JPH09504094A

JPH09504094A - 磁性ラテックス粒子および非磁性粒子を用いて免疫物質をアッセイする方法

Info

Publication number: JPH09504094A
Application number: JP7505617A
Authority: JP
Inventors: エステーベ，フレデリック; アミラル，ジャン; パドゥラ，クリスティアノ; ソリナス，イサベラ
Original assignee: ソシエテディアグノスティカ−スターゴ
Priority date: 1993-07-28
Filing date: 1994-07-27
Publication date: 1997-04-22
Also published as: ATE177533T1; FR2708348B1; DE69417039D1; EP0711414A1; EP0711414B1; FR2708348A1; WO1995004279A1; DE69417039T2

Abstract

(57)【要約】第１の免疫材料により感作された磁性ラテックス粒子からなる免疫試薬、ならびに第２の免疫材料により感作された非磁性粒子からなる免疫試薬を包含し、前記第１の免疫材料または前記第２の免疫材料は試験予定の免疫物質のコンジュゲートであり、一方他のものは前記コンジュゲートのコンジュゲートであるかまたは前記免疫物質のいずれかであるシステムを用いて、抗原および抗体からなる群から選択される免疫物質をアッセイする方法。

Description

【発明の詳細な説明】磁性ラテックス粒子および非磁性粒子を用いて免疫物質をアッセイする方法発明の分野本発明は免疫反応：抗原＋抗体→抗原−抗体のための「支持体」として働く磁性ラテックス粒子および該反応において「タッグ(tag)」として働く非磁性粒子を用いる、抗原および抗体からなる群から選択される免疫物質をアッセイするための新規な方法に関する。本発明はまた新規な工業的産物として、免疫材料で感作(sensitize)された前記磁性粒子および非磁性粒子を包含するアッセイキットにも関する。従来技術歴史的には、コンジュゲート抗体（またはそれぞれ抗原）と接触せしめることによる抗原（またはそれぞれ抗体）により感作されたラテックス粒子の肉眼的凝集（すなわち裸眼にとって視認可能な凝集）に基づくアッセイ方法が始めてJ.M. SINGER，American Jounal of Medicine,31 766-779(1961)による論文に記載されたことは知られている。これらのアッセイ方法は、透過または回析（すなわち拡散）された光強度の変動を用いることにより、肉眼的規模での凝集の検出を顕微鏡的規模での抗原／抗体凝集反応の検出によって置き換えることによりそれらの感度および反応時間に関して改善されている。これにより比濁法（タービジメトリー、trubidimetry）および比濁法（ネフェロメトリー、nephelometry）による定量的および定性的アッセイが提案されるに至っている。タービジメトリー（光吸収の測定による）の分野においては、360 nmでの吸収の測定による（β２−ミクログロブリン）アッセイのための抗（β２−ミクログロブリン）抗体で被覆したミクロン以下のラテックス粒子（平均直径：０．７９マイクロメートル）の使用がA.M.BERNARD ら、Clin，Chem.，27（6）832-837(19 81)および A.M.BERNARDおよびR,R,LAUWERYS，Clin，Chem.,Acta，119 335-339(1 982)による論文から知られており、マイクロカップにおける血清イムノグロブリンをアッセイするためのモノクローナルまたはポリクローナル抗IgＧ抗体の使用は Y.MAYNARDら、Clin，Chem.,32(5)752-757(1986)による論文から知られている。ネフェロメトリー（光拡散の測定による）の分野では、ウサギIgＧをアッセイするための抗ウサギIgＧ抗体で被覆されたミクロン以下のラテックスビーズ（平均直径：０．３マイクロメートル）使用が J.GRANGEら，Journal of Immunologi cal Methods，18 365-375(1977)による論文から知られている。このラテックスビーズは、この場合、抗ウサギIgＧ抗体である。リガンドを結合するためのＣＯＯＨ基を含有するカルボキシル化ポリスチレンからなる。前記論文は特に「吸着された抗原または抗体を含有するラテックス球の調製は、アッセイ媒体のｐＨおよびイオン強度が変化する場合はそれらが自己凝集を受ける傾向があるゆえに標準化困難である。」と指摘している。また、ネフェロメトリーアッセイ（波長５５０nmおよび観察アングル９０°での読み）を行うための、抗体に共有結合した直径３００nmを有するラテックス球（ポリスチレン）の使用は Anne-Marie BONNEFOYら、C.R.Acad.Sci.Paris，283 Series D,pp.115-118,1976年７月５日、による論文から知られている。要約すると、０．１mg/ml（タービジメトリー法）より高いかまたは０．０２m g/ml（ネフェロメトリー法）より高い免疫物質濃度に関して使用できるタービジメトリー法およびネフェロメトリー法は、非常に「特定化された」装置およびサンプルの前処理を必要とする。これらの方法は幾つかの欠点により限定される、すなわち： − 安定で標準化された懸濁液を調製することの困難。 − 抗体または抗原で感作されたラテックスの自然発生的自己凝集。 − 検量曲線の測定範囲の小ささ（光学濃度（ＯＤ）の変動は０．３〜０．４を越えない）。 − 感度と再現性の欠如。 − ある場合には（ばらばらにするための）、使用前の微粒子状試薬の処理、および試薬の低い安定性。および − 方法の実施困難および時として複雑な検出。これらの欠点が大きいゆえに、これらの方法は実際的利益があるにもかかわらず活用されていない。さらに、試験予定の相当する抗原の存在下における抗体（またはそれぞれ抗原）により感作されたミクロン以下のラテックス粒子からなる試薬の凝集によるタービジメトリーアッセイまたはネフェロメトリーアッセイ法は US-A-5 175 112（J.AMIRAL ら）から知られており、この方法はラテックスの種類、該ラテックスの粒子の粒度分布、該粒子の安定化法、液体反応媒体のイオン強度およびｐＨを特別に選択することにより、感度を改善するのに役立つ（タービジメトリーによる感度閾値約１００ng/mlおよびネフェロトメリーによる感度閾値約１０ng/ml）。さらに、磁性ラテックス粒子そしてより詳細には常磁性ラテックス粒子（こられはラテックス粒子製造者により「超常磁性」ラテックス粒子と呼ばれる）を包含するアッセイキットが知られている。こられのキットと共に供給されるアッセイプロトコル（特に AMERS HAM および CIBA-CORNING 社により市販されるキットのプロトコル）は、免疫材料により感作された前記磁性ラテックス粒子がＥＩＡ（「エンザイムイムノアッセイ」）法またはＲＩＡ（「ラジオイムノアッセイ」）法において、濾過または遠心分離操作と置き代わるために主に使用されるという意味で、本発明のそれと異なる方法を活用していると思われる。特に、磁性ラテックス粒子を含有する知られたキットのアッセイプロトコルは、（ｉ）凝集の分野に関与せず、そして（ ii）一方では、特に直接アッセイまたは「バック」アッセイ（すなわち試薬または希釈剤を付加的に注入することもすすぐこともなく、同じ媒体および同じ反応容器中で操作することによる）と呼ばれる本発明による好ましい方法を記載も示唆もせず、他方では単一工程での競合的阻害による他方に関する「直接」アッセイ（「バック」アッセイの反対）も記載も示唆もしていない。さらに、測定／同定法がUS-A-4 115 535（I.GIAEVER），JP-A-5 180 842(NIPP ON PAINT Co.Ltd.)[DERWENT DATABASE WPI,No.93-267053に要約され、1993年７月23日に刊行された]およびWO-A-8606493(LABSYSTEMS OY) から知られており、この方法は、 (1) (a)磁性粒子ならびに非磁性着色粒子であり同じ抗原により感作された粒子を(b)該抗原の特異的抗体を含有する可能性のあるサンプルと反応させ、そして (2) 磁場を適用して液体反応媒体の非凝集部分中における前記サンプル中の前記抗体の存在を示す光学濃度低下を観察する、ことを包含する。この競合／凝集技法は、それにもかかわらず、知られたＥＩＡおよびＲＩＡ法に比較して充分に高感度でないという欠点を有する。また、生物学的流体のサンプル中に存在する可能性のある抗体の測定法（または同定法）もEP-A-0410 893(MITSUBISHI KASEI)から知られており、この方法は以下のことを包含する： (1) 前記サンプルを、(a)前記抗体の特異的抗原により感作した非磁性粒子、および(b)抗体を固定する材料（例えばタンパクＡ、または抗体のＦｃフラグメントを固定する他の物質）により感作した磁性粒子を包含する混合物と反応させ、 (2) 磁場を適用して凝集しなかった非磁性粒子を磁性粒子と分離し、そして (3) 凝集しなかった非磁性粒子の量を評価して前記サンプル中に存在する抗体の量を測定する。この後者技術においては、Ｆｃを固定する材料により感作された磁性粒子は測定すべき抗体と抗原との反応を増幅する手段として作用する。しかしながら、この技術は既知ＥＩＡおよびＲＩＡ法に比較して充分に高感度でないという欠点を有する。発明の目的本発明の目的の一つは、実質的より速やかで、タービジメトリー、ネフェロメトリーまたは磁場による以前に知られた凝集測定法より付随的により高感度である、顕微鏡的規模での凝集によるアッセイ、測定または同定のための新規な技術的解決を提案することである。感度に関する理想的な目的は、ＥＩＡおよびＲＩＡ法の閾値（アッセイすべき免疫物質の最小濃度が10ng/ml〜１ng/mlの範囲にある）に到達するために、ＥＩＡ技術の通常の洗浄を必要としない凝集技法または均質一工程技法を用いることである。本発明のもう一つの目的は、タービジメトリー、ネフェロメトリーまたは磁場による凝集を測定するための技法の前記した欠点を克服することである。本発明によれば、免疫物質〔Ｘ〕をアッセイまたは同定するための新規な技術的解決が意図され、これは磁性および非磁性粒子を使用するもので、これら粒子のうち（ｉ）ある粒子は前記免疫物質の〔抗Ｘ〕コンジュゲートにより感作され、そして（ii）他方の粒子は前記免疫物質〔Ｘ〕、前記〔抗Ｘ〕コンジュゲートの〔抗（抗Ｘ）〕コンジュゲートまたは前記〔抗Ｘ〕コンジュゲートと同一またはそれとは異なるコンジュゲートで感作される。