JPH08507076A - 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス - Google Patents

新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス

Info

Publication number
JPH08507076A
JPH08507076A JP6519294A JP51929494A JPH08507076A JP H08507076 A JPH08507076 A JP H08507076A JP 6519294 A JP6519294 A JP 6519294A JP 51929494 A JP51929494 A JP 51929494A JP H08507076 A JPH08507076 A JP H08507076A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
adenovirus
cells
neoplastic
defective adenovirus
replication
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP6519294A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3556666B2 (ja
Inventor
マクコーミック，フランシス
Original Assignee
オニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテイド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテイド filed Critical オニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテイド
Publication of JPH08507076A publication Critical patent/JPH08507076A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3556666B2 publication Critical patent/JP3556666B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

(57)【要約】 ウイルス−ベース療法により新形成症状を治療するための方法及び組成物を提供する。p53又はRBに結合し、そして／又はこれを失活させるウイルス・タンパク質を欠く突然変異体ウイルスを、p53及び／又はRB機能を欠いた細胞を含んで成る新生物をもつ患者に投与する。この突然変異体ウイルスは、新形成細胞内の複製表現型を実質的に作り出すことができるが、本質的に正常なp53及び／又はRB機能をもつ非−複製性の非−新形成細胞内で複製表現型を実質的に作り出すことができない。新形成細胞内での複製表現型の優位な生成は、直接的にか又はウイルス複製表現型を発現する細胞内での細胞遺伝子の発現によるかのいずれかにより、新形成細胞の優先的な殺生をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス 技術分野 本発明は、新形成（neoplastic）哺乳動物細胞内で複製し、そして／又は後期 領域遺伝子を発現することができるが、非-新形成細胞内で本質的に複製できな い組換え細胞障害ウイルス（recombinant cytopathic viruuses）の組成物、こ のような組換えウイルスを構築し、そして増殖させるための方法、このような組 換えウイルスにより新形成疾患を治療する方法、並びにこのような組換えウイル スを含んで成る治療組成物を提供する。 背景 正常細胞の増殖は、成長-束縛性の（growth-constraining）腫瘍-サプレッサ ー遺伝子と釣り合った成長-促進性のプロト-オンコジーン（proto-oncogenes） により調節されていると考えられている。プロト-オンコジーンの活性を強化す る突然変異は、新形成細胞の成長を駆動するオンコジーンを創り出す。反対に、 腫瘍サプレッサー遺伝子を失活させる遺伝子病変は、一般的に、その失活した腫 瘍サプレッサー対立遺伝子にホモ接合である細胞を導く突然変異（単数又は複数 ）を通じて、これらの遺伝子により課せられた正常な複製の束縛からその細胞を 開放することができる。普通には、活性化されたオンコジーン（すなわち、活性 な構造又は調節突然変異を含むプロト-オンコジーン）の形成との組み合わせに おける失活した腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、p53、RB、DCC、NF-1）は、本 質的に束縛されない成長が可能な新形成細胞（すなわち、形質転 換細胞）を産生することができる。 細胞のオンコジーン形質転換は、細胞の代謝、生理、及び形態における多くの 変化を導く。オンコジーンにより形質転換された細胞の１つの特徴的な変化は、 細胞-成長調節遺伝子の適正な発現により正常に課せられた細胞増殖及び分化に ついての束縛に対する応答の損失である。 様々なタイプの遺伝子変化は全て、細胞-成長調節遺伝子の変更された発現又 は働き及び異常成長を導くことができるけれども、１以上の事件が悪性細胞への 正常細胞の新形成形質転換を導くために必要であるということが一般的に信じら れている（Land et al．（1983）Nature 304：596；Weinberg RA（1989）Cancer Res ．49：3713）。ほとんどの細胞タイプについて悪性形質転換を導く正確な分 子経路及び二次的な変化は、明らかでない。推定の細胞-サイクル制御機能をも ち、そして／又は機能転写の複合体の形成に含まれる幾つかのタンパク質、例え ば、p53及びRBの変更された発現又は活性が細胞内の増殖制御の損失を導くこと ができる多数の事件が報告されている（Ullrich et al．（1992）J．Biol．Chem ．267： 15259；Hollstein et al．（1991）Science 253：49；Sager R（1992）C urr．Opin．Cell．Biol．4： 155；Levine et al．（1991）Nature 351：453）。 いくつかのオンコジーンが、特定の癌のかなりのフラクション内に特徴的な活 性な突然変異を有していることが見いだされている。例えば、rasH及びrasKコー ディング領域内の特定の突然変異（例えば、コドン12、コドン16；Parada et al ．（1984）Nature 312：649）及びAPC遺伝子（Powell et al．（1992）Nature 3 59 ：235）は、培養細胞のオンコジーン形質転換に関係し、そして特定のヒト癌 （例えば、結腸腺癌（colon adenocarcinoma）、膀胱癌、肺癌及び腺 癌、悪性肝癌（hepatocarcinoma））のかなりのパーセンテージにおいて存在す る。これらの発見は、このようなオンコジーンの活性形態（単数又は複数）を特 異的に認識する診断及び治療試薬（例えば、ポリヌクレオチド・プローブ及び抗 体）の開発を導いた（米国特許第4,798,787号及び米国特許第4,762,706号）。 他のオンコジーン、例えば、myc、erbB-2、及びpim-1の過剰又は不適当な発現 は、そのコーディング領域内の活性突然変異（単数又は複数）の存在を必ずしも 必要とせずにオンコジーン形質転換を強化することができるようである。erbB-2 の過剰発現は、胸、胃、及び卵巣の腺癌においてしばしば見いだされ、そしてこ れらの細胞タイプにおけるerbB-2レベルは、新形成についての診断マーカーとし て役立つことができるかもしれず、そして／又は特異的な腫瘍表現型（例えば、 特定の医薬、成長速度、分化状態に対する抵抗性）と相関することができる。 様々なオンコジーン（米国特許第4,736,866号及び米国特許第5,087,571号）又 は機能的に破壊された腫瘍サプレッサー遺伝子（Donehower et al．（1992）Nat ure 356： 215）を宿すトランスジェニッック動物が、発癌物質スクリーニング検 定における使用、とりわけ他の潜在的な用途について記載されている。 形質転換された表現型及び新形成の下にある分子機構のより詳細なモデルの開 発におけるこの上記進歩にもかかわらず、慣用の化学療法を超える癌の治療に利 用可能な重要な治療方法は、ほとんどもたらされなかった。多くの慣用の化学療 法剤は、低い治療指数（therapeutic index）をもち、治療投与量レベルは、毒 性を作り出す投与量レベルに又はその付近にある。ほとんどの慣用の化学療法剤 の毒性副作用は、不快であり、そして他の副作用の中にあって、致死的な骨髄抑 制を導く。 先天性疾患、例えば、嚢胞性繊維症（cystic fibrosis）を引き起こす欠陥対 立遺伝子を矯正し又は補う遺伝子治療を行うための最近のアプローチは、限定さ れた開始の成功の報告をもって達成されている。幾つかの遺伝子治療は、複製- 欠陥組換えアデノウイルスを使用してインビボにおける細胞内に欠陥対立遺伝子 の機能性コピーを発現することができるポリヌクレオチド配列を形質導入するこ とを含む（Rosenfeld et al．（1992）Cell 68：143）。これらの遺伝子治療法 の中の幾つかは、患者から体外移植された単離細胞内にポリヌクレオチドを導入 することにおいて有効であるが、インビボにおいて高く有効であることは示され なかった。腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor（TNF））及びインターロイキ ン-２（interleukin-2（IL-2））をエンコードするポリヌクレオチドによる体外 移植腫瘍細胞のトランスフェクトに頼る癌への治療アプローチが記載されている （Pardoll D（1992）Curr．Opin．Oncol．4：1124）。 遺伝子治療方法がインビボにおける形質転換細胞内でオンコジーン又は腫瘍サ プレッサー遺伝子の欠陥対立遺伝子を矯正するために改良されることが可能であ ることがいつか証明されることができるであろうが、現在の遺伝子治療の方法は 、その場における新形成の実際の遺伝子治療のための十分なパーセンテージの新 形成細胞を有効に形質導入し、そして（例えば、相同的組換えにより）正しく標 的化することができると報告されていない。癌生物学の性質は、新形成細胞の実 質的なフラクション、好ましくは、形質転換された細胞のクローンの子孫の全て が、有効な治療効果について除去されているということを、命令する。その上、 現在の遺伝子治療方法は非常に高価であり、患者内への再導入に先立って体外移 植された細胞をエクスビボ（ex vivo）において培養することを必要とする。た とえそれらが有効であったとしても、このような方法の広い適用は、 極端に高価なものであろう。 従って、新形成疾患の診断及び治療のための方法及び組成物、特に、慣用の抗 新形成化学療法の典型である非-新形成細胞の不所望の殺生を伴なわずに新形成 細胞を選択的に除去する方法についての、本分野における必要性が存在する。本 発明は、これらの及び他の必要性を満たす。 本明細書中に討議する文献は、本出願の出願日の前に単にそれらの開示につい て提供されている。本明細書中の何も、先の発明によって本発明者らがこのよう な開示に実際よりも前の日付を付与する資格がないと認めることとして解釈され てはならない。 本発明の要約 本発明は、非-新形成細胞内で実質的に複製欠陥であり、そして新形成細胞内 で少なくとも部分的な複製表現型を示す組換えアデノウイルスにより新形成細胞 を感染させることにより新形成細胞を除去するための幾つかの新規の方法及び組 成物を、提供する。新形成と非-新形成細胞内での本発明に係るアデノウイルス 構築物の複製表現型における差異は、癌のウイルス-ベースの治療のための生物 学的基礎を提供する。アデノウイルス細胞障害効果の発現、及び場合により負の -選択性薬剤遺伝子（例えば、HSV tk）の発現は、本発明の組換えアデノウイル ス構築物により感染された新形成細胞のアデノウイルス複製表現型特性により関 連付けられ、これ故、新形成と非-新形成細胞との間を区別し、そして新形成細 胞の選択性細胞毒性を提供する。本法は、特にアデノウイルス構築物について詳 細に記載されているけれども、本法は、効率的な複製が、非-新形成細胞内に存 在するが新形成細胞内では実質的に非存在であり又は非機能性である宿主細胞タ ンパク質（例えば、p53、RB）の結合及 び／又は隔離及び／又は失活を必要とするような本質的にいずれかのウイルス・ タイプに利用可能であると信じられる。 アデノウイルスが細胞内で効率的に複製するために、アデノウイルスE1b遺伝 子生成物、p55は、宿主細胞のp53タンパク質と複合体を形成し、それにより、p5 3を隔離及び／又は失活させ、そしてp53において欠陥のある細胞を作り出す。p5 3機能において欠陥にされたこのような細胞は、アデノウイルスの複製を支援す ることができる。この方法で、野生型アデノウイルスは、p53を含む細胞内で複 製することができる。なぜなら、アデノウイルスp55タンパク質が宿主細胞のp53 タンパク質を失活させ、そして／又は隔離するからである。本発明の１つの態様 においては、感染された細胞内でp53タンパク質との機能性複合体を実質的に形 成することができない突然変異体のp55タンパク質をエンコードしているE1b座を 含んで成る組換えアデノウイルスが、その組換えアデノウイルスにより感染され ることができる新形成細胞を含んで成る個体又は細胞集団に投与される。