JPH08506813A

JPH08506813A - オリゴヌクレオチドの自動合成

Info

Publication number: JPH08506813A
Application number: JP6518236A
Authority: JP
Inventors: エイ．マックグラウ，ロイヤル; マイケルグロッセ，ウィリアム
Original assignee: ユニバーシィティーオブジョージアリサーチファウンデーション，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-02-11
Filing date: 1994-02-04
Publication date: 1996-07-23
Also published as: WO1994018226A1; US5541314A; EP0683790A4; US5368823A; EP0683790B1; DE69424151T2; DE69424151D1; EP0683790A1

Abstract

(57)【要約】 DNAセグメントの自動合成の装置および方法は、複数の反応カラム（11）を利用し、これらのカラムの全ては、反応チャンバー（10）の空間に対して入口末端（13）で開放されている。移動可能な試薬供給ライン出口（12）は、カラムの入口末端（13）に近接して配置され、送達の入力順序に従って、各カラム（11）に試薬を付与する。送達順序はプロセッサーの制御下にある。試薬は、各カラム（11）の出口末端（14）で減圧（22）を行うことによって、全てのカラム（11）から同時に除去される。このデバイスは、異なる長さの、多数の異なるオリゴヌクレオチドの並行合成を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドの自動合成本発明は、オリゴデオキシヌクレオチドの自動化学合成、特に、同時方式で複数の異なるオリゴデオキシヌクレオチドの合成を行う装置および方法に関する。発明の背景 DNAを合成する分野は、複数のDNAセグメント、すなわちオリゴデオキシリボヌクレオチド（しばしば、オリゴデオキシヌクレオチドと短くされ、さらにオリゴヌクレオチドと短くされる用語）を同時に生成するための自動機器を含めて発展している。これらの機械は、反応のための支持物質が不活性な多孔性のフィルター（「フリット(frit)」と呼ばれる）の間のカラムの中に入れられた反応カラムを、しばしば用いる。反応カラムは自動装置の中に配置され、化学物質は順番にかつ適切な量で、自動方式でカラムに添加され得る。この目的は、支持体と結合した出発物質から所望のオリゴヌクレオチドを合成することである。現在知られている自動合成装置は、機械に配置される反応カラムの数によって制限され、一度に少しのオリゴヌクレオチドしか生成し得ない。カラムの数が増加するにつれて、配管およびバルブのネットワークの複雑さが増大することによって、反応カラムの数は、実際問題として制限される。なぜならば、現在知られている合成装置は、いくつかの試薬供給リザーバーからの密集した配管ネットワークを各々の反応カラムに供給するからである。結果として、従来の自動合成装置は、典型的には、数時間でわずか１〜４プライマー長の（代表的に20-マー）オリゴヌクレオチドの自動合成を提供する。４カラムユニットが８時間の就労時に３回作動する場合、12プライマーが生成され得る。１日あたり100個のオリゴヌクレオチドプライマーを生成するためには、これらの高価な機械が８つ必要である。また、100プライマーの合成に関係する高価な試薬および労力のコストは、高い。プライマーの生成における改良は、例えば、完全なヒトゲノムを配列決定するのに必要な努力を含めて多くの分野の研究および開発活動にとって大きく期待されている。しかし、現在利用可能な自動合成装置は、処理量、操業コストおよび収率に関して多くの点で不適切である。プライマー長のオリゴヌクレオチドの生成に加え、現在知られている合成装置は、はるかに長いオリゴヌクレオチド（すなわち、100ヌクレオチド長を超える）を生成し得る。100ヌクレオチドのDNAを生成するための時間は、20ヌクレオチドDNAの生成の約５倍以上の時間がかかる。それゆえ、本発明の目的は、相当少ない試薬物質を用いて等量収率を得、操作における労カコストを減し、機械の複雑さを制限することによって合理的な範囲内で機械の初期経費を維持し、そして毎日数100のプライマーの生成を可能にする装置を提供することである。発明の要旨本発明の装置において、反応チャンバーは、特定のオリゴヌクレオチド配列が合成される１つまたはそれ以上の反応カラムを含む。各反応カラムの入口末端は、チャンバー内の空間に対して開いており、そしてチャンバー自体は、好ましくは密封され、そして不活性ガスが充填される。装置は、チャンバー内に位置する移動可能な供給ライン出口を有する。この出口は、各カラムの入口末端の上方に配置され得、ヌクレオチド試薬、キャッピング試薬、脱保護化試薬（deblocking reagents）、洗浄薬品などが、各カラムに供給され得る。これら試薬の全ては、リザーバーおよびリザーバーと供給ラインとを接続するバルブ機構を含む供給システムに配置される。フラッシュ（flush）／プライム（prime）カラムもまたチャンバー内に配置され、供給ラインは各々の異なる化学物質を添加する間にフラッシュおよびプライミングされ得る。適切な試薬を各反応カラムに供給した後、圧力差をカラムにかけ、試薬を流出させる。好ましくは、減圧供給源を反応カラムの出口末端に接続し、全てのカラムから化学物質を迅速に排出し、同時に、カラムを乾燥させ、そして次の試薬を受け取る準備をする。移動可能なキャリアープレートは、多数の反応カラムを保持し、そして反応チャンバーの内外に反応カラムの移動を容易にするために提供される。反応チャンバーがアセンブルされた場合、キャリアープレートは流出深皿（basin）から反応チャンバーを密封して、チャンバーと深皿との間の空間的なつながりを反応カラムを通してのみとする。反応カラムは、多孔性物質および反応支持物質から構成される。多孔性物質は、圧力差を付与して試薬を多孔性物質から流出深皿に排出するまで、試薬を維持して、反応支持物質で飽和し、そして反応支持物質と相互作用する。支持物質は、制御細孔ガラス（CPG）のような被覆支持体であり得、ガラスフリットのような多孔性物質のカラムに入れられる。あるいは、多孔性物質は、それ自体、誘導体化に適切であり得、それゆえ反応カラム内でフリットと支持物質とを結合し得る。支持物質を直接誘導体化するプロセスは、合成プロセスの前に、装置内で行われ得る。試薬の適用を所望の順序に従って装置を操作する際、各反応カラムは、特定の試薬を受け入れるように指定される。関連したエレクトロニクスおよびソフトウェアーを有するコンピューターは、適切な時間周期および正確な順番でのバルブの開閉、供給ライン出口の動作、各試薬をカラムに添加するための適切なインキュベーション期間の設定、ならびにインキュベーション期間が完了した後のカラムの排出を含むプロセスの全ての局面を制御する。非同時カップリングが用いられる。すなわち、ヌクレオチド試薬をカップリングする場合、そのための第１試薬がカラムの位置に関わらず、その塩基を必要としている全てのカラムに送り出される。第１試薬を必要としないカラムは、移動可能な出口によって飛び超えられる。装置は、供給システムに適切な試薬、適切な制御プログラム、および適切な反応支持体を利用することによって、種々のプロセスを自動化するために用いられ得る。上記のように、例えば、オリゴヌクレオチドを合成するための反応支持体は、装置中で直接誘導体化され得、そして合成プロセスの前に直接実行する場合、キャリアープレートは誘導体化および合成プロセスの両方において装置中に残り得る。図面の簡単な説明図１Ａは、本発明の装置の主な構成要素を示すブロック図である。図１Ｂは、図１Ａのアセンブリとして、反応カラムを有するキャリアープレートを示す。図１Ｃは、図１Ｂの反応カラム中に配置される反応支持物質を示す断面図である。図２は、図１に示される装置の特定バージョンを提供する、研究室プロトタイプの概略図である。図３は、図２の研究室プロトタイプで用いられる試薬供給システムの詳細を示す。図４は、図２の反応チャンバーの詳細を示し、この中に32個の反応カラムが配置される。図５は、反応チャンバーの側面図である。図６は、反応チャンバー内で用いられる代表的な反応カラムを示す。図７は、図１の制御センターの主な構成要素のブロック図である。図８は、本発明の装置を操作する方法の流れ図である。図９Ａおよび９Ｂは、図８に示される方法の主な工程の各々を実行するための詳細な工程を示す。図９Ｃは、図９Ｂの方法の変法を示す。図10Ａおよび10Ｂは、図９Ｂおよび図９Ｃの方法に代わるアプローチを示す。発明の詳細な説明図面を参照して、同様の番号は、種々の図面中の同様の部分および構造的特徴を示す。図１Ａは、多数の反応カラム11が配置される、密閉された反応チャンバー10を示す。フラッシュカラム12もまた反応チャンバー内に位置している。各反応カラム11は、開放入口末端13、および流出深皿17に注ぐ出口末端14を含む。カラム11 は、キャリアープレート８中に形成され、この詳細は、図１Ｂおよび図１Ｃに示される。キャリアープレート８は、反応チャンバー中に装着する場合、バルクヘッド16に固定され、流出深皿から反応チャンバー10を密閉し、それによって、反応チャンバー10と流出深皿17との間の空間的つながりは、反応カラム11を介してのみとされ得る。移動可能な試薬出口18は、動力手段19によって駆動されるスライドキャリッジ30にマウントされ、出口18は反応チャンバー10中の各反応カラムの入口末端にわたって配置される。化学試薬は、リザーバーＲ₁〜Ｒ_nに貯蔵され、そして供給システム20のバルブおよび配管から、供給ライン33に至り、移動可能な試薬出口18に送り出される。不活性ガス供給器21は、ライン35に圧力をかけて、リザーバーＲ₁〜Ｒ_nの各々にガスを供給する。リザーバーに圧力をかけることによって、リザーバーと関連する出口バルブが開いている場合には、液体試薬は供給ラインに移動される。不活性ガスはまた、供給器21から通気バルブＶ₁を共有するライン36および36'を通り、反応チャンバー10に提供される。不活性ガスは、バルブＶ₂を共有するライン3 6および36"を通り、流出深皿17に送られる。好ましくは、真空ポンプ22は、バルブＶ₃およびライン46を介して流出深皿に接続される。これは、深皿17を排出し、そして反応カラムに置かれたあらゆる試薬薬品を排液リザーバー37に吸い込むためである。真空ポンプ22はまた、バルブＶ₄およびライン45を介してフラッシュカラム12を排出するために働く。これは、カラム12中に流されたあらゆる薬品を排液リザーバー37に吸い込むためである。反応制御センター23は、試薬薬品の添加を反応カラムの各々に適切な順序で制御するために、システム内の全てのバルブ、および動力手段19を制御するために接続される。図１Ａ〜１Ｃは、移動可能なキャリアープレート８中で形成された反応カラム 11を有する移動可能なキャリアープレート８を示す。反応カラムの各々は、所望の反応のために適切に誘導体化された孔性支持物質７を含む。試薬薬品が反応カラム11に添加されると、各々の薬品は、多孔性物質によって維持されて、反応カラムの入口および出口末端に圧力差をかけることによって多孔性支持体７を介して吸い込まれるまでの所望のインキュベーション期間の間、誘導体化された支持体で満たされ、そして誘導体化した支持体と相互作用する。