発明の主題これらの目的は、一方では第１の免疫材料により感作された磁性ラテックス粒子からなる免疫試薬、および他方では第２の免疫材料により感作された非磁性粒子からなる免疫試薬を包含し、前記第１の免疫材料および第２の免疫材料の一方が試験予定の免疫物質のコンジュゲート(conjugate)であり、そして他方が前記コンジュゲートのコンジュゲートであるかまたは前記免疫物質であるシステムの非凝集部分を検出するのに役立つ（比較的簡単な実験室光度計を用いて）本発明による新規な技術的解決のおかげで達成される。本明細書で使用するコンジュゲートなる用語は、「発明の詳細な記載」なる頭書きで始まる区分の初めの方で後記する定義と一致する。本発明によれば、抗原および抗体からなる群から選択され試験予定のサンプル中に存在する可能性のある免疫物質（Ｘ）をアッセイ、同定または測定する方法がそれゆえ推奨され、この方法は（ｉ）磁性ラテックス粒子および（ii）非磁性ラテックス粒子を使用し、（１°）液体媒体中で前記試験予定であって前記免疫物質を含有しうるサンプルを生物学的に知られた量の（Ａ）第１の免疫材料により感作された磁性ラテックス粒子からなる免疫試薬、および（Ｂ）第２の免疫材料により感作された非磁性粒子からなる免疫試薬、と接触せしめ、ここで前記第１の免疫材料および第２の免疫材料の一方は試験予定の前記免疫物質（Ｘ）の（抗Ｘ）コンジュゲートであり、第２のものは (a)前記（抗Ｘ）コンジュゲートと同じかまたはそれと異なる前記免疫物質のコンジュゲートであるか、または(b)前記免疫物質であるかまたは前記（抗Ｘ）コンジュゲートの（抗（抗Ｘ））コンジュゲートであり；（２°）生成する反応媒体を１時間を越えない時間インキュベートし；（３°）磁場を適用して、生成する反応媒体中の前記磁場により転置された磁性生成物を前記磁場により影響されなかった非磁性生成物から分離し；次に、（４°）免疫反応および前記磁場により影響されなかった非磁性生成物のみを含有する、得られる反応媒体の一部分を観察することにより、試験予定のサンプル中に存在しうる前記免疫物質（Ｘ）を評価する、ことにある工程を包含することを特徴とする。本発明によれば、試験予定のサンプル中に含有されうる免疫物質（Ｘ）をアッセイ、同定または測定するためのアッセイキットであって、（Ａ）第１の免疫材料により感作された磁性ラテックス粒子からなる免疫試薬、および（Ｂ）第２の免疫材料により感作された非磁性粒子からなる免疫試薬、を包含することを特徴とするキットも提案される。略語便宜上本発明では以下の略語が使用されている。ＣＭＶサイトメガロウィルスを表わす。ＤＦＤｐに属する特定のモノマーフラグメントを表わす。ＤＤｉＦｎＤｐに属する特定のダイマーＤフラグメントを表わす。ＥＩＡエンザイムイムノアッセイを表わす。Ｆ(ab) 分枝ａおよびｂを有し、Ｉｇ抗体のパパイン（papaine）による開裂により得られるフラグメントを表わす。Ｆ(ab')₂ 分枝ａおよびｂを有し、Ｉｇ抗体のペプシンによる開裂により得られるフラグメントを表わす。Ｆｃ実質的に分技ｃからなり、Ｉｇ抗体の化学的または酵素的開裂により得られるフラグメントを表わす。Ｆｃフラグメント類は同族であるが開裂様式により構造的に異なる（Ｆ(ab)およびＦ(ab')₂から分離されたＦｃに関しては刊行物FR-A-2 645 647に示される詳細を参照されたい）。ＦＤＰ FgDPまたはFnDP分解産物を表わす。 FgDP フィブリノーゲン分解産物を表わす。 FnDP フィブリン分解産物を表わす。ＧＭＶジャーマン麻疹ウィルスを表わす。 HBcAb Ｂ型肝炎コア抗体を表わす。 HBcAg Ｂ型肝炎コア抗原を表わす。 HBsAb Ｂ型肝炎表面抗体を表わす。 HBsAg Ｂ型肝炎表面抗原を表わす。ＨＣＶＣ型肝炎ウィルスを表わす。ＨＩＶヒト免疫不全ウィルスを表わす。ＨＳＶ単純庖疹ウィルスを表わす。Ｉｇイムノグロブリン、特にＩｇＧ、ＩｇＭまたはその混合物(IgG/IgM) を表わす。ＩＶ_A Ａ型インフルエンザウィルスを表わす。ＩＶ_B Ｂ型インフルエンザウィルスを表わす。ＯＤ光学濃度を表わす。ＰＡＩプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターを表わす。 PAI-1 それぞれｔＰＡおよびｕＰＡと（tPA-PAI-1）および(uPA-PAI-1)を形成する物質である、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１を表わす。ＲＦリウマトイド因子を表わす。ＲＩＡラジオイムノアッセイを表わす。ＲＳＶレスピラトリ−シンシチアル(syncitial)ウィルスを表わす。ＲＴ周囲温度（１８〜２５°）を表わす。ｔＰＡ任意の組織プラスミノーゲンアクチベーターを表わし、そしてｓｃｔＰＡ（一本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーター）およびｔｃｔＰＡ（二本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーター）を包含する。ＴＶトキソプラズマ症ウィルスを表わす。ｕＰＡ任意のウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターを表わし、そしてｓｃｕＰＡ（一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、プロウロキナーゼとも呼ばれる）およびｔｃｕＰＡ（二本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼとも呼ばれる）を包含する。