JPH08506837A - アシル化タンパク質凝集物、ならびに抗体に対するイムノアッセイ試験での信号増強へのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、−ＣＯ−Ｒ基（式中のＲはＣｌ−Ｃ４アルキル基で、カルボキシ、ヒドロキシ、ＳＯ₃ＨあるいはＰＯ₃Ｈ₂で置換されていてもよい）でアシル化したタンパク質凝集物に関するものであり、このタンパク質凝集物は、抗体を検出するイムノアッセイで、信号強度を増大させ、偽陰性の結果を防止するために使用される。本発明は、このタンパク質凝集物を含有する、緩衝液含有試薬ならびに免疫学的結合相手物質含有結合試薬にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アシル化タンパク質凝集物、ならびに抗体に対する イムノアッセイ試験での信号増強へのその使用 本発明は、アシル化タンパク質凝集物、その製造、ならびに免疫検定用薬剤 および試薬中でのその使用、ならびに抗体検出イムノアッセイおよび対応する免 疫学的検出方法での信号増強物質としてのその使用に関するものである。 免疫学的検出方法は、近年重要性を増してきた。免疫学的検出方法を用いる と、生体試料中の薬剤、ホルモン、タンパク質、そして特に感染性生物の存在を 迅速かつ正確に検出することができる。いずれの免疫学的検出方法でも、第一の 特異結合相手物質、検出対象物質（被検体）、ならびにリガンドと反応して結合 する第二の特異結合相手物質との間で特異結合反応が生じる。リガンドと、特異 的なリガンド結合相手物質とは、特異結合対を形成し、この特異結合対は、通常 、抗原と抗体あるいは抗体フラグメントとの複合体である。各反応で、２種以上 のリガンドあるいは結合相手物質が相互に反応することも可能である。こうした 特異結合反応は、種々の方法で検出される。一般には、特異結合反応に関与する 一方の物質を標識しておく。通常の標識方法では、放射線アイソトープ、色素原 、蛍光原、あるいは酵素標識を用いる。不均一系イムノアッセイでは、結合相手 物質の一方を固相上に固定化しておく。 不均一系イムノアッセイ、特にいわゆるサンドイッチイムノアッセイでの抗 原に対する特異的抗体の検出は、第一インキュベ ーション工程で、固相に結合しておいた抗原を、大抵はヒトの血清あるいは血漿 である分析対象試料と接触させることによって行う。インキュベーションの間に 、試料中に含まれている抗原に対する抗体が、壁部に結合しておいた抗原と結合 する。反応後、試験混合物を洗浄し、第二の反応工程で、測定対象の抗体クラス に対する標識を有する二次抗体を用いて、固相に結合した抗体を検出する。この 検出は、第二インキュベーション工程で、測定対象の抗体クラスに対する標識（ モノクローナルあるいはポリクローナル）抗体、あるいは標識被検体の類似物が 、第一インキュベーション工程で壁部結合抗原と結合した抗体と結合することで 可能となる。ＩｇＧ抗体を検出する場合には、標識抗−ＩｇＧ抗体を使用するの が好ましく、ＩｇＭ抗体を使用する場合には、標識抗−ＩｇＭ抗体を使用するの が好ましい。第二インキュベーション工程の後、試験混合物を洗浄し、結合しな かった過剰な標識抗−抗体あるいは被検体類似物を除去する。第三工程で、結合 した抗体の量の検出を、たとえば、酵素イムノアッセイの場合、試験混合物を基 質溶液と反応させ、その結果生じる発色を測光して測定することによって行う。 この発色の吸収あるいは信号は、結合した抗体の量に比例する。 こうした抗体イムノアッセイの特定の実施態様では、抗原を固相に直接結合 せず、アッセイの前、あるいは好ましくはアッセイ中に、他の特異結合相手物質 を介して固相に結合する。ある好適な方法では、ビオチンを共有結合しておいた 抗原を、ストレプトアビジンでコーティングした固相に結合する。 抗体試験でのある種の干渉が、特に、ＨＩＶ、ＨＣＶのよう な抗原に対するＩｇＧ抗体や、トキソプラズマ症抗体などを検出する間に生じる ことを見いだした。抗原に対する抗体（たとえばＨＣＶに対する抗体）を高濃度 で含有しているヒト血清の同量の試料を、こうした抗原に対する抗体を含有して いない各種の血清で希釈すると、いずれの血清も特異抗体の総含量は同一である にもかかわらず、希釈血清からの抗体の回収量には有為な差異が生じるのである 。酵素イムノアッセイでは、血清希釈試料で生じる信号は、生じるはずの信号よ り２−１０倍も低かった。こうした現象が生じる理由はよくわかっていないが、 ヒト血清が、特異抗体の抗原への結合を妨害する物質を含んでいることが考えら れる。別の、あるいは追加の説明としては、ヒト血清中に含まれるこうした物質 が、第二インキュベーション工程での結合抗体の検出を妨害していることも考え られる。血清成分によって生じる信号のこうした大幅な低減は、弱い陽性の血清 を調べる場合には特に致命的で、へたをすると血清を陰性であると判定すること となり、その結果、不正確な診断を招くことになってしまう。 したがって、本発明の一つの目的は、抗体を検出するイムノアッセイで信号 を十分に増大させて、偽陰性の分析結果を低減あるいは防止することにある。