感染さ れた非-新形成細胞内で効率的にp53タンパク質を隔離する組換えアデノウルスル の実質的な非能力は、導入された組換えアデノウイルスのポリヌクレオチド（単 数又は複数）が非-新形成細胞内で複製表現型を発現することができないという ことをもたらす。反対に、機能性p53タンパク質を欠いた新形成細胞は、アデノ ウイルスの細胞障害効果による新形成細胞の除去を導く導入された組換えアデノ ウイルスによる複製表現型の発現及び／又は複製表現型に結合した負の選択遺伝 子の発現を支援する。これらの態様の好ましい変種においては、組換えアデノウ イルスは、p53を実質的に結合することができず、そして場合により機能性p19タ ンパク質をも欠くことができる（すなわち、E1aポリペプチドの存在中でアデノ ウイルスの初期領域遺伝子の発現を阻害することがで きない）突然変異体p55をエンコードしているE1b座を含んで成る。本発明の組換 えアデノウイルスは、さらに、強化された細胞障害効果を作り出す突然変異体p1 9遺伝子を含んで成ることができ；本分野において公知のこのような突然変異体 は、p19 cyt突然変異体遺伝子である。しかしながら、感染の間のウイルスDNAの 完全性を維持するために幾つかの突然変異体内で機能性p19を保持することが好 ましくあることができる。 本発明の他の態様においては、感染された細胞内でRBタンパク質との複合体を 実質的に形成することができないE1aタンパク質（例えば、p289R又はp243R）を エンコードしているE1a座を含んで成る組換えアデノウイルスが、その組換えア デノウイルスにより感染されることができる新形成細胞を含んで成る個体又は細 胞集団に投与される。感染された非-新形成細胞内で効率的にRBタンパク質を隔 離するその組換えアデノウイルスの実質的な非能力は、その導入された組換えア デノウイルス・ポリヌクレオチド（単数又は複数）が非-新形成細胞内で複製表 現型を発現することができないということをもたらす。反対に、機能性RBタンパ ク質を欠いた新形成細胞は、アデノウイルスの細胞障害効果による新形成細胞の 除去を導く導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の発現及び／又は 複製表現型に結合した負の選択遺伝子の発現を支援する。これらの態様の好まし い変種においては、組換えアデノウイルスは、RB（及び／又はその300kDポリペ プチド及び／又はその107kDポリペプチド）に結合することができるCR1及び／又 はCR2ドメインを欠いているが、アデノウイルスの初期遺伝子のトランス作用（t ransactivation）させることができる機能性CR3ドメインを含んで成る突然変異 体E1aタンパク質（例えば、p289R）をエンコードしているE1a座を含んで成る。 これらの態様のさらなる変種は、その組み合えアデ ノウイルスが、RBに結合し且つこれを失活させるタンパク質を実質的に発現する ことができず、そして場合により、機能性p19タンパク質をも含んで成ることが できる（すなわち、E1a機能の非存在中でアデノウイルスの初期領域遺伝子の発 現を剌激することができる）非機能性E1a座を含んで成るようなものを含む。本 発明の組換えアデノウイルスは、強化された細胞障害効果を作り出す突然変異体 p19遺伝子を、さらに含んで成ることができ；本分野において公知のこのような 突然変異体は、p19 cyt突然変異体遺伝子である。 本発明は、非-新形成細胞内で複製欠陥であるが、機能性p53及び／又はRBを欠 いた新形成細胞内で複製表現型を発現することができる新規の組換えアデノウイ ルス構築物を提供する。新規の組換えアデノウイルス構築物は、E1a及び／又はE 1b遺伝子領域内に、特に、E1b p55タンパク質をエンコードしている配列並びにE 1a p289R又はp243Rタンパク質のCR1及びCR2ドメイン内に、突然変異、例えば、 欠失又は点突然変異を含んで成る。幾つかの態様においては、負の選択遺伝子（ negative selectable gene）、例えば、HSV tk遺伝子が、その負の選択遺伝子が 、複製表現型を発現する感染細胞（すなわち、新形成細胞）内で優先的に転写さ れ、そして負の選択剤（例えば、ガンシクロビル、FIAU）の有効投与量の投与に よりこのような細胞の負の選択を提供するように、E1a又はE1b突然変異をも含ん で成る組換えアデノウイルス構築物内で、初期領域（例えば、E2、E1a、E1b）エ ンハンサー／プロモーター、後期領域遺伝子エンハンサー／プロモーター（例え ば、主要後期プロモーター）、あるいはCMVエンハンサーを含む初期又は後期領 域プロモーター、に作用可能な状態で結合される。負の選択遺伝子は、E1a及び ／又はE1b構成配列の代わりに挿入されることができ、それぞれ、E1a(-)複製欠 陥突然変異体、E1b(-)複製欠陥突然変異体、又はE1a/ E1b二重突然変異体を、同時に形成する。 インビボにおける新形成細胞集団へのデリバリーのための医薬として許容され る形態におけるこのような組換えアデノウイルスを含んで成る抗新形成組成物も 提供される。 本発明は、p53及び／又はRBに結合し及び／又はこれを失活するための機能性 タンパク質を欠いた、組換えパポバウイルス（papovaviruses）、例えば、ヒト 乳頭腫ウイルス（human papillomavirus（HPV）、ポリオーマウイルス（polyoma viruses）（例えば、BK、JC）及びSV40をも、提供する。機能性E6タンパク質の 発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、p53を効率的に分解する能力を 実質的に欠くであろうし、そしてそれ故、十分なレベルの機能性p53を含む細胞 内ではなくp53(-)細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。機能性 E7タンパク質の発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、RBに効率的に結 合する能力を実質的に欠くであろうし、そしてそれ故、十分なレベルの機能性RB を含む細胞内ではなくRB(-)細胞内で複製表現型を顕出することができるであろ う。機能性E6タンパク質と機能性E7タンパク質の両方の発現を欠いたヒト乳頭腫 ウイルス突然変異体は、RB及びp53に効率的に結合する能力を実質的に欠くであ ろうし、それ故、十分なレベルの機能性RB及び／又はp53を含む細胞内ではなくp 53(-)RB(-)細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。 本発明は、非-新形成細胞集団内での発現と比較したとき、新形成細胞集団内 で複製表現型を優先的に発現し、そして／又は細胞障害効果を発現することがで きる組換えウイルスを患者に投与する段階を含んで成る新形成疾患の新規の治療 方法をも提供する。 図面の簡単な説明 図１は、アデノウイルスE1a-289Rポリペプチドのドメイン構造及びタンパク質 -タンパク質相互作用の略図を示す。 図２（a-i）は、野生型アデノウイルスと組換え-欠陥の組換えアデノウイルス 突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示 す。図示された各細胞系は、偽-感染、図２（a）；又は野生型アデノウイルス２ による1.0のMOIにおける感染、図２（b-c）；突然変異体誘導体dl 1010、図２（ d-e）；突然変異体誘導体dl 1520、図２（f-g）；又は突然変異体誘導体dl 434 、図２（h-i）であった。図２（a）は、偽-感染９日後の結果を示す。残りのパ ネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（b）、４日間；図２（c）、 ７日間；図２（d）、８日間；図２（e）、１２日間；図２（f）、14日間；図２ （g）、20日間；図２（h）、６日間；図２（i）、14日間。（上記の）感染後の 各日に、細胞をPBSにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をク リスタル・バイオレットにより染色した。PBS単独により感染された各細胞系疑 似物が、生存力についての対照として含まれた。 図３（a-c）は、野生型及び突然変異体アデノウイルスによる正常ヒト肺２倍 体繊維芽細胞系IMR90（ATCC CCL 186）の感染を示す。IMR90細胞は、0.1、1.0、 10、及び100に一致するMOIsにおいて示されたウイルスにより感染された。感染 後の所定の日に、細胞をPBSにより洗浄し、そして細胞をクリスタル・バイオレ ットにより染色した。それぞれの６-ウェル皿の中の１のウェルを、ウイルス感 染についての陽性対照として役立つ293細胞により接種した。図３（a）は、感染 後９日目に野生型Ad2により感染された細胞を示す。図３（b）は、感染後９日目 にdl 1010により感染された細胞を示す。図３（c）は、感染後９日目にdl 1520 により感染された細胞を示す。 定義 特にことわらない限り、本明細書中に使用する全ての技術及び科学用語は、本 発明の属する技術分野における通常の知識を有する者により一般的に理解される のと同じ意味をもつ。本明細書中に記載されたものと類似の又は等価な方法及び 材料のいずれをも本発明の実施又は試験において使用することができるけれども 、その好ましい方法及び材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を 以下に定義する。 用語”天然の（naturally-occuring）”とは、本明細書中に使用するとき、対 象物に適用するとき、対象物が天然に発見されることができることをいう。例え ば、天然の源から単離されることができ、そして実験室内で人により意図的に修 飾されていない（ウイルスを含む）生物内に存在するポリペプチド又はポリヌク レオチド配列は、天然である。本明細書中に使用するとき、用語”組換え（reco mbinant）”は、ポリヌクレオチド構築物（例えば、及びアデノウイルス・ゲノ ム）が、部分的に、人による意図的な修飾により、生成されていることを示す。 本明細書中に使用するとき、用語”複製欠陥ウイルス（replication deficien t virus）”とは、ウイルス複製表現型の発現を支援する所定の細胞集団（例え ば、p53及び／又はRB機能を実質的に欠いている細胞）内、並びに非-複製性の非 -形質転換細胞に特徴的な正常なp53及びRB機能レベルを含んで成る細胞内で細胞 増殖を阻害し、アポプトシスを誘導し、又は複製表現型を発現することが実質的 にできない所定の細胞集団内で、細胞増殖を優先的に阻害し又はアポプトシス（ apoptosis）を誘導するウイルスをいう。典型的には、複製欠陥ウイルスは、正 常RB及び／又はp53機能を含んで成る細胞に対してプラーク形成効率における実 質的な減少を示す。 本明細書中に使用するとき、用語”p53機能（p53 function）”とは、そのp53 ポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1b p55タンパク質に結合する ことができるような、p53遺伝子によりエンコードされているポリペプチドの本 質的に正常なレベル（すなわち、同一の組織学的タイプの非一新形成細胞と比較 して）をもつ性質（property）をいう。例えば、p53機能は、p53の失活（すなわ ち、突然変異体）形態の産生により又はp53ポリペプチド（単数又は複数）の発 現の実質的な減少又は全損失により、失われることができる。また、p53機能は 、野生型p53タンパク質をエンコードしているp53対立遺伝子を含んで成る新形成 細胞内に実質的に非存在であることができ；例えば、p53座の外側の遺伝子変更 、例えば、p53の異常細胞下プロセシング又は局在化をもたらす突然変異（例え ば、その核よりもむしろ細胞質内で優先的にp53の局在化をもたらす突然変異） は、p53機能の損失をもたらすことができる。 本明細書中に使用するとき、用語”RB機能”とは、そのRBポリペプチドが野生 型アデノウイルス２又は５のE1aタンパク質に結合することができるような、RB 遺伝子によりエンコードされているポリペプチドの本質的に正常なレベル（すな わち、同一の組織学的タイプの非-新形成細胞と比較して）をもつ性質をいう。 例えば、RB機能は、RBの失活（すなわち、突然変異体）形態の産生により又はRB ポリペプチド（単数又は複数）の発現の実質的な減少又は全損失により、失われ ることができる。また、RB機能は、野生型RBタンパク質をエンコードしているRB 対立遺伝子を含んで成る新形成細胞内に実質的に非存在であることができ；例え ば、RB座の外側の遺伝子変更、例えば、RBの異常細胞下プロセシング又は局在化 をもたらす突然変異が、RB機能の損失をもたらすことができる。 