９Ｃ３ＤＤｉ（DIAGNOSTICA STAGO社により市販）の特異的モノクローナル抗体。２Ｆ７ＤＤｉ（DIAGNOSTICA STAGO社により市販）の特異的モノクローナル抗体。７Ｄ４ＰＡＩ−１（DIAGNOSTICA STAGO社により市販）の特異的モノクローナル抗体。７Ｆ５ＰＡＩ−１（DIAGNOSTICA STAGO社により市販）の特異的モノクローナル抗体。図面の簡単な説明同封の非限定的図面において：図１は「バック」アッセイと呼ばれそしてアッセイ予定の免疫物質に対して生成された抗体により感作された磁性ラテックス粒子および該免疫物質に対して生成された抗体により感作された非磁性ラテックス粒子を用いる、本発明によるアッセイの反応メカニズムを概略的に示す。図２はタービジメトリー（４５０nmで測定したＯＤ）によりプロットされ、本発明によるＤＤｉのアッセイの検量に関係する「薬量／応答」曲線を示す。 OSTICA STAGO社により市販の、ＤＤｉアッセイ用キット）の通知書に示されるＥＩＡ操作に従い、図２における曲線と同じ条件で比較用にプロットされた「薬量／応答」曲線を示す。図４は本発明の方法によるＤＤｉアッセイ（図２）とＥＩＡ法（図３）によるＤＤｉアッセイの間の相関示す。図５は本発明によるプロテインＣのアッセイの「薬量／応答」曲線を示す。図６はフルオレセンスによりプロットし、そして本発明によるＤＤｉのバックアッセイの検量に関係する「薬量／応答」曲線を示す。図７はフルオレセンスによりプロットし、そして本発明によるＰＡＩ−１のバックアッセイの検量に関係する「薬量／応答」曲線を示す。図８はタービジメトリー（４５０nmでＯＤ測定）によりプロットし、そして本発明の方法によるHBsAb のバックアッセイの検量に関係する「薬量／応答」曲線を示す。発明の詳細な記載本発明によれば、「免疫物質」なる表現は免疫反応：抗原＋抗体→抗原−抗体に関与する（抗原／抗体）対の任意のエレメントを意味することが理解される。（抗原／抗体）対は、ここでは（抗原性物質／抗体）対のみならず、（ビオチン／アビジン）のような、免疫学的対（アゴニスト／アンタゴニスト）または（コンジュゲート／抗コンジュゲート）および（アクチベーター／インヒビター）対〔特に（ｔＰＡ／ＰＡＩ）対〕をも包含する。「抗原性物質」なる表現は適正な意味におけるすべての抗原、ならびにそのものから抗体が生成または産生することのできるすべての物質を表わす。抗体を生成しうる物質の中では、特にハプチン、ペプチド、少なくとも１個のペプチドフラグメントを含有する薬物、アルカロイドおよび、一般的には、免疫学的構造を有するすべての物質があげられうる。所定の物質（それぞれＸまたは抗Ｘ）の「コンジュゲート」なる用語は、免疫反応における該物質の特異的な〔それぞれ抗Ｘまたは抗（抗Ｘ）〕パートナーを意味することが理解される。この定義によれば、「コンジュゲート」なる用語は前記パートナーが例えば酵素型のタッグに結合していることを必ずしも意味しない。本発明によれば好ましい（抗原／抗体）対は（抗原性物質／抗体）対である。第１の免疫材料は（ｉ）吸着または（ii）共有（すなわち架橋を形成する二官能性化合物によって）により磁性ラテックス粒子に結合される。吸着または共有による結合法は参考文献として本明細書にとり込まれる前記した特許US-A-5 175 112 に（ｉ）吸着および共有による結合、（ii）ラテックス粒子の安定化、および（iii）ラテックス１ｇ当りのＣＯＯＨ基のミリ当量の数、に関して記載されている。この第１の免疫試薬のラテックス粒子は磁性である、すなわち反磁性（磁石によりこれらは追い払われる）またはより良好には本発明によれは常磁性（これらは磁石にひきよせられる）である。これらラテックス粒子は実質的に球形であり、そして好都合には０．０２〜２０．０マイクロメートルの間の直径を有するマイクロビーズの形態で提供される。第２の免疫材料は抗原または抗体を結合しうる非磁性粒子に結合され、これら非磁性粒子は特にラテックス粒子、金属性粒子および他の吸着剤粒子、例えば粘度（特にベントナイト）および薬用炭からなる群から選択される。非磁性ラテックス粒子は無色であるか、着色されたか、または着色を与えうるものであることができる。蛍光性、燐光性、ルミネセンス、および化学ルミネセンスである。非磁性ラテックス粒子は本発明によるアッセイの感度を改善する。金属性粒子は特に金又は銀のコロイド状粒子であることができる。非磁性ラテックス粒子への第２の免疫材料の結合は前記したように吸着または共有により達成される。第２の免疫材料の金属性粒子（例えばコロイド状Ａｕまたはコロイド状Ａｇ）または他の吸着剤粒子（例えばベントナイトおよび薬用炭）への結合は一般に吸着により達成される。前記第２の免疫材料を含有する免疫試薬を得るのに役立てられる非磁性粒子（好都合には非磁性ラテックス粒子）は実質的に球形でありそして好都合には０．０１〜１０．０マイクロメートルの範囲の直径を有するマイクロビーズの形態で提供される。さらに好都合には、磁性ラテックス粒子（この場合好ましくは常磁性ラテックス粒子）および非磁性粒子（特に非磁性ラテックス粒子）は、たとえ１〜２０のマイクロメートルの間の直径を有する粒子が満足できる結果を生じるとしても、ミクロン以下の粒子すなわチ１マイクロメートルを越えない直径を有するマイクロビーズである。