蛋白質ＡＩ ＲＩＡ１００キツト、論文番号１０９１５ ２、カビ・フアーマシア・エービー、スウェーデン）により測定された。３．５リツトルのバイオ反応器中でのＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３の培養 強力に凍結された貯蔵培養物が５００ｍｌの媒体Ａを植え付けるために使用さ れかつ８〜１０時間３０℃で２リツトルの調節されたエルレンマイヤーフラスコ 中で予備培養された。バイオ反応器作動容量の１０％に対応する接種物がバイオ 反応器に搬送された。 培養を２．５リツトルの作動容量により３．５リツトルのバイオ反応器（ベラ ーク・エービー、スウェーデン）中で行った。温度を誘起前の成長相中３０℃で かつ次いで３７℃に上昇した。ｐＨは２５％アンモニアの溶液により７．０に維 持された。通気率は１ｖｖｍに保持されかつ溶解酸素圧力（Ｄ．Ｏ．Ｔ．）は羽 根車速度を調整することにより３０％に保持された。初期グルコースが消費され た後、グルコース供給バツチが、グルコースの６０％溶液を供給することにより グルコース制限に装置を保持して、始められた。初期供給量、０．０４ｇ／分 が３時間保持されかつ次いで３時間の間に０．４ｇ／分に徐々に増加された。細 胞成長は６００ｎｍでの光学濃度に従うことにより監視された。 １６時間の培養後、５８のＯＤにおいて、蛋白質合成が０．５ｍＭ ＩＰＴＧ を添加することにより誘起されそして温度は３７℃に増加された。誘起後４時間 Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの濃度は２．３ｇ／ｌ、そして追加の２時間後、濃度は２．５ ｇ／ｌであつた。結果は第７図に示されている。実施例３ ３．５リツトルのバイオ反応器中でのＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４の培養 媒体および成長条件は実施例２に記載されたものと同一であつた。５８のＯＤ において、１５．５時間の培養後、ＩＰＴＧを加えかつ温度を上昇させた。５時 間後、上清中のＡｐｏ ＡＩ−Ｍの濃度は１．６ｇ／ｌであつた。結果は第８図 に示されている。実施例４ ３．５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ６８３の培養 醗酵は１．０ｍＭ ＩＰＴＧが誘起に使用されたことを除いて、実施例２によ り行われた。１５時間後、７４のＯＤにおいて、ＩＰＴＧを添加しかつ温度を上 昇させた。誘起後７．５時間、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの上清濃度は２．０ｇ／ｌであ る。結果は第９図に示されている。実施例５ ３．５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養 培養は、カナマイシンがバイオ反応器媒体に添加されなかつたことを除いて、 実施例２に記載されたように実施された。１５時間後、６０のＯＤにおいて、Ｉ ＰＴＧを添加されそして温度を上昇させた。１０時間後上清中のＡｐｏ ＡＩ− Ｍの濃度は３．７ｇ／ｌ、そして誘起後２２時間、濃度は４．４ｇ／ｌであつた 。結果は第１０図に示されている。実施例６ ７５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養 培養が３５リツトルの作動容量を有する７５リツトルのバイオ反応器（ケマツ プ・エージー、スイス）中で行われた。媒体温度成長条件は実施例２におけるも のと同一であつた。３０％以上のＤ．Ｏ．Ｔ．値を保持するために、空気圧を誘 起に続いている２時間１．４バールに上昇させた。ＩＰＴＧを添加しかつ温度を ７５のＯＤにおいて１６時間の醗酵後上昇させた。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの濃度は誘 起の時間後１．９ｇ／ｌであつた。結果は第１１図に示されている。実施例７ ３００リツトルのバイオ反応器内でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養 １８０リツトルの作動容量を有する３００リツトルのバイオ反応器（ケモフエ ルム・エービー、スウエーデン）が使用された。接種物はシエーカーフラスコ中 の予備培養時間が１４時間であつたことを除いて、実施例２に記載されたごとく 調製された。接種物は１８リツトルの作動容量を有する５０リツトルの種子バイ オ反応器に移された。シエーカーフラスコ内でならびにバイオ反応器内で使用さ れた媒体は媒体Ａであつた。種子バイオ反応器媒体は５ｇ／ｌのグルコースによ り補われそして温度は３０℃であつた。