反応カラムは、好都合には、反応チャンバー10の内外でカラムをマニュアル操作するために、キャリアープレート８中に形成される。図１Ｂは、アレー中に48個の反応カラムを有する二次元マトリックスでのカラム11を有するキャリアープレート８を示す。本発明は、100またはそれ以上の配列の同時合成のために、100個またはそれ以上の反応カラムを有するキャリアープレートを意図する。動力手段19は、移動可能な出口18に対して二次元運動を提供し、この出口は任意の選択されたカラムの上に位置し得る。図２は、図１に示される本発明の原理によって組み立てられた研究室用プロトタイプを示す。反応チャンバー10は、二次元的配置ではなく単列で配置された多数の反応カラム11を含む。研究室プロトタイプにおける反応カラムの実際の数は、図２は全くその数を示していないが、32個程度であり得る。プロトタイプの反応カラム11は、以下に詳細を説明するLuerフィッティング（fitting）を利用してつくられ、それゆえ、図１Ｂおよび１Ｃに見られるキャリアープレートの配置とは異なる構造である。移動可能な試薬出口（供給ライン出口）18は、レール31に沿って前後に移動するスライド30の上に位置する。スライド30は、動力手段19（図１に示される）を介して駆動されるドライブベルト32に接続される。供給ライン出口18は、ライン 33を介して試薬供給システム20に接続される。システム20は、図３に詳細に示されるバルブマニホールド、および本装置によって実行される特定のプロセスに必要な全ての薬品リザーバーを含む。プロトタイプによって実行される例示的なプロセスについて、10個のリザーバーが図２に示される。加圧不活性ガス供給器21 は、ライン35を介して、全てのリザーバーに接続されるが、各リザーバーへの接続は、図２では明確に示していない。ライン36は、不活性ガスを反応チャンバー 10および流出深皿に運ぶ。深皿17はまた、排液リザーバー37を介して真空ポンプ 22に接続される。研究室プロトタイプにおいては、パーソナルコンピューター38が、順序を制御するために用いられる。この順序に従って薬品が反応カラムに添加され、各カラム中に所望のオリゴヌクレオチドを生成する。コンピューター38は、出口18の移動、バルブの作動、反応のタイミング、要するに全プロセスを制御するために働く。コンピューター38の出力は、入力／出力（I/O）ボード39およびリレーボード40を介して提供される。システムはまた、24ボルト出力供給器41およびコンピューター38のフレーム内にマウントされた平行拡張ボード（paralle l expansion board）を備える。ステッパモーター（stepper motor）が、動力手段19（図１に示される）として用られ、試薬出口18を制御順序に従って配置する。動力手段19は、ステッパモーターコントローラー42の制御下にある。コントローラー42は、ステッパモーターによる試薬出口18の配置に関する最終的な制御器であるコンピューター38に接続される。図２はまた、不活性ガス圧力を調節するための圧力レギュレータ43および減圧ゲージ44を示す。図３は、プロトタイプ試薬供給システム20のいくらか詳細を示す。このシステムは、試薬ボトルリザーバー50〜59、バルブ60〜71、試薬出口供給ライン33、33 'および33"、およびリザーバーの各々に接続された不活性ガス加圧ライン35からなる。図３は、リザーバー50中にある洗浄薬品が、関連バルブが作動したときに、全供給ラインを洗い流すように、供給システム内に配置されることを示す。例えば、バルブ71の操作は、ライン33'および33を洗浄するために行い、一方、バルブ60の操作は、ライン33"および33を洗浄するために行う。明らかに、このシステムは容易に拡大または縮小されて、異なる数の試薬を供給し得る。図４は、研究室プロトタイプにおける32個の反応カラム11を示す、反応チャンバー10の詳細図である。図４は、レール31（および図５に示されるレール31'）の上を前後に移動するスライド30上に配置された試薬供給ライン出口18を示す。スライド30は、プーリー80および81の上に据え付けられたドライブベルト32に接続される。図４には示してないが、動力手段19はドライブプーリー81に接続される。不活性ガスは、ライン36'を介して反応チャンバー10に、そしてライン36"によって流出深皿17に導入される。減圧は、ライン45によってフラッシュカラム12に供給され、一方、ライン46は、流出深皿17に対して減圧を行う。図５は、側壁を取り除いた反応チャンバー10の末端図または側面図であり、スライド30が２つのガイドレール31および31'の上に据え付けられていることをはっきりと示す。ドライブプーリー81は、たわみ継手94を介してステッパモーター 19に接続される。反応チャンバー10は、部屋の中に密閉される。この部屋は、それぞれ上壁92、背壁93、および底壁96によって、示してないが側壁によって、ならびにシール91により反応チャンバーの上壁、底壁、および側壁に密閉された取り外し可能な透明前面90によって規定されている。プロトタイプにおいて、流出深皿17は、穴なしフレーム（solid frame）17'のくり抜き部分である。バルクヘッド16は、流出深皿17が、反応カラム11を受け入れるLuerフィッティング15を介して以外は反応チャンバー10中の空間につながらないように、シール95によって穴なしフレーム17'の上部に密閉される。図６は、図２のプロトタイプで用いられる円筒形状の反応カラム11の詳細図を示す。カラム11は、はめあい（mating）Luerフィッティング15に挿入するために、円錐形の出口末端を有する。反応カラムは多孔性フリット９およびフリット９の上に配置された支持体100を含む。第２のフリット９Ａは支持体100の上に配置される。この支持体は、特定のサイズの孔を有する特定のビーズサイズの制御細孔ガラス（Controlled Pore Glass）（CPG）から構成される。所望の反応のための開始物質は、CPGのような支持物質を含み、これは合成される各配列の３'ヌクレオシドによって指示されるような保護ヌクレオシド（Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ）で適切に誘導体化される。適切な誘導体化ヌクレオシドを有する特定のサイズのCPG 支持体は市販されており、これを反応カラムに詰める。誘導体化ヌクレオシド支持体はまた、本発明の装置を用いても生成され得る。図７は、反応制御センター23の主な構成要素を示す。プロセッサー110は、リードオンリーメモリー（ROM）111およびランダムアクセスメモリー（RAM）112に接続される。ハードディスクドライブ113およびディスケットドライブ114は、生成したオリゴヌクレオチドの配列を都合良く保存するためのシステムに含まれる。キーボード115のような入力手段および出力スクリーン116は、システムのユーザーとプロセッサー110との間の相互伝達を可能にする。出力ライン117は、試薬供給ライン出口18を正しい反応カラムに配置するために、そして装置によって処理される順序に従って正しい化学試薬をその反応カラムに入れるために、出力シグナルをバルブ制御ユニット118およびモーター制御ユニット119に伝える。研究室プロトタイプにおいて、Zenithパーソナルコンピューター、モデルZ-100が、Q ua-Tech（POPXB-721）からの平行拡張ボードおよび Qua-Techリレーボード（OPOUT-241）と共に、外部に据え付けられた24ビットデジタルI/Oボード（Qua-Tech UIO-10）と共に用いられた。ここで完全な装置の記載と共に、本発明の装置を用いる特定のプロセスの説明を以下に示す。機器を作動する前に、デバイスによって生成されるべき種々のオリゴヌクレオチド配列がテキストファイルに入力され、そしてディスケットドライブ114で用いられるディスケット、またはディスクドライブ113に設けられたハードディスクのいずれかにおかれる。バルブおよびモーターの動作を制御するプログラムは RAM 112にある。制御プログラムは所望のテキストファイルを呼び出し、そしてそこで見い出される配列のDNAの自動合成を指示する。32種の特定のオリゴヌクレオチドを合成するための32種のヌクレオチド配列の例を以下の表３に示す。また、操作を始める前に、プロトタイプデバイスの32個のカラムを適切な支持物質で充填する。カラムは、好都合には、調製エリアから移動して反応チャンバー10に挿入されるキャリアープレート８に配置される。前記のように、支持体は互いに異なるヌクレオシド物質を含み得るので、異なる配列が本発明の装置で同時に生成され得る。反応カラムを有するキャリアープレート８を反応チャンバー10に移動し、そして各反応カラムを、それが接続されるLuerフィッティング15に保持した後、透明前面90を所定の位置に固定し、気密な反応チャンバー10を作製する。試薬ボトルを適切な試薬で満たし、そしてしっかりとキャップする。試薬供給システムを、不活性ガス、例えばアルゴンで約7.5psiに加圧する。ボトルからバルブへの試薬ラインを、適切なバルブを個々にスイッチすることによってプライミングする。真空ポンプを作動して、減圧を約20インチHgに調節する。手動バルブＶ₁（図１）、およびアルゴンタンク21と接続した全ての手動バルブを開いて、反応チャンバーを充満させる。合成プログラムを開始すると、機器は第１の合成サイクルに入る。従来の機器がそうであるように、１サイクルは以下の反応：脱保護（脱トリチル化）、カップリング、酸化およびキャッピングからなる。アセトニトリルによる洗浄が各反応に続く。例示のために、脱保護工程は以下のように進行する。最初に、出口18 をモーター19によってフラッシュカラム12に移動する。脱保護化試薬51が供給ライン33および33'をプライミングするに充分な量で流れるように、バルブ70を操作する。流動は、供給ライン33および33'を接続する位置にある二方向遮断バルブ（two position latching valve）66を介して生じる。フラッシングおよびプライミング操作の間、カラム12からライン45を介して排液リザーバー37に試薬を除去するために、バルブＶ₄を介してフラッシュカラム12に減圧を付与する。供給ラインをプライミングした後、バルブ70を閉じ、そして出口18を、支持列中の各位置に連続的に移動させる。出口18を各支持体の上に配置する間、バルブ70は、適量の試薬を各支持体に送達するに必要な時間、しばらくの間開放される。脱保護反応は、適切なインキュベーション時間の間に進行し、この後、試薬を反応カラムから除去する。反応カラムからの脱保護化試薬の除去は、バルブＶ₃を開け、流出深皿に減圧を付与することによって行われる。この操作によって、脱保護化試薬を受け入れた全てのカラムは排出される。バルブＶ₃を閉じた後、バルブＶ₂を開けてアルゴンを流出深皿17に入れ、フリット９の上下の圧力を等しくする。試薬をカラムに付与したときに、減圧することによって試薬の除去を行うまでの全インキュベーション期間中に試薬が支持体を飽和するように、フリットに関する圧力の均等化が必要とされる。脱保護工程において、移動可能な出口18の第２のパス（pass）は、カップリングされるカラムの全てにわたってなされ、第２期の脱保護化試薬を提供する。この後、インキュベーションおよび除去が再度実行される。脱保護操作は、しばしば４つのパスからなる。典型的なDNA合成に用いられる脱保護化試薬は、以下の表１に示されるジクロロ酢酸である。