JPH08507603A - マルチクローナル抗体フォーマットで結合タンパク質を用いた競合イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ビタミンＢ₁₂葉酸及び他の目標分析物に特異的な結合タンパク質を、結合タンパク質に対して異なる特異性を有する抗体と共に用いる改良型イムノアッセイ法。抗体は、特異的結合タンパク質と捕獲可能な物質とを直接又は間接的に架橋結合する。

Description

【発明の詳細な説明】マルチクローナル抗体フォーマットで結合タンパク質を用いた競合イムノアッセ イ 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、試料分析物に特異的な結合タンパク質が抗体によって結合される特 異的結合アッセイに関する。抗体は結合タンパク質の異なるエピトープに対して 特異的であり、可溶性又は不溶性物質に結合し得、それによって分離手順が容易 になる。 ２．従来技術の説明 本発明は、特異的結合パートナーに対するリガンドの親和性に基づいて液状媒 体中のリガンドの存在を測定する方法及び手段に関する。特に本発明は、放射性 物質を使用しない特異的結合アッセイに用いるための方法及び手段に関する。 人体における葉酸（folate）の欠乏は、巨赤芽球性貧血の一般的な原因である 。ヒトでは、葉酸はテトラヒドロ葉酸、次いで５−メチルテトラヒドロ葉酸（５ ′−ｍＴＨＦ）に代謝される。５′−ｍＴＨＦの濃度は、競合結合アッセ イを用いて測定されることが多い。標準試薬中に較正剤（calibrator）として用 いられる５′−ｍＴＨＦを含むのが有用である。残念ながら５′−ｍＴＨＦは非 常に不安定であり、その使用には凍結乾燥形態で該物質を封入することを必要と し得る。 Corning Glass WorksのRicebergに付与された米国特許第4,350,659号は、５′ −ｍＴＨＦと葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）のような結合タンパク質との複合体 を形成することにより５′−ｍＴＨＦを安定化させる方法を開示している。さら に複合体を凍結乾燥すると乾燥粉末が得られる。粉末の貯蔵に推奨されるものに は気密及び耐光性容器が含まれる。５′−ｍＴＨＦは凍結乾燥によりその使用時 まで安定な形態で貯蔵し得る。そのような方法は、アッセイキットの製造には実 用的ではなく、臨床実験用のセッティングに用いることは難しい。さらに、凍結 乾燥した物質を再構成した後でも不安定性問題が再発する可能性がある。 ビタミンＢ₁₂の欠乏は神経損傷の原因となり得る。さらに、このビタミンは適 切な葉酸代謝に必要なものであるために、その欠乏は巨赤芽球性貧血の原因とも なる。巨大赤芽球症（megalobutastosis）は、他の原因による葉酸の欠 乏によっても発生し得るので、巨大赤芽球症がこれらのビタミンのいずれか一方 又は両方の欠乏によるものかどうかを決定する必要がある。 Corning Glass WorksのRicebergに付与された米国特許第4,399,228号は、葉酸 及びビタミンＢ₁₂の競合タンパク質結合アッセイを開示している。放射性⁵⁷Ｃｏ 又は¹²⁵Ｉトレーサーを患者の試料に加えてガンマ計数管で計測する。該アッセ イでは、結合タンパク質は多孔質ガラスに共有結合される。患者試料中の内在性 結合タンパク質は反応管を沸騰させると破壊される。放射性物質の取り扱いが危 険且つ困難であることから、ラジオイムノアッセイと同様な感度及び迅速性を有 し且つ結合反応を監視する手段として放射能以外の特性を利用する便利な特異的 結合アッセイシステムを開発しようとする多くの試みがなされてきた。 Bio-Rad LaboratoriesのLewinらに付与された米国特許第4,028,465号は、試料 の血清葉酸を測定する放射性競合アッセイ法を開示している。血清葉酸結合タン パク質は加熱により不活化される。該発明は、加熱段階の前の葉酸の安定化に用 い得る緩衝液中のジチオトレイトールのようなスルフヒドリルの使用を開示して いる。この安定剤の使用 は、該安定剤が臭気がひどくなく計量が容易な固体であるという点でメルカプト エタノールを用いる方法より有利である。 葉酸及びビタミンＢ₁₂アッセイは、内在性結合タンパク質から試料中へ葉酸を 遊離させるために試験の前に加熱又は沸騰段階を用いるのが一般的であった。加 熱又は沸騰段階は正確な調節が困難であり且つ時間のかかるものである。より最 近のアッセイでは、沸騰させずに化学的手段により試料を変性させる。強塩基を 用い、他の化学物質を加えるか又は加えずに変性を行い得る。 Rohm and Haas CompanyのForandらに付与された米国特許第4,418,151号も血清 葉酸についてのラジオアッセイに関する。測定量の血清を一定量の放射線で標識 したビタミンＢ₁₂及び／又は葉酸トレーサーと混合する。高アルカリ性環境中、 シアン化カリウムのような変換剤の存在下に溶液をメルカプタン変性剤に暴露す る。メルカプタン溶液の使用により、保護緩衝液中での安定化が可能になり、且 つ高ｐＨのために内在性結合タンパク質が不活化される。 University PatentsのAllenに付与された米国特許第4,４51,571号は、強塩基 と共に、β−メルカプトエタノール （ＢＭＥ）、チオグリコレート、チオグリセロール又はジチオトレイトール（Ｄ ＴＴ）のようなスルフヒドラル化合物の使用を開示している。