ｐＨおよび通気は実施例２と同一であり かつＤ．Ｏ．Ｔ．は３０％以下であった。培養物が４のＯＤに達すると、種子バ イオ反応器の内容物が３００リツトルのバイオ反応器に移された。このバイオ反 応器において媒体の温度、ｐＨおよび通気は実施例２に記載された通りであつた 。誘起前にＤ．Ｏ．Ｔ．はその最大にまで羽根車速度を増加しかつその後空気圧 を増加することにより３０％にまたはそれ以上に保持された。誘起後空気圧は１ ５〜２０％のＤ．Ｏ．Ｔ．を結果として生じる２バールに増加された。バイオ反 応器中の培養の１６時間後培養物が５１のＯＤを有したとき、ＩＰＴＧが添加さ れかつ温度が３７℃に増加された。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの濃度は誘起後５時間およ びそれに続く時間の間中１．３ｇ／ｌであり、一方バイオ反応器は冷却され、Ａ ｐｏ ＡＩ−Ｍの濃度は１．５ｇ／ｌに増加した。結果は第１２図に示されてい る。実施例８ ３．５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養 培養は以下を除いて実施例２に記載されたものと同様に実施された。グルコー スの初期量（１５ｇ／ｌ）は１２時間後消費された。その後グルコースの６０％ 溶液が特定の時間間隔にわたつた直線的に供給量を変化する予めプログラムされ た供給特性を使用して加えられた。Ｄ．Ｏ．Ｔ．は攪拌機速度により制御された 、３０％で一定に保持された。供給は０．０９ｍｌ／分の流量で開始されかつ４ 時間中に０．７２ｍｌ／分に増加され、その後４８分一定であつた。その後それ は１時間３６分の間に０．５７ｍｌ／ｌに減少されかつ次いで１時間４８分の間 に０．３２ｍｌ／分にかつ次いで５４分の間に０．２２ｍｌ／ｌに減少された。 供給は最後に５時間５４分の間に０．１８ｍｌ／ｌに減少されかつ次いで醗酵の 終わりまで４１時間で一定に保持された。１８時間後、６１のＯＤにおいて、Ｉ ＰＴＧを添加しかつ温度を上昇させた。Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの上清濃度は、誘起後 ２３時間、１．９ｇ／ｌであつた。結果は第１３図に示されている。実施例９ ３．５リツトルのバイオ反応器中でのＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３の培養 培養は醗酵が一定の温度、３０℃で行われた以外は実施例２に記載されたもの と同様に実施された。１８時間 後、８０のＯＤにおいて、ＩＰＴＧを添加させた。誘起後１７．５時間、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの上清濃度は１．４ｇ／ｌであつた。結果は第１４図に示されている 。実施例１０ 完全な組み換えＡｐｏ ＡＩ−Ｍの特性 Ａｐｏ ＡＩ−Ｍを実施例６に記載したように大腸菌により製造しかつその後 標準クロマトグラフ法により純化させた。製品は第４図に示した導出されたアミ ノ酸シーケンスに比較された。Ｎ−端末シーケンス決定 完全な蛋白質のＮ−端末シーケンスをミリゲン・バイオサーチ・プロシーケン サー・タイプ６０００を使用してエドマン減成（２０サイクル）により決定した 。見出されたシーケンスはＡｐｏ ＡＩ−ＭのＮ−端末と同一であつた。Ｃ−端末残留物決定 組み換えＡｐｏ ＡＩ−ＭをカルボキシルペプチダーゼＰ（ベーリンガー・マ ンハイム）により消化しその後解放されたアミノ酸をピコタグ（商標）法（ウオ ーターズ）を使用して分析した。Ｃ−端末残留物がグルタミンとして明確に同定 された。アミノ酸組成 完全な蛋白質のアミノ酸組成を酸加水分解後ベツクマン６３００アミノ酸分析 機を使用して決定した。結果は以下の表１に示されている。見出された組成はＡ ｐｏ ＡＩ−Ｍの組成と矛盾がなかつた。 円形２色（ＣＤ）スペクトル 完全な組み換え蛋白質のおよびヒトＡｐｏ−Ａ１標準（シグマ）のＣＤスペク トルが２０ｍＭ燐酸ナトリウム 緩衝剤、ｐＨ７．５中で記録された。観察された差異は実験誤差内にあつた（第 １５図）。実施例１１ Ｃ−端末断片の特性 ５９−残留物Ｃ端末断片（残留物１８５〜２４３）がヒドロキシルアミンによ る分裂により製造された。組み換えＡｐｏ ＡＩ−Ｍ（４８０μｇ）を、２Ｍヒ ドロキシアミン、３Ｍ塩化グアジニウム、０．２Ｍ ＮａＯＨおよび２ｍＭ Ｅ ＤＴＡを含有する０．５ｍｌ分裂溶液中で分解させた。分裂溶液の初期ｐＨは９ ．４であつた。反応混合物は４０℃で５時間培養された。