本明細書中に使用するとき、用語”複製表現型（replication phe notype）”とは、複製欠陥アデノウイルスのようなウイルスにより感染された細 胞の１以上の以下の：（1）後期遺伝子生成物、例えば、キャプシド・タンパク 質（例えば、アデノウイルス・ペントン塩基性ポリペプチド）の実質的な発現又 はウイルス後期遺伝子プロモーター（単数又は複数）から開始されるRNA転写、 （2）ウイルス・ゲノムの複製又は複製中間体の形成、（3）ウイルス・キャブシ ド又は包装されたビリオン粒子のアセンブリー、（4）感染細胞内での細胞障害 効果（CPE）の出現、（5）ウイルス溶菌サイクルの終了、及び（6）機能性癌タ ンパク質（単数又は複数）をエンコードしている野生型複製コンピテントDNAウ イルスにより感染された非-新形成細胞内でのp53又はRB機能の排除の間に典型的 に付随する他の表現型の変更、のような表現型特性をいう。複製表現型は、少な くとも１の上記列記の表現型特性、好ましくは１以上の上記表現型特性を含んで 成る。 用語”抗新形成複製欠陥ウイルス（antineoplastic replicationdeficient vi rus）”とは、本明細書中に使用するとき、同一の組織学的細胞タイプの感染非- 複製性非-新形成細胞に対して感染新形成細胞の優先的な細胞死により、ヒトに おける新生物の顕出又は進行を阻害する機能的性質をもつ組換えウイルスをいう 。 本明細書中に使用するとき、”新形成細胞（neoplastic cells）”及び”新形 成（neoplasia）”とは、それらが細胞増殖の制御のかなりの損失を特徴とする 異常細胞表現型を示すように、比較的自律的な成長を示す細胞をいう。新形成細 胞は、活性に複製しているか又は一時的な非-複製休止状態（G1又はG0）にある ことができる細胞を含んで成り；同様に、新形成細胞は、よく-分化した表現型 、ほとんど-分化していない表現型、両タイプの表現型の混合物をもつ細胞を含 んで成ることができる。従って、全ての新形成細胞が、必 ずしも、所定の時間点において複製している細胞ではない。新形成細胞として定 められたセットは、良性新生物における細胞及び悪性（又は明らかな（frank） ）新生物から成る。明らかに新形成の細胞は、しばしば、癌（cancer）といわれ 、内胚葉（endodermal）又は外胚葉（ectodermal）の組織学的起源の細胞から生 じる場合、典型的には、癌腫（carcinoma）といわれ、又は中胚葉（mesodermal ）から誘導された細胞タイプから生じる場合、肉腫（sarcoma）といわれる。 本明細書中に使用するとき、用語”作用可能な状態で結合された（operably l inked）”とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の結合をいう。核 酸は、それが他の核酸配列との機能的な関係に置かれているとき、”作用可能な 状態で結合されて”いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがそ のコーディング配列の転写に影響を与える場合に、コーディング配列に作用可能 な状態で結合されている。作用可能な状態で結合されたとは、結合されているDN A配列が典型的には隣接し、そして２つのタンパク質コーディング領域を接続す る必要がある場合、隣接し且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしなが ら、エンハンサーは、一般的に、数キロ塩基によりそのプロモーターから隔てら れた時に機能し、そしてイントロン配列は様々な長さを有することができるので 、幾つかのポリヌクレオチド要素は、作用可能な状態で結合されているが隣接し ていなくてもよい。 本明細書中に使用するとき、”生理学的な条件（physiological condition） ”とは、無傷の哺乳動物細胞内又は生きた哺乳動物の組織空間又は臓器内の条件 と実質的に同様なイオン強度、pH、及び温度をもつ水性環境をいう。典型的には 、生理学的条件は、約150 mM NaCl（又は場合によりKCl）、pH 6.5-8.1、及び約 20-45℃の温度をもつ水性溶液を含んで成る。一般的には、生理学的条件は、生 物学的 な巨大分子の分子間会合に好適な結合条件である。例えば、150 mM NaCl、pH 7. 4、37℃における生理学的条件が、一般的に、好適である。 詳細な説明 以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、及び分子ウイルス学における、以下に 使用する命名法及び実験室手順は、本分野においてよく知られたものであり、そ して一般的に使用されている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプ チド合成、（複製欠陥ウイルス株をトランス-相補することができる細胞系を含 む）ウイルス株の生成及び増殖、細胞培養、等のための標準的な技術が、使用さ れる。一般的な酵素反応及び生成段階が、製造者の仕様書に従って行われる。こ れらの技術及び手順は、一般的に、本分野における慣用法及び様々な一般的な文 献に従って行われる（一般的には、Sambrook et al．Molecular Cloning：A Lab oratory Manual，2d ed．（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Virology，Second edition．eds．Fields BN and Knipe DM，（1990）Raven Press，New York，NY（引用により本明細書中に取り込む。 ）を参照のこと。）。これらは、本明細書の全体に提供される。この中の手順は 、本分野においてよく知られており、そしてその読者の便利のために提供されて いる。この中に含まれる情報のすべてを、引用により本明細書中に取り込む。 以下に使用する命名法並びに以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、及び分子 ウイルス学における実験の手続は、本分野においてよく知られ、かつ、一般的に 使用されるものである。標準的な技術は、組換え体核酸法、ポリヌクレオチド合 成、ポリペプチド合成、（複製欠陥ウイルス株をトランス相補することができる 細胞系を含む）ウイルス株の生成及び増殖、細胞培養、等のために使用される。 一般的酵素的な反応及び精製段階を製造者の取扱説明書に従って実施した。これ らの技術及び手続は、本分野における慣用法並びに本分野の全体にわたり提供さ れるさまざまな一般的な文献（一般的には、Sambrook et al．Molecular Clonin g：A Laboratory Manual，2d ed.（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Pres s，Cold Spring Harbor，N.Y.；Virology，Second edition，eds．Fields BN an d Knipe DM，（1990）Raven Press，New York，NY，（引用により本明細書中に 取り込む。）を参照のこと。）に従って一般的に行なわれる。 新形成は、変異体遺伝子型及び表現型をもつ新形成細胞の生成を部分的に特徴 とする病因症状である。いくつかの腫瘍は、RB機能を欠いているがp53機能を有 する細胞の集団を含んで成ることができ；このような細胞はRB(-)と命名される 。いくつかの腫瘍細胞は、p53機能を欠いているがRB機能をもつことができ；こ のような細胞はp53(-)と命名される。いくつかの腫瘍は、p53とRBの両方を欠く 細胞を含んで成ることができ、p53(-)RB(-)と命名される。細抱系SAOS2（以下実 験の実施例を参照のこと。）は、p53(-)R(-)である新形成細胞型の一例である。 また、p53及びRBの本質的に正常なレベルを含んで成る新形成細胞が存在するこ とができ；正常なp53及び正常なRBの両方をもつこのような細胞は、このような 新形成細胞において複製表現型を優位に顕出することができる新形成 ウイルス構築物のための基礎を提供することができる他の癌タンパク質（例えば 、p53又はRB以外の腫瘍サプレッサー遺伝子生産物）を欠くことができる。 本発明の基礎は、哺乳動物細胞に感染するいくつかのDNAウイルス（例えば、 アデノウイルス；パポバウイルス、例えばBK及びJC，SV40、並びに乳頭腫ウイル ス、例えば、HPV、等）がそのウイルスの複製サイクルを通しての効率的な発達 に本質的であるウイルスのタンパク質をエンコードしているということであり； これらのウイルス・タンパク質のいくつかは細胞タンパク質、例えば、細胞−分 裂制御及び／又は効率的なウイルス複製に必要な条件としての、転写複合体の形 成に関係するものを隔離する。p53及びRBのような細胞タンパク質に結合し、こ れを隔離し、又は分解するウイルスタンパク質の非存在中、ウイルス複製は、実 質的に阻害される。p53及び／又はRBを隔離し又は分解する能力を欠いた突然変 異体ウイルスにより感染された正常な（すなわち、非−新形成の）細胞は、一般 的に、その突然変異体ウイルスの複製を支援することができず、これ故に、この ような突然変異体ウイルスは、複製欠陥（又は複製欠損）であると考えられる。 しかしながら、p53又はRBの隔離又は分解は、機能的なp53又はRBを欠いた細胞（ このような細胞はそれぞれp53(-)及びRB(-)と命名される。）におけるウイルス 複製に必要ではないので、p53及び／又はRB隔離又は分解について欠損である複 製欠陥突然変異体ウイルスが本質的に正常なp53及び／又はRB機能をもつ細胞よ りも大きな程度まで、このようなp53(-)又はRB(-)細胞内で複製表現型を発現す ることができるということが可能である。新形成細胞は、しばしば、p53機能を 欠き（p53(-)細胞）、RB機能を欠き（RB(-)細胞）、又は両方の機能を欠く（p53(-) RB(-)細胞）。これ故に、いくつかの複製欠陥ウイルス突然変異体 は、新形成細胞において複製表現型を優先的に示すことができる。 機能的RB失活タンパク質（例えば、アデノウイルスE1a，HPV E7タンパク質） を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、RB(-)細胞及びRB(-)p53(-)細胞 内で複製表現型を顕出するであろう。機能的p53失活タンパク質（例えば、アデ ノウイルスE1b p55，HPV E6タンパク質）を発現する能力を欠いたウイルス突然 変異体は、p53(-)細胞及びRB(-)p53(-)細胞内で複製表現型を顕出するであろう 。機能的p53失活タンパク質（例えば、アデノウイルスE1b p55，HPV E6タンパク 質）と機能的RB失活タンパク質（例えば、アデノウイルスE1a，HPV E7タンパク 質）の両方を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、RB(-)p53(-)細胞内 で複製表現型を顕出するであろう。複製表現型の発現に関連する細胞毒性が、そ れ故に、RB(-)，p53(-)、又はRB(-)p53(-)表現型をもつ新形成細胞を優先的に殺 生するための基礎として使用されることができる。いくつかの複製性の非−新形 成細胞がその細胞分裂サイクルを通じての進行の間にRB(-)表現型、p53(-)表現 型、又はRB(-)p53(-)表現型を過渡的に示すことができるけれども、本発明に係 るウイルス突然変異体は、必らずしも完全に選択的でないにもかかわらず、優先 的に、新形成細胞を殺し、それ故に、単独で又は他の治療のモダリティー（様相 ）との組み合わされて使用されるべき有用な抗新形成療法モダリティーを構築す るために、使用されることができる。上記HPV E7ポリペプチドの37のアミノ−末 端残基内の欠失（又は他の失活突然変異）が、RB(-)細胞への適用のための好ま しいHPV突然変異体である。なぜなら、これらの残基は、RB結合のために重要で あるからである。 以下に指示する方法及び組成物は複製欠陥アデノウイルス構築物に関係する方 法のために特に記載されているけれども、本発明が、 p53タンパク質又はRBタンパク質の分解を隔離し又は強化する癌タンパク質をエ ンコードしている他のDNAウイルス、例えば、複製欠陥乳頭腫ウイルス種（例え ば、HPV型16，18，33の突然変異体）であって、それぞれp53及び／又はRB機能を 実質的に排除するE6及び／又はE7遺伝子内に突然変異を含むものによって実施さ れることができると信じられている。アデノウイルス科のメンバー（特にマスト アデノウイルス属）に加えて、パポバウイルス科のメンバー、特に乳頭腫ウイル ス及びポリオーマウイルスであってp53又はRBを隔離し及び／又は失活するウイ ルス・タンパク質をエンコードしているものが、本発明に係る方法における使用 に好適であると信じられている。 アデノウイルス及びパポバウイルス生物学の一般的な記載については、Virolo gy ，Second edition，eds．Fields BN and Knipe DM，Vol.2，pp.1651-1740，Ra ven Press，New York，NY，（引用により本明細書中に取り込む）をガンダンス として参照されることができる。以下の特定の記載は、これに限定されるもので はないが、アデノウイルス血清型５及びアデノウイルス血清型２に言及する。他 のアデノウイルス血清型も使用されることができると信じられているけれども、 アデノウイルス５型は、そのE1aウイルス遺伝子領域、及び他のウイルス遺伝子 の、ウイルスのポリヌクレオチドのヌクレオチド番号付け慣行及びウイルス−エ ンコード・ポリペプチドのアミノ酸番号付けのための一般的な引用点を提供する 。アデノウイルス２型は、E1bウイルス遺伝子領域、及び他のウイルス遺伝子領 域の番号付け慣行のための便利な引用を提供する。