スルフヒドラル化 合物は、内在性結合タンパク質を破壊し、それによって測定試料のビタミンＢ₁₂ 又は葉酸が遊離する。強塩基は分析物をその結合タンパク質から放出させはする が、全ての内在性結合タンパク質を実質的に変性させはしない。従って、結合タ ンパク質からの分析物の遊離を支援し且つアッセイに干渉し得る阻止（blocking ）抗体を排除するために、スルフヒドラルのような別の化合物を有しているのが 有利である。阻止抗体は、結合因子と反応することからアッセイにとって面倒な 存在となり得る。 Cambridge Patent DevelopmentsのSelfに付与された米国特許第4,828,985号は 、非免疫原性物質と該非免疫原性物質に対する一次抗体との複合体に対して二次 抗体を産生させる方法を教示している。二次抗体は、非免疫原性物質に対する抗 体でも一次抗体に対する抗体でもない。検出は、二次抗体を酵素標識又は何か他 の検出可能な手段で標識して行う。 本発明は、特異的結合タンパク質をより多く結合し得る 方法を開示している点で現存の技術より改良されている。本発明は、結合タンパ ク質の異なるエピトープに対して２種のモノクローナル若しくはポリクローナル 抗体の混合物又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との混合物により結 合を増加させる方法を開示する。この方法は、分析物を検出する数種の異なるア ッセイに利用し得る。本発明の他の利点は、このマルチクローナルフォーマット により、葉酸アッセイにおける較正剤として、不安定な５′−ｍＴＨＦの代わり にプテロイルグルタミン酸（ＰＧＡ）の使用が可能になるという点にある。 発明の要旨 本発明は、特異的結合タンパク質結合能がマルチクローナル抗体フォーマット を用いることにより増強される不均一系アッセイに関する。マルチクローナルフ ォーマットは結合タンパク質を単一抗体フォーマットの効率の最高１０倍も結合 させる。この改良法は概して、抗体混合物を用いて特異的結合ペアメンバーを捕 獲可能な物質に直接又は間接に結合することを含む。特異的結合ペアメンバーは 結合部位を含んでおり、該部位は目標試料分析物又は標識した 分析物アナローグによって占拠される。次いで、抗体、特異的結合ペアメンバー 及び試料分析物又は分析物アナローグが結合したものである捕獲可能物質を、検 出が行われ得るマトリックス物質とのイオン相互反応により単離し得る。 本発明は、特異的リガンドを結合し得る結合タンパク質を用いるいずれのアッ セイにも利用可能である。本発明の他の利点は、葉酸アッセイにおける較正剤と して、５′−ｍＴＨＦの代わりにＰＧＡを使用する点にある。葉酸アッセイにお ける５′−ｍＴＨＦの慣用的な使用から、５′−ｍＴＨＦが不安定な化合物であ ることが立証された。本発明を用いることにより、較正剤としてＰＧＡの使用が 可能になるが、モノクローナル又はポリクローナルフォーマット単独では、ＰＧ Ａと５′−ｍＴＨＦとの間には性能に差があることが示された。 発明の詳細な説明 マルチクローナルフォーマット 本発明は、特異的結合タンパク質に対するリガンドの親和性に基づいて液状媒 体中のリガンドの存在を測定する方法及び手段に関する。 本発明は、患者の試料中の分析物を測定するための不均一アッセイ法を開示す る。この方法には二つの分離した段階がある。第１段階は、ポリアニオン性物質 と、特定の結合タンパク質に対して異なる結合特異性を有する抗体との結合であ る。次いで、結合タンパク質を抗体に加えて、ポリアニオン／抗結合タンパク質 抗体／結合タンパク質複合体を形成する。この複合体を捕獲試薬と称する。第２ 段階は、特定の試薬と患者の試料との反応である。複合体中の結合タンパク質は 、その特定の分析物を患者の試料中で捕獲する。ポリアニオンを捕獲するポリカ チオンマトリックスに反応混合物を移入する。酵素に結合した分析物アナローグ を含む試薬を加えて、占拠されていない結合タンパク質に結合させる。結合して いない物質をマトリックスから洗いだし、酵素用の標準蛍光基質を添加した後、 蛍光強度から分析物の濃度を決定することが可能である。 さらに本発明は、２種以上の抗結合タンパク質モノクローナル抗体の混合物又 はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との混合物が単一の抗体だけの場合 より良好に機能する方法を用いる。この方法が如何に機能し得るかを示す一つの 例は、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）である。２ 種以上の抗体（２種以上のモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体とポリ クローナル抗体との混合物）を共有結合を介してカルボキシメチルアミロース（ ＣＭＡ）のようなポリアニオンに結合させる。次いでＦＢＰを混合物に加え、Ｆ ＢＰを非共有結合的に抗体に結合する。実際には、抗体はＦＢＰとポリアニオン との間の結合剤として機能する。この方法により、結合タンパク質とポリアニオ ンとの直接結合が回避される。結合タンパク質とポリアニオンとの直接結合は、 結合タンパク質の高次構造を変化させ、それによってその試験試料分析物に結合 する能力に影響を及ぼすことが可能である。単一のモノクローナル抗体に対して ２種の抗体を用いる場合の著しい差を示すために、２種の個別のモノクローナル 抗体を２種の抗体の１：１混合物と対比して試験した。