Ｃ−端末断片は、０． ２５％ペンタフルオロプロピオン酸を含有する水中で１０〜６０％アセトニトリ ルの勾配で抽出されるＹＭＣ−パツクプロテインＲＰコラム（ＹＭＣ社、日本国 ）を使用して、逆相ＨＰＬＣにより純化された。Ｃ−端末断片が３６〜３８％ア セトニトリルで単一の、非蛍光の、鋭いピークとして抽出された。Ｎ−端末シーケンス Ｃ−端末断片全体のシーケンスが実施例８に記載されたようなエドマン減成に より決定された。見出されたシーケンスはＡｐｏ ＡＩ−Ｍ、残留物１８５〜２ ４３と同一であつた。Ｃ−端末残留物 Ｃ−端末断片のＣ−端末残留物は実施例１０に記載されたと同様なグルタミン として明確に同定された。アミノ酸組成 Ｃ−端末断片のアミノ酸組成は実施例１０に記載されたごとく決定され、そし て結果は表２において以下に示されている。見出された組成はＡｐｏ ＡＩ−Ｍ 、残留物１８５〜２４３の組成と矛盾がなかつた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラーク マッツ スウェーデン国，エス―181 41 リジン ゴ，ツレバーゲン 17 (72)発明者 ミカエルソン アーサ スウェーデン国，エス―117 37 ストッ クホルム，ゲーグスンドスバーゲン 25 (72)発明者 セリッツ トルステン スウェーデン国，エス―171 73 ソルナ, オドリングスバーゲン １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）大腸菌を使用するアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ（ミラノ）の細胞外製造を付与 する発現ベクトルにおいて、該発現ベクトルを複製原点を支持するプラスミドと 、誘起可能なプロモーターシーケンスと、信号ペプチド用のＤＮＡシーケンス符 号化と、アポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ用のＤＮＡシーケンス符号化と、転写終了暗号 とから構成したことを特徴とする発現ベクトル。 ２）アポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ用のＤＮＡシーケンス符号化は成熟した蛋白質用 のシーケンス符号化であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の発現ベク トル。 ３）誘起可能なプロモーターはｔｒｃプロモーターまたはその機能的派生物で あることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の発現ベクトル。 ４）信号シーケンスはｏｍｐＡ信号シーケンスの派生物であることを特徴とす る請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載の発現ベクトル。 ５）請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の発現ベクトルによ り変換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株。 ６）成長媒体中に請求の範囲第５項に記載の変換された大腸菌菌株を培養し、 固定相が達成される前に対数成長相中にアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ蛋白質の発現 を誘起し、そして 成長媒体から製品を分離する工程からなる、ことを特 徴とするＡｐｏ ＡＩ−Ｍの製造方法。 ７）培養を低い温度で開始し、そして温度を誘起の前、それと同時にまたはそ の後に対数成長相に上昇させられることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の 製造方法。 ８）培養を約２９から約３１℃で、好ましくは約３０℃で開始させ、そして温 度を対数成長相において約３７℃に上昇させることを特徴とする請求の範囲第７ 項に記載の製造方法。 ９）培養を一定の温度、好ましくは約２５から３７℃で行うことを特徴とする 請求の範囲第６項に記載の製造方法。 １０）誘起を成長媒体が少なくとも約５０の光学濃度に達したとき行うことを 特徴とする請求の範囲第６項ないし第９項のいずれか１項に記載の製造方法。 １１）採収を最適細胞培養状態で行うことを特徴とする請求の範囲第６項ない し第１０項のいずれか１項に記載の製造方法。 １２）成長媒体をトリプトンにより適切に補われたイースト抽出物から構成し たことを特徴とする請求の範囲第６項ないし第１１項のいずれか１項に記載の製 造方法。 １３）製造媒体には抗生物質がないことを特徴とする請求の範囲第６項ないし 第１２項のいずれか１項に記載の製造方法。