こ の目的は、イムノアッセイを行う際に、特にアシル化したタンパク質凝集物を使 用することによって達成される。 本発明の一主題は、抗体測定イムノアッセイでの信号強度を増大させる物質 であるタンパク質凝集物であり、この物質は、−ＣＯ−Ｒ基でアシル化されてい る。ここでＲは、枝分かれあるいは非枝分かれＣ１−Ｃ４アルキル残基であり、 カルボキシ、ヒド ロキシ、ＳＯ₃ＨあるいはＰＯ₃Ｈ₂基で置換されていてもよい。 本発明の別の主題は、イムノアッセイでの信号強度を増大させる対応する手 段であり、この手段は、緩衝液と、信号強度を増大させる本発明の物質の１種な いし数種とを含有するものである。 本発明の別の主題は、測定対象抗体に対する結合相手物質を含有する抗体測 定イムノアッセイ用特異結合試薬であり、さらに、イムノアッセイでの信号強度 を増大させる本発明の物質の１種ないし数種あるいは手段を含有することを特徴 としている。 本発明のさらに別の主題は、本発明の物質または本発明の信号増大手段を、 抗体に対する特異結合相手物質、特に非標識の結合相手物質と接触させることに よって、抗体測定イムノアッセイでの信号を増大させ、偽陰性の分析結果を減ら す方法である。 本発明の特定の主題としては、信号強度を増大させて偽陰性の結果を防止しつ つ試料中の抗体を測定する方法があり、この方法は、 −抗体について調べる試料を、その抗体の１種ないし数種の特異結合相手物 質と接触させ、その際、少なくとも１種の結合相手物質を標識しておいて、抗体 との間で検出可能な結合対を形成させ、 −標識結合対あるいは遊離標識結合相手物質の信号を、試料中の抗体の存在 あるいは濃度の指標として測定する ことによって試料中の抗体を測定し、その際、試料あるいは特異結合物質の１種 に、−ＣＯ−Ｒ基でアシル化した凝集タンパク質を添加することを特徴としてい る。ここでＲは、枝分かれあるいは非枝分かれＣ１−Ｃ４アルキル残基であり、 カルボキシ、ヒド ロキシ、ＳＯ₃ＨあるいはＰＯ₃Ｈ₂基で置換されていてもよい。 試料は、通常、体液、たとえば、血液、血清あるいは血漿、唾液、尿をはじ めとする体液で、特に血清あるいは血漿である。 検出対象の抗体は、抗原に対するあらゆる抗体、特にイムノグロブリン抗体 である。 特異結合相手物質は、特異結合対の測定対象抗体と特異的に反応する任意の 生物学的あるいは化学的結合相手物質とすることができ、特に、抗原、ハプテン 、ならびに抗−抗体とすることができる。 イムノアッセイに用いる特異結合相手物質の少なくとも１種は、標識してお く。標識しておくことによって、たとえば放射能、化学発光、燐光、蛍光、ある いは電気化学発光を介して、または可視色によって、信号を直接あるいは間接に 測定することが可能となる。特異結合相手物質に、酵素標識、ビオチンあるいは アビジン標識などを行って、いくつかの反応に関与して検出可能な物質を生じる 間接的に検出可能な物質とすることもできる。酵素標識、特に、ペルオキシダー ゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、あるいは電気化学発光標 識が好適である。本発明では、検出対象抗体に対する標識抗−抗体を利用するの が好適である。 本発明の信号増強物質は、アシル化したタンパク質凝集物である。タンパク 質凝集物は、同種あるいは異種の定義済みのタンパク質単量体を重合して高分子 の粒子とした凝集物であると理解されたい。定義としては、タンパク質凝集物は 、水溶液中でも個々の分子に分解しないように互いにしっかりと結合した少なく と も２つ、好ましくは３−４０，０００個、特に好ましくは３０−６００個のタン パク質単量体から構成される人工的な粒子であると理解されたい。好適な態様で は、タンパク質凝集物は水に可溶である。 タンパク質の重合凝集は、熱あるいは化学物質を用いた方法によって行うこ とができる。 熱重合方法では、高温を加えることによってタンパク質単量体を複合させて 凝集体とする。タンパク質の熱凝集については、アルブミンを使用した凝集がＥ Ｐ−Ａ−２６９０９２に記載されている。 タンパク質単量体の化学重合は、非タンパク質含有ホモあるいはヘテロニ官 能性リンカー分子を用いて行う。タンパク質を連結するこうした方法は、当業者 にとって公知であり、たとえば、ＧＢ−Ａ１５０５４００、ＥＰ−Ａ−０１２２ ２０９、あるいはＥＰ−Ａ−２６９０９２に記載されている。タンパク質単量体 をヘテロニ官能性リンカーに連結する例としては、ビス（マレインイミド）メチ ルエステル、ジメチルスベリミデート、ジスクシンイミジルスベレート、グルタ ルジアルデヒド、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ ネート、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルスクシンイミド、Ｎ−スクシン イミジル（４−イオジンアセチル）アミノベンゾエート、またはマレインイミド ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＨＳ）あるいはマレ インイミドベンゾイル−ＮＨＳ（ＭＢＳ）とＮ−スクシンイミジル−３−アセチ ル−チオプロピオネート（ＳＡＴＰ）との反応を挙げることができる。