上記の競合アッセイにお いて、ＦＢＰはモノクローナル抗体の一方又は両方を介してＣＭＡに結合した。 ２種の抗ＦＢＰモノクローナル抗体の１：１混合物はモノクローナル抗体単独の ものより良好に機能する。表１は、マルチクローナルフォーマットが如何に有効 であるかを示唆している。表１の数字は基質の回転率（turnover rate）を示す 。このフォーマットが同一のタンパク質 に対して異なる親和性を有する抗体を用いていることに留意する必要がある。 ２種の抗体の１：１混合物は、劇的にシグナルを増加させる。これは、１：１ 混合物中の抗体によって結合される葉酸結合タンパク質がより多く存在すること を示唆している。これは同様に、分析物アナローグの結合、従ってシグナルがよ り多く存在することを意味する。 抗体とポリアニオンとの結合は、２種の方法の中のいずれかで達成し得る。第 １の方法では、個別のモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体とポリクロー ナル抗体との混合物を別々の時点で結合させることが可能である。従って、抗体 はそれぞれ、１：１に混合される前に、別々のインキュベーション段階でポリア ニオンに結合する。第２の方法は、両抗体を（適切な抗体比率を用いて）混合し 、次いで混合物を単一のインキュベーション段階でポリアニオンに結合させるも のである。第２の方法は、一回のインキュ ベーション段階で行うために大量の抗体を用いる作業に有用である。 異なる比率のモノクローナル抗体では、マルチクローナルフォーマットを用い ると個別のクローンだけの場合より良い結果が得られる。マルチクローナルフォ ーマットを少量添加するだけでさえ、抗結合タンパク質抗体／結合タンパク質能 力が増強されることは明らかである。モノクローナル対マルチクローナルフォー マットを用い、マルチクローナルフォーマットの比率を変えて実験した結果を表 ２に示す。この場合もまた、示されている値は、占拠されていない結合タンパク 質部位に結合する検出可能な標識に因る基質の回転率である。 葉酸結合タンパク質抗原の特性決定 ＰＧＡアフィニティークロマトグラフィーによりウシの乳清からＦＢＰ抗原を 単離した。銀染色されたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び等電 点電気泳動により、タンパク質の均一性を確認した。ＰＡＧＥにより見られる２ つの可視バンドは、グリコシル化及び非グリコシル化ウシＦＢＰの文献記載の分 子量に相当する。カチオン／アニオン交換クロマトグラフィー、並びに逆相高性 能クロマトグラフィー法では、ＦＢＰ調製物中に２種の成分以外は示されなかっ た。トリフルオロメタンスルホン酸を用いた化学的脱グリコシル化により、高分 子量成分は、低分子量バンドと同一の電気泳動移動度を有する単一成分に変換さ れた。これらのデータは、２種の成分が、異なるグリコシル化度を有するＦＢＰ を表すという結論を支持するものである。 さらに、タンパク質がＦＢＰであることが以下により立証された。（１）タン パク質が放射性葉酸の特異的高親和性結合を示し、（２）最初の23個のアミノ酸 のＮ末端アミノ酸配列を分析することにより、ウシＦＢＰの文献記載のアミノ酸 配列（Svendsen，I.，Hansen，S.I.，Holm，J.及びLyngbye，J.，Carlsberg Res earch Communications，49 ：12-31，1984）と完全に一致した明確な配列が得られ、且つ（３）ガスクロマ トグラフィー質量分析により、30,850及び25,968の分子量を有する２種の成分が 炭水化物側鎖含有及び非含有ＦＢＰポリペプチドの予想質量と一致することが示 された。ＦＢＰモノクローナル抗体の産生 免疫原の調製 動物免疫感作のための免疫原として、また反応性スクリーニングのための抗原 として、精製された葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）を用いた。免疫感作戦略 精製された葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）を用いて２匹の６〜８週齢メスＢＡ ＬＢ／ｃマウス（Charles River，Wilmington，MA.）を免疫感作した。投与量は １：１の比率の完全フロイントアジュバント（Freund'ｓ Complete Adjuvant） （Difco Laboratories，Detroit，mI.）：ＦＢＰ溶液100μl中200μgＦＢＰであ った。アジュバントエマルジョン注入経路を腹膜内と皮下とに等分して行った。 動物に３週間の休養期間を与えてから、融合３日前に100μl中100μgのＦＢＰの 静脈内前融合追加免疫注射をした。融合 融合当日に、２匹のマウスを頚管切除して殺し、脾臓を取り出した。脾細胞を Iscove'ｓ Modified Dulbecco'ｓ Medium（ＩＭＤＭ）（GIBCO） Grand Island ，NY.）で一度洗浄し、I000RPMで10分間遠心した。ペレット化脾細胞をＳＰ２／ Ｏ骨髄腫細胞（Dr．Milstein，Cambridge，U.K.の研究室から得た）と１：１の 比率で合わせ、ＩＭＤＭで洗浄し、遠心した。上清を取り除き、１mlの50％ポリ エチレングリコール（ＰＥＧ）（American Type Culture Collection，Rockvill e，MD.）を１分間でペレットに加えたが、その間、軽くたたいたりかき回したり してペレットがゆっくり分散するようにした。