表１はまた、以下の表３に示されるオリゴヌクレオチド配列を合成するのに用いられる化学試薬の他の例を示す。表１に示される特定の薬品は、成功した操作に用いられた薬品の例示となるが、本発明の装置および方法論は、いかなる特定のカップリングの化学にも限定されないことが理解されるべきである。合成サイクルの各工程のインキュベーション時間および試薬添加の数は、試薬に依存して変化する。成功したプロトコルについての値を、以下の表２に示す。２つの工程は試薬の混合を必要とする。すなわち、カッブリング工程は、アミダイトと活性剤との混合を必要とし、そしてキャッピング工程は、キャップＡおよびキャップＢ溶液の混合を必要とする。混合は、試薬ラインのプライミングの間および反応カラムへの試薬添加の間に、最初の１つのバルブ、次いでもう一方のバルブを速やかに開けることによって、ライン33で行われる。例えは、活性化剤とアミダイト「Ａ」とを混合するために、二方向遮断バルブ66をライン33"および33をつなぐように位置させ、そしてバルブ61および62を素早く交互に開閉し、アミダイトおよび活性化剤を供給ライン33"および33に配置させる。バルブ61および62は、コンピューター38の制御下で操作されて、所望の混合比（表２に、活性化剤とアミダイトとが 1.8：１として示される）を提供する。キャッピング工程が行われるときには、バルブ66はライン33'および33を接続するように位置し、そしてバルブ68および6 9は素早く交互に開閉されて、キャップＡおよびキャップＢ溶液を供給ライン33' および33に配置させる。キャップＡとキャップＢとの所望の混合比は、表２に示されるように１：１である。本発明の手順のカップリング工程は、非同時カップリングの概念を利用する。そこでは、各ヌクレオチド試薬の添加は、その試薬を必要とする各支持体がそれを受け取るまで、非隣接カラムに対して進行する。各々のカップリングの開始では、制御プログラムは、32個の支持体のうちどれが「Ａ」を必要としているか決定して、Ａの添加を判別された全ての支持体に対して行い、次いでどれが「Ｃ」を必要としているか決定してＣの添加を行い、同様の操作をつづける。これは、全ての支持体が必要なヌクレオチド試薬を受け取るまで行われる。非同時カップリングは、試薬使用の節約、および操作の迅速性を導く。節約は、フラッシングおよびプライミング工程を避けることによって行われる。さもなければ、これらの工程は、あるカラムがＡを要求し、その次がＣを、３番目が再びＡを、次いでＴを要求してゆく場合などに、連続するカラムにおいて直接隣接するカラムへの操作を繰り返し生じ得る。インキュベーション期間ならびにフラッシングおよびプライミング操作の必要性を制限することによって、操作速度は改善され、そしてカラムの数が増加するほど、この利益はより顕著となる。この利点は、出口をカラムからカラムに移動させる時間はインキュベーション時間と比較して短いことから生じる。本発明の手順は、異なる長さのオリゴヌクレオチドの並行合成を可能にする。合成が完了したオリゴヌクレオチドを有する支持体は、他の合成が完了するまで無視される。全ての支持体は酸化およびキャップされ、次いで所望ならば、全てのオリゴヌクレオチドは、最後の脱トリチル化工程において同時に脱トリチル化される。装置は、32未満のオリゴヌクレオチドの合成を可能にする。例えば、入力ファイルが１配列のみ、または６配列のみを含む場合、試薬はそれぞれ１カラムのみ、または６カラムのみに送達される。全てのオリゴヌクレオチドの合成が完了したときに、反応カラムを装置から除去する。前面プレート90をはずし、そしてキャリアープレート８を全ての反応カラム11と共に反応チャンバー10から取り外し、作業台に移す。次いで、DNA生成物はそれらの支持体から切断され得、公知の従来の脱保護を受け得る。所望ならば、DNA生成物はまた、周知の方法に従ってさらに精製され得る。自動合成操作が行われている間、第２の合成操作のために第２のキャリアープレート中の各カラムに適切な支持体が挿入された第２のキャリアープレート８を調製し得る。第１の合成が完了し、そして第１のキャリアープレートが反応チャンバーから除去されたとき、次いで第２のキャリアープレートが反応チャンバーに移動し、第２の自動合成操作が直ちに開始され得る。第２の合成操作を行う間、第１のバッチの脱保護工程を行い得る。この後、第１のキャリアープレートは第３のバッチのために適切な支持体で準備され得る。このようにして、労力の節約が達成される。しかし、これらの手動工程の全ては、適切なカラム中で直接誘導体化した支持体を生成する機械を用いることによって避けられ得る。反応制御センター23の１つの実施の詳細を図７に示し、そして上記する。当該分野に周知のように、プロセスのための制御プログラムは、ディスクドライブ11 3またはディスクドライブ114のいずれかからシステムに読み取られ、そして実際のプロセシング操作のためにRAM 112に保存される。表３のように、生成すべき各配列用の塩基試薬物質、すなわちＡ、Ｃ、ＴまたはＧを添加する順序に関する入力データ（テキストファイル）もまた、システム中に読み取られなければならない。これは、配列が前もって調製されている場合は、ディスクドライブまたはディスケットドライブから達成され得るか、あるいはコンピューターユーザーのための出力スクリーン116の対話式ディスプレーを用いてキーボード115からシステムに入力され得る。反応制御センターを初期化するためには、制御プログラムおよび生成される配列の入力データの両方をRAM 112に読み取らせなければならない。表２に示される入力データもまた、各試薬の添加の回数およびプロセスの種々の工程の時期を提供するために、RAMに読み取られなければならない。プロセスを作動するために、上記で概説したような反応制御センターの初期化に加えて、初期セットアッププロセスは、図３に示されるスキームに従って、各試薬物質を適切なリザーバーに充填（loading）することを必要とする。セットアップ手順の重要な局面は、カラムをキャリアートレー８の上にのせて接続させることである。これは、好都合には作業台（キャリアートレーは、ここから反応チャンバーへの挿入のために移動される）の上で行われる。ここで、各カラムは、それが接続されるLuerフィッティング15の中に適切に配置される。反応チャンバーは、反応チャンバー10の前面にプレート90を固定することによって密閉される。接続される特定のカラムの特定の支持体の位置は、制御センターの配列データで調整されなければならないことを注意すべきである。このようにして、正しい配列の正しいカラムに対して薬品の添加が正しい順番で行われる。例えば、表３を参照すると、表３の配列の３'末端に対応する適切な支持体を含有するカラムは、そこに示される指示に従ってキャリアートレーに載置される。従って、Ｔ支持体を含有するカラムは、１、２、12、18、19、20、22、26および32 の位置に置かれる。Ｇ支持体を含有するカラムは、３、４、11、23、24および31 の位置に置かれる。同様に、Ａ支持体を有するカラムおよびＴ支持体を有するカラムは、表３の３'データに対応する位置でキャリアートレー上に配置される。ガス供給タンク21とつながった手動バルブを開けると、加圧された不活性ガスがライン35に流れ、各リザーバーを加圧する。ガスはまたライン36にも流れ、そして反応チャンバー10に至り、チャンバーを不活性ガスで充満させる。反応チャンバーのための手動通気バルブ（示してない）はこの操作の間に開放され得るので、不活性ガスが流入すると、チャンバー中の全ての空気が置換され得る。必要ならば、バルブＶ₂を開け、そしてバルブＶ₃を閉じて、不活性ガスを流出深皿中に流入し得る。セットアップおよび初期化手順が行われた後に、装置は、オリゴヌクレオチドを合成するプロセスを開始する準備ができている。制御プログラムの操作を図８に示す。ここで、第１工程200は、カップリングされる全ての支持体を脱保護することである。観察される32個の支持体がプロトタイプユニット内に配置され得るが、カップリングされる支持体の実際の数は、任意の特定の実行の際に、１〜 32個まで変化し得る。 DNAを合成する化学は周知であり、それゆえ詳細には説明しない。工程200での脱保護操作の一般的な目的は、支持体に結合した誘導体化ヌクレオシドから５' 保護成分を除去することである。保護成分の除去は、カップリング試薬の付与に対してヌクレオシドを反応性にし得る。いったん脱保護工程が行われると、供給ラインはフラッシングされ、そして脱保護された支持体の全ては工程201で洗浄される。この工程は、次の工程202を行う前に、脱保護化化学試薬の全てが除去されることを保証する。次の工程202は、ヌクレオチド試薬「Ａ」（これは、塩基「アデニン」を含有する試薬の一般名である）の添加を必要とする全ての支持体のカップリング工程である。供給ラインをフラッシングおよびリプライミング（repriming）した後、本発明のプロセスの次の工程203は、ヌクレオチド試薬「Ｃ」（これは、保護された「シトシン」前駆物質を含有する試薬の一般名である）を必要とする全ての支持体をカップリングすることである。工程204では、供給ラインを洗浄およびリプライミングした後、ヌクレオチド試薬「Ｇ」の添加を必要とする全ての支持体のカップリングが行われる。Ｇは、塩基「グアニン」を含有するヌクレオチド試薬の一般名である。同様に、工程205では、塩基「Ｔ」を必要とする全ての支持体のカップリングが実行される。Ｔは、塩基「チミン」を含有するヌクレオチド試薬の一般名である。本発明の装置の操作は、上記で命名されたＡ、Ｃ、ＴおよびＧのヌクレオチド試薬を使用する特定カップリング化学の使用を通じて、本明細書に例示されることを注意すべきである。これらの試薬は、「ホスホトリエステル」および「ホスホネート」化学物質のような現在知られる他のカップリング化学物質と区別するために、しばしばひとまとめにして「ホスホルアミダイト(pho sphoramidite)」または「アミダイト(amidite)」試薬と称される。本発明の装置は、適切にプログラムされ、機械の操作を例示するために本明細書で選択したもの以外のカップリング化学物質と共に用いられ得る。適切なインキュベーション期間の後、減圧をかけ、試薬をカラムから除去して排液リザーバーに送る。カップリングされた支持体の全てを工程206で洗浄して、あらゆる未反応のＡ、Ｃ、ＧおよびＴ試薬を除去する。カップリングされた支持体の全てを工程207で酸化し、そして工程208で再び洗浄する。保護化化合物を添加し、工程209で、カッブリングしなかったあらゆる生成初期のオリゴヌクレオチドをキャップする。カップリングされた支持体を工程210で再び洗浄し、そして追加の試薬を工程200から210の反復によって添加して、順に次の塩基を提供する。表３に示される配列の合成が完了したとき、工程211での照会は、支持体を脱保護する工程212のブランチに進み、そして工程213でそれらを洗浄する。次いで、通常の脱保護を含む最後のワークアップとして、支持体を反応チャンバーから作業台に除去し得る。図９Ａ〜９Ｂは、図８で示されるプロセスの各工程を実行する際に行われる手順のより詳細な説明である。例えば、脱保護工程200（図８）を入力する場合に、工程250〜263の項目の操作が行われる。図９の工程250で示される第１の操作は、回数ｎをセットすることであり、脱保護化試薬は全量0.7mlの試薬を提供するために各カラムに添加される。これを行うために、制御プログラムは、表２に示される入力データの参照を行い、脱保護工程における添加数を確かめる。