本発明によれば、（ｉ）第１の免疫材料により感作され、そして３００〜８００nmの範囲の直径を有する磁性ラテックス粒子、および（ii）第２の免疫材料により感作され、そして１００〜６００nmの範囲の直径を有する非磁性粒子、を使用するのが特に推奨される。本発明を実施するのに使用されるラテックスは前記US-A-5 175 112に記載されるラテックスまたはクロロメチル化ラテックスが好都合である。本発明の方法により、血液（血漿または血清）、尿、唾液または乳のような水性生物学的媒体中における免疫物質を同定できる。これら免疫物質は、（ｉ）抗原性物質例えばＤＤｉ、ＰＡＩ、ｔＰＡ（特にｓｃｔＰＡおよび／またはｔｃｔＰＡ）、ｕＰＡ（特にｓｃｕＰＡおよび／またはｔｃｕＰＡ、プロテインＣ、（ ii）細菌またはウィルス起原の抗原、例えばＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＩＶ_A抗原またはＩＶ_B抗原または、（iii）細菌、カビまたはウィルスのエンベロープまたは核の一部分に存在するかまたはそれに対して生成された抗体、例えば、ＨＢｃＡｂ、ＨＢｓＡｂ、ＣＭＶ、ＧＭＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＭＣＶ、ＲＣＶまたはＴＶ抗体、であることができる。実施に際し第１の技術的解決によれば、アッセイ予定の免疫物質（Ｘ）は抗原性物質（特にＤＤｉ、ＦｇＤＰ、ＦｎＤＰ、ＰＡＩ、プロテインＣ、ＨＢｃＡｂ、ＨＢｓＡｇ、ＲＳＶ、ＩＶ_A、ＩＶ_B、アデノウィルス等）であり、第１の免疫材料は前記免疫物質の特異的な（抗Ｘ）抗体であり、そして第２の免疫材料は、（ｉ）第１の免疫材料のモノクローナル（抗Ｘ）抗体と同一またはそれと異なる、前記免疫物質の特異的なモノクローナル抗体であるか、または（ii）前記免疫物質であるかまたは第１の免疫材料のモノクローナル（抗Ｘ）抗体の（抗（抗Ｘ））コンジュゲートである、のいずれかである。特に直接反応媒体中で実施される「バック」アッセイにとって非常に好都合には、第２の免疫材料は、この場合、第１の免疫学的（抗Ｘ）材料の抗体と同一またはそれと異なり、前記免疫物質（Ｘ）に対して特異的なモノクローナル抗体であるのが好ましい。第２の技術的解決によれば、実施に際してはアッセイ予定の免疫物質（Ｘ）は抗体（特にＨＢｓＡｂ、ＨＢｃＡｂ（総Ｉｇ／ＩｇＭ）、ＴＶのＩｇＧ／ＩｇＭ抗体、ＧＭＶのＩｇＧ／ＩｇＭ抗体、ＣＭＶのＩｇＧ／ＩｇＭ抗体、ＨＳＶのＩｇＧ／ＩｇＭ抗体、ＨＣＶのＩｇＧ／ＩｇＭ抗体、ＨＩＶのＩｇＧ抗体等）であり、そして（ｉ）第１の免疫材料が前記免疫物質の（抗Ｘ）抗体であり、そして第２の免疫材料が前記免疫物質の特異的な抗原なあるか、または（ii）第１の免疫材料および第２の免疫材料が同一または相異なっていて、それぞれ前記免疫物質の特異的抗原である。本発明の方法による免疫学的凝集反応においては、磁性ラテックス粒子が「支持体」として作用し、そして非磁性粒子が「タッグ」として作用する。インキュベーションまたは反応後（前記段階（２°）による）、特に磁石により生成される磁場の作用の下に、すべての磁性ラテックス粒子（反応した粒子ならびに未反応粒子）が集められ、このようにして一方では凝集から生成する反応生成物を同伴し、他方遊離の非磁性粒子すなわち前記磁性ラテックス粒子と凝集しなかった非磁性粒子はアッセイ予定の抗原の媒介により直接（第２の免疫材料が抗原であるかまたは第１の免疫材料のコンジュゲートである場合）（第２の免疫材料がアッセイすべき抗原の抗体である場合）懸濁液中に残存し、そして裸眼によるかまたは光度計による評価をすることができる。実施に際しては、この評価は特に光吸収または拡散の測定によるＯＤの変動によるか、また蛍光、燐光、ルミネセンスまたは化学ルミネセンスにより実施される。従って、試験予定の物質Ｘが抗原であり、そして第１および第２の免疫材料が既知量で使用される、前記物質Ｘの、特異的モノクローナル（またはポリクローナルすら）抗体である場合（前記第２の免疫材料は前記物質Ｘに関し化学量論的に過剰ある）、バックアッセイは直接実施される。なぜなら磁場による分離後、ＯＤの変動は、（ｉ）懸濁液中に残存する第２の免疫材料により感作された非磁性粒子の量に比例し、そして（ii）試験予定の抗原性物質Ｘの濃度と逆比例するかまたはそれの減少性（decreasing）函数であるからである。一方、試験予定の物質Ｘが抗原である場合は、第１の免疫材料が前記物質Ｘ（既知量で使用される）の特異的なモノクローナル（抗Ｘ）抗体であり、そして第２の免疫材料が物質Ｘ（既知量で使用され、タッグを付けられている）であるかまたは第１の免疫材料のモノクローナル抗体のコンジュゲートモノクローナル（抗（抗Ｘ））抗体（既知量で使用され、タッグを付けられている）であり、磁場による分離後、アッセイすべき抗原（Ｘ）の直接アッセイが行われる（これはいわゆるバックアッセイの逆アッセイである）。第２の免疫材料により感作された粒子からなる免疫試薬のタッグ付けは、ここでは前記第２の免疫材料と関連するか（特に蛍光剤とのカップリングによるタッグ付け）、または前記粒子と関連する（特に着色されたかまたは蛍光性粒子の使用から生ずるタッグ付け）。さらに、前記示したとおり、第２の免疫材料により感作された粒子に着色されたかまたは蛍光性粒子、特に着色されたか、蛍光性であるか、燐光性であるか、ルミネセンスであるか、または化学ルミネセンスであるラテックスのマイクロビーズの使用は本発明方法によるアッセイの感度を改善する。