ホモ二官 能性リ ンカーの例としては、ジアミノヘキサン、カルボジイミドなどがある。 好適実施態様では、本発明の方法は、熱的な方法で複合凝集したタンパク質 重合体を利用する。熱重合してからアシル化、特にアセチル化あるいはスクシニ ル化したアルブミン、好ましくは血清アルブミン、特にウシ血清アルブミン（サ ーモＢＳＡ）が特に好適である。アシル化されていないサーモウシ血清アルブミ ンは、ＥＰ−Ａ２６９０９２に記載されている。 重合は、ある程度大型で均一な粒径のタンパク質凝集物の粒子が生成するよ うに実施、制御するのが有利である。粒径は、１０−２００ｎｍ、特に２０−５ ０ｎｍとするのが特に有利である。これは、２４０，０００Ｄａ−２．２ｘ１０⁹ Ｄａ、特に好適には２．２ｘ１０⁶−３５ｘ１０⁶Ｄａの分子量に相当する。粒 径は、通常の公知の方法、たとえはＰＣＳ（光子相関分光分析）によって測定す ることができる。場合によっては、本発明に特に適した粒径範囲を、ゲル濾過に よって粗重合生成混合物から分離して、特に均一な粒径を得ることもできる。 重合に使用するタンパク質単量体は、同一のものを用いることも、各種の異 なったものを用いることもできる。均質なタンパク質単量体を重合するのが好適 で、アルブミン単量体が特に適当である。アルブミン単量体としては、いずれの 動物アルブミンあるいはヒトアルブミンも使用できるが、特に血清アルブミンを 使用することができる。本発明では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が特に好適 である。 本発明では、タンパク質凝集物を−ＣＯ−Ｒ基でアシル化す る。ここでＲは、枝分かれあるいは非枝分かれＣ１−Ｃ４アルキル残基で、カル ボキシ、ヒドロキシ、ＳＯ₃ＨあるいはＰＯ₃Ｈ₂で置換されていてもよい。特に 好適な置換基は、カルボキシ基である。 アシル基は、タンパク質単量体に含有させておくことも、タンパク質重合体 の重合後にタンパク質凝集物に含有させることもできる。タンパク質のアシル化 は、公知の方法で、好ましくはアシル無水物あるいはアシル−Ｏ−スクシンイミ ドを用いて実施することができる。アセチル化あるいはスクシニル化タンパク質 凝集物、特にアルブミン凝集物が特に有利であることがわかった（Ｒ＝メチルお よび／またはＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）。アセチル化に際しては、酢酸−Ｏ−ス クシンイミドが好適である。スクシニル化に際しては、琥珀酸無水物を使用する のが好適である。 アシル化の過程では、タンパク質凝集物の本質的に遊離状態のアミノ基（た とえばリシン残基）をアシル化する。アシル化タンパク質凝集物という用語は、 存在する遊離アミノ基の少なくとも１つがアシル化されていることを意味する。 しかし、全遊離アミノ基がほぼ完全にアシル化されているのが好適である。 本発明の別の主題は、免疫試験用緩衝液と、本発明の干渉低減用物質とを含 む免疫試験での干渉低減剤である。使用が可能な緩衝液としては、イムノアッセ イで通常使用されているすべての水性緩衝液、たとえばリン酸塩、グリシン−Ｈ Ｃｌあるいはグリシン−ＮａＯＨ、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、または有機緩 衝液、たとえばイミダゾール／ＨＣ、トリエタノールアミン、ＭＥＳ（４−モル フォリノエタンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（ＴＲＩＳ （ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチ ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−Ｎ−モルホリノ−プ ロパン−スルホン酸）、ならびに他の類似した緩衝液が挙げられる。緩衝塩類の ｐＨ値ならびに濃度は、たとえば、それが使用されるイムノアッセイ、また酵素 ラベルに使用する酵素に応じて決まる。通常、ｐＨ値は４−９の範囲である。通 常の緩衝液の濃度は、１ｍＭ−１Ｍの範囲である。 干渉低減用物質の濃度は、干渉低減剤を接触させる物質に含まれる免疫試験 成分ならびに干渉成分の量に応じたものとする。通常のイムノアッセイでは、免 疫試験成分、特に非標識ビオチン相手物質と接触させた後の干渉低減剤中の干渉 低減用物質の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ−５０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは５ｍｇ ／ｍｌ−２０ｍｇ／ｍｌの範囲という高濃度とする必要がある。個別の事例によ っては、２００ｍｇ／ｍｌの濃度が必要となることもある。 本発明の干渉低減剤は、さらに別の物質、たとえば保存剤などを含有するこ ともできる。イムノアッセイに使用するうえでは、干渉低減剤は、水性緩衝液中 に存在させるのが好適である。さらに、本発明の干渉低減剤は、多孔質担持物質 （フリース）、たとえば試験片に含浸させるのに使用したり、固形形状、たとえ ば凍結乾燥物として保存したりすることも可能である。 