このデータは、脱保護工程で４回の添加が行われることを示す。すなわち、供給ライン出口は、脱保護化試薬の必要とされる全容量（0.7m1）を各カラムに供給するために、カラムにわたって４つのパスを生じなくてはならず、各々のパスは0.175mlを送り出す。それゆえ、制御プログラムは、工程250の制御パラメーターｎを等価な４にセットする。工程251では、試薬供給ライン出口18は、フラッシュカラム12に移動される。工程252では、リザーバー51中の脱保護化試薬で供給ライン33をプライミングするために、適切なバルブが開かれる。図３を参照すると、バルブ66はライン33および33'を接続するように位置し、そしてバルブ70はライン33'とリザーバー51を接続するように作動する。脱保護化試薬で供給ライン33をフラッシングおよびプライミングした後、バルブ70は閉じられる。工程253では、工程252と同時に行われ、バルブＶ₄はフラッシュカラムを排出するために操作される。カップリングされるカラム数は、表３のような入力データから工程254で制御プログラムによって読み取られ、そして出口18は、工程255でステッパモーターによってカップリングされる最初のカラムに移動される。表３に示される例を参照すると、デバイスの32個のカラム全てがカップリングされる。オリゴID番号09 6Aは、直線状のカラム配置の最初のカラムで合成され、そしてオリゴID番号095B は、列の32番目の最後のカラムで合成される。前記のように、プロトタイプのデバイスは、コンピューターシステムに読み込まれる任意の特定の操作について表３のような入力データを用いて、１から32までの任意の数のオリゴヌクレオチドを合成するために作動し得る。本実施例では、32個全てのカラムが用いられているため、出口18は、工程 255でまず、第１のカラムに移動される。バルブ70は、適切な量の脱保護化試薬（0.175ml）を第１のカラムに提供するのに必要な期間、工程256で開放される。その後、バルブ70は閉じられ、そして工程257で、カップリングされる全てのカラム（この場合、脱保護された全てのカラムである）についてこの工程が完了したかどうかの照会がなされる。この手順のこの時点では、脱保護化試薬は第１のカラムに添加されただけなので、この応答は「いいえ(no)」であり、そして元に戻って、カップリングされる全てのカラムが0.175mlの脱保護化試薬を受け取るまで工程255から257を繰り返す。脱保護化試薬を全ての適切なカラム（この場合、32のカラム）に添加した後、試薬出口18は工程258でフラッシュカラムに移動され、そして工程259でシステムは、脱保護化試薬が生成初期のオリゴヌクレオチドの５'末端をマスクからはずすに必要なインキュベーション時間が完了するまで待機している。表２はその時間を15 秒としている。工程260では、バルブＶ₃を開けて、反応カラムの全ての出口末端に減圧をかけ、カップリングされるカラムから脱保護化試薬を排出する。次いで、工程261でバルブＶ₃を閉め、そしてバルブＶ₂を開いてアルゴンを減圧チャンバー中に導入し、カラムの入口および出口末端の両方の圧力を等しくする。ｎは、工程262でｎ−１に等しくセットされ、脱保護操作のこの時点では、ｎを３にセットする。工程263での照会は、ｎが０に等しいかどうかであり、そしてこの場合は違うので、カップリングされるカラムの全てに２回目の脱保護化試薬を添加するために、元に戻って工程254から263 を繰り返す。脱保護操作工程200の４回の反復の後、ｎは０と等しくなり、そして工程263での照会は、脱保護操作が完了したことを確認する。洗浄工程201（図８）を開始し、脱保護化試薬が残っている供給ラインおよび反応カラムをきれいにする場合、図９Ａおよび９Ｂに示される手順が再び行われる。ただし、ｎは表２に示されるように工程250で５に初期設定される。そして図３を参照して分かるように、工程252で開閉されるバルブはバルブ71である。フラッシュカラムは工程253で排出され、そして工程254でカップリングされる全てのカラムが確認される。工程255〜257は、カップリングされる全てのカラム（この場合、32のカラム）が洗浄薬品を含むまで、行われる。工程258〜263は、適切なインキュベーション時間（２秒）を与え、カラムを排出し、フリットの上下の圧力を等しくし、そしてｎの値を４に減少する操作である。工程254〜263は、５つのパスが完了してｎ＝０になるまで、繰り返される。洗浄プロセス工程201が完了した後、工程202（図８）が、試薬Ａの添加を必要とする支持体の全てをカップリングするために入力される。再び、工程202を行うための詳細な手順を図９に示す。ｎ（カップリング工程における添加数）は、表２に示されるように、工程250で３に等しくセットされ、そしてバルブ61および62は、供給ラインをプライミングするために工程252で開閉される。バルブ66もまた、ライン33"および33を接続するために作動される。アミダイト試薬Ａに加えて、活性化剤もまた試薬Ａと共に供給ラインに導入されることに注意する。このことは、好ましくは、工程252の間にバルブ61および62を迅速に開閉することによって達成されて、供給ライン33のプライミングにおいてアミダイトと活性化剤とを混合する。フラッシュカラムは工程253で排出され、そしてアミダイトＡとカップリングされるカラムの数が、表３の配列入力データを参照することによって、工程254で確認される。表３は、カップリングが行われる配列を示す。上述のように、３'ヌクレオチドは、あらかじめ作製したスターター（starter）支持体から誘導体化され、これはセットアップ手順の一部として適切なカラムに配置される。従って、最初のカップリング物は機械の中で生成されており、表３の３'末端から２番目の塩基を添加する。それゆえ、Ａの最初の添加は、カラム３、４、６、11、15、16、23 、24、27および28の支持体に対してである。Ｃの最初の添加は、カラム１、７、８、12〜14、22および26に対してである。ＧおよびＴの最初の添加についても同様である。第１の添加の完了後、第２添加というように行われ、表３に示される配列の３'から５'方向に合成が進行する。入力データを確認して、出口18は、カップリングされる次のカラム、すなわち、試薬Ａの添加を受ける最初のカラム、カラム３に工程255で移動される。工程256で、バルブ61および62は、迅速な手法で再び開閉されて、アミダイトＡと活性化剤との混合物をカラム３に送り出す。表２に従って、３回の添加のうちこの１回目で、0.1mlをカラム３に供給するに充分な時間、アミダイト／活性化剤混合物は、送達される。そして、３回の全てのパスが完了したときには、全量の0.3mlが送達される。工程257で、アミダイトＡを受け取る次のカラム、すなわち、カラム４に出口1 8を配置する工程255の方に枝分かれが進む。工程256は、0.1mlのアミダイトＡ／活性化剤をカラム４に添加する工程であり、この後、工程255および256の手順がカラム６、11、15、16、23、24、27および28について繰り返される。この手順のこの時点で、アミダイトＡを添加する第１のパスが完了すると、工程257の枝分かれで、工程258および258Aに進む。ここで、出口は、フラッシュ／プライムカラム12の上のホームポジションに移動され、そしてアミダイトＡ、Ｃ、ＴまたはＧが添加されたかどうかの照会では、工程400のブランチに進む。工程400では、３つの手順のうちの１つが、操作を継続するために選択される。これらの３つの別個の手順は、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本発明の装置を利用するプロセスで行われ得る多くのバリエーションの例示である。例えば、手順E1を選択する場合、カップリング工程は、脱保護および洗浄工程に関して上記ですでに説明した同じ手法で行われる。手順E2を選択する場合、この手順は、 E1手順の変形である。ただし、特定の工程は以下に説明するように飛び越される。手順E3を選択する場合、かなり異なる別の手順が、以下に説明するように行われる。図９Ｂの手順E1において、工程259でアミダイトＡのインキュベーション期間（15秒）を完了した後、カップリングされたカラムを工程260で排出し、そして圧力を工程261で等しくする。アミダイトＡを添加する第１のパスがここに完了したので、ｎは工程262で２にセットされ、そしてｎは０ではないので、工程263 の枝分かれでは、アミダイトＡを添加する第２のパスのために工程255に進む。第２のパスの完了後、プロセスは、第３かつ最終のパスに続き、この後工程26 3での照会によって、アミダイトＣを添加するために図８の工程203に戻る。アミダイトＡに関して上記で説明されたE1（図９Ｂ）の手順は、Ｃを必要とすると認識されたカラムにアミダイトＣを添加する際に繰り返される。表３を参照すると、これらのカラムは、制御プログラムによってカラム１、７、８、12〜14 、22および26であると認識される。アミダイトＣを各カラムに添加する３回のパスを完了した後は、ｎ＝０であり、そして供給ラインはフラッシュおよび洗浄される。次いでアミダイトＧが、上記で説明されたのと同様に添加され、次いでアミダイトＴが添加される。４種のヌクレオチド試薬の全てが添加されると、図８に示されるプロセスの次の工程、すなわち、全てのカップリングされた支持体の洗浄を要求する工程206を行うために元に戻る。図９Ａおよび９Ｂに示されるプロセスは、工程206の洗浄操作において再び行われる。このとき、活性化剤およびアミダイト薬品の供給ライン33"を洗浄し得るために、バルブ60が開放される。工程206の完了後、図９Ａおよび９Ｂに示されるプロセスは、酸化工程207の間に再び行われる。これは、ライン33'および33 を接続するようにバルブ66が作動した状態でバルブ67を作動することによって行われる。他の洗浄工程は、バルブ71を含む工程208で行われ、次いでカップリングされた支持体の全ては、工程209でキャップされる。この工程を行うために、バルブ68および69は交互に繰り返し開いて、供給ライン33中で２つのキャッピング試薬を混合させる。カップリングされた支持体は、工程210で再び洗浄される。合成手順のこの時点で、第１のヌクレオチド試薬と、表３に示される32配列のための各スターター物質とをカップリングすることについて、全ての工程が完了した。すなわち、全てのカップリングが成功した場合には、カラム１の支持体は、このとき、すでにあるＴの５'末端に結合したＣを有し；カラム２の支持体は、すでにあるＴの５'末端に結合したＴを有し；カラム３の支持体は、Ｇの５'末端に結合したＡを有し；カラム23の支持体は、Ｇの５'末端に結合したＡを有する、など。理想的には、特定のカラム中で生成される分子の全ては、同じ長さで同じヌクレオチド配列である。しかし、カップリング効率は完全ではなく、そしていくらか少しの割合の分子集団はカップリングし得ない。カップリングに失敗したあらゆる生成初期のオリゴヌクレオチドは、工程209でキャップされ従って、次のカップリング反応には関与しない。このようにして、完全長の配列より短い配列の合成は排除されるか、または最小化される。工程211で、さらに他のカップリングを行うかどうかの照会をはいと回答する。なぜならば、１回目のカップリングしかこの時点では完了していないからである。表３は、調製下における特定の合成が、オリゴヌクレオチドプライマーに20 〜25の長さの範囲の塩基カップリングを提供することを示す。従って、工程211 の枝分かれでは、工程200に進む。