混合物に30mlのＩＭＤＭを加え上 記のように遠心した。上清をデカントし、ペレットをＨＡＴ（ヒポキサンチン、 アミノプテリン及びチミジン）（Gibco，Gaithersburg，MD.）、10％ウシ胎児血 清（ＦＢＳ）（Hyclone Laboratories，Logan，UT.）及びSalmonella typhimuri um mitogen（ＳＴＭ）（1%v/v）（RIBI Immunochem Research，Inc.，Hamilton ，MT.）と共にＩＭＤＭに再懸濁した。ＳＴＭはＢ細胞特異的マイトジェンであ り、融合頻度を高めるために用いられる。融合細胞懸濁液 を96ウエルの組織培養プレートに入れた。一次融合スクリーニング 10日目に一次融合スクリーニングを実施し、その時点では培養は集密化してい た。エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて上清試料の抗ＦＢＰ反応性を 検出した。マイクロタイターウエルをリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中5μg/mlのＦ ＢＰ100μlでコートし、室温で一晩インキュベートした。翌日、プレートを１ウ エル当たり200μlのＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で30分間ブロッ クした。プレートを蒸留水で３回洗浄した後、１ウエル当たり50μlの培養上清 を加え、１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、１ウエル当たり50 μlの希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ-ＨＲＰＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼ ）結合体（Kirkegaard Perry Laboratories，Gaithersburg，MD.）をプレートに 加え、30分間インキュベートした。最後のプレート洗浄をし、Ｏ−フェニレンジ アミン２ＨＣｌ（ＯＰＤ）（Abbott Laboratories、Abbott Park，IL）を用いて 発色させた。光学密度の相対強度の読み取りをしてハイブリッド＃１−２７９及 び＃１−６４１を陰性対照、即ち正常なマウス血清（ＮＭＳ）（Organon Teknik a-Capp el，Malvern，PA）の３倍として同定し、該ハイブリッドをクローニング及びそ の後の評価の候補として選択した。ハイブリッドのクローニング ハイブリッド＃１−２７９及び＃１−６４１を限界希釈によりクローン化した 。１×１０²〜１×１０⁶で出発して１〜10倍希釈を行った。用いられたクローニ ング培地は10％v/vＦＢＳ及び１％v/vＨＴ（ヒポキサンチン及びチミジン）Ｓｕ ｐｐｌｅｍｅｎｔ（Gibco，Gaithersburg，MD.）を含むＩＭＤＭであった。100 μlの細胞懸濁液をＴＣプレートの96ウエルのそれぞれに加えた。７日目にプレ ートに１ウエル当たり200μlのクローニング培地をフィードした。クローンの選択 追加のＥＩＡスクリーニングに基づいて集密化培養のクローン上清についてさ らに評価を行うために、１×１０⁶希釈ウエルからクローン＃１−２７９−１７ ６及び＃１−６４１−１０１を選択した。用いられたＥＩＡスクリーニング法は 先に記載のものである。サブクローンの選択 試薬の再現性のためには、１−２７９−１７６という単一の細胞系を確実に得 ることが必要であった。そのために、 細胞系を上記のように再度クローン化した。＃−１−２７９−８６６のサブクロ ーン選択には上記のＥＩＡスクリーニングを用いた。ウェスターン法による評価 ２−メルカプトエタノール（Bio-Rad，Richmond，CA.）を用いて還元及び非還 元ＦＢＰ抗原10μgを、製造者の指示により、ミニ電気泳動及びトランスファー システム（Profile^TMSystem，Schleicher & Schuell，Keene，N.H.）により、８ 〜16％、1.0mmのミニ-ポリアクリルアミドゲル（Novex，San Diego，CA）上で泳 動させた。次いでタンパク質をゲルからニトロセルロースに移動した。ニトロセ ルロースをストリップに切断し、抗体をストリップ上で数時間インキュベートし た。還元及び非還元抗原に対する抗体の結合能を、４−クロロ−ナプトール（4- chloro-napthol）（Sigma，St．Louis，MO.）により発色する上記のヤギ抗マウ スＩｇＧ＋Ｍ−ＨＲＰＯ結合体を用いて検出した。１−２７９−８６６由来の抗 体は、還元及び非還元条件下で３２ｋＤ ＭＷ ＦＢＰに対して反応性であるこ とが判明した。１−６４１−１０１由来の抗体は、ウェスターン法試験において ＦＢＰ抗原に対して反応性でないことが判明し た。これらのデータに基づき、ハイブリッド細胞系が産生したモノクローナル抗 体は、２種の異なるエピトープ結合部位に対するものであることが判明した。アイソタイプ １−２７９−８６６及び１−６４１−１０１と同定された細胞系から分泌され たモノクローナル抗体のアイソタイプをＥＩＡクロノタイピング（clonotyping ）キット（Southern Biotech，Birmingham，AL.）で測定した。該アッセイは、 製造者の推薦する手法により行われ、その結果は、どちらもＩｇＧｌ、κ（カッ パ）であったことを示している。