試験予定の免疫物質を含有する液体生物学的媒体はＲＦを含有する可能性があるので、特に止血のメカニズムに関与する生成物の血漿アッセイと関連して、第１および第２の免疫材料の抗体をＦ（ａｂ）またはさらに良好でさえあるＦ（ａｂ’）₂のようなフラグメント（前記ＲＦに感受性である分枝Ｃ不存在）の一つにより置換するのが時として有用であり好都合である。図１はバックアッセイの実施のメカニズムを示す。１ａ部分によれば、材料が反応器（この場合カップまたはマイクロカップ）中で接触せしめられ、そして反応せしめられ（１時間を越えない間隔、好ましくは０．７５時間を越えない間隔、そしてより良好には５分から３０分までの範囲の間隔、大抵の場合アッセイ時間は１０〜１５分、事実１０分未満）、前記材料は抗原であるアッセイすべき免疫物質１１であり、常磁性ラテックス粒子１２は前記免疫物質に対して特異的に生成された第１のモノクローナル抗体１３により感作されており、そして非磁性ラテックス１４（好ましくは着色または蛍光性）は前記免疫物質に対して特異的に生成された第２のモノクローナル抗体１５により感作されている。１ｂ部分に従い、適切な温度（特にＲＴから６０℃までの範囲、そして好ましくはＲＴ）でのインキュベーション（すなわち反応）後、反応容器１０の底付近に向って磁石２０を持ち込むことにより磁場を適用する。適用可能な（すなわち 15）から生成する反応生成物およびまだ未反応の免疫試薬（12−13）は磁石２０によりひきつけられるが、一方反応しなかった過剰の試薬（14−15）は懸濁液中に残る。換言すれば、磁場の作用の下では、磁性ラテックス粒子は凝集から生ずる反応生成物を同伴し収集するが、一方過剰でありかつ前記反応生成物中に包含されない非磁性粒子は反応容器１０の側壁上に得られる透明部分２１によってＯＤの測定を可能ならしめ、それからアッセイ予定のサンプル中に含有される前記免疫物質の濃度が導き出される。この濃度は検量曲線から測定できるしまたは、適用できるものとして１種または２種の対照試験から測定できる。ＯＤ測定中は、磁場が維持される。一般に、非常に正確な評価ができるためには、５分〜３０分の範囲のインキュベーション時間で充分である。到達する感度閾値は、特にプロテインＣのアッセイに関して約１〜１０ng/mlであり、これは現在用いられているＥＩＡおよびＲＩＡ法の低い方の閾値（１ng/ml）と同じかまたはそれと類似する。蛍光ラテックスを用いるＰＡＩ−１のアッセイにおいては、達成される感度は前記ＥＩＡおよびＲＩＡ法の閾値とこれも同じかまたはそれより低くさえある。同様に、図１のバックアッセイは粒子１４に結合されたモノクローナル抗体を、既知量で使用され適切な粒子１４に結合された免疫物質で置き換えることにより「直接」アッセイに変えることができる。それにより、物質１１と１５が常磁性ラテックス粒子１２に結合した第１の免疫材料１３と競合的に反応するアッセイが得られる。本発明による方法の興味は本質的にその速度、および同じ反応容器中で同じ液体媒体内で実施される簡単さにある。もし第１のおよび第２の免疫材料の一方の量が不充分である場合は、この生成物を同じ反応容量に加えて反応後のＯＤの評価を反復することが可能である。従って、本発明により推奨される技術的解決はバックアッセイを「１工程」で実施するのに役立つ（同じマイクロカップ、同じ試薬、同じ反応媒体、中間での濾過も洗浄もなし）。第１の免疫材料により感作された磁性ラテックス粒子からなる免疫試薬および第２の免疫材料により感作された非磁性粒子からなる免疫試薬はそれぞれ生物学的緩衝液中における懸濁液中にて供給されるので、本発明の方法による凝集免疫反応のための特殊な緩衝液媒体の調製が不必要となる。アッセイ予定の免疫物質を含有するサンプルを、それと反応しない第１の免疫材料または第２の免疫材料の媒体中に導入するか、またはそのそれぞれと反応する場合は両者の媒体の混合物中に導入することで充分である。本発明のさらなる利点および特徴は以下の実施例の記載からより明白に理解されよう。これら実施例は説明のために掲げるものであって本発明がそれらに限定されることを決して意味しない。実施例１ＤＤｉのアッセイＤＤｉのサンプル、直径約６５０nmを有し抗ＤＤｉモノクローナル抗体（９Ｃ３）により感作された常磁性ラテックス粒子、および直径約３００nmを有し同じモノクローナル抗体（９Ｃ３）によるかまたは第１のモノクローナル抗体と異なる第２の抗ＤＤｉモノクローナル抗体（２Ｆ７）により感作された非磁性ラテックス粒子を、マイクロカップ中に入れられた液体緩衝液中で接触せしめる。この場合液体緩衝液はそれぞれの抗体の媒体の混合物であることができる。材料をＲＴで０．２５時間反応（すなわちインキュベート）せしめる。マイクロカップの底部で外部から適用された磁石により磁場を生成させ、この磁場をＯＤの測定中維持した。この測定は特にタービジメトリーにより、上清に面して配置されたマイクロカップ側壁の透明部分を介して行う。漸増量のＤＤｉを含有するサンプルでは、図２の検量曲線がＤＤｉ濃度の函数としてのＯＤのダイヤグラムとしてプロットされている。ＤＤｉ濃度は横座標（ μg/ｍｌで）に示されそして４５０nmで測定されたＯＤは縦座標に示される。図２の曲線はＹ＝ａ＋ｂｅ^-x/c (1) の種類の指数関数的曲線であり、ここで上式中ＤＤｉのアッセイに関しては実験で以下のことが示される：ａ＝0.20557265 ｂ＝0.97343085 ｃ＝0.60269355 図２の検量曲線を用いて、試験予定のサンプルのＤＤｉ含量を測定することができる。 