当業者は、他のアデノウイル ス血清型内の対応の位置を容易に同定するであろうと信じられている。ヒト乳頭 腫ウイルスに対する文献は、一般的に、新形成に関連した型（例えば、16型、18 型、又は33型）に言及してい る。但し、非−オンコジーン型も使用されることができる。 E1a突然変異体 網膜芽腫（retinoblastoma）腫瘍サプレッサー遺伝子（RB）の遺伝子機能の損 失は、さまざまなタイプの腫瘍の病因論に関係している。この腫瘍サプレッサー 遺伝子の生産物、pRB又はp105と言われる105キロダルトンのポリペプチドは、細 胞分裂サイクル調節性タンパク質である。このpRBポリペプチドは、細胞分裂サ イクルのＧ1期において細胞を休止させることにより細胞増殖を阻害する。このp RBタンパク質も、アデノウイルスE1a，SV40の大きなＴ抗原、及び乳頭腫ウイル スE7を含む、いくつかのDNAウイルス癌タンパク質の主要な標的である。これら のウイルス・タンパク質は、pRBに結合し、そしてこれを失活させ、そしてpRBを 失活させる機能は、ウイルスの複製の容易化において重要である。このpRBタン パク質は、アデノウイルスE2遺伝子及びいくつかの細胞遺伝子の発現に関連する E2F転写因子と相互作用し、そしてこの転写因子の活性を阻害する（Bagchi et a l.（1991）Cell 65：1063；Bandara et al．（1991）Nature 351：494；Chellap ran et al．（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．（U.S.A.） 89：4549，（引用に より本明細書中に取り込む））。このウイルス癌タンパク質、例えば、アデノウ イルスE1aは、E2Fの活性化をもたらすpRB／E2F複合体を破壊する。しかしながら 、このE2Fと複合体化するのに充分に機能的であるpRBを欠く細胞は、転写活性な E2Fを所有するために、機能的な癌タンパク質、例えば、E1aの存在を必要としな いであろう。それ故、RBと複合体を形成する能力を欠いているが他の本質的な複 製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、RB機能において欠 陥のある細胞（例えば、実質的に欠失したRB対立遺伝子についてホモ接合又はヘ テロ接合である細胞、本質的に非機能的である突然変異体RB タンパク質をエンコードしているRB対立遺伝子を含んで成る細胞、RBタンパク質 の機能の欠如をもたらす突然変異を含んで成る細胞）において複製表現型を示す であろうが、非−複製性の非−新形成細胞においては複製表現型を実質的に示さ ないであろうと、信じられている。このような複製欠陥アデノウイルス種は、本 明細書中便利には、E1a-RB(-)複製欠陥アデノウイルスとして言及される。 RB機能を欠く新形成細胞のサブ集団及び本質的に正常なRB機能を発現する非− 新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチャ ー又はヒト癌患者）は、感染状態（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス感 染に好適な状態、典型的には、生理学的状態）の下でE1a-RB(-)製欠陥アデノウ イルスの感染性投与量を含んで成る組成物により接触されることができる。この ような接触は、上記E1a-RB(-)複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感 染をもたらす。この感染は、RB機能を欠いた新形成細胞のサブ集団を含んで成る 細胞のかなりのフラクション中で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的 に正常なRB機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団においては複製表現型の実質的 な発現を作り出さない。感染されたRB(-)細胞における複製表現型の発現は、例 えば細胞病理学上の効果（cytopathic effect（CPE））、細胞溶解、アポプトシ ス、等による細胞の死をもたらし、その細胞集団からの新形成RB(-)細胞の選択 的排除をもたらす。 典型的には、RB(-)新形成細胞を選択的に殺すのに好適なE1a-RB(-)複製欠陥ア デノウイルス構築物は、E1aポリペプチドがRBタンパク質に効率的に結合する能 力を失活させる突然変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を含んで成る 。このような失活突然変異は、典型的には、p105 RBタンパク質及びp107タンパ ク質の結合に関係する、E1a CR1ドメイン（Ad5内のアミノ酸30-85：ヌクレオ チド位置697-790）及び／又はCR2ドメイン（Ad5内のアミノ酸120-139；ヌクレオ チド位置920-967）内で生じる。好ましくは、（アミノ酸150-186にわたる）CR3 ドメインが残り、そして切り詰められたp289Rポリペプチドとして発現され、そ してアデノウイルス初期遺伝子のトランス作用において機能的である。図１は、 このE1a-289Rポリペプチドのドメイン構造を図示する。 本発明に係る方法及び組成物中における使用に好適なE1a-RB(-)複製欠陥アデ ノウイルス構築物は、以下の実施例に限定されずに：（１）効率的なRB結合に必 要なCR1及びCR2ドメイン（アミノ酸２〜150；ヌクレオチド560〜1009の欠失）を 欠いているが、CR3ドメインを実質的に保持しているE1aタンパク質をエンコード しているアデノウイルス血清型５ NT dl 1010（Whyte et al．（1989）Cell 56 ：67，（引用により本明細書中に取り込む））、並びに（２）野生型アデノウイ ルス内のE1a領域の全体をエンコードしているヌクレオチド448-1349にわたる領 域を欠いている欠失ウイルス・ゲノムを含んで成るアデノウイルス血清型５ dl 312（Jones N and Shenk T（1979）Proc．Natl．Acad．Sci．（U.S.A.） 76：36 65（引用により本明細書中に取り込む））を含む。Ad5 NT dl 1010は、好ましい E1a-RB(-)複製欠陥アデノウイルスであり、Dr.E.Harlow，Massachusetts Genera l Hospital，Boston，MAから入手可能である。 E1a-RB(-)突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞におけ る感染性ビリオンの形成を阻害するために、このようなアデノウイルス構築物内 に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失 活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビ リオンを形成する完全なウイルス複製が望ましくない治療的モダリティーにおい て好ましいであろう。これらの充分に失活された突然変異体は、非 複製性E1a-RB(-)突然変異体といわれる。このような非複製性突然変異体は、p53(-) RB(-)細胞内でさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異体を含んで成り；こ のような突然変異は、典型的には、本質的なビリオン・タンパク質又はプロテア ーゼにおける構成的な突然変異である。しかしながら、多くのモダリティーにお いては、突然変異体ウイルスが複製可能であり、そして他の細胞に拡がりそして それを感染させることができる突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオ ンを形成し、それにより、突然変異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増 幅することが望ましい。 RBに結合する能力を欠く追加のE1a(-)突然変異体は、典型的には、CR1及び／ 又はCR2ドメイン内で、E1aポリペプチドをエンコードしているE1a遺伝子領域内 で突然変異を生成させ、その突然変異体E1aポリペプチドを発現させ、水性結合 条件下、その突然変異体E1aポリペプチドをp105又はRBの結合性断片と接触させ 、そして本発明における使用に好適な候補E1a(-)突然変異体として、RBに特異的 に結合しない突然変異体E1aポリペプチドを同定することにより、当業者により 生成されることができる。他の検定法は、上記突然変異体E1aポリペプチドを水 性結合条件下300kDタンパク質及び／又はp107タンパク質、又はそれらの結合性 断片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補E1a(-)突然変異体とし て３00kD及び／又はp107ポリペプチドと特異的に結合しない突然変異体E1aポリ ペプチドを同定することを含む。他の結合検定法は、E1a(-)突然変異体タンパク 質（又はE1aタンパク質の非存在）が転写因子E2Fと複合体を形成する能力がない こと、及び／又は生理学的条件下でRB：E2F複合体からRBタンパク質を乖離する 能力の欠如を測定することを含む（Chellapran et al．（1991）op．cit.，（引 用により本明細書中に取り込む。））。 E1a機能を欠いた突然変異体、例えば、E1a−依存性転写調節配列に結合したさ まざまなリポーター・ポリペプチドの転写のE1aによるトランス作用の損失、等 を測定するための他の機能検定法が使用されるであろう。 E1b突然変異体 細胞リン脂質p53の機能は、その細胞分裂サイクルを通して哺乳動物細胞の進 行を阻害することである。野生型アデノウイルスE1bp55タンパク質は、おそらく 不活性形態におけるp53を隔離することにより、p53をもち、かつ、p53機能の実 質的な失活を作り出す感染細胞においてp53に結合する。機能的なE1bタンパク質 は、機能的p53を含む細胞における効率的なアデノウイルスの複製に不可欠であ る。これ故、p53に結合する能力を実質的に欠くアデノウイルス変異体は、機能 的p53の正常レベルをもつ非−複製性、非−新形成細胞においては複製欠陥であ る。 ヒト腫瘍細胞は、突然変異した（例えば、置換、欠失、フレームシフト突然変 異した）p53対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合であり、そしてその細 胞分裂サイクルの正常な制御に必要なp53機能を欠いている（Hollstein et al． （1991）Science 253：49；Levine et al．（1991）op．cit.，（引用により本 明細書中に取り込む））。従って、多くの新形成細胞は、p53(-)である。なぜな ら、それらが、p53タンパク質の充分なレベルを欠いているか、そして／又は、 それらが、実質的なp53機能が不可能であり、そして野生型p53が存在することが できるときでさえ（例えば、機能的マルチマーの形成を阻害することにより）p5 3機能を実質的に取り除くことができるp53の突然変異体形態を発現するかのいず れかであるからである。いくつかの新形成細胞は、本質的に野生型のp53タンパ ク質をエンコードしている対立遺伝子を含んで成るが、p53機能を 実質的に排除する第二の部位突然変異、例えば、その核内よりもむしろ細胞質内 に局在化するp53タンパク質をもたらす突然変異を含んで成ることができ；この ような第二部位突然変異体も、p53機能を実質的に欠いている。 p53と複合体を形成する能力を欠いているが他の本質的なウイルス複製機能を 実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、p53機能において欠陥であ る細胞（例えば、実質的に欠失したp53対立遺伝子についてホモ接合である細胞 、本質的に非機能的である突然変異体p53タンパク質を含んで成る細胞）の内で 複製表現型を示すであろうが、非−複製性の非−新形成の細胞内で複製表現型を 実質的に示さないであろうと信じられている。このような複製欠陥アデノウイル ス種は、E1b-p53(-)複製欠陥アデノウイルスとして適宜本明細書中で言及される 。 p53機能を欠く新形成細胞のサブ集団及び本質的に正常なp53機能を発現する非 −新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチ ャー又はヒト癌患者）は、感染条件（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス 感染に好適な条件、典型的には生理学的条件）の下でE1b-p53(-)複製欠陥アデノ ウイルスの感染投与量を含んで成る組成物と接触されることができる。このよう な接触は、上記E1b-p53(-)複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染を もたらす。この感染は、p53機能を欠く新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞 のかなりのフラクション内で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的に正 常なp53機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団内での複製表現型の実質的な発現 を作り出さない。