本発明の別の主題は、特異結合対の相手物質、ならびに本発明の干渉低減物 質あるいは干渉低減剤を有する特異免疫結合試薬である。 本発明では、イムノアッセイの特異結合相手物質の１種ない し数種、ならびに本発明の干渉低減物質の少なくとも１種あるいは干渉低減剤を 混合することによって、結合試薬を得る。必要に応じて、添加剤、たとえば保存 剤あるいは安定剤なども加えることができる。特異結合相手物質の量は、使用す るイムノアッセイ、結合する相手物質の量、使用する標識の種類といった要因を はじめとする種々の要因に応じて決まる。一般に、濃度の範囲は１−２０μｇ／ ｍｌである。 結合試薬中のアシル化タンパク質凝集物の量は、１ｍｇ／ｍｌ−５０ｍｇ／ ｍｌの範囲とするのが有利で、５−２０ｍｇ／ｍｌの範囲とするのが好適である 。単離された事例では、２００ｍｇ／ｍｌ以下の濃度が必要となることもある。 標識結合試薬は、特異結合リガンドの存在あるいは不在と検出するうえで特 異結合相手物質が有用であるような任意の均質系あるいは不均質系イムノアッセ イで用いることができる。例としては、サンドイッチ検定、競合イムノアッセイ をはじめとする当業者にとって公知の各種のイムノアッセイを挙げることができ る。試験は、溶液中で行うことも、固相担体上で行うこともできる。 一般に、本発明のイムノアッセイを行うにあたっては、リガンドを含有する 試料を、本発明の溶液中の特異結合試薬と反応させる。すると、抗体と、その特 異結合相手物質との間で、特異結合複合体が直接あるいは間接に形成される。抗 体と、その特異結合相手物質は、直接複合体を形成することができ、その場合、 結合相手物質はリガンドに対して特異的である。しかし、結合相手物質が、１つ または数個の特異結合分子を介して、リガンドと複合体を形成し、こうした結合 分子がさらに抗体と結合することも 可能である。 本方法を、固相担体、たとえば試験管、マイクロタイタープレート、あるい は試験用担体上での不均質系イムノアッセイとして実施する場合には、抗体に対 する特異結合相手物質を、担体上に直接固定化することができる。しかし、抗体 の結合相手物質に対する特異結合相手物質を、担体上に固定化するのが好適であ る。好適な例としては、ビオチニル化した結合相手物質に対する特異結合試薬と しての固定化したストレプトアビジンがある。こうした不均質系イムノアッセイ の種々の変種は専門家に公知である。 競合イムノアッセイでは、抗体と、標識抗体類似物質とが、非標識リガンド 結合相手物質をめぐって競合する。この非標識リガンド結合相手物質は、不均質 系イムノアッセイの場合と同じく、第二の結合部位、好ましくはビオチンのよう な特異結合部位を介して固相に結合することができる。 サンドイッチイムノアッセイでは、リガンドは、第一の特異結合部位で標識 結合相手物質と結合し、第二の結合部位で非標識リガンド結合相手物質と結合す る。この非標識リガンド結合相手物質は、不均質系イムノアッセイの場合と同様 に、固相用に別の特異結合部位を有している。したがって、抗体、標識結合相手 物質、ならびに非標識結合相手物質の間で、複合体が形成される。不均質系の試 験では、複合体は、非標識結合相手物質を介して固相と結合し、たとえば、洗浄 によって遊離標識結合相手物質から分離することができる。遊離あるいは結合状 態の標識リガンド結合相手物質を、公知の方法によって、測定対象リガンドの存 在あるいは量の指標として測定する。酵素標識を使用する場合には、 色形成性の酵素基質を標識種に加え、その結果生じる発色を測定する。 本発明の物質の効果は、サンドイッチイムノアッセイ、特に不均質系サンド イッチイムノアッセイで、特に有利なかたちで発揮される。 非標識結合相手物質を含有する試料を、溶液中で本発明のアシル化したアル ブミン凝集物とともにインキュベートし、この工程の後に標識結合相手物質を加 えると、本発明の物質の効果を特に有利に生かすことができることが経験上示さ れた。 本発明の別の主題は、本発明の物質のイムノアッセイでの使用である。また 、本発明の特定の主題の一つは、イムノアッセイで信号強度を増大し、偽陰性の 分析結果を減らすにあたっての、本発明の物質の使用である。抗体検出イムノア ッセイに際して本発明の物質あるいは手段を使用すると、抗体の濃度が低くて本 発明を使用しないかぎりほとんど測定不能な信号でも、有意に増強されることが 経験的に示された。イムノアッセイの感受性はかなり上昇し、本発明の物質を使 用しなければ陰性と判定されたであろう試料でも、抗体に関して陽性であるとは っきり特定することが可能となる。信号の増大は２−５倍にも上る。本発明の重 合体物質によって抗体試験での信号がこのようにドラスチックに増大することは 予想外であった。というのは、本発明の物質が存在すると、インキュベーション 溶液の粘度が増大し、抗体ならびに抗体−抗原複合体の壁部までの拡散が低減す るからである。そうした場合、試験での信号は、通常、低減すると予測される。 本発明のさらに別の主題は、本発明の物質を製造する方法で ある。