D-DIMERE’キット（DIAGNOSTICA STAGO社により市販）の試薬および操作プロトコルを用いＥＩＡ法によりプロットした。得られる曲線を図２の曲線と同じ座標システムを用いて図３に示す。図３の曲線は上記等式(1)による指数関数的曲線であり、そこでは、ａ＝0.25361282 ｂ＝0.98641938 ｃ＝0.49755979 である。本発明のバックアッセイ法による測定結果と前記ＥＩＡ法によるバックアッセイの測定結果の相関は図４に示されるように直線である。相関係数（ｒ²）は０．９より高い。実施例２ＰＡＩ−１のアッセイ実施例１に記載され図１に示される操作プロトコルに従い、第１の抗（ＰＡＩ −１）モノクローナル抗体（７Ｆ５）で感作された常磁性ラテックス粒子（直径：６００nm）からなる免疫試薬および第２の抗（ＰＡＩ−１）モノクローナル抗体（７Ｄ４）で感作された非磁性ラテックス粒子（直径：２５０nm）からなる免疫試薬を用いて、サンプル中に含有されるＰＡＩ−１のバックアッセイを実施する。ＰＡＩ−１の検量曲線は等式(1)による指数関数的曲線によるか、または該指数関数的曲線と実質的に同等である双曲線により表わすことができる。実施例３プロテインＣのアッセイ実施例１に記載され図１に示される操作プロトコルに従い、プロテインＣの２種の特異的なモノクローナル抗体を用い、非磁性ラテックス粒子が蛍光性であるプロテインＣのバックアッセイを実施する。システム蛍光＝プロテインＣ濃度の函数、による相当する検量曲線を図５に示し、ここでＸは横座標上のプロテインＣ濃度（％Ｗ／Ｖにて表わす）でありそしてＹは縦座標上の蛍光である。感度閾値は約10ng/mlである。実施例４ＤＤｉのアッセイ抗ＤＤｉ抗体、すなわちこの場合抗体９Ｃ３、で感作された常磁性ラテックス粒子、およびＤＤｉで感作された非磁性蛍光性ラテックス粒子を用いＤＤｉの直接アッセイを実施する以外は前記実施例１に記載される操作を行う。システム蛍光＝遊離ＤＤｉ濃度の函数、による相当する検量曲線を図６に示し、そこではＸは横座標上の遊離ＤＤｉ濃度（μｇ／ｍｌで表わす）であり、そしてＹは縦座標上の蛍光である。実施例５ＰＡＩ−１のアッセイＰＡＩ−１のバックアッセイを、抗（ＰＡＩ−１）抗体、すなわちこの場合抗体７Ｄ４、で感作された常磁性ラテックス粒子および第２の抗（ＰＡＩ−１）抗体、すなわちこの場合抗体７Ｆ５、で感作された非磁性蛍光性ラテックス粒子を用いて実施する以外は前記実施例２に記載の操作を用いる。システム蛍光＝ＰＡＩ−１濃度の函数、による相当する検量曲線を図７に示し、ここでＸは横座標上のＰＡＩ−１濃度（ng/mlで表わす）でありそしてＹは縦座標上の蛍光である。ＰＡＩ−１のこのアッセイの感度は約１ng/mlである。実施例６ＨＢｓＡｇのアッセイ実施例１に記載されそして図１に示される操作プロトコルに従い、ＨＢｓＡｇの２種の特異的なモノクローナル（または、絶対的に必要な場合はポリクローナル）抗体を用い、ＨＢｓＡｇのバックアッセイを実施する。実施例７ＨＢｓＡｂのアッセイＨＢｓＡｂのサンプル、直径約６５０nmを有しそして第１のＨＢｓＡｇ抗原で感作された常磁性ラテックス粒子、および直径約３００nmを有しそして第１の抗原と同じかまたはそれとは異なる第２のＨＢｓＡｇ抗原で感作された非磁性ラテックス粒子を、マイクロカップ中に入れられた液体緩衝液中で接触せしめる。液体緩衝液はこの場合各抗原の媒体の混合物であることができる。材料をＲＴで０．２５時間反応（すなわちインキュベート）せしめる。マイクロカップの底部に外部から適用された磁石により磁場を生成させ、そしてこの磁場をＯＤの測定期間中は維持する。この測定は特にタービジメトリーにより、上清に面して配置されたマイクロカップの側壁の透明な部分を介して実施する。システムＯＤ＝ＨＢｓＡｂ濃度の函数、によりタービジメトリーによって得られる相当する検量曲線を図８に示し、そこではＸは横座標上のＨＢｓＡｇ濃度（ μｇ／ｍｌで表わす）であり、そしてＹは縦座標上のＯＤである。アッセイまたは同定キットに関し以下のことが推奨される。 (1) 前記免疫物質が抗原性物質である場合、第１の免疫材料はＸの特異的モノクローナル抗体であり、そして第２の免疫材料は第１のものとは異なりかつ非磁性ラテックス粒子に結合される、Ｘの特異的なモノクローナル抗体である。 (2) Ｘが抗体である場合、第１の免疫材料はＸの特異的抗原であり、そして第２の免疫材料は第１のものとは異なりかつ非磁性ラテックス粒子に結合された、Ｘの特異的な抗原である。 (3) Ｘが抗原である場合、第１の免疫材料がＸの特異的なモノクローナル抗体であり、そして第２の免疫材料が第１のものとは異なりかつ金または銀の非磁性コロイド状粒子に結合された、Ｘの特異的なモノクローナル抗体である。および (4) Ｘが抗体である場合、第１の免疫材料はＸの特異的抗原であり、そして第２の免疫材料は第１のものとは異なりかつ金または銀の非磁性コロイド状粒子に結合された、Ｘの特異的な抗体である。比較アッセイ比較のために、一方では前記US-A-4 115 535記載の方法に従い第１のＨＢｓＡｇ抗原で感作された非磁性ラテックス粒子および前記第１のＨＢｓＡｇ抗原により感作された磁性かつ着色ラテックス粒子を用い、および前記EP-A-0 410 893記載の方法に従い第１のＨＢｓＡｇ抗原で感作された非磁性ラテックス粒子およびプロテインＡで感作された磁性かつ着色ラテックス粒子を用い、本発明の実施例７によるＨＢｓＡｂのアッセイ感度の閾値を測定した。得られた結果を下記表１に訂正(corrected)した。これらは、本発明による方法が従来の２種の方法のそれよりずっとはるかに感度が高いことを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/551 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/551 (72)発明者ソリナス，イサベライタリア、アイ―00199 ローマ、ビアルイジマンチネリ、57