感染されたp53(-)細胞内での複製表現型の発現は、例えば、細 胞病理学的効果（CPE）、細胞溶解、アポプトシス、等による細胞の死をもたら し、その細胞集団からの新形成p53(-)細胞の 選択的排除をもたらす。 典型的には、p53(-)新形成細胞の選択的殺生に好適なE1b-p53(-)複製欠陥アデ ノウイルス構築物は、E1b・p55ポリペプチドが効率的にp53タンパク質に結合す る能力を失活させる突然変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を含んで 成る。このような失活性突然変異は、典型的には、p53に結合するp55の領域内で 生じる。場合により、この突然変異体E1b領域は、そのE1b領域の残りによりエン コードされている機能的p19タンパク質をエンコードし、そしてこれを発現する ことができ、そして、それは、E1aポリペプチドの非存在中アデノウイルス初期 遺伝子のトランス作用において機能的である。 本発明に係る方法及び組成物における使用に好適なE1b-p53(-)複製欠陥アデノ ウイルス構築物は、以下の実施例に限定されないが：（１）p55タンパク質の翻 訳の開始のために使用されるAUGコドンの３アミノ酸下流の終止コドンを生成す るヌクレオチド位2022におけるＣ〜Ｔ突然変異及びヌクレオチド3336において第 ２の終止コドンを生成する小さなリンカー挿入により置換されたヌクレオチド24 96〜3323間の欠失を含む、アデノウイルス２型dl 1520（Barker and Berk（1987 ）Virology 156：107，（引用により本明細書中に取り込む）並びに（２）少な くとも2022位の突然変異及び／又は2496-3323の欠失突然変異、又はその実質的 な部分、及びp19 cyt突然変異体を産生するためのp19内の追加の突然変異を含ん で成る複合アデノウイルス構築物、を含み；この複合ウイルス構築物は、p55を 欠いており、そしてp19 cyt突然変異の増強された細胞病理学的効果を含んで成 る。Ad2 dl 1520は、Dr．A．Berk，University of California at Los Angeles ，Los Angeles，CAから入手可能であり、そしてBarker and Berk（1987）Virolo gy 156：107，（引用 により本明細書中に取り込む）を含む文献中に記載されている。 E1b-p53(-)突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞内での 感染性ビリオンの形成を阻害するために上記のようなアデノウイルス構築物中に 追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失活 突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビリ オンを形成する完全なウイルスの複製が望ましくない治療的モダリティーにおい て好ましいであろう。これらの完全に失活された突然変異体は、非複製性E1b-p5 3(-)突然変異体と言われる。このような非複製性突然変異体は、p53(-)RB(-)細 胞内においてさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異を含んで成り；このよう な突然変異は、典型的には、不可欠なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼ内 の構成的な突然変異である。 しかしながら、多くのモダリティーにおいては、その突然変異体ウイルスが複 製可能であり、そして他の細胞に拡がり、かつ、感染することができる突然変異 体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより突然変異体ウイ ルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。 p53に結合する能力を欠いている追加のE1b(-)突然変異体は、p55をエンコード しているE1b遺伝子領域内に突然変異を生成し、突然変異体p55ポリペプチドを発 現させ、水性結合条件下、突然変異体p55ポリペプチドをp53又はp53の結合性断 片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補E1b(-)突然変異体として p53に特異的に結合しない突然変異体E1bポリペプチドを同定することにより、当 業者により生成されことができる。 より典型的には、機能的検定法が候補E1b(-)突然変異体を同定するために使用 されるであろう。例えば、p53機能の測定のための Friend検定法が、Frebourg et al.（1992）Cancer Res． 52：6977，（引用によ り本明細書中に取り込む）中に本質的に記載されているように行なわれるであろ う。p53を失活させる能力を欠いているE1b突然変異体は、候補E1b(-)複製欠陥突 然変異体として同定されるであろう。 E1a／E1b ２重突然変異 いくつかのヒト腫瘍細胞は、p53機能とRB機能の両方を、１又は両方のタンパ ク質種の突然変異性の失活又は欠失のいずれかにより、欠いている。このような 細胞は、p53(-)RB(-)細胞と命名されている。 p53に結合する能力を欠いており、そしてRBに結合する能力も欠いているが、 他の不可欠なウイルス複製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス 種が、p53(-)RB(-)細胞内で複製表現型を優位に示すであろうと信じられている 。このような複製欠陥アデノウイルス種は、本明細書中適宜、E1a-RB(-)／E1b-p 53(-)複製欠陥アデノウイルス、又は単にE1a／E1b ２重突然変異体と言われる。 このようなE1a／E1b ２重突然変異体は、E1a領域内の少なくとも１のE1a-RB(-) 突然変異及びp55をエンコードしているE1b領域内の少なくとも１のE1b-p53(-)突 然変異を併合して、E1a／E1b ２重突然変異体アデノウイルスを形成することに より、当業者により構築されることができる。このような複製欠陥２重突然変異 体アデノウイルスは、p53とRB機能の両方において欠陥があるが非複製性の非− 形質転換細胞内で複製表現型を実質に示さないであろうような細胞内で、あるい はp53又はRB機能のいずれかにおいて欠陥であるが両方の機能においては欠陥が ないような細胞内で、複製表現型を示すであろう。例えば、Ad2 dl 434突然変異 体（Grodzicker et al.（1980）Cell 21：454，（引用により本明細書中に取り 込 む）は、E1a座の欠失及びE1b座の部分的欠失を含んで成り、そして機能的E1a及 びE1b p55タンパク質をエンコードする能力を実質的に欠いている。 p53及びRB機能を欠いている新形成細胞のサブ集団並びに本質的に正常なp53機 能及び／又はRB機能を発現する非−新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団 （例えば、混合された細胞カルチャー又はヒト癌患者）は、感染条件（すなわち 、その細胞集団のアデノウイルス感染に好適な条件、典型的には生理学的条件） 下で、複製欠陥E1a／E1b ２重突然変異体アデノウイルスの感染投与量を含んで 成る組成物と接触されることができる。このような接触は、E1a／E1b ２重突然 変異体複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染をもたらす。 この感染は、p53機能とRB機能の両方を欠いている新形成細胞のサブ集団を含 んで成る細胞のかなりのフラクション内で複製表現型の優位な発現を作り出すが 、本質的に正常なp53機能及び／又はRB機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団内 で複製表現型の実質的な発現を作り出さない。 感染したp53(-)RB(-)細胞内での複製表現型の発現は、例えば、細胞病理学的 効果（CPE）、細胞溶解、等による細胞死をもたらし、その細胞集団から新形成p 53(-)RB(-)細胞の選択的排除をもたらす。 E1a／E1b ２重突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞内 で感染性ビリオンの形成を阻害するために上記のようなアデノウイルス構築物中 に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失 活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビ リオンを形成する完全なウイルス複製が望ましくないような治療のモダリティー において好ましいであろう。これらの完全に失活された突然変異体は、非複製性 E1a／E1b ２重突然変異体と言われる。このような非複製性突然変異体は、p53(- ) RB(-)細胞内でさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異を含んで成り；このよ うな突然変異は、典型的には、不可欠なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼ 内の構成的な突然変異である。 しかしながら、多くのモダリティーにおいては、その突然変異体ウイルスが複 製可能であり、そして他の細胞に拡がり、そしてそれを感染させることができる 突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより突然変 異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。 負の選択のウイルス構築物 感染細胞内のアデノウイルス複製表現型の発現は、一般的に、細胞溶解、細胞 病理学的効果（CPE）、アポプトシス、又は他の細胞死の機構により、ウイルス −誘導細胞毒性と相関するけれども、抗新形成治療のために使用されるべき組換 え体アデノウイルスの細胞毒性を増大させることがしばしば好ましくあることが できる。このような増大は、典型的には、複製表現型を発現する細胞内で正の転 写調節を示すアデノウイルスのプロモーターに作用可能な状態で結合された組換 え体アデノウイルス内に負の選択遺伝子を含む形態を呈することができる。例え ば、HSV tk遺伝子カセットは、複製欠陥アデノウイルスのE3プロモーター、例え ば、-Ad5 NT dl 1110の直下流に作用可能な状態で結合されることができる。し ばしば、この負の選択カセットに適合するようにアデノウイルス・ゲノムの（す なわち、ウイルス複製及びパッケージングのための）非必須部分を欠失させるこ とが望ましく；従って、このE3遺伝子領域の実質的な部分が欠失され、そして負 の選択カセット、例えば、E2プロモーター（ 及びエンハンサー）又は他の好適なプロモーター／エンハンサーに作用可能な状 態で結合されたHSV tk遺伝子により置換されることができる。あるいは、負の選 択遺伝子は、アデノウイルス後期領域プロモーターに作用可能な状態で結合され て、後期遺伝子プロモーターの転写を特徴とする複製表現型を発現する細胞内で その負の選択遺伝子産物の効率的な発現を許容することができる。 インビボにおいて感染性ビリオンを形成するウイルス複製が望ましくない態様 のためには、非複製性であるアデノウイルス複製欠陥構築物が使用される。この ような非複製性突然変異体は、E1a(-)及び／又はE1b(-)突然変異を含んで成り、 そして好適な新形成細胞（例えば、p53(-)細胞、RB(-)細胞、又はp53(-)RB(-)細 胞）内での複製表現型の生成に必要な遺伝子機能の全てを含んで成るが、感染性 ビリオンの形成に、例えば、構造コート・タンパク質、プロテアーゼ、等に、必 要な少なくとも１の必須遺伝子機能を欠失している。あるいは、このウイルスに より誘発された顕出免疫応答が、そのウイルスの感染性ビリオンを中和し、そし てその拡がりを緩和することができる。E1a及び／又はE1b突然変異に加えて相補 性トランス−作用機能を欠いている非複製性突然変異体は、その欠失されたトラ ンス−作用性の機能（単数又は複数）を提供することができる相補性ヘルパー・ ウイルス又はヘルパー細胞系と共に増殖されることができる。例えば、トランス においてE1aとE1b機能を提供する293細胞系（ATCC # CRL 1573；Graham et al． （1977）J．Gen．Virol． 36：59，（引用により本明細書中に取り込む）は、ト ランスにおける追加の機能、例えば、ビリオン・コート・タンパク質等を提供す るために修飾されることができ、ウイルス株を開発するために“非複製性”突然 変異体の増殖を許容する。細胞内でのHSVtk遺伝子の発現は、その細胞が負の選 択剤、例えば、ガンシクロビ ル又はFIAUに晒されない場合には、その細胞に直接的には毒性でない。負の選択 遺伝子が実質的に発現されるような複製表現型を発現する感染細胞は、その負の 選択剤（例えば、ガンシクロビル）が、そのtk遺伝子を発現する感染細胞が選択 的に排除されるであろう時に、有効な選択的投与量において投与されるまで、本 質的に全く追加の細胞毒性を作り出さない；従って、負の選択は、増強された細 胞病理学的殺生のために、及び／又は複製表現型を示す細胞を殺すことによりさ らなるウイルス複製を静める（damp out）ために使用されることができる。