この方法の特徴とするところでは、第１工程で、タンパク質、好ましくは アルブミン、特にウシ血清アルブミンを、二官能性のリンカーを用いた化学凝集 反応で凝集させ、その際、化学凝集反応は、熱凝集反応とするのが好ましい。好 適な粒径は１０−２００ｎｍの範囲であり、特に好適なのは２０−５０ｎｍの範 囲である。熱凝集は、５０−１００℃の範囲、さらに好ましくは６０−８０℃の 範囲の温度で行うのが好ましい。次に、第２工程で、−ＣＯ−Ｒ−基によるアシ ル化を適当なアシル化剤を用いて行う。アシル化は、アシル化剤を用いて行い、 たとえばＨＰＬＣによって監視するのが好ましい。 しかし、ＵＳ−Ａ−５，０５１，３５６にしたがってタンパク質をアシル化 し、その後アシル化したタンパク質を熱あるは化学的に重合することによって、 この方法を逆順で実施することも可能である。実施例１ アセチル化サーモＢＳＡが、ＨＣＶ陽性の血清の信号に対して及ぼす影響 ベーリンガー・マンハイム製のエンザイムン−テスト（Enzymun- イ １．インキュベーション用緩衝液 リン酸ナトリウム ４０ミリモル／１、ｐＨ７．４ 塩化ナトリウム ７．１ｇ／１ Ｎ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ １ｇ／１ ２−クロロアセトアミド １ｇ／リットル 診断に基づいた血漿（Plasma-diagnostic-based） ２１０ｍｌ／ｌ ビオチニル化ＨＣＶペプチド （抗原に応じて５−１００ｎｇ／ｌ） ０−１％の範囲の各種濃度のアセチル化サーモＢＳＡ （０．１％＝１ｍｇ／ｍｌ、粒径３０ｎｍ） ２．複合体形成用緩衝液 リン酸緩衝液 ４０ミリモル／ｌ、ｐＨ７．０ ウシアルブミン １ｇ／ｌ ウシＩｇＧ ４ｇ／ｌ トリトンＸ１００ １ｇ／ｌ 抗ヒトＦｃγ抗体（ヒツジ）−ＰＯＤ ３．基質緩衝液 リン酸／クエン酸 １０ミリモル／ｌ、ｐＨ４．４ Ｈ₂Ｏ₂ ３．２ミリモル／ｌ ＡＢＴＳ １．２ミリモル／ｌ ベーリンガー・マンハイム社製の装置であるＥＳ６００で、試料１−４を用いて 試験を行う。 第１工程： １時間： ストレプトアビジンでコーティングした試験管中での、 ２０μｌの試料＋０．５ｍｌのインキュベーショ ン用緩衝液のインキュベーション。 第２工程： １時間： ０．５ｍｌの複合体を含む複合体形成用緩衝液の添加。 洗浄工程 第３工程： 色素原を有する０．５ｍｌの基質緩衝液との１時間のインキュベー ション。 ４２２ｎｍでの基質溶液の測定。 表１に、アセチル化サーモＢＳＡの濃度の増大が、試料１−４の測定値に及ぼす 影響を示す。ブランクの値が同じままであるのに対し、アセチル化サーモＢＳＡ の濃度を上昇させた場合には、信号が有意に増大する。結果から、感受性が有意 に増大することが示される。 実施例２ 各種粒径のアセチル化サーモＢＳＡを用いた抗ＨＣＶ試験 インキュベーション用緩衝液に、２５ｎｍ−８５ｎｍの範囲の各種粒径のアセチ ル化サーモＢＳＡ５ｍｇ／ｍｌを含有させる以外は、実施例１にしたがって試験 を行う。 結果を表２に示す。 ＨＣＶ−陰性血清において信号の増大が全くないのに対し異なった粒径のサー モＢＳＡを使用したとき、有意な信号増加が見られる。 実施例３ インキュベーション用緩衝液に、各種粒径のスクシニル化サーモＢＳＡを含有さ せる以外は、実施例２にしたがって試験を行う。 実施例４ アセチル化熱凝集ウシ血清アルブミン（アセチル化サーモＢＳＡ）の調製 １．熱凝集ＢＳＡの調製 １ｇのＢＳＡを、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０ ）中で７０℃に加熱し、この温度に４時間保つ。次に、溶液を冷却し、濾過し、 超遠心（排除限界：３０，０００Ｄａ）を用いて５０ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。 次に、容積３０倍の再蒸留水に対して透析し、凍結乾燥する。得られた生成物は 、分子量が約７００，０００、粒径が３０±８ｎｍ（光子相関分光分析（ＰＣＳ ）で測定）である。 ２．サーモＢＳＡのアセチル化 １００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中の４０００ｇの熱凝集Ｂ ＳＡを、２５℃に加熱する。タンパク質濃度をＯＤ２８０ｎｍによって測定して から、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌに調整する。正確な値に調整するにあたっ ては、必要に応じて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を使用する ことができる。このサーモＢＳＡ溶液を、撹拌容器にいれ、２５℃に加熱する。 酢酸のヒドロキシスクシンイミドエステル溶液（濃度１００ｍｇ／ｍｌ）を、水 を含まない室温のＤＭＳＯに溶解する。アセチル化サーモＢＳＡ溶液１リットル あたり、１１．５ｍｌのスクシンイミドエステル溶液を加える。その結果、ＤＭ ＳＯ中の最終濃度は、約１％となる。ｐＨ値をチェックしてから （目標値６．５−９）、アセチル化混合物を２５℃で１２０分間かきまぜる。酢 酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの減少を、ＴＳＫ３０００／ＨＰＬＣ で監視する（２６０ｎｍで検出）。