そして、各配列に第２の塩基カップリングを追加するために、上述の全プロセスを繰り返す。表３に示されるように、この手順のこの部分の間は、カラム１の支持体はＡを受け取り；カラム２の支持体はＣを受け取り；カラム３の支持体はＧを受け取り、そしてカラム32の支持体はＧを受け取る。プロセスは、第２のカップリングの完了後、全ての塩基が32のカラムの各々に添加されるまで続けられる。全てのカップリングが完了したとき、図８および９の手順は24回行われる。この時点で、工程211で、さらなるカップリングを行うかどうかの照会をいいえで回答し、そして枝分かれを工程212に進む。工程212および213は、上述のように作業台でさらにオリゴ処理を意図する任意選択的な工程である。いくつかの精製方法はトリチル基の存在を利用しているので、工程212および213は、望ましいものであり得ない。これらの工程を行う場合、工程212では、脱保護（脱トリチル化）試薬が、全てのカラムに添加され、脱保護の後、全てのカラムは工程213で洗浄される。前面カバー90を取りはずし、そして32個の支持体カラム11を反応チャンバー10から取り出す。 32位置プロトタイプでの初期実行の結果を表４に示す。表４は、生成した32オリゴヌクレオチドの各々の収量を示す。全収量は、分取ゲルから回収した精製オリゴヌクレオチドの光学密度測定に基いており、そして各配列について約500マイクログラムの平均総収量を示す。このランは６時間で完了し、たとえプロトタイプにおける試薬の使用法を最適化する本格的な試みがなされなかったとしても、先行技術の市販のシングルカラムシンセサイザーで同様の配列を生成するランのわずか約1/4のランで試薬が消費される。試薬消費の節約に加えて、プロトタイプシンセサイザーを用いて32個のオリゴヌクレオチドを合成するのに必要な時間は、先行技術のシングルカラムまたは４のカラムシンセサイザーにより必要とされる時間より著しく少ない。プロトタイプに包含される操作の革新的な主要部、すなわち、カップリングされる各カラムの入口が反応チャンバーの空間に対して開放されている「開放した」流路、移動制御された試薬出口（これは、支持体から支持体に移動し得る）、複数の各カラムと結合した流出深皿、および制御されたチャンバーの空間は、カラムを直列に並べるか、あるいは二次元的配置のカラムを提供するかのいずれかでデバイス中のカラムの数を単に増加することによって、オリゴヌクレオチドプライマーの同時生成をさらに増大させることを可能にする。32を超える追加のカラムを適用させるためのハードウェアおよびソフトウェアの変更は最小であり、このことは先行技術システムとはっきり対照的である。このようなシステムは、試薬供給システムから個々のカラムの全てに至ってぎっしりと配管され、カラムの追加を困難な問題にしている。本明細書に記載される本発明の方法の利点の１つは、送達ラインのシングルプライミングが、１サイクルの間に添加される各アミダイトに必要な全てであることである。プライミングはかなりの量の試薬を消費するので、試薬消費の節減は、送達ラインを各カラムに対して有する先行技術デバイスと比較して相当なものである。同時に調製されるオリゴヌクレオチドの数が多くなればなるほど、本発明の方法の利点は、さらによりいっそう重要となる。種々の工程における試薬の効果的な切り替えは、試薬の節約を改善するが、減圧をかけることによる試薬の除去もまた、有為な改良点であり、必要な試薬の量が節約される。減圧は試薬を吸い込むので、カラムは乾燥され、従って、次の試薬のより効果的な使用が提供される。開放流路の使用は、チャンバー内の雰囲気が制御され得るように、一般に密閉された反応チャンバーを必要とする。制御された雰囲気を維持することなくDNA を合成することは可能であり得るが、収量は悪くなる。なぜならば、この化学は水分にとても敏感であるからである。水分に敏感でない化学が開発されるならば、周囲の条件で機器を操作することが可能である。カラム中に試薬溶液を保持する力、すなわち、表面張力および毛管現象のような力と、試薬をカラムから流出させる力、すなわち、重力および圧力差のような力との間でバランスが達成されることを注意しなくてはならない。バランスを提供することによって、試薬薬品は、インキュベーション期間の間、カラムを飽和させ得るが、圧力差がかけられると、全てのカラムから迅速かつ均一に引き出される。上述のように、本発明の装置はいくつかの様式で作動し、合成を行い得る；フレキシビリティがこの自動化装置の特徴である。例示するために、工程400では、３つの手順のうち１つを選択し得る。ブランチE1の手順は上で選択および説明した。しかし、装置の使用者が手順E2を選択した場合、ブランチは図９Ｃに進む。手順E2への最初のエントリーは、アミダイトＡを添加する第１のパスが完了し、そして移動可能な出口がフラッシュ／プライムカラム12の上のホームポジションに移動したときである。工程258Aで、アミダイトＡ、Ｃ、ＴまたはＧが添加されたかどうかの照会によって、工程400へとブランチを進み、ここで手順E2を選択する。ｎは、アミダイトＡの３回の添加を与えるために、工程250で３に等しくセットされたので、そして１回目のパスがここで完了しているので、ｎは、工程258Bで２にセットされる。ｎは０ではないので、工程258Cのブランチは、工程 258Dに進み、15秒のインキュベーション期間の完了を待つ。その後、アミダイトＡを添加する２回目のパスのために工程255に戻る。この手順のこのバリエーションにおいて、最初に全てのカップリングを排出することなく、そしてフリットの上下の圧力を等しくすることなく工程255に戻ることに注意する。これらの工程は、フリットの多孔度によって試薬が15秒のインキュベーション期間の間に支持体から実質的に流れ去るような場合には飛ばされ得る。このプロセスは、アミダイトＡを添加する第２のパスについて前述したように続き、そして第３かつ最終のパスに続き、その後、工程258Cでの照会によって、インキュベーション期間を待つための工程258Fへとブランチを進む。この期間が完了するとき、全てのカップリングされたカラムは、工程258Gで排出され、そしてフリットの上下の圧力は、工程258Hで等しくされる。この手順のこの時点では、アミダイトＡのみが添加され、それゆえ、図８に示されるようなプロセスの次の主な工程、アミダイトＣを添加するための工程203に戻る。選択された図９Ｃで示されるE2バリエーションに関する図９の手順は、表３を参照して前述したように、アミダイトＣを必要とすると認識されたカラムにＣを添加するために繰り返される。これらのカラムは、制御プログラムによって、カラム１、７、８、12〜14、22および26と認識される。アミダイトＣを各カラムに添加する３回のパスを完了する後、ｎ＝０となり、そして供給ラインはフラッシングおよび洗浄される。次いで、アミダイトＧが上述のように同じ様式で添加され、次いでアミダイトＴが添加される。４つ全てのヌクレオチド試薬が添加されたとき、図８に示されるプロセスの次の工程、すなわち、全ての支持体の洗浄を要求する工程206を行うために戻る。本発明の装置はまた、工程400でE3の選択を通して図10に示されるように制御プログラムを変更することによって、いくらかの追加の試薬薬品を用いる支出で、より速いターンアラウンドを行うために操作され得る。このバージョンにおいては、第１の試薬（例えば、Ａ）を所定のカラムに添加するカップリング工程のための３つのパスのうち最初の終結時に、供給ラインは次の試薬（例えば、Ｃ）でフラッシングおよびプライミングされる。この操作では、15秒という比較的長いインキュベーション期間の終結を待つことなく、試薬Ｃを添加してゆく。試薬Ｃの添加後、次の試薬ＴおよびＧが要求通り添加され、その後、このプロセスは 15秒の一回のインキュベーション期間を待つ。次いで、全てのカップリングされたカラムは同時に排出される。次いで、このプロセスは、あともう２回繰り返されて、完全なカップリング工程に必要とされる３回のパスを達成する。この別法は、図９Ｂおよび９Ｃに示されるE1およびE2プロセスよりも多くの試薬を用いるが、それでもなお、各カラムに個々のラインをプライムした先行技術システムよりも、かなり少ない試薬を使用する。カラムの数が増加するにつれ、本発明のシステムの利点は、ますます大きくなる。図10の別プロセスは、時間的意義において図９Ｂおよび９Ｃに示されるプロセスよりも優れる。なぜならば、機械が待機状態にある比較的長い15秒のインキュベーション期間の回数が著しく減少されるからである。図10の方法を行うために、初期セットアップ手順は、上述と同じであり、そして図８に示される最初の２つの工程、工程200および201が、カップリングされる全ての支持体を脱保護および洗浄するために、前述のように進行する。図８の工程202で、制御プログラムは、試薬Ａが添加されるかどうか最初に決定する。表３の実施例合成ではＡが必要とされるので、試薬Ａを添加するための工程202が行われる。前述のように、図９Ａおよび９Ｂに示される工程250〜258Aは、Ａ試薬を必要とする全ての支持体にＡを添加する第１のパスを完了するために行われる。工程258Aでの照会によって、工程400へとブランチを進み、別法である図10 のE3に進む。図10の工程300において、試薬Ａを添加したかの決定がなされる。この決定は制御プログラム内でされ、このプログラムは必要な場合、工程202でＡの添加を要求する。そして表３の入力データは、Ａの添加を必要としている。あるいは、この決定は、処理装置からのフィードバックよって行われ得る。工程301で、表３の入力データは、試薬Ｃの添加が必要かどうかを決定するために調べられる。その場合、供給ラインは、工程302で、ＡでフラッシングおよびＣでプライミングされ、その後、ヌクレオチド試薬Ｃの添加がその試薬を必要とする全てのカラムになされるまで、工程255〜257が繰り返される。次いで、工程257での照会によって、供給ラインをフラッシュ／プライムカラムに移動させるための工程258 へのブランチに進み、そしてブランチを、再び図10のE3に進む。工程300は、Ａがこの手順のこのループでは添加されなかったので、工程303へとブランチを進む。工程303で、制御プログラムは、試薬Ｃが添加されたことを確認する。次に、表３の入力データは、工程304でレビューされて、試薬Ｇが添加されるべきかどうか決定する。入力データはＧを含むので、供給ラインは、工程305で、ＣでフラッシングおよびＧでプライミングされる。工程255〜257は、Ｇの添加がその試薬を必要とする全てのカラムになされるまで、再び繰り返される。次いで、工程258および258Aが行われて、他のエントリーE3から図10の工程3 00へと進む。この手順のこのループでは、ＡもＣも添加されなかったので、工程300および3 03はいいえと決定されるが、Ｇは添加されているので、工程306では、工程307へとブランチを進み、試薬Ｔが必要とされるかどうか決定する。表３の入力データをレビューし、そして試薬Ｔは添加されるべきなので、工程308で、供給ラインはＧでフラッシングおよびＴでプライミングされる。工程255〜257は、Ｔを、その試薬を必要とする全ての支持体に添加するために再び行われる。工程258および258Aでは再びE3がエントリーされ、図10に進む。工程300、303、および306は全て、いいえで決定されるが、工程310のブランチでは工程311へと進み、15秒の必要とされるインキュベーション期間の完了を待つ。インキュベーション期間の完了後、全てのカラムは工程312で排出され、そしてフリットの上下の圧力差が工程313で等しくされる。