さら に、この負の選択剤の投与量及び／又は投与スケジュールを調整することにより 、この負の選択遺伝子を発現する感染細胞集団の部分的排除のみを作り出すこと が可能である。一般的に、ガンシクロビルの投与量は、標準的投与量−応答曲線 を作成し、そして感染した新形成細胞の排除の所望のレベルが観察される投与レ ベルを測定することにより換算される。動物へのガンシクロビル（GANC）の投与 に関する情報は、パッケージ挿入物からヒト処方箋を含む本技術分野におけるさ まざまな源において入手可能である。細胞培養において使用されるとき、ガンシ クロビルの選択濃度は、典型的には、0.05μＭ〜50μＭのレンジ内、典型的には 、約１μＭのレンジにあり、約0.2μＭがインビトロ適用において使用され、そ して約１−５μＭがインビボ適用において投与される（典型的には、水溶液中12 5ms／mlのガンシクロビルをロードされた浸透ポンプからの連続輸注により約24 時間にわたり投与される）。インビボにおける投与のための投与量スケジュール は、７日間にわたり静脈中に与えられた５mg／kg体重B.I.D.の投与量においてガ ンシクロビルを含んで成ることができる。 負の選択遺伝子は、E1a-RB(-)複製欠陥アデノウイルス構築物、E1ba-p53(-)複 製欠陥アデノウイルス構築物、E1a／E1b ２重突 然変異体複製欠陥ウイルス構築物、等の中に取り込まれることができる。 好ましい態様は、tk発現カセットを作るためのポリアデニレーション部位を含 む、Ad5 NT dl 1110のE2プロモーター又は他のプロモーター及び／又はエンハン サー（例えば、大きな後期プロモーター、E1aプロモーター／エンハンサー、E1b プロモーター／エンハンサー）に作用可能な状態で結合されたHSV tk遺伝子カセ ット（Zjilstra et al．（1989）Nature 342：435；Mansour et al.（1988）Nat ure 336：348；Johnson et al.（1989）Science 245：1234；Adair et al（1989 ）Proc.Natl.Acad.Sci．（U.S.A.）86：4574；Capecchi，M．（1989）Science 2 44 ：1288,（引用により本明細書中に取り込む）である。このtk発現カセット（ 又は他の負の選択発現カセット）は、例えば、そのE3遺伝子の実質的な欠失のた めの代わりとして、アデノウイルスのゲノム内に挿入される。他の負の選択遺伝 子及び複製欠陥アデノウイルス構築物は、当業者に自明であろう。E2プロモータ ーに作用可能な状態で結合された負の選択遺伝子は、E1a(-)複製−欠陥アデノウ イルス突然変異体内への取り込みのための特に好ましい態様であると信じられて いる。なぜなら、そのE2プロモーターが、多数のE2F部位を含むからである。一 方、RB(-)とp53(-)RB(-)は、RB機能を欠き、そしておそらくE2プロモーターから のより効率的な転写を示すであろう。 診断及びインビトロにおける用途 本発明に係る複製欠陥アデノウイルスは、p53及び／又はRB機能を欠く細胞の 存在を検出するために使用されることができる。例えば、p53及び／又はRBを欠 く新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞サンプルが、好適な複製欠陥アデノウ イルス種により感染される。好適なインキュベーション期間の後、複製表現型（ 例えば、Tryp anブルーを排除する能力の損失、ビリオン形成、ウイルスDNA内への3Ｈ−チミジ ンの取り込み）を発現する細胞サンプル中の細胞を、その細胞サンプル中の複製 性及び／又は新形成性細胞の数又は比率の測定を提供するために定量することが できる。このような方法は、体外移植細胞サンプル（例えば、リンパ球白血病の ための化学療法を経験する患者からのリンパ球サンプル）に基づき、患者内の化 学療法後に、新形成を診断し、そして／又は腫瘍細胞負荷を評価するために使用 されることができる。 他の診断用途及び変法は自明である；例えば、リポーター遺伝子（例えば、ル シフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）を、複製欠陥アデノウイルス内の負の選 択遺伝子と置換することができ；形質転換された細胞は、リポーター遺伝子の発 現により（例えば、細胞サンプル又は形質転換検定法において）等級付けし、こ れを、細胞内でのp53及び／又はRBの欠如を示す複製表現型の発現と関連付ける 。 治療法 新形成疾患の治療は、E1a-RB(-)複製欠陥アデノウイルス、E1b-p53(-)複製欠 陥アデノウイルス、E1a／E1b ２重突然変異体、及び負の選択遺伝子をさらに含 んで成る複製欠陥アデノウイルスを含む、本発明の複製欠陥アデノウイルスを含 んで成る組成物を患者に投与することにより与えられることができる。 p53及び／又はRB機能を欠いた細胞を含んで成るさまざまなヒト新形成が、複 製欠陥アデノウイルス構築物により治療されることができる。例えば、これらに 限定されないが、気管支癌腫、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、小細胞及び非−小細胞肺 癌腫、肺腺癌、肝癌、膵臓癌腫、膀胱癌腫、大腸癌腫、胸癌腫、子宮癌腫、卵巣 癌腫、又はリンパ球白血病をもつヒト患者又は非ヒト哺乳動物を、適当な複製欠 陥アデノウイルスの有効抗新形成投与量を投与することにより治療することがで きる。感染性アデノウイルス粒子の懸濁液を、静脈内、腹膜内、筋中、皮下、及 び表在局所的に含むさまざまな経路をもって新形成組織に適用することができる 。１ml当り約103〜1012以上のビリオン粒子を含むアデノウイルス懸濁液を、（ 例えば、気管支癌腫、小細胞肺癌腫、非−小細胞肺癌腫、肺腺癌、又は喉頭癌を 治療するための肺デリバリーのために）ミストとして吸入させ、又は、腫瘍（例 えば、気管支癌腫、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、子宮癌腫）を治療するために腫瘍部 位に直接的に綿棒で塗ることができ、又は輸注により（例えば、卵巣癌の治療の ためには腹膜腔中に、肝癌又は他の非−肝臓一次腫瘍のためには門脈中に）、あ るいは腫瘍塊（例えば、胸腫瘍）内への直接的注入、浣腸（例えば、結腸癌）、 又はカテーテル（例えば、膀胱癌）を含む他の好適な経路により、投与すること ができる。 候補抗新形成アデノウイルス突然変異体を、新形成細胞の等価な移植片を宿す 未処理マウスと比較して、p53及び／又はRB機能を欠いた新形成細胞の移植片を 宿すnu／nuマウスにおける腫瘍形成又は新形成細胞負荷を減少させるそれらの能 力により、さらに評価することができる。 抗新形成複製欠陥アデノウイルス突然変異体を、新形成疾患をもつ患者への治 療的及び診断的投与のために配合することができる。治療的又は予防的用途のた めに、抗新形成複製欠陥アデノウイルス変異体の１以上の種の薬理学的有効投与 量を含む滅菌組成物を、新形成症状の治療のために、ヒト患者又は獣医学的非ヒ ト患者に投与する。一般的には、本組成物は、水性懸濁液中に約103〜1015以上 のアデノウイルス粒子を含んで成るであろう。医薬として許容される担体又は賦 形剤が、このような滅菌組成物中でしばしば使用され る。さまざまな水溶液、例えば、水、緩衝液、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン 、等を使用することができる。これらの溶液は、無菌であり、そして所望のアデ ノウイルス・ビリオン以外の粒状物を一般的に含まない。これらの組成物は、生 理学的な条件に近づけるのに必要な医薬として許容される補助的物質、例えばpH 調整及び緩衝化剤、毒性調整剤、等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、 塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等を含むことができる。アデ ノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤を含むことができる。 複製欠陥ウイルスは、リポソーム又は免疫リポソーム・デリバリーにより新形 成細胞にデリバリーされることができる；このようなデリバリーは、新形成細胞 集団上に存在する細胞表面特性（例えば、免疫リポソーム内の免疫グロブリンに 結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づいて、新形成細胞に対して選択的に 標的化されることができる。典型的には、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソ ーム又は免疫リポソーム内に包み込まれる。例えば、複製欠陥アデノウイルス・ ビリオンの懸濁液は、常法により免疫リポソームを形成するためにミセル内に包 み込まれる（米国特許第5,043,164号、米国特許第4,957,735号、米国特許第4,92 5,661号；Connor and Huang（1985）J．Cell．Biol． 101：582；Lasic DD（199 2）Nature355：279；Novel Drug Delivery（eds．Prescott LF and NimmoWS：Wi ley，New York，1989）；Reddy et al．（1992）J．Immunol．148：1585；（引 用により本明細書中に取り込む））。個体の癌細胞上に存在する癌細胞抗原（例 えば、CALLA，CEA）に特異的に結合する抗体を含んで成る免疫リポソームを、こ れらの細胞に対してビリオンを標的化するために使用することができる。 本抗新形成複製欠陥アデノウイルスを含む組成物又はそれらのカ クテルを、新形成疾患の予防的及び／又は治療的処置のために投与することがで きる。治療的用途においては、組成物を、その症状及びその合併症を治癒し又は 少なくとも部分的に休止させるのに充分な量において、特定の新形成疾患を既に 患った患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、“治療的有効投与量 （therapeutically effective dose）”又は“有効投与量（efficacious dose） ”と定義される。この用途のために有効な量は、その症状の重度、その患者の一 般的な状態、及び投与の経路に依存するであろう。 予防的な適用においては、抗新形成複製欠陥アデノウイルスを含む組成物又は そのカクテルは、新形成の再発に対する患者の抵抗性を強化し又は緩解時間を遅 延化するために、現在は新形成疾患状態にはない患者に投与される。このような 量は、“予防的有効投与量（prophytactically effective dose）”であると定 義される。この用途においては、適正な量は、再び、その患者の健康及び免疫の 一般的レベルに依存する。 これらの組成物の単一又は多数の投与は、その治療内科医により選択される投 与量レベル及びパターンにより行なわれることができる。いずれの事件において も、医薬配合物は、患者を有効に治療するのに充分な量の本発明に係る抗新形成 複製欠陥アデノウイルスを提供すべきである。 本発明に係る抗新形成複製欠陥アデノウイルス治療は、他の抗新形成プロトコ ール、例えば、慣用の化学療法と組み合わされることができる。 突然変異体アデノウイルスの増殖 本発明に係るアデノウイルス突然変異体（例えば、E1a-RB(-)複製欠陥アデノ ウイルス、E1b-p53(-)複製欠陥アデノウイルス、及びE1a／E1b ２重突然変異体 ）は、典型的には、感染性突然変異体 ビリオンの複製及び形成を支援するためにトランスにおいて、それぞれ、E1a機 能、E1b機能、又は両E1a及びE1b機能を提供することができる細胞系（例えば、2 93細胞系ATCC # CRL 1573，American Type Culture Collection，Rockville，MD ；Graham et al.（1977）J.Gen.Virol． 36：59）内でウイルス株として増殖さ れる。 以下の実施例を、限定ではなく実施例として提供する。変法及び他の態様は、 当業者に自明であろう。 実験的実施例 以下の実験的実施例は、p53及び／又はRb機能を欠いた新形成細胞に複製−欠 陥組換えアデノウイルス調製物を投与することが新形成細胞を効率的に殺すこと ができるということを立証する。また、本実施例は、p53及びRb機能を含む非− 新形成細胞が複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物による殺生に対し比較的抵 抗性であるということを示す。それ故、以下に示すデータは、複製−欠陥組換え アデノウイルスが新形成細胞を選択的に殺すために使用されることができるとい う実験的証明を提供する。この選択的殺生は、突然変異体アデノウイルスが新形 成細胞内で複製表現型を誘導するが、非−新形成細胞内で複製表現型（又は関連 の細胞病理学的効果）を実質的に誘導しない差異的能力を発揮することにより提 供される。対照の非−新形成細胞及びさまざまな新形成細胞型を提案する細胞系 を、DMEM（高グルコース）中集密において又はその付近で６−ウェル培養皿内に プレートし、そして標準的な培養条件下37℃、５％CO2においてインキュベート した。細胞をプレートして５×105細胞／ウェルの密度においてスクリーンした 。