インキュベーションの後、塩酸リシン溶液を 最終濃度５ｍＭまで加えて、アセチル化工程を停止させる。 停止させたアセチル化反応の生成物を、フィルタープレスで濾過する。次に 、プレスを水で洗浄し、濾液と洗浄液を一緒にする。 一緒にした濾液をポリスルホン膜１０ＫＤで５０リットルまで濃縮する。濃 縮溶液を、容積で１０倍の２０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）に対して ダイアフィルトレーションすると、濃縮液は、ダイアフィルトレーション用緩衝 液によって２倍の容積に希釈されるので、当初の容積まで再度濃縮する。ダイア フィルトレーションの生成物を、ＴＳＫ３０００／ＨＰＬＣ分析で測定する。溶 液を８０±１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、その後、０．１％クロロアセトアミドなら びに０．０１％ＭＩＴ（メチルイソチアゾロン）で安定化させる。 ＰＣＳで測定したところ、粒径は３０ｎｍ±１５であった。実施例５ 化学的に重合され、アセチル化されたウシ血清アルブミン（Ｐ−ＲＳＡ−Ｓｕｃ ｃ）の調製 １．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の重合 ａ）マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＨＳ）による ＢＳＡの活性化 ３ｇのＢＳＡを３０ｍｌの３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に 溶解し、１８０ｍｇＭＨＳ／ｍｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を０． ６ｍｌ加える。２５℃で１時間インキュベートしてから、溶液にリシンを１０ｍ Ｍまで加え、１５０倍の容積の透析用緩衝液（１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液／ ５０ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／ｐＨ６．２） に対して透析を行う。 ｂ）Ｓ−アセチルチオプロピオニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＡＴＰ ）によるＢＳＡの活性化 ３ｇのＢＳＡを３０ｍｌの３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解し、１４０ ｍｇＳＡＴＰ／ｍｌＤＭＳＯ溶液を０．６ｍｌ加える。２５℃で１時間インキュ ベートしてから、溶液に１０ｍＭまでリシンを加え、１５０倍の容積の透析用緩 衝液（１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液／５０ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ／ｐ Ｈ６．２）に対して透析を行う。 ｃ）活性化ＢＳＡ成分の重合 （ｂ）で調製したＳＡＴＰで活性化したＢＳＡを含有している溶液に、２５ ｍＭまでヒドロキシルアミンを加え、ｐＨを７．５に調整し、２５℃で１時間イ ンキュベートした。その後、（ａ）で調製した、ＭＨＳで活性化したＢＳＡを含 有している溶液を加え、２５℃でさらに４５分間インキュベーションを続ける。 １０ｍＭのシステインを加えることによって重合を停止する。さらに３０分間経 過した時点で、溶液に２５ｍＭまでＮ−メチルマレインイミドを加え、１５０倍 の容積の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／０．１５ＭＮａＣｌ／ｐＨ７．２に対 して透析を行う。 ２．スクシニル化 ０．１ｇ琥珀酸無水物／１ｍＩＤＭＳＯ溶液２．６ｍｌを、（１）で得られ た透析済みのポリＢＳＡ溶液に加える。２５℃で６０分間インキュベートしてか ら、溶液に５０ｍＭまでリシンを加え、１５０倍の容積の２０ｍＭリン酸カリウ ム緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析し、凍結乾燥した。

【手続補正書】 【提出日】１９９５年１１月１０日 【補正内容】 請求の範囲 １．−ＣＯ−Ｒ基（式中のＲは、置換または未置換の、枝分かれもしくは非枝分 かれ低級アルキル基である）でアシル化したタンパク質凝集物。 ２．タンパク質がアルブミンであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパ ク質凝集物。 ３．アルブミンがウシ血清アルブミンであることを特徴とする、請求項２に記載 のタンパク質凝集物。 ４．ＲがＣ１−Ｃ４アルキル基で、カルボキシ、ヒドロキシ、ＳＯ₃ＨまたはＰ Ｏ₃Ｈ₂基で置換されていてもよいことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１ つに記載のタンパク質凝集物。 ５．