JPH08507680A

JPH08507680A - 組換え抗ｖｌａ４抗体分子

Info

Publication number: JPH08507680A
Application number: JP6516243A
Authority: JP
Inventors: アール．ロブ，ロイ; ジェイ．カール，フランク; アール．テンペスト，フィリップ
Original assignee: バイオジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1993-01-12
Filing date: 1994-01-07
Publication date: 1996-08-20
Also published as: US7157086B2; JP2005000165A; JP2013198493A; EP0678122A1; US7829092B2; GR3031692T3; DK0678122T3; JP2012191936A; US6602503B1; AU5993694A; DE69419721T2; JP2010183907A; SG44845A1; US7482003B2; WO1994016094A3; DE69419721D1; ES2137354T3; US20120022236A1; JP2008024711A; HK1011031A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子を含む組換え抗ＶＬＡ４抗体分子を開示する。これらの抗体は、喘息及び炎症性腸疾患を含む特異的及び非特異的炎症の治療において有用である。更に、これらの開示するヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体は、炎症の診断及び炎症部位の位置決めにおいて有用であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】組換え抗ＶＬＡ４抗体分子発明の分野本発明は、ヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子を含む、組換え抗ＶＬＡ抗体分子に関するものである。発明の背景Ａ．免疫グロブリン及びモノクローナル抗体天然の免疫グロブリンは、種々の断片例えば酵素開裂によって誘導することの出来るＦab、（Ｆab'）₂及びＦｃ断片を有するものとして長年にわたって公知である。天然の免疫グロブリンは、一般に、各上腕の自由末端側に抗原結合部位を有するＹ型分子を含む。構造の残り特にＹの幹は、免疫グロブリンと関係するエフェクター機能を媒介する。特に、免疫グロブリン分子は、ジスルフィド結合によって結合された２つの重（Ｈ）ポリペプチド鎖及び２つの軽（Ｌ）ポリペプチド鎖からなる。免疫グロブリン鎖の各鎖は、それぞれ約１１０アミノ酸である領域又はドメインに分割される。軽鎖は２つのかかるドメインを有するが、他方、重鎖は４つのドメインを有する。各ポリペプチド鎖のアミノ末端ドメインのアミノ酸配列は、高度に可変性であり（Ｖ領域）、他方、残りのドメインの配列は保存的若しくは定常的である（Ｃ領域）。それ故に、軽鎖は、１つの可変ドメイン（Ｖ_L）と１つの定常ドメイン（Ｃ_L）からなり、他方、重鎖は、１つの可変ドメイン（Ｖ_H）と３つの定常ドメイン（ＣＨ₁、ＣＨ₂及びＣＨ₃）を含む。Ｙ型分子の１つの腕は、軽鎖（Ｖ＋Ｃ_L）及び可変ドメイン（Ｖ_H）及び１つの定常ドメイン（ＣＨ₁）からなる。このＹの尾部は、残りの重鎖定常ドメイン（ＣＨ₂＋ＣＨ₃）からなる。重鎖のＣ末端は、会合してＦｃ部分を形成する。各可変領域内には、３つの超可変域がある。これらの超可変域は、抗原の結合におけるそれらの重要性の故に相補性決定領域（ＣＤＲ）としても記載される。可変ドメインの４つの一層保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）として記載される。免疫グロブリンの各ドメインは、疎水性面が一緒にパックされた、ジスルフィド橋によって結合された２つのベーターシートからなる。個々のベータ鎖は、ループによって一緒に結合されている。全体の外観は、末端にループを有するベータ円筒部として記載することが出来る。ＣＤＲは、可変領域のベータ円筒部の一端にループを形成する。天然の免疫グロブリンは、アッセイ、診断に用いられて来ており、又一層限られた程度で治療に用いられて来た。しかしながら、かかる利用は（特に、治療において）、天然の免疫グロブリンのポリクローナル特性によって妨げられてきた。免疫グロブリンの治療剤としての可能性の実現に向けての重要なステップは、限定された特異性のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の調製のための技術の発見（Kohler等、1975［1］）であった。