テストした新形成細胞系は：ヒト１次骨肉腫から得られたSAOS-2（ATCC HTB85 ）；ヒト骨肉腫から得られたU-20S（ATCC HTB96）；膵臓又は腸内に起源をもつ ヒト転移性腺癌腫から得られたHS700T（ATCC HTB147）；形質転換され たヒト胎児腎臓、293（ATCC CRL1573）；及びヒト大腸腺癌腫から得られたDLD-1 （ATCC CCL221）であった。これらの細胞系のそれぞれは、American Type Cultu re Collection，Rockville，MDから入手可能である。対照の非−新形成細胞は、 IMR90（ATCC CCL186）及びWI-38（ATCC CCL75）、両方２倍体ヒト肺繊維芽細胞 系であった。 これらの細胞カルチャーを、順番に、平行して、野生型アデノウイルス２型、 並びに複製−欠陥組換え体アデノウイルス突然変異体dl 11010，dl 434及びdl 1 520により感染させた。余った培養皿を、細胞をカウントする目的のためにプレ ートした。これらの細胞は、上記ウイルス感染のために使用した細胞の同一懸濁 液から生じたものであった。細胞を、所望の感染的重度（MOI）のためにその細 胞カルチャーに添加すべきウイルス・プラークー形成単位（PFU）の数を決定す るためにカウントした。上記野生型アデノウイルス２型及び上記突然変異体アデ ノウイルスを、0.1，1.0，10、及び100のMOIsにおいて上記平行細胞カルチャー に添加した。PBS中に懸濁されたウイルスを、１mlの容量において上記細胞ウェ ルに添加した。接種された培養皿を、接種直後及び37℃、５％CO2において約１ 時間の吸収時間を通じての半分あたりでＸ−軸及びＹ−軸の両方においてロック した。 １時間の吸収期間の後、高グルコース及び２％ウシ胎児血清を含む２mlのDMEM を添加し、そしてそのカルチャーを、標準的な培養条件下37℃、５％CO2におい てインキュベートした。 感染後の各時間において、図２（a-i）を参照のこと、細胞カルチャーを、ウ イルス調製物による細胞殺生の効果を測定するために20％メタノール中0.5％ク リスタル・バイオレットにより染色した。死んだ細胞を脱着し、そしてウェルか ら濯ぎ出し、一方、生きた細胞は、ウェル内に残り、そして上記染料により染色 された。これら の効果は、上記複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物が、非−新形成細胞に対 して新形成細胞を優先的に殺すこと、並びに野生型アデノウイルス２型が新形成 細胞と非−新形成細胞の両方をほとんど等しく良好に殺すことを示している。こ れらの結果は、dl 11010突然変異体が新形成細胞の殺生において特に有効であり 、そしてdl 1520突然変異体及びdl 434突然変異体も有効であるということを立 証した。これらの結果の例を図2a-i中に示す。これらは、野生型アデノウイルス ２型、突然変異体；dl 1010（EIA(-)），dl 1520（E1B(-)）、又はdl 434による 感染後の各時間において得られた染色された細胞ウェルの写真である。図2aは、 ウイルスの非存在中、細胞カルチャーのそれぞれが集密まで成長し、そして培養 ウェルに付着したことを示している。図2b-cは、野生型アデノウイルス２型が、 少なくともいくつかの細胞がそれぞれのウェル内で染色され、変動した効力及び 不完全性を伴うけれども、各培養ウェル内で細胞を殺すことができたということ を示している。WI-38及びSAOS-2系が、アデノウイルス感染のための良好な宿主 ではないこと、並びにIMR90（図3a-c）がヒト２倍体繊維芽細胞のための代替対 照細胞系として役立つということが注目される。図2d-eは、dl 1010突然変異体 が、感染−抵抗性SAOS-2以外のすべての新形成細胞系を効率的に殺すことができ たということを示している。dl 1010は、感染12日後までに、293，U2OS，HS700T 、及びDLD-1系を殺し、そして２倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を実質的に殺さ なかった。図2f-gは、dl 1520突然変異体が、感染14-20日後までに５の新形成細 胞系の中の３（293，HS700T、及びDLD-1）を効率的に殺すことができたが、２倍 体トヒ肺繊維芽細胞（WI-38）を実質的に殺さなかったということを示している 。dl 1520は、E1B(-)突然変異体であり、そして細胞系USOSはこのようなE1B(-) 突然変異体ウイルスが複製することを 許容せず、これは、予測されるように、突然変異体組換え−欠陥アデノウイルス による感染についての各形質転換細胞系の特異性を示している。図2h-iは、dl 4 34突然変異体（２重−突然変異体：E1A(-)E1B(-)）が感染の14-20日後までに５ 新形成細胞系の中の３（293，HS700T、及びDLD-1）を効率的に殺すことができ、 そして２倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI-38）を実質的に殺さなかったことを示して いる。DLD-1及びU2OS系は、dl 434の複製についての部分的に抵抗性の表現型を 示した。 図３（a-c）は、IMR90ヒト２倍体肺繊維芽細胞が野生型Ad2，dl 1010、及びdl 1520により差別的に殺されたことを示している。293細胞系は、陽性対照として 役立つ。図３（a）は野生型Ad2が10又は100のMOIにおいてIMR90細胞を効率的に 殺したことを示している。図３（b）は、たとえ、dl 1010が図２（d-e）中に示 すように、新形成細胞系293，U2OS，HS700T、及びDLD-1を殺したとしても、dl 1 010が、テストした最高MOIにおいてIMR90細胞内で複製することができなかった ことを示している。図３（c）は、dl 1520ウイルスが100のMOIにおいてのみIMR9 0細胞を効率的に殺すことができたことを示しており；この高いウイルス投与量 において、複製よりもむしろウイルス過負荷の結果として細胞が死ぬ可能性を除 外することができない。 従って、図２（a-i）及び３（a-c）中に示すデータは、複製−欠陥組換え体ア デノウイルス突然変異体が、予測されるように、p53及び／又はRb機能を欠く新 形成細胞を選択的に殺すために使用されることができるということを示している 。 本発明を、理解の明瞭さの目的をもって説明によりいくぶん詳細に記載してき たけれども、特定の変更及び修正がクレームの範囲内で行われることができると いうことは自明であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 8931−4Ｂ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．細胞集団内で新形成細胞を排除するための方法であって： 感染条件下、（１）機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合することができ る発現ウイルス癌タンパク質を欠く組換え体複製欠陥アデノウイルスを、（２） ウイルス癌タンパク質と結合複合体を形成することができる上記機能的腫瘍サプ レッサー遺伝子産物を含む非−新形成細胞及び上記機能的腫瘍サプレッサー遺伝 子産物を欠く新形成細胞を含んで成る細胞集団に、接触させ、それにより、感染 細胞集団を生成する、 段階を含んで成る方法。 ２．ウイルス癌タンパク質が、アデノウイルスE1aポリペプチド又はアデノウ イルスE1bポリペプチドである、請求項１に記載の方法。 ３．腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、p53又はRBである、請求項１に記載の方 法。 ４．新形成細胞が、p53(-)RB(-)である、請求項１に記載の方法。 ５．組換え複製欠陥アデノウイルスが、RBに結合することができるE1aポリペ プチドをエンコードしておらず、そしてまた、p53に結合することができるE1b p 55ポリペプチドをエンコードしていない、請求項４に記載の方法。 ６．組換え体複製欠陥アデノウイルスが：Ad5 NT dl 1110，Ad5 dl 1312、及 びAd2 dl 1520から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 ７．新形成細胞及び非−新形成細胞を含んで成る細胞集団が、哺乳動物中に存 在し、そして接触段階が、個体に組換え体複製欠陥ア デノウイルスを投与することによりインビボにおいて行われる、請求項１に記載 の方法。 ８．哺乳動物が、ヒトである、請求項７に記載の方法。 ９．組換え体複製欠陥アデノウイルスが、p53機能、RB機能、又はp53機能とRB 機能の両方を欠いた新形成細胞内で感染性ビリオンを形成するように複製される ことができる、請求項１に記載の方法。 10．新形成細胞内で形成された感染性ビリオンが、患者内でインビボにおいて 隣接細胞に拡がり、かつ、それに感染することができる、請求項９に記載の方法 。 11．組換え体複製欠陥アデノウイルスが、ヒト患者の新形成細胞内での感染性 ビリオンの形成について非複製性である、請求項１に記載の方法。 12．組換え体複製欠陥アデノウイルスが、E1a／E1b ２重突然変異体である、 請求項１に記載の方法。 13．ヒトにおける新形成症状の治療方法であって、機能的腫瘍サプレッサー遺 伝子産物を欠く新形成細胞を含んでなる新生物をもつヒト患者に、治療的有効投 与量の組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る組成物を投与することを含 んで成るような方法。 14．腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、p53又はRBである、請求項13に記載の方 法。 15．腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、p53であり、そして組成物が、E1b-p53(- ) 複製欠陥アデノウイルスである組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る 、請求項14に記載の方法。 16．腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、RBであり、そしてE1a-RB(-)複製欠陥ア デノウイルスである組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る、請求項14に 記載の方法。 17．組成物が、E1a／E1b ２重突然変異複製欠陥アデノウイルスである組換え 体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る、請求項14に記載の方法。 18．組成物が、E1a-RB(-)複製欠陥アデノウイルス、E1b-p53(-)複製欠陥アデ ノウイルス、及びE1a／E1b ２重突然変異体複製欠陥アデノウイルスから成る群 から選ばれ、そしてさらにウイルス・プロモーターに作用可能な状態で結合され た負の選択遺伝子を含んで成る組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る、 請求項14に記載の方法。 19．ウイルスが、Ad5 NT dl 1110，Ad5 dl 1312、及びAd2 dl 1520から成る群 から選ばれる、請求項18に記載の方法。 20．新形成疾患の治療のための抗新形成組成物であって、E1a-RB(-)複製欠陥 アデノウイルス、E1b-p53(-)複製欠陥アデノウイルス、及びE1a／E1b ２重突然 変異体複製欠陥アデノウイルスから成る群から選ばれる組換え複製欠陥アデノウ イルスの治療的有効投与量を、医薬としてデリバリー可能な形態で含んで成る組 成物。 21．p53及び／又はRBを隔離し又は分解する能力を欠いた組換え複製欠陥ウイ ルスの有効投与量を、新生物をもつ患者に投与することを含んで成る新形成症状 の治療方法。 22．ウイルスが、アデノウイルス、乳頭腫ウイルス、及びポリオーマウイルス から成る群から選ばれている、請求項21に記載の方法。 23．ウイルスが、E6遺伝子又はE7遺伝子内に突然変異を含んで成るヒト乳頭腫 ウイルスである、請求項22に記載の方法。
JP51929494A 1993-02-16 1994-02-16 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス Expired - Lifetime JP3556666B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1752593A 1993-02-16 1993-02-16
US08/017,525 1993-02-16
PCT/US1994/002049 WO1994018992A1 (en) 1993-02-16 1994-02-16 Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003431544A Division JP2004115543A (ja) 1993-02-16 2003-12-25 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08507076A true JPH08507076A (ja) 1996-07-30
JP3556666B2 JP3556666B2 (ja) 2004-08-18