この場合、添加される全ての試薬について第１のパスが完了しているので、制御パラメーターｎは、工程314で２に変更される。ｎは０ではないので、ブランチは工程315で工程316に進み、試薬Ａが添加されるかどうかが問われる。表３の入力データはＡを要求しているので、供給ラインは、工程317で、ＴでフラッシングおよびＡでプライミングされる。元に戻って、試薬Ａを要求する全ての支持体が添加を受けるまで、工程255〜257を行う。工程258および258Aでは再びE3がエントリーされ、図10に進む。プロセスは、上述のように、全ての必要とされるカップリング試薬が添加されるまで、すなわち、表３の入力データに対応する合成プロセスのための全てのカップリングが完了するまで続けられる。この時点で、工程315では、図８の工程2 06へとブランチを進み、カップリングされた支持体の全てを洗浄する。プロセスは、前述のように、全ての残りの工程を通して完了される。上述のように、本発明の装置および手順は、多数のDNA（またはRNA）オリゴヌクレオチドの高速、経済的な生成を必要とする多くの状況で価値がある。例えば、１つのこのような状況は、合成DNAがジデオキシ法（dideoxy method）によるD NA配列決定のプライマーとして用いられる分子遺伝子調査においてである。ジデオキシ法によって長い配列を得るための１つの戦略（strategy）は、「プライマーウォーキング(primer-wa lking)」がそうである。この戦略では、長い鋳型が調製され、そして配列決定は１つの末端から開始される。配列はできるだけ遠くにリード（read）され、そして新しいプライマーは、第１の「リード」の末端近くの配列に基づいて化学的に合成される。新しいプライマーを用いて、配列決定の第２ラウンドを開始し、それによって開始配列を伸長する。このプロセスの反復によって、主に鋳型の長さによってのみ制限される長い連続した配列が生成する。しかし、ウォーキングプロセスの各工程は、新しい鋳型に特異的なプライマーの合成を必要とする。プライマーウォーキング戦略による多数の長い鋳型のパラレルなジデオキシ配列決定は、多数の短い鋳型の調製と関連する労力および費用を減少させることによって、およびまた、長い連続した配列を再びアセンブルすることに含まれる努力を軽減させることによって、配列データの獲得を劇的に促進させる可能性を有する。大規模な配列決定プロジェクトのためのパラレルプライマーウォーキングアプローチの費用面で有効な実施が、本発明によって実現される。図２〜７に記載される特定のプロトタイプは、１列のカラムおよび１つの供給ライン出口を有する。二次元的配置のカラムは図１Ｂに示され、そして二次元な移動の可能な出口が、その配置での使用に提供される。また、所望ならば、装置は、１つ以上の移動可能な出口および１つ以上のフラッシュ／プライムカラムを有し得る。この手法において、アミダイトＡに対する15秒のインキュベーション期間の間、第２の出口は、例えば、アミダイトＣを供給し得るか；または、第２の出口は、完全に異なるグループのカラムに供され得る。プロトタイプは、閉じたループ操作のためのフィードバックデータを提供する検出装置を備えてない。このタイプの操作は今日までのところ必要とされないが、明らかにこのような制御は機器に追加され得る。例えば、デバイスが100またはそれ以上のカラムを有するように組み立てられる場合、フィードバック制御が所望され得る。上記の手順において、図２〜７のプロトタイプ機械に関し、機械のセットアップは、表３の配列の３'末端に対応する正しい支持体を含有するカラムの使用を必要とし、これらのカラムは、制御センターの配列データと調整される手法で、キャリアープレート中に載置される。それゆえ、Ｔ支持体を含有するカラムは、位置１、２、12、18、19、20、22、26および32に配置される。Ｇ支持体を含有するカラムは、位置３、４、11、23、24、および31に配置される。同様に、Ａ支持体を有するカラムおよびＴ支持体を有するカラムは、表３の３'データに対応する位置でキャリアートレーに配置される。プロトタイプのための手動セットアップ手順は、オペレーターが順序良く系統的に作業することを必要とし、適切に前（pre）誘導体化した支持体をそれらの正しい位置に配置する。このような操作は、１から４個のカラムを有する先行技術の機器においては問題ではなかった。支持体を置き違える可能性は、32 個のカラムを有するプロトタイプでは増加し、そしてカラムの数が増加するほど、作業はますます退屈となり、誤りを犯しやすくなる。32カラムプロトタイプによってここに例示される本発明の装置は、図１Ｂの二次元的配置に関して上述したように、100またはそれ以上のオリゴの同時合成に応用するために、さらに開発および拡張され得る。支持体を適切なカラム中に手作業で配置する必要を軽減するために、本発明の装置はまた、誘導体化した支持体物質を最初に生成するように用られ得る。そして、これは同じ配置を用いて行われ得、次の合成プロセスに用いられる。種々の支持体物質および種々の化学物質が、誘導体化した支持体を生成するのに公知である。高分子支持体、シリカゲル支持体、セルロースおよび他のものは、制御細孔ガラス（CPG）と同様に公知である。本発明の装置は、これらの種々の支持体を直接誘導体化するために用いられ得ることが想像される。図１Ｂおよび１Ｃに関連して、支持体物質は、直接の誘導体化に適する多孔性フリット様物質であり得る。適切な誘導体化薬品は図３のリザーバー中に置かれ、供給ライン 33は、誘導体化操作の順序において適切な試薬を含有し得る。バルブを操作し、かつ出口18を移動させる制御プログラムは、添加される試薬の量、添加の数およびインキュベーション期間を与える入力情報と共に提供されなければならない。いったん支持体が誘導体化されて洗浄されると、次いで、上記の合成プロセスが、手作業で支持体を置き違えるという危険を招くことなく行われ得る。所望ならば、図１Ｂに示されるようなキャリアープレート８中で誘導体化支持体を生成するために、それ以降の合成プロセスに直接進むことなく、機器を用い得る。この手法において、多くの誘導体化支持体は、次の合成操作のために蓄積され得る。本発明を特定の実施態様について上に記載してきた（例えば、特定の制御プログラムフォーマット）が、フォームおよびディテールの種々の変更は、本発明の意図および範囲から離れることなくその中でなされ得ることが当業者によって理解される。本発明は、反応カラムの入口末端と出口末端との間に圧力差を付与する減圧供給源についても記載されるが、任意の適切な手段によって圧力差を提供することは、本発明の明らかな意図および範囲内である。また、プライマー長のオリゴヌクレオチドの生成は、本装置の主な使用として容易に想像されるが、所望ならば、はるかに長いオリゴヌクレオチドが生成され得る。本発明は、以下の請求の範囲で定義する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グロッセ，ウィリアムマイケルアメリカ合衆国ジョージア 30606，アセンズ，シカモアードライブ 240

Claims

【特許請求の範囲】１．オリゴヌクレオチドの合成を含むプロセスを自動化するための装置であって、以下を含む装置：個々の試薬薬品のリザーバー、バルブおよび出力供給ラインを含む供給システムであって、該供給ラインが該薬品の任意の１つまたはそれ以上で満たされ得るように、該バルブは該リザーバーと該供給ラインとに接続される；該供給ラインの出口を含む反応チャンバー；該反応チャンバー内に配置された反応カラムであって、該反応カラムの入口末端は該反応チャンバー内の空間に対して開放されている：該チャンバー内に配置されたフラッシュ／プライムカラムであって、該フラッシュ／プライムカラムの入口末端は該反応チャンバーの空間に対して開放されている；および該フラッシュ／プライムカラムの該入口末端に近接した最初の位置から、該反応カラムの該入口末端に近接した位置に、該供給ラインの該出口を移動させるための動力手段。２．請求項１に記載の装置であって、前記反応カラムの入口末端と出口末端との間に等しくされる圧力を提供し、試薬薬品添加のための該反応カラムにおいてインキュベーション期間を与えるための、そして該反応カラムの該入口末端と出口末端との間に圧力差を与えて、該インキュベーション期間の完了の際に該反応カラムを排出するための、前記反応チャンバーに接続された圧力手段をさらに含む、装置。３．請求項１に記載の装置であって、少なくとも１つの追加の反応カラムをさらに含み、それによって該装置に多数の反応カラムを提供し、各反応カラムは、前記反応チャンバーの空間に対して開放された入口末端を有し、前記動力手段が、前記供給ラインの前記出口を、該多数の反応カラムの各々の入口末端に近接した位置に移動させる、装置。４．請求項３に記載の装置であって、前記多数の反応カラムの選択された１つの上に、前記供給ラインの前記出口を配置するための、前記動力手段に接続された制御手段をさらに含み、そして前記反応チャンバーに近接して配置され、かつ該反応チャンバーから密閉された流出手段であって、該多数の反応カラムの各々の出口末端と接続する手段をさらに含み；そして該多数の反応カラムの入口末端と出口末端との間に等しくされる圧力を提供し、試薬薬品添加のための該多数の反応カラムにおいてインキュベーション期間を与えるための、そして該多数の反応カラムの該入口末端と出口末端との間に圧力差を提供し、該インキュベーション期間の完了の際に該複数の反応カラムを排出するための、該反応チャンバーと該流出手段とに接続された圧力手段をさらに含む、装置。５．請求項４に記載の装置であって、前記反応チャンバーに挿入および該反応チャンバーから取り出される移動可能なキャリアープレート手段をさらに含み、該移動可能なキャリアープレート手段が、前記多数の反応カラムを保持し、そして該装置のアセンブリの際、該反応チャンバーと前記流出手段との間の空間的な連絡を、該多数の反応カラムを介してのみ可能にする方式で、該反応チャンバーを該流出手段から密閉する、装置。６．請求項５に記載の装置であって、ここで、前記移動可能なキャリアープレート手段が、前記多数の反応カラム内で反応支持物質を誘導体化するために、そして誘導体化の後、該移動可能なキャリアープレートを該装置のアセンブリから取り出すことなくオリゴヌクレオチド合成プロセスを続けるために、該装置中にアセンブルされ、そしてここで、該反応カラムの各々は、前記試薬薬品が該多数の反応カラムに適用される場合にはそれをを維持するための、そして前記圧力差を付与する際には該試薬薬品を前記流出手段まで通過させ得るための多孔性手段を含む、装置。７．