等電点電気泳動 １−２７９−８６６及び１−６４１−１０１抗体の電気泳動をＰｈａｓｔＳｙ ｓｔｅｍ（Pharmacia-LKB，Piscataway，N.J.）で評価した。ドデシル硫酸ナト リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）プロフィールをク ーマシー染色して、各抗体について、２５ｋＤの単一の軽鎖バンド及び５５ｋＤ の単一の重鎖バンドという典型的な抗体バンドパターンを同定した。銀染色され たＩＥＦプロフィールから、１−２７９−８６６については6. 8±0.2のｐＩを、１−６４１−１０１については6.6±0.2のｐＩを同定した。寄託 細胞系１−２７９−８６６及び１−６４１−１０１をAmerican Tissue Cultur e Collection （A.T.T.C.）（Rockville，Maryland）に寄託した。細胞系１−２ ７９−８６６はA.T.C.C.番号HB11249、また１−６４１−１０１はA.T.C.C.番号H B11250の受託番号を得た。方法及び試薬 本発明は、２種以上の抗結合タンパク質モノクローナル抗体の混合物、又はモ ノクローナル抗体とポリクローナル抗体との混合物により、モノクローナル若し くはポリクローナル単独のものよりもよい反応率を得る方法を教示する。このア ッセイ法は多くのタンパク質並びに、葉酸及びビタミンＢ₁₂等の該タンパク質の 結合剤に適用可能であるが、これらには限定されない。 分析物の存在について試験すべき試料には、アッセイに干渉し得る内在性タン パク質を変性させる種々の段階を課してよい。本発明は、酢酸、塩化ナトリウム 及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）と混合したＤＴＴを用い て試料を前処理することが好ましい。ＤＴＴはタンパク質を変性させるのみなら ず、５′−ｍＴＨＦの還元形態を保持させる。分析物によっては、他の一般的な 変性剤をＤＴＴの代わりとしてよい。 第２の変性段階では、試料に0.75M水酸化カリウムを添加するのが好ましい。 この添加は、試料中の内在性葉酸結合物質をさらに変性させ、それによって測定 対象である葉酸を放出する高塩基性環境が造り出される。ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ及 びＮＨ₄ＯＨのような他の強塩基を用いてもよい。 用いられた捕獲法はＣＭＡのようなポリアニオンを利用する。ポリアニオンに 結合するのは、葉酸結合タンパク質と複合体を形成する抗葉酸結合タンパク質抗 体の混合物である。該抗体は、ポリアニオンと葉酸結合タンパク質との間の結合 剤として機能する。葉酸結合タンパク質は、ポリアニオン関連抗体に非共有結合 的に結合する。変性した試料がＦＢＰの添加前又は添加時に中和されることが重 要である。本発明においては、中和はＦＢＰ添加時に行われるのが好ましい。捕 獲試薬は、50mMホウ酸緩衝液（ｐＨ8.1）、0.2％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ） 、0.1％Ｔｗｅｅｎ−２０、0.1％アジ化ナトリウム、0.003％硫酸デキストラ ン及び１mMＥＤＴＡからなる溶液に希釈してよい。ＨＳＡ構成成分は内在性葉酸 結合タンパク質を含んでいない。アジ化ナトリウムは、ある程度の抗菌作用を提 供し得る一般に実験室用試薬に用いられている保存料である。捕獲試薬中の硫酸 デキストランは、アッセイの精度に干渉し得る予期せぬ（stray）カチオン種（ 即ち、マトリックス由来のカチオンダスト）に結合する。 ホウ酸緩衝液を含む捕獲試薬を反応ウエルに添加して、変性剤を中和し、試薬 中の葉酸を葉酸結合タンパク質に結合させる。インキュベーション後、ポリアニ オンをポリカチオン物質に結合させるマトリックスに反応混合物を移入する。 ポリカチオンの添加を可能にする種々の方法がある。ポリカチオン物質は、該 物質をポリアニオンに結合させる捕獲試薬に直接添加することが可能である。別 の方法は、反応混合物をマトリックスに添加する前の或る段階でポリカチオンを 反応混合物に添加するものである。好ましい方法は、マトリックスをポリカチオ ンでプレコートし、次いで反応混合物を添加するものである。 結合体試薬（conjugate reagent）は、プテロイン酸に 結合し且つ50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）（ｐＨ7. 4）、0.5％ＨＳＡ、0.1M塩化ナトリウム、1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛 、0.1％硫酸デキストラン及び0.1％アジ化ナトリウムに希釈したアルカリ性ホス ファターゼ酵素を含んでいる。結合体は占拠されていない葉酸結合タンパク質部 位に結合する。結合体試薬はプテロイン酸の使用には限定されない。ＰＧＡを含 む他の葉酸アナローグを結合体試薬に用いてもよい。 本発明においては、標準ＩＭｘ（登録商標）（Abbott Laboratories，North C hicago，IL.，60064）メチルウンベリフェリルホスフェート基質を用いる。 先に述べたように、標準又は較正剤として５′−ｍＴＨＦを使用することには 問題があった。５′−ｍＴＨＦは、いったん光、温度及び大気に暴露されると不 安定になる。５′−ｍＴＨＦは、その不安定性により較正剤としての有用性が無 効になる。