Family

ID=21783090

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51929494A Expired - Lifetime JP3556666B2 (ja) 1993-02-16 1994-02-16 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス
JP2003431544A Withdrawn JP2004115543A (ja) 1993-02-16 2003-12-25 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003431544A Withdrawn JP2004115543A (ja) 1993-02-16 2003-12-25 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス

Country Status (11)

Country Link
EP (2) EP0931830B1 (ja)
JP (2) JP3556666B2 (ja)
AT (2) ATE178490T1 (ja)
AU (1) AU682854B2 (ja)
CA (1) CA2152941C (ja)
DE (2) DE69417734T2 (ja)
DK (2) DK0689447T3 (ja)
ES (2) ES2157109T3 (ja)
GR (2) GR3030385T3 (ja)
PT (1) PT931830E (ja)
WO (1) WO1994018992A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005531306A (ja) * 2002-06-28 2005-10-20 オンコリティクス バイオテック， インコーポレイティッド 新生物について表現型を検査する薬剤としての腫瘍溶解性ウイルス
JP2006512284A (ja) * 2002-05-27 2006-04-13 ホルム，ペル・ゾンネ アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用
JP2011201889A (ja) * 2003-11-14 2011-10-13 Per Sonne Holm アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用
KR101123510B1 (ko) * 2002-10-15 2012-04-12 페르 손네 홀름 신규한 아데노바이러스, 이를 암호화하는 핵산 및 이들의 조성물

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747469A (en) 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
CA2108144A1 (en) 1991-03-06 1992-09-07 Jack A. Roth Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5516631A (en) * 1992-10-13 1996-05-14 La Jolla Cancer Research Foundation Method of inhibiting replication of hyperproliferative cells
ES2310580T3 (es) 1993-04-30 2009-01-16 Wellstat Biologics Corporation Composiciones purificadas del virus de la enfermedad de newcastle.
US5776743A (en) * 1994-09-06 1998-07-07 La Jolla Cancer Research Foundation Method of sensitizing tumor cells with adenovirus E1A
US6638762B1 (en) 1994-11-28 2003-10-28 Genetic Therapy, Inc. Tissue-vectors specific replication and gene expression
FI972225L (fi) * 1994-11-28 1997-07-16 Genetic Therapy Inc Vektorit kudosspesifistä replikaatiota varten
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US6326356B1 (en) 1996-10-18 2001-12-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Suppression of neu overexpression using a mini-E1A gene
US20030026789A1 (en) * 1995-05-03 2003-02-06 Richard J. Gregory Gene therapy using replication competent targeted adenoviral vectors
US6004942A (en) * 1995-08-30 1999-12-21 The Regents Of The University Of California Methods for treating arthritis by administering an apoptosis regulator
US6133243A (en) * 1996-02-22 2000-10-17 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Liposomal-viral DNA complexes for treating disease
US6054467A (en) * 1996-07-05 2000-04-25 Sidney Kimmel Cancer Center Down-regulation of DNA repair to enhance sensitivity to P53-mediated apoptosis
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
WO1998013508A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Dana-Farber Cancer Institute Method of targeting malignant cells using an e2f responsive promoter
AU742696B2 (en) * 1996-11-18 2002-01-10 Mcgill University Post-mitotic neurons containing adenovirus vectors that modulate apoptosis and growth
US6080578A (en) * 1996-12-31 2000-06-27 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic adenoviral E1B mutated viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
US6403370B1 (en) 1997-02-10 2002-06-11 Genstar Therapeutics Corporation Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system
US6565831B1 (en) 1999-02-24 2003-05-20 Oncolytics Biotech Inc. Methods for preventing reovirus recognition for the treatment of cellular proliferative disorders
US6110461A (en) * 1997-08-13 2000-08-29 Oncolytics Biotech Inc. Reovirus for the treatment of neoplasia
US6136307A (en) 1997-08-13 2000-10-24 Oncolytics Biotech Inc. Reovirus for the treatment of cellular proliferative disorders
US6696423B1 (en) 1997-08-29 2004-02-24 Biogen, Inc. Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US6020135A (en) 1998-03-27 2000-02-01 Affymetrix, Inc. P53-regulated genes
US7691370B2 (en) 1998-10-15 2010-04-06 Canji, Inc. Selectivity replicating viral vector
EP1121442A2 (en) * 1998-10-15 2001-08-08 CANJI, Inc. Recombinant e1a deleted adenoviral vectors
CZ301506B6 (cs) * 1998-10-15 2010-03-31 Canji, Inc. Selektivne se replikující rekombinantní virový vektor a zpusob jeho prípravy, farmaceutická formulace, zpusob usmrcení bunky s defektní dráhou, transformovaná bunka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß
US20020037274A1 (en) * 1998-10-26 2002-03-28 Angelica Williams Single agent method for killing tumor and tumor associated endothelial cells using adenoviral mutants
WO2000029573A2 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Canji, Inc. Adenoviral vectors
GB9906815D0 (en) 1999-03-24 1999-05-19 Isrec Anti-neoplastic viral agents
CN1477964A (zh) 1999-04-15 2004-02-25 应用病毒治疗肿瘤
DE19929569A1 (de) * 1999-06-21 2000-12-28 Holm Per Sonne Mittel zur Behandlung maligner Erkrankungen unter Verwendung des Proteins YB-1
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
WO2001036650A2 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Onyx Pharmaceuticals, Inc. An oncolytic adenovirus
AUPQ425699A0 (en) 1999-11-25 1999-12-23 University Of Newcastle Research Associates Limited, The A method of treating a malignancy in a subject and a pharmaceutical composition for use in same
AR028039A1 (es) 2000-05-03 2003-04-23 Oncolytics Biotech Inc Remocion de reovirus de celulas neoplasticas intermediadas por ras a partir de composiciones celulares mixtas
US8491884B2 (en) 2000-05-03 2013-07-23 Oncolytics Biotech Inc. Virus clearance of neoplastic cells from mixed cellular compositions
AR035227A1 (es) 2001-02-20 2004-05-05 Oncolytics Biotech Inc Uso de un agente quimioterapeutico para la manufactura de un medicamento para la sensibilizacion de celulas neoplasicas resistentes a agentes quimioterapeuticos con reovirus
CA2439185A1 (en) 2001-02-23 2002-09-06 Novartis Ag Vector constructs
US20040005546A1 (en) 2002-02-28 2004-01-08 Oncolytics Biotech Inc. Use of ribozymes in the detection of adventitious agents
CA2374388C (en) 2002-02-28 2005-07-12 Matthew C. Coffey The use of ribozymes in the detection of adventitious agents
EP1944035A1 (en) 2002-05-09 2008-07-16 Oncolytics Biotech Inc. Method for reducing pain using oncolytic viruses
RU2351361C2 (ru) * 2002-05-27 2009-04-10 Пер Сонне ХОЛЬМ Новое применение аденовируса и кодирующих его нуклеиновых кислот
AU2011221393A1 (en) * 2002-05-27 2011-09-29 Per Sonne Holm Novel use of adenoviruses and nucleic acids coding therefor
AU2002953436A0 (en) 2002-12-18 2003-01-09 The University Of Newcastle Research Associates Limited A method of treating a malignancy in a subject via direct picornaviral-mediated oncolysis
DK1649023T3 (da) 2003-07-21 2008-10-06 Transgene Sa Polypeptid med forbedret cytosindeaminaseaktivitet
KR100756055B1 (ko) 2006-01-27 2007-09-07 연세대학교 산학협력단 신생혈관 생성을 조절하는 재조합 아데노바이러스
US8470977B2 (en) 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
CA2744294A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Transgene Sa Use of a saccharomyces cerevisiae mitochondrial nucleic acids fraction for immune stimulation
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
WO2012022496A2 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Per Sonne Holm Method for killing tumor stem cells
SG11201507393TA (en) 2013-03-14 2015-10-29 Salk Inst For Biological Studi Oncolytic adenovirus compositions
ES2899913T3 (es) 2014-09-24 2022-03-15 Salk Inst For Biological Studi Virus tumorales oncolíticos y métodos de uso
EP3390645B1 (en) 2016-02-23 2022-09-14 Salk Institute for Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
AU2017375633C1 (en) 2016-12-12 2023-04-27 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
KR20240093758A (ko) 2017-04-21 2024-06-24 베이롤 칼리지 오브 메드신 종양용해성 바이러스요법 및 면역요법
BR112020019942A2 (pt) 2018-04-09 2021-01-26 Salk Institute For Biological Studies composições de adenovírus oncolítico com propriedades de replicação aprimoradas

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2051289C (en) * 1990-09-14 2002-11-26 Robert L. Martuza Viral mediated destruction of neoplastic cells

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006512284A (ja) * 2002-05-27 2006-04-13 ホルム，ペル・ゾンネ アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用
JP2012179058A (ja) * 2002-05-27 2012-09-20 Per Sonne Holm アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用
JP2005531306A (ja) * 2002-06-28 2005-10-20 オンコリティクス バイオテック， インコーポレイティッド 新生物について表現型を検査する薬剤としての腫瘍溶解性ウイルス
KR101123510B1 (ko) * 2002-10-15 2012-04-12 페르 손네 홀름 신규한 아데노바이러스, 이를 암호화하는 핵산 및 이들의 조성물
JP2011201889A (ja) * 2003-11-14 2011-10-13 Per Sonne Holm アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用
JP2014177481A (ja) * 2003-11-14 2014-09-25 Per Sonne Holm アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用

Also Published As

Publication number Publication date
GR3030385T3 (en) 1999-09-30
GR3035914T3 (en) 2001-08-31
PT931830E (pt) 2001-08-30
EP0689447A4 (en) 1997-06-04
WO1994018992A1 (en) 1994-09-01
CA2152941C (en) 2003-04-22
AU6272294A (en) 1994-09-14
EP0931830B1 (en) 2001-03-07
ES2157109T3 (es) 2001-08-01
DE69417734D1 (de) 1999-05-12
DE69417734T2 (de) 1999-10-07
ES2134346T3 (es) 1999-10-01
CA2152941A1 (en) 1994-09-01
EP0689447B1 (en) 1999-04-07
DE69426841D1 (de) 2001-04-12
ATE199568T1 (de) 2001-03-15
AU682854B2 (en) 1997-10-23
EP0689447A1 (en) 1996-01-03
DK0931830T3 (da) 2001-06-11
EP0931830A3 (en) 2000-07-12
ATE178490T1 (de) 1999-04-15
EP0931830A2 (en) 1999-07-28
JP3556666B2 (ja) 2004-08-18
DE69426841T2 (de) 2001-09-06
JP2004115543A (ja) 2004-04-15
DK0689447T3 (da) 1999-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3556666B2 (ja) 新形成の治療及び予防のための細胞障害ウイルス
US5801029A (en) Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
JP4225577B2 (ja) 新形成の治療及び予防のための細胞変性ウイルス
RU2222600C2 (ru) Аденовирус-рекомбинант, несущий структуру аденовирусного вектора (варианты), способ восстановления функции протеина p53 в опухолевой клетке с дефицитом природного p53, способ производства аденовируса-рекомбинанта
US12318418B2 (en) Modified adenoviruses
US6296845B1 (en) Selective killing and diagnosis of p53+ neoplastic cells
JP5746823B2 (ja) Ｅ３−１９ｋタンパク質の小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルス及び癌治療におけるその用途
EP0951553B1 (en) Adenovirus e4 proteins for inducing cell death
CN1242051A (zh) 用于肿瘤治疗和预防的致细胞病变病毒
JP2002527455A (ja) 組換え欠失アデノウイルスベクター

Legal Events

Date Code Title Description
TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20040511

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20040513

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090521

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100521

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110521

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120521

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130521

Year of fee payment: 9

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term