請求項４に記載の装置であって、ここで、前記圧力手段は、減圧供給源を包み、そして前記流出手段は流出深皿を包み、該流出深皿は、該減圧供給源と前記多数の反応カラムの出口末端との間に接続され、ここでは、減圧圧力は、全ての反応カラムに同時に付与され、そして前記反応チャンバーを不活性ガスで充満するための、該反応チャンバーに接続された不活性ガスの供給源をさらに含む装置であって、該反応チャンバーは周囲の空間に対して密閉され、そして該不活性ガスの供給源を該流出深皿に接続するためのガスラインをさらに含む装置であって、ここで、該流出深皿は該不活性ガスで充満され、第１のバルブは、該流出深皿への不活性ガスの流れを制御し、そして第２バルブは、該流出深皿と該減圧供給源とを接続し、ここで、該流出深皿は、該第２のバルブを閉じた状態で該第１のバルブを開けることによって、該反応カラムに試薬薬品を付与する前に、不活性ガスで充満され、そしてここで、該流出深皿は該減圧供給源に接続され、該第１のバルブを閉じた状態で該第２のバルブを開けることによって、該多数の反応カラムから試薬薬品を除去し、ここで、該反応カラムの各々は、該試薬薬品が該反応カラムに付与される場合にはそれらを維持するための、そして前記圧力差を付与する際には該薬品を該流出手段まで通過させ得るための多孔性手段を含み、そしてプロセッサー手段および制御プログラムをさらに包む装置であって、該プロセッサー手段は、ランダムアクセスメモリーと、該制御プログラムを保持および作動させ、かつ入力データを保持するための１つまたはそれ以上のディスクおよびディスケットドライブとに接続され、該プロセッサー手段は、前記動力手段を制御するための前記制御手段に接続され、該プロセッサー手段はまた該バルブと接続され、ここで、該プロセッサー手段は該制御プログラムを作動して、該多数の反応カラムに試薬を添加するプロセス、および前記インキュベーション期間の完了後、該多数の反応カラムを排出するプロセスの全ての局面を制御し、そしてディスプレーおよび手動入力手段をさらに包む装置であって、ここで、使用者は、必要とされるように、該制御プログラムおよび該入力データを調整または置換し得る、装置。８．以下の工程を包含する、オリゴヌクレオチドを合成する方法：請求項５に記載の装置を提供する工程であって、ここで、前記移動可能なキャリアープレート手段は、第１および第２のキャリアープレートを含む、工程；該第１のキャリアープレートに、誘導体化した支持体を含有する前記多数の反応カラムを供給する工程；前記反応チャンバー内に該第１のキャリアープレートを配置する工程；第１の操作実行において、カップリングされる反応カラム中でオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、該実行は、コンピューター反応制御センターの制御下である工程；該第１の操作実行の間、該第２のキャリアープレートに、誘導体化した支持体を含有する第２の多数の反応カラムを調製する工程；該第１の操作実行の終結時に、該装置から該第１のキャリアープレートを取り出す工程；および該第１の実行の完了後、第２の操作実行を開始するために、該反応チャンバー内に該第２のキャリアープレートを配置する工程。９．請求項４に記載の装置であって、ここで、各々の前記反応カラムが、同じかまたは異なる長さのオリゴヌクレオチドを生成するための反応支持体を含み、前記試薬薬品が、脱保護化薬品、洗浄薬品、酸化薬品、キャッピング薬品およカップリング薬品を含み、前記制御手段が、以下：カップリングされる各支持体に脱保護化薬品を添加することによって、カップリングされる全ての支持体の脱保護を制御する手段；各支持体から脱保護化薬品を引き出すために、各支持体の入口末端と出口末端との間の圧力差の付与を制御する手段；該支持体の入口末端および出口末端についての該圧力差の除去を制御する手段；適切な洗浄薬品を各支持体に付与することによって、全ての脱保護された支持体の洗浄を制御する手段；各支持体から該洗浄薬品を引き出すために、各支持体の入口末端と出口末端との間の圧力差の付与を制御する手段；カップリングされる該支持体に適切な試薬カップリング薬品を添加することによって、カップリングされる全ての支持体のカップリングを制御する手段；該支持体から該試薬カップリング薬品を引き出すために、各支持体の入口末端と出口末端との間の圧力差の付与を制御する手段；各々の該支持体に適切な洗浄薬品を付与することによって、全てのカップリングされた支持体の洗浄を制御する手段；各々の該支持体に適切な酸化薬品を添加することによって、全てのカップリングされた支持体の酸化を制御する手段；各々の該支持体から該酸化薬品を引き出すために、該支持体の入口末端と出口末端との間の圧力差の付与を制御する手段；各々の該支持体に適切な洗浄薬品を付与することによって、全ての酸化された支持体の洗浄を制御する手段；該カップリングした支持体の各々に適切なキャッピング薬品を付与することによって、全てのカップリングした支持体のキャッピングを制御する手段；各々の該支持体から該キャッピング薬品を引き出すために、該支持体の入口末端と出口末端との間の圧力差の付与を制御する手段；各々の該支持体に適切な洗浄薬品を付与することによって、全てのキャッピングされた支持体の洗浄を制御する手段をさらに含み；ここで、全ての支持体のカップリングを制御する該手段は、以下：第１の試薬薬品、例えばＡを必要とする全ての支持体のカップリングを制御するための第１の手段；第２の試薬薬品、例えばＣを必要する全ての支持体のカップリングを制御するための第２の手段；第３の試薬薬品、例えばＧを必要とする全ての支持体のカップリングを制御するための第３の手段；第４の試薬薬品、例えばＴを必要とする全ての支持体のカップリングを制御するための第４の手段；および第２、第３または第４の試薬をこれらの試薬を必要とするカラムに加える前に、該第１のカップリング試薬を、この試薬を必要としている全てのカラムに加えることについて、該第１、第２、第３および第４の手段の作動を順次制御するための手段、をさらに含む、装置。１０．請求項９に記載の装置であって、ここで、前記支持体のカップリングを制御するための前記手段が、各試薬を、この試薬を必要とする各支持体に複数回添加することの適用を制御するための手段を含み；ここで、該支持体のカップリングを制御するための該手段は、以下：供給ラインの出口をフラッシュカラムの入口に移動することを開始するために、異なる試薬で支持体をカップリングする合間にエネルギーが与えられる、活性化手段；適切な洗浄薬品の付与によって、該供給ラインの洗浄を制御するための手段；および次のカップリング試薬での該供給ラインのプライミングを制御する手段、を含む、装置。１１．オリゴヌクレオチドを合成するための装置を操作する方法であって、ここで、該装置は、多数の試薬を有する供給システム、同じかまたは異なる長さのオリゴヌクレオチドを同時方式で生成するための複数の反応支持体、および、支持体から支持体に移動させることによって、該多数の試薬を該支持体に供給するための移動可能な試薬出口を含み、以下の工程：脱保護化薬品を各支持体に添加することによって、カップリングされる全ての支持体を脱保護する工程；各支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、各支持体から脱保護化薬品を引き出す工程；該圧力を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；適切な洗浄薬品を各支持体に付与することによって、全ての脱保護された支持体を洗浄する工程；各支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、各支持体から該洗浄薬品を引き出す工程；該圧力差を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；適切な試薬カップリング薬品を該支持体に添加することによって、カップリングされる全ての支持体をカップリングする工程；各支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、該支持体から該試薬カップリング薬品を引き出す工程；該圧力差を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；適切な洗浄薬品を各々の該支持体に付与することによって、全てのカップリングされた支持体を洗浄する工程；該支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、該支持体から該洗浄薬品を引き出す工程；該圧力差を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；適切な酸化薬品を各々の該支持体に添加することによって、全てのカップリングされた支持体を酸化する工程；該支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、各々の該支持体から該酸化薬品を引き出す工程；該圧力差を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；適切な洗浄薬品を各々の該支持体に付与することによって、全てのカップリングされた支持体を洗浄する工程；該支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、各々の該支持体から該洗浄薬品を引き出す工程；該圧力差を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；適切なキャッピング薬品を各々の該カップリングされた支持体に付与することによって、全てのカップリングされた支持体をキャッピングする工程；該支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、各々の該支持体から該キャッピング薬品を引き出す工程；該圧力差を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；適切な洗浄薬品を各々の該支持体に付与することによって、全てのカップリングされた支持体を洗浄する工程；該支持体の入口末端と出口末端との間に圧力差を付与し、各々の該支持体から該洗浄薬品を引き出す工程；該圧力差を除去し、そして該支持体の入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；を包含し、そしてここで、全ての支持体をカップリングする該工程は、以下の工程：第１の試薬薬品、例えばＡを必要としている全ての支持体を最初にカップリングする工程；次いで第２の試薬薬品、例えばＣを必要としている全ての支持体をカップリングする工程；次いで第３の試薬薬品、例えばＧを必要としている全ての支持体をカップリングする工程；次いで第４の試薬薬品、例えばＴを必要としている全ての支持体をカップリングする工程；を包含する、方法。１２．請求項１１に記載の方法であって、ここで、カップリングの各工程が、各の試薬を、この試薬を必要とする各支持体に複数回添加することを必要とし；ここで、全てのカップリング試薬の一回の添加が、インキュベーション期間を待つ前に行われ、そしてここで、異なる試薬薬品をカップリングする各工程の合間に以下の工程が行われる、方法：試薬薬品の供給ラインの出口をフラッシュカラムの入口に移動する工程；および適切な洗浄薬品を付与することによって、供給ラインを洗浄し、次いで該供給ラインに次のカップリング試薬を試験する工程。１３．