さらに、５′−ｍＴＨＦは較正マトリックス中にヒト血清の使用を必 要とし得る。また５′−ｍＴＨＦを用いる場合にはアスコルビン酸塩（ascorbat e）及びクエン酸塩（citrate）の添加も必要となる。これらを添加すると、使用 時の５′−ｍＴＨＦの安定性は増大する が、アスコルビン酸塩はアッセイを妨害することが判明した。 本発明は、その較正試薬としてＰＧＡを用いる。ＰＧＡを用いることの利点は いくつかある。先ず、ＰＧＡは５′−ｍＴＨＦより安定である。第２に、アッセ イの較正にＰＧＡを用いると５′−ｍＴＨＦを用いる場合より結果の再現性がよ い。第３には、ＰＧＡの安定化にアスコルビン酸塩を必要としない。さらに、較 正剤としてＰＧＡを用いると、較正剤用希釈剤としてヒト血清の代りにウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）を用いることが可能になる。これによって、ヒト血清に係 わる危険、コスト及び入手可能性などの問題がなくなる。 ５′−ｍＴＨＦは患者試料中で実際に測定される葉酸の代謝形態である。従っ て、５′−ｍＴＨＦ以外の較正剤は、適切な結合タンパク質によって結合され、 試料の５′−ｍＴＨＦレベルとの良好な相関関係を与えるに十分なものでなけれ ばならない。マルチクローナルフォーマットは、その作用機序は不明であるが、 ５′−ｍＴＨＦと同じようにＦＢＰとＰＧＡとを結合させる。従って、マルチク ローナルフォーマットを用いることにより、ＰＧＡによる較正 （又は検量）が可能になり且つ試験試料５′−ｍＴＨＦの良好な指示が得られる 。比較の例を図１に示す。 本発明の他の改良点は、クエン酸塩を添加すると、ゼロ日値のＰＧＡ安定性が 数カ月まで改善されたという発見にある。ＰＧＡゼロ日値安定性をクエン酸塩（ 100mM）添加及び非添加ＢＳＡ希釈剤中で評価した。クエン酸を加えると、ＰＧ Ａゼロ日値安定性は-20℃、４℃、45℃及び室温で経時的に改善される。図２は 、クエン酸塩のＰＧＡゼロ日値安定性増強効果を示している。試験ポイントは、 ＩＭｘ（登録商標）装置で測定し、ＭＵＰ回転率は示されている日に測定した。 得られた率をゼロ日の基準値（baseline runs）と比較した。 同様な方法をビタミンＢ₁₂のアッセイに用いることができる。ビタミンＢ₁₂は 、α−メチルチオグリセロールを用い、それに続く高アルカリ性環境下に内在性 の固有因子から分離するのが好ましい。これは、放出されたビタミンＢ₁₂の捕獲 試薬複合体との結合を可能にし、それによって検出過程が容易になる。 ２種の慣用アッセイを用いて、患者試料を分析し、個々の葉酸濃度を測定した 。患者試料は、マルチクローナル及 びポリクローナルフォーマットの両方を用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（ Bio-Rad Chemical Div．Richmond，CA.，94804）及びＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標 ）（Corning Inc.，Science Products Division，Corning，N.Y.，14831）アッ セイに対してＩＭｘ（登録商標）によって分析した。表３からわかるように、２ 種の方法の間には良好な一致が見られた。表示「Ｎ」は試験した患者試料の数を 指す。 マルチクローナル試薬が45℃で３日後にも良好な安定性を示したという事実も 重要である。２種の別個のモノクローナル、２種のモノクローナルの１：１混合 物及びポリクローナル試料を異なる温度で試験した。マルチクローナル 試薬（１：１混合物）は45℃で３日後にその４℃での活性の10％を失ったに過ぎ ない。表４に示されているように、マルチクローナルフォーマットは、高温での 貯蔵後の高基質回転率で示されているように、より多くの結合タンパク質に結合 する良好な能力を示している。 本発明の方法は、いくつかの分析物に適合するように用いることが可能である 。用いた抗体は、試薬性能の可変性を排除するべく開発されたものである。初期 には捕獲試薬中で２種のＣＭＡ−抗体結合体を混ぜ合わせてマルチクローナルフ ォーマットを製造した。これは後に、２種の抗体を混ぜ合わせ、次いで混合物を ＣＭＡと結合させてマルチ クローナル抗体を製造することにより簡易化された。抗体混合物は２種の別個の モノクローナル抗体であるか、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体と の組み合わせであってよい。 アッセイの開始時に、試料にＤＴＴ試薬を加えて試料の５′−ｍＴＨＦを保存 するための還元環境を維持する。ＤＴＴは、ジスルフィド結合を還元し、他のタ ンパク質をよりアルカリ変性しやすくすることによって、タンパク質変性剤とし ての機能も果たし得る。文献に記載されている論文により、葉酸結合タンパク質 が12以上のｐＨで不可逆的に変性することが示唆されている。本発明は、好まし くは水酸化カリウム試薬を用いて内在性葉酸結合タンパク質を破壊することによ り患者試料を変性させる。これによって、ＣＭＡ／マルチクローナル／ＦＢＰ複 合体を、放出された患者試料葉酸に結合させる。従って、このアッセイでは、変 性のためにｐＨを再現可能に上昇させ、次いで捕獲希釈剤で塩基を中和しなけれ ばならない。最近の文献及び本出願人の経験は、約9.3のｐＨで較正剤中のＰＧ Ａと試料中の５′−ｍＴＨＦとの最適な結合が得られることを示唆している。 