Ｒがメチル基あるいは−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＯＯＨ基であることを特徴とする、 請求項４に記載のタンパク質凝集物。 ６．タンパク質凝集物がホモあるいはヘテロの二官能性リンカーで化学的に凝集 されたものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つに記載のタン パク質凝集物。 ７．タンパク質凝集物が熱によって凝集されたものであることを特徴とする、請 求項１〜５のいずれか１つに記載のタンパク質凝集物。 ８．タンパク質凝集物が熱によって凝集されたアセチル化あるいはスクシニル化 ウシ血清アルブミンであることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質凝集 物。 ９．アシル化タンパク質凝集物の粒径が１０−２００ｎｍの範囲であることを特 徴とする、請求項１〜８のいずれか１つに記載のタ ンパク質凝集物。 10．粒径が２０−５０ｎｍの範囲であることを特徴とする、請求項９に記載のタ ンパク質凝集物。 11．請求項１〜１０のいずれか１つに記載のタンパク質凝集物および緩衝液を含 有することを特徴とする、抗体検出用のイムノアッセイにおいて信号を増強する ための作用剤。 12．緩衝液のｐＨ値が４−９の範囲であることを特徴とする、請求項１１に記載 の作用剤。 13．抗体検出イムノアッセイに用いる、抗体の１種または数種の特異結合相手物 質を含有する特異結合試薬であって、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のア シル化タンパク質凝集物または請求項１１もしくは１２に記載の作用剤を含有し ていることを特徴とする特異結合試薬。 14．結合相手物質が標識またはビオチニル化された結合相手物質であることを特 徴とする、請求項１３に記載の特異結合試薬。 15．結合相手物質が抗原であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載 の特異結合試薬。 16．結合相手物質が標識抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の特異 結合試薬。 17．１）抗体について調べる試料を、抗体の１種または数種の特異結合相手物質 と接触させて、抗体との間で検出可能な結合対を形成させ、ここで少なくとも１ 種の結合相手物質が標識されており、 ２）標識結合対または遊離標識結合相手物質の信号を、試料中の抗体の存在 または濃度の指標として測定する ことによって信号強度を増大させることにより偽陰性の結果を防 止しつつ試料中の抗体を測定する方法であって、試料および少なくとも１種の特 異結合相手物質を、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のアシル化タンパク質 凝集物と接触させることを特徴とする方法。 18．抗体がウイルスに対するものであることを特徴とする、請求項１７に記載の 方法。 19．非標識結合相手物質が測定対象抗体と結合可能な抗原またはエピトープであ ることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。 20．標識結合相手物質が抗−抗体であることを特徴とする、請求項１７〜１９の いずれか１つに記載の方法。 21．まず、試料と非標識結合相手物質をアシル化タンパク質凝集物と接触させ、 次に、標識結合相手物質を加えることを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれ か１つに記載の方法。 22．非標識結合相手物質が固相に結合させた結合相手物質用の別の結合部位を有 することを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれか１つに記載の方法。 23．非標識結合相手物質がビオチニル化されていることを特徴とする、請求項２ ２に記載の方法。 24．請求項１〜１０のいずれか１つに記載のアシル化タンパク質凝集物をイムノ アッセイにおいて使用する方法。 25．イムノアッセイでの信号強度を増大させ、偽陰性の測定値が生じるのを防止 するために、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のアシル化タンパク質凝集物 を使用する方法。 26．請求項１に記載のアシル化タンパク質凝集物を調製するための 方法であって、 ａ）タンパク質単量体を重合させて凝集物を形成し、 ｂ）タンパク質凝集物を対応するアシル化剤でアシル化する ことを特徴とする方法。 27．タンパク質を熱によって重合することを特徴とする、請求項２６に記載の方 法。 28．タンパク質凝集物をアセチル−Ｏ−スクシンイミドでアセチル化するか、ま たは琥珀酸無水物でスクシニル化することを特徴とする、請求項２６に記載の方 法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シュミッド，フランツ ドイツ連邦共和国 ディー―86911 ディ ッセン，ビルケノー 15番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． −ＣＯ−Ｒ基（式中のＲは、枝分かれあるいは非枝分かれＣ１−Ｃ４アル キル残基で、カルボキシ、ヒドロキシ、ＳＯ３ＨあるいはＰＯ₃Ｈ₂基で置換され ていてもよい）でアシル化したタンパク質凝集物。 ２． タンパク質がアルブミンであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載 のタンパク質凝集物。 ３． アルブミンがウシ血清アルブミンであることを特徴とする請求の範囲第２ 項に記載のタンパク質凝集物。 ４． Ｒがメチル基あるいは−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＯＯＨ基であることを特徴とする 請求の範囲第１から３項に記載のタンパク質凝集物。 ５． タンパク質凝集物が、ホモあるいはヘテロの二官能性リンカーで化学的に 凝集されたものであることを特徴とする請求の範囲第１から４項に記載のタンパ ク質凝集物。 ６． タンパク質凝集物が、熱によって凝集されたものであることを特徴とする 請求の範囲第１から４項に記載のタンパク質凝集物。 ７． タンパク質凝集物が、熱によって凝集されたアセチル化あるいはスクシニ ル化ウシ血清アルブミンであることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のタン パク質凝集物。 ８． アシル化タンパク質凝集物の粒径が１０−２００ｎｍの範囲であることを 特徴とする請求の範囲第１から７項に記載のタンパク質凝集物。 ９． 粒径が２０−５０ｎｍの範囲であることを特徴とする請求の範囲第８項に 記載のタンパク質凝集物。 １０．緩衝液を含有している、抗体検出イムノアッセイでの信号を増強する手段 で、請求の範囲第１から９項に記載のタンパク質凝集物を含有することを特徴と する手段。 １１．緩衝液のｐＨ値が４−９の範囲であることを特徴とする請求の範囲第１０ 項記載の手段。 １２．抗体検出イムノアッセイに用いる、抗体の１種ないし数種の特異結合相手 物質を含有する特異結合試薬で、請求の範囲第１から９項に記載のアシル化タン パク質凝集物または請求の範囲第１０もしくは１１項に記載の手段も有している ことを特徴とする特異結合試薬。 １３．結合相手物質が、標識あるいはビオチニル化された結合相手物質であるこ とを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の特異結合試薬。 １４．結合相手物質が抗原であることを特徴とする請求の範囲第１２または１３ 項に記載の特異結合試薬。 １５．結合相手物質が標識抗体であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記 載の特異結合試薬。 １６． １）抗体について調べる試料を、抗体の数種の特異結合相手物質の１種 と接触させて、抗体との間で検出可能な結合対を形成し、ここで少なくとも１種 の結合相手物質が標識されており、 ２）標識結合対または遊離標識結合相手物質の信号を、試料中の抗体の 存在または濃度の指標として測定する ことによって信号強度を増大させることにより偽陰性の結果を防止しつつ試料 中の抗体を測定する方法であって、 試料ならびに少なくとも１種の特異結合相手物質を、請求の範囲 第１から９項に記載のアシル化タンパク質凝集物と接触させることを特徴とする 該方法。 １７． 抗体がウイルスに対するものであることを特徴とする請求の範囲第１６ 項に記載の方法。 １８． 非標識結合相手物質が、測定対象と結合可能な抗原あるいはエピトープ であることを特徴とする請求の範囲第１６または１７項に記載の方法。 １９． 標識結合相手物質が、抗−抗体であることを特徴とする請求の範囲第１ ６から１８項に記載の方法。 ２０． まず、試料と非標識結合相手物質をアシル化タンパク質凝集物と接触さ せ、次に、標識結合相手物質を加えることを特徴とする請求の範囲第１６から１ ９項のいずれかに記載の方法。 ２１． 非標識結合相手物質が、固相に結合させた結合相手物質用の別の結合部 位を有することを特徴とする請求の範囲第１６から２０項のいずれかに記載の方 法。 ２２． 非標識結合相手物質がビオチニル化されていることを特徴とする請求の 範囲第２１項に記載の方法。 ２３． 請求の範囲第１から９項のいずれかに記載のアシル化タンパク質凝集物 のイムノアッセイへの使用。 ２４． イムノアッセイでの信号強度を増大させ、偽陰性の測定値が生じるのを 防止するにあたっての請求の範囲第１から９項のいずれかに記載のアシル化タン パク質凝集物の使用。 ２５． 請求の範囲第１項に記載のアシル化タンパク質凝集物を生成するにあた り、 ａ）タンパク質単量体を重合させて凝集物を形成し、 ｂ）タンパク質凝集物を、対応するアシル化剤でアシル化する ことを特徴とする方法。 ２６． タンパク質を熱によって重合することを特徴とする請求の範囲第２５ 項に記載の方法。 ２７． タンパク質凝集物を、アセチル−Ｏ−スクシンイミドでアセチル化する か、あるいは琥珀酸無水物でスクシニル化することを特徴とする請求の範囲第２ ５項に記載の方法。