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原および抗体からなる群から選択されかつ試験予定のサンプル中に存在する可能性のある免疫物質（Ｘ）をアッセイする方法であって、（ｉ）磁性ラテックス粒子および（ii）非磁性ラテックス粒子を使用し、（１°）液体媒体中で前記試験予定であって前記免疫物質を含有しうるサンプルを生物学的に知られた量の、（Ａ）第１の免疫材料により感作された磁性ラテックス粒子からなる免疫試薬、および（Ｂ）第２の免疫材料により感作された非磁性粒子からなる免疫試薬、と接触せしめ、ここで前記第１の免疫材料および第２の免疫材料の一方は試験予定の前記免疫物質（Ｘ）の（抗Ｘ）コンジュゲートであり、第２のものは(a )前記（抗Ｘ）コンジュゲートと同じかまたはそれと異なる前記免疫物質のコンジュゲートであるかまたは(b)前記免疫物質または前記（抗Ｘ）コンジュゲートの抗（抗Ｘ）コンジュゲートであり；（２°）生成する反応媒体を１時間を越えない時間イイキュベートし；（３°）磁場を適用して、生成する反応媒体中の前記磁場により転置された磁性生成物を前記磁場により影響されなかった非磁性生成物から分離し；次に、（４°）免疫反応および前記磁場により影響されなかった非磁性生成物のみを含有する、得られる反応媒体の一部分を観察することにより、試験予定のサンプル中に存在しうる前記免疫物質（Ｘ）を評価する、ことにある工程を包含する方法。２．すべての免疫反応が発生する段階（２°）のインキュベーションが４５分を越えず、そして好ましくは５〜３０分の範囲にある請求の範囲１記載の方法。３．非磁性粒子が金または銀のコロイド状粒子である請求の範囲１記載の方法。４．非磁性粒子がベントナイトまたは薬用炭の粒子である請求の範囲１記載の方法。５．(a)試験予定の免疫物質が抗原でありそして(b)第１の免疫材料および第２の免疫材料がそれぞれ前記免疫物質の特異的抗体である請求の範囲１記載の方法。６．(a)試験予定の免疫物質が抗体でありそして(b)第１の免疫材料および第２の免疫材料がそれぞれ前記免疫物質の特異的抗原である請求の範囲１記載の方法。７．試験予定の免疫物質が抗原であり、そして第１の免疫材料が前記免疫物質の特異的抗体でありそして第２の免疫材料が前記タッグ付けされた免疫物質からなる抗原である請求の範囲１記載の方法。８．試験予定の免疫物質が抗体であり、そして第１の免疫材料が前記免疫物質の特異的抗体でありそして第２の免疫材料が前記タッグ付けされた免疫物質からなる抗体である請求の範囲１記載の方法。９．第２の免疫材料が非磁性ラテックス粒子に結合されている請求の範囲１および５〜８のいずれか１項記載の方法。 10．工程（４°）の評価が透過、拡散、蛍光、燐光、ルミネセンスまたは化学ルミネセンスによる光学濃度の測定により行われる請求の範囲１記載の方法。 11．試験予定のサンプル中に含有されうる免疫物質（Ｘ）をアッセイ、同定または測定するためのキットであって、（Ａ）第１の免疫材料により感作された磁性ラテックス粒子からなる免疫試薬、および（Ｂ）第２の免疫材料により感作された非磁性粒子からなる免疫試薬、を包含するキット。 12．前記免疫物質（Ｘ）が抗原性物質であり、第１の免疫材料がアッセイ予定の免疫物質（Ｘ）の特異的モノクローナル抗体であり、そして第２の免疫材料が第１のものとは異なりかつ非磁性ラテックス粒子に結合されたものである、アッセイ予定の前記免疫物質（Ｘ）の特異的モノクローナル抗体である請求の範囲11記載のアッセイキット。 13．前記免疫物質（Ｘ）が抗体である場合には、第１の免疫材料がアッセイ予定の免疫物質（Ｘ）の特異的抗原であり、そして第２の免疫材料が第１のものとは異なりかつ非磁性ラテックス粒子に結合されたものである、アッセイ予定の前記免疫物質（Ｘ）の特異的抗原である請求の範囲11記載のアッセイキット。 14．前記免疫物質（Ｘ）が抗原である場合は、第１の免疫材料がアッセイ予定の免疫物質（Ｘ）の特異的モノクローナル抗体であり、そして第２の免疫材料が第１のものとは異なりかつ金および銀の非磁性コロイド状粒子に結合されたものである、アッセイ予定の前記免疫物質（Ｘ）の特異的モノクローナル抗体である請求の範囲11記載のアッセイキット。 15．前記免疫物質（Ｘ）が抗体である場合は、第１の免疫材料がアッセイ予定の免疫物質（Ｘ）の特異的抗原であり、そして第２の免疫材料が第１のものとは異なりかつ金および銀の非磁性コロイド状粒子に結合されたものであるアッセイ予定の前記免疫物質（Ｘ）の特異的抗原である請求の範囲11記載のアッセイキット。 16．非磁性ラテックス粒子が着色されたか、蛍光性であるか、燐光性であるか、ルミネセンスであるかまたは化学ルミネセンスである請求の範囲11記載のアッセイキット。