本発明において、希釈剤は、ＣＭＡ／マルチクローナル／ＦＢＰ捕獲試薬を機 能させ且つ安定に保つのに適切でなければならないだけでなく、ＫＯＨの中和も 行なわなければならない。従って、捕獲試薬は適切なＰＧＡ及び５′−ｍＴＨＦ の性能を得るために反応ｐＨを緩衝する。ホウ酸塩は9.3に近いｐＫＡを有し且 つＦＢＰ結合能を助ける好ましい緩衝剤である。４％スクロースを添加するとホ ウ酸塩の溶解度が増大する。スクロースのこの機能の遂行能力は、ホウ酸塩と結 合するｃｉｓ−ヒドロキシ基によるものである。スクロースは、４℃で貯蔵され ている捕獲希釈剤からホウ酸塩が偶発的に沈殿するのを阻止する。 葉酸アッセイ １．手順 （ａ）ＩＭｘ（登録商標）（Abbott Laboratories，Abbott Park，IL.，60064） カルーセルに較正剤及び／又は対照並びに試験試料（それぞれ最低100μl）をロ ードする。次いで0.4mlのジチオトレイトール（ＤＴＴ）をカルーセルの第１反 応セルの希釈前ウエルに入れる。 （ｂ）反応ウエルがそれぞれ第１反応セルの希釈前ウエルからのＤＴＴ0.015ml 及び較正剤、対照又は試料0.018mlを受けとるとアッセイが始まる。ＤＴＴはタ ンパク質を変性させ、試料中の５′−ｍＴＨＦの還元形を保持する。各ウエルを ８分間インキュベートする。 （ｃ）各反応ウエルに0.028mlの0.75Ｍ水酸化カリウム（ＫＯＨ）を加え、８分 間インキュベートする。 （ｄ）反応ウエルに、0.15mlの捕獲試薬（ホウ酸緩衝液中のＦＢＰと複合体を形 成したポリアニオン−抗ＦＢＰ抗体）を加える。捕獲試薬中のホウ酸緩衝液は、 変性剤を中和（約9.3の最終ｐＨ）し、試料中の葉酸とＦＢＰとを結合させる。 捕獲試薬中の硫酸デキストランは予期せぬカチオン種（即ち、マトリックス由来 のカチオンダスト）に結合し、アッセイの可変要素を減少させる。ウエルを12.5 分間インキュベートする。 （ｅ）0.22mlの反応混合物を、ポリアニオン（抗体を介してＦＢＰに結合された ）がイオン相互作用により反応セルのマトリックス上のポリカチオンに結合する イオン捕獲反応セルマトリックスに移入する。 （ｆ）マトリックスを希釈剤で２度洗浄して、結合していない物質を除去し、次 いで0.06mlの結合体試薬を加える。用いられた結合体試薬はプテロイン酸に結合 した仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼである。結合体は捕獲ＦＢＰ上の葉酸が 占拠していない部位に結合する。 （ｇ）次いで未結合の結合体をマトリックスの表面から洗いだし、0.06mlのメチ ルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）試薬を加え、遊離したＭＵの蛍光を 読み取る。蛍光強度は較正剤又は患者試料中の葉酸の量に反比例する。 ビタミンＢ₁₂アッセイ １．手順 （ａ）カルーセルに較正剤及び／又は対照並びに試験試料（それぞれ最低100μl ）をロードする。次いで0.4mlのα-モノチオグリセロールをカルーセル中の第１ 反応セルの希釈前ウエルに入れる。 （ｂ）各反応ウエルが0.01mlのα-モノチオグリセロール及び0.06mlの較正剤、 対照又は試料を受けとると検 定が始まる。還元剤がタンパク質を変性させる。８分間インキュベートする。 （ｃ）各反応ウエルに0.08mlのＫＯＨを加え、８分間インキュベートする。 （ｄ）0.15mlの捕獲試薬（ホウ酸緩衝液中の固有因子と複合体を形成したポリア ニオン−抗固有因子抗体）を反応ウエルに加え、次いで変性剤を中和（約9.3の 最終ｐＨ）し、試料中のビタミンＢ₁₂を固有因子と結合させる。捕獲試薬中の硫 酸デキストランは予期せぬカチオン種（即ち、マトリックス由来のカチオンダス ト）に結合する。12.5分間インキュベートする。 （ｅ）0.15mlの反応混合物を、ポリアニオン（抗固有因子抗体を介して固有因子 に結合された）がイオン相互作用によりマトリックス上にコートされたポリカチ オンに結合するイオン捕獲反応セルマトリックスに移入する。 （ｆ）マトリックスを希釈剤で２度洗浄し、次いで0.05mlの結合体試薬を加える 。用いられる結合体試薬は、ビタミンＢ₁₂又はビタミンＢ₁₂アナローグに結合し た仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼである。結合体は捕獲された固有因子上の ビタミンＢ₁₂が占拠していない部位に結合する。 （ｇ）次いで未結合の結合体をマトリックスの表面から洗いだし、0.06mlのメチ ルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）試薬を加え、遊離したＭＵの蛍光を 読み取る。蛍光強度は較正剤又は患者試料中のビタミンＢ₁₂の量に反比例する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハーマン，ロバート・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ケンウツド・アベニユー・3514 (72)発明者 シユウ，ステイーブン・シー アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バー ノン・ヒルズ、アシユランド・コート・ 204 (72)発明者 ホークスワース，デイビツド・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60060、マン デレイン、ノース・グリーンビユウ・146 (72)発明者 ピンカス，メアリー・エス アメリカ合衆国、イリノイ・60630、シカ ゴ、ウエスト・グレゴリー・4845