装置を用いてオリゴヌクレオチドを合成する自動化方法であって、該装置は、ホスホルアミダイト塩基Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧ、脱保護化薬品、洗浄薬品、キャッピング薬品および酸化薬品のような多数の試薬を有する供給システム、反応チャンバーの空間に対して開放された入口末端、および出口末端を各々が有する複数の反応カラムであって、該反応カラムの少なくとも１つはオリゴヌクレオチドを生成するための支持体を有する反応カラム、該カラムを排出するために該反応カラムにわたって圧力差を付与および除去するための手段を含み、少なくとも１つの供給出口は該反応チャンバー内に配置され、該出口は、該供給出口および選択された反応カラムの入口末端の位置を合わせることによって該供給システムから該反応カラムに送達するための供給ラインと接続され、該装置は、選択された反応カラムおよび供給出口の位置合わせを制御するために、そして選択された反応カラムにおける試薬および薬品の添加および除去を制御するために、どの反応カラムが該供給出口に合わせされるべきかを選択するための手段を含む制御システムによって制御され、以下の機械式工程を包含する、方法：供給出口、およびこのような支持体を有する各々の選択された反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで脱保護化薬品を各々のこのようなカラムに供給することによって、カップリングされる支持体を脱保護する工程；各反応カラムの入口末端と出口末端との間に第１の圧力差を付与し、カップリングされる各支持体から脱保護化薬品を除去する工程；該第１の圧力差を除去し、そして該反応カラムの入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；供給出口、およびこのような支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、脱保護された支持体を洗浄する工程；各反応カラムの入口末端と出口末端との間に第２の圧力差を付与し、カップリングされる各支持体から該洗浄薬品を除去する工程；該第２の圧力差を除去し、そして該反応カラムの入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；供給出口、およびこのような支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な試薬カップリング薬品をこのような反応カラムに供給することによって、カップリングされる支持体をカップリングする工程；各反応カラムの入口末端と出口末端との間に第３の圧力差を付与し、各カップリングされた支持体から該試薬カップリング薬品を除去する工程；供給出口、およびカップリングされた支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、カップリングされた支持体を洗浄する工程；各反応カラムの入口末端と出口末端との間に第４の圧力差を付与し、該カップリングされた支持体から該洗浄薬品を除去する工程；該第４の圧力差を除去し、そして該反応カラムの入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；供給出口、およびカップリングされた支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な酸化薬品を、カップリングされた支持体を有する各々の反応カラムに供給することによって、カップリングされた支持体を酸化する工程；各反応カラムの入口末端と出口末端との間に第５の圧力差を付与し、各々の酸化された支持体から該酸化薬品を除去する工程；該第５の圧力差を除去し、そして該反応カラムの入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；供給出口、および酸化された支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、酸化された支持体を洗浄する工程；各反応カラムの入口末端と出口末端との間に第６の圧力差を付与し、各々の酸化された支持体から該洗浄薬品を除去する工程；該第６の圧力差を除去し、そして該反応カラムの入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；供給出口、およびカップリングされた支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切なキャッピング薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、酸化された支持体をキャッピングする工程；各反応カラムの入口末端と出口末端との間に第７の圧力差を付与し、各キャップされた支持体から該キャッピング薬品を除去する工程；該第７の圧力差を除去し、そして該反応カラムの入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程；供給出口、およびキャップされた支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、キャップされた支持体を洗浄する工程；該反応カラムの入口末端と出口末端との間に第８の圧力差を付与し、キャップされた支持体を有する各々のこのような反応カラムから該洗浄薬品を除去する工程；該第８の圧力差を除去し、そして該反応カラムの入口末端および出口末端の圧力を等しくする工程。１４．請求項１３に記載の方法であって、ここで、カップリングの各工程が、各試薬を、この試薬を必要とする各支持体に複数回添加することを必要とし、そしてここで、カップリングの各工程が、この試薬を必要とする全ての支持体に対する一回の添加が完了した後、インキュベーション期間を待つことをさらに包含する、方法。１５．請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記装置は、前記反応チャンバーの空間に対して開放された入口末端、および出口末端を有するフラッシュ／プライムカラムを含み、そしてここで、異なる試薬薬品をカップリングする各工程の合間に以下の工程が行われる、方法：供給出口と該フラッシュプライムカラムの入口末端との位置を合わせる工程；および適切な洗浄薬品を付与することによって、該供給ラインを洗浄し、次いで該供給ラインを次のカップリング試薬でプライミングする工程。１６．請求項１３に記載の方法であって、ここで、カップリングの各工程が、各試薬を各支持体に複数回添加することを必要とし、そしてここで、全てのカップリング試薬の一回の添加が、インキュベーション期間を待つ前に行われる、方法。１７．請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記装置は、前記反応チャンバーの空間に対して開放された入口末端、および出口末端を有するフラッシュ／プライムカラムを含み、そしてここで、異なる試薬薬品をカップリングする各工程の合間に以下の工程が行われる、方法：供給出口と該フラッシュ／プライムカラムの入口との位置を合わせる工程；および適切な洗浄薬品を付与することによって、前記供給ラインを洗浄し、次いで該供給ラインを次のカップリング試薬でプライミングする工程。１８．脱保護化薬品、洗浄薬品、キャッピング薬品および酸化薬品を保持する多数のリザーバー、ならびに４種のホスホルアミダイト試薬Ａ、Ｃ、ＴおよびＧを含有するリザーバーを有する供給システムを含む装置の使用によってオリゴヌクレオチドの合成を制御するための制御システムであって、該装置は、前記反応チャンバーの空間に対して開放された入口末端、および出口末端を各々が有する多数の反応カラムを保持する反応チャンバーを有し、該反応カラムの少なくとも１つはオリゴヌクレオチドを生成するための支持体を有し、少なくとも１つの供給システム出口は該反応チャンバー内に配置され、該出口は、該供給出口および選択された反応カラムの入口末端の位置を合わせることによって該供給システムから該反応カラムに送達するための供給ラインに接続され、以下を含む制御システム：どの反応カラムが該供給出口に位置合わせされるべきかを選択するためのシグナルを提供する手段；該供給出口および選択された反応カラムの位置合わせを制御するためのシグナルを提供する手段；選択された反応カラムに添加される試薬および薬品の量を制御するためのシグナルを提供する手段；該供給出口、およびカップリングされる支持体を有する各々の選択された反応カラムの入口末端を合わせ、そこで脱保護化薬品を各々のこのようなカラムに供給することによって、カップリングされる全ての支持体を脱保護するためのシグナルを提供する手段；供給出口、および脱保護された支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、脱保護された支持体を洗浄するためのシグナルを提供する手段；供給出口、およびカップリングされる支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な試薬カップリング薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、カップリングされる支持体をカップリングするためのシグナルを提供する手段；供給出口、およびカップリングされた支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、カップリングされた支持体を洗浄するためのシグナルを提供する手段；供給出口、およびカップリングされた支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な酸化薬品を、カップリングされた支持体を有する各反応カラムに供給することによって、カップリングされた支持体を酸化するためのシグナルを提供する手段；供給出口、および酸化された支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、酸化された支持体を洗浄するためのシグナルを提供する手段；供給出口、およびカップリングされた支持体を有する各反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切なキャッピング薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、酸化された支持体をキャッピングするためのシグナルを提供する手段；供給出口、およびキャップされた支持体を有する各々の反応カラムの入口末端を位置合わせし、そこで適切な洗浄薬品を各々のこのような反応カラムに供給することによって、キャップされた支持体を洗浄するためのシグナルを提供する手段。１９．請求項１８に記載の制御システムであって、カップリング試薬の、カップリング試薬を必要とする全てのカップリングされた支持体への一回の添加の完了の後、カップリング試薬のための第１のインキュベーション期間を与えるシグナルを提供する手段をさらに包含する、制御システム。２０．請求項１８に記載の制御システムであって、ここで、前記装置が、前記反応チャンバーの空間に対して開放された入口末端を有するフラッシュ／プライムカラムを含み、以下をさらに含む制御システム：該フラッシュ／プライムカラムと供給出口とを位置合わせするためのシグナルを提供する手段；および供給ラインを洗浄するためのシグナルを提供する手段。２１．請求項１８に記載の制御システムであって：全てのカップリング試薬の一回の添加の達成が完了した後、カップリング試薬について第１のインキュベーション期間を与えるためのシグナルを提供する手段をさらに包含する、制御システム。２２．請求項１８に記載の制御システムであって、前記装置が、前記反応カラムの入口末端と出口末端との間に圧力差を付与および除去するための手段を包含し：該圧力差を付与および除去するためのシグナルを提供する手段をさらに包含する、制御システム。２３．請求項１８に記載の制御システムであって：次の試薬が反応カラムに添加される前に、各試薬がその試薬を必要とする全ての反応カラムに供給されるように、４種の試薬Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧの送達を順番に行うシグナルを提供する手段をさらに包含する、制御システム。