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試験試料中の分析物の存在又は量を測定するための改良法であって、 分析物に特異的な第１の結合ペアメンバーに特異的であり且つ捕獲可能な物質 に結合した少なくとも２種の異なるモノクローナル抗体の混合物又はモノクロー ナル抗体とポリクローナル抗体との混合物を用いて、前記第１の結合ペアメンバ ーを前記捕獲可能な物質に結合する段階、前記試験試料中に存在する任意の分析 物を前記第１の結合ペアメンバーに捕獲させる段階、分析物又は第１の結合ペア メンバーに指向する第２の特異的結合ペアメンバーに直接又は間接的に結合した 検出可能な標識を添加する段階、前記捕獲可能な物質を捕獲して、該物質を試験 試料から分離する段階、及び遊離しているか又は捕獲された検出可能な標識を前 記分析物の存在又は量に関して監視する段階を含む前記方法。 ２．試験試料中の分析物の存在又は量を測定するための方法が、 第１の特異的結合ペアメンバーに特異的な第２の特異的 結合ペアメンバーに直接又は間接的に結合した検出可能な標識を含む指示試薬及 び、前記第１の特異的結合ペアメンバーに対する少なくとも２つの異なるモノク ローナル抗体の混合物又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との混合物 によってポリアニオンポリマーに結合した前記第１の特異的結合ペアメンバーを 含む捕獲試薬に、試験試料を接触させて試験混合物を形成する段階、前記捕獲試 薬との結合に関して前記試験試料を前記指示試薬と競合させる段階、マトリック スにイオン結合させることにより前記試験試料から前記ポリアニオンポリマーを 分離する段階、並びに遊離しているか又は捕獲された検出可能な標識を監視して 、前記試験試料中の前記分析物の存在又は量を決定する段階からなる、請求項１ に記載の方法。 ３．前記試験試料を、前記捕獲試薬、次いで前記指示試薬に順次接触させること により前記試験混合物を形成する請求項２に記載の方法。 ４．前記試験試料を同時に前記捕獲試薬及び前記指示試薬に接触させることによ り前記試験混合物を形成する請求項２に記載の方法。 ５．それぞれが異なる抗体に結合した数種の捕獲可能な物 質を混合することにより、前記抗体混合物を得ることができる請求項１に記載の 方法。 ６．前記第１の特異的結合ペアメンバーが前記試験試料中の特定の分析物に特異 的な結合タンパク質である請求項２に記載の方法。 ７．前記第１の特異的結合ペアメンバーが葉酸結合タンパク質であり、前記分析 物が葉酸である請求項６に記載の方法。 ８．前記捕獲試薬と組み合わせる前に、試験試料を還元剤で処理し、次いでアル カリ性剤で処理する請求項２に記載の方法。 ９．前記還元剤がジチオトレイトールである請求項８に記載の方法。 １０．前記アルカリ性剤が水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム 又はアンモニア水である請求項８に記載の方法。 １１．標準試薬としてプテロイルグルタミン酸（ＰＧＡ）を用いる請求項７に記 載の方法。 １２．クエン酸塩を添加して前記ＰＧＡを安定化させる請求項１１に記載の方法 。 １３．葉酸分析物と競合する前記第２の特異的結合ペアメンバーがプテロイン酸 である請求項７に記載の方法。 １４．前記指示試薬が前記第２の特異的結合ペアメンバーに直接又は間接的に結 合したアルカリ性ホスファターゼである請求項２に記載の方法。 １５．第１の特異的結合ペアメンバーが固有因子であり、分析物がビタミンＢ₁₂ である請求項２に記載の方法。 １６．前記還元剤がα−メチルチオグリセロールである請求項１５に記載の方法 。 １７．安定剤として４％スクロースを含むホウ酸緩衝液に前記捕獲試薬を希釈す る請求項２に記載の方法。 １８．前記マトリックスをポリカチオン物質でプレコートして該マトリックスを 製造する請求項２に記載の方法。 １９．ポリカチオンを反応混合物と同時に前記マトリックスに添加する請求項２ に記載の方法。 ２０．前記マトリックスに移入する前にポリカチオンを反応混合物に直接加える 請求項２に記載の方法。 ２１．葉酸結合タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌するＡ ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１１２４９のハイブリドーマ細胞系（１−２７９ −８６６）。 ２２．葉酸結合タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌するＡ ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１１２５０のハイブリドーマ細胞系（１−６４１ −１０１）。 ２３．細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ−１１２４９によって分泌される請 求項１に記載の方法に有用なモノクローナル抗体。 ２４．細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１１２５０によって分泌される請 求項１に記載の方法に有用なモノクローナル抗体。