しかしながら、殆どのＭＡｂは、ゲッ歯類（即ち、マウス、ラット）の脾臓細胞とゲッ歯類のミエローマ細胞との融合により生成される。従って、それらは、本質的にゲッ歯動物の蛋白質である。１９９０年までに、１００を超えるマウスモノクローナル抗体が、臨床的に試みられた（特に米国で、特に癌の治療への応用のために）。しかしながら、現在までに、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答と呼ばれるヒトにおける望ましくない免疫応答によるマウスモノクローナル抗体の拒絶が特に慢性疾患の治療にとって重大な制限となっているということが認識された。それ故に、ゲッ歯類ＭＡｂのヒトにおける治療剤としての利用は、ヒト患者がそのＭＡｂに対する免疫応答を開始して、そのＭＡｂを完全に除去するか又は少なくともその効力を減じるという事実によって本来的に制限されている。実際に、ゲッ歯類起源のＭＡｂは、ＨＡＭＡ応答がじきにＭＡｂを無効にし、並びに、望ましくない反応を起こすので、一人の患者において１回若しくは数回以上は使用することが出来ない。事実、ＨＡＭＡ応答は、大部分の患者において、マウス抗体の一回の注射の後に観察された（Schroff等、1985［2］）。ＨＡＭＡの問題を解決する方法は、免疫的に適合性のヒトモノクローナル抗体を投与することである。しかしながら、ヒトモノクローナル抗体の開発のための技術は、マウス抗体のそれよりずっと遅れており（Borrebaeck等、1990［3］）、非常に少数のヒト抗体が臨床研究において有用であることが判明しているだけである。それ故に、ヒトにおいて一層抗原性の少ない非ヒトＭＡｂを製造するための提案がなされた。かかる技術は、「ヒト化（humanization）」技術と総称することが出来る。これらの技術は、一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術の利用を含む。抗体遺伝子をクローン化するための組換えＤＮＡ技術の利用は、別法を提供し、それにより、マウスモノクローナル抗体は、同じ抗原結合特性を有するヒト型に優勢に変換され得る（即ち、ヒト化される）（Riechmann等、1988［4］）。一般に、ヒト化技術のゴールは、ＣＤＲを除いて、ヒトにおける抗原性を減じ若しくは除去するために、マウス成分が非常に少ないか事実上含まれないヒト化抗体を開発することである（例えば、Tempest等、1991［5］を参照されたい）。ＭＡｂをヒト化する初期の方法は、一つの抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が他の抗体から導かれた定常ドメインに結合したキメラ抗体の産生を含んだ。かかるキメラ化手順を実施する方法は、例えば、ＥＰ１２０６９４［６］、ＥＰ１２５０２３［７］、及びＷＯ／０１５３３［８］に記載されている。一般に、非ヒトＭＡｂ例えばマウスＭＡｂからの可変ドメインとヒト免疫グロブリンからの定常ドメインとを有する抗体分子の製造方法が記載されている。かかるキメラ抗体は、それらが未だかなりの割合の非ヒトアミノ酸配列即ち完全な非ヒト可変ドメインを含みそれ故に特に長期間投与した場合に幾らかのＨＡＭＡ応答を誘出し得る（Begent等、1990［9］）ので、本当にヒト化されてはいない。更に、これらの方法は、幾つかの場合（例えば、ＥＰ１２０６９４［６］；ＥＰ１２５０２３［７］及び米国特許第４，８１６，５６７号［１０］）には、Ｉｇポリペプチド鎖の如何なる有意の量の発現、若しくはイン・ビトロ可溶化及び鎖再構成を伴わないＩｇ活性の生成にも導かず、或はこれらの鎖の分泌及び所望のキメラ組換え抗体へのアセンブリーへも導かないと考えられる。これらの同じ問題は、初期の非キメラ組換え抗体の産生（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号［１１］）についても注意され得る。Ｂ．ヒト化組換え抗体及びＣＤＲグラフト技術初期のキメラ抗体製造のための方法に続いて、新たなアプローチがＥＰ０２３９４００［１２］に記載され、それにより、抗体は一の種についてのそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）を他の種からのもので代用することによって変更される。この方法を用いて、例えば、ヒトの重鎖及び軽鎖Ｉｇの可変領域ドメインからのＣＤＲを別のマウス可変領域ドメインからのＣＤＲで代用することが出来る。これらの変更されたＩｇ可変領域を、続いて、ヒトＩｇ定常領域と結合して、置換されたマウスＣＤＲを除いて全体的にヒトの組成である抗体を造ることが出来る。かかるマウスＣＤＲ置換された抗体は、相当少ないマウス成分しか含まないので、ヒトにおいて、キメラ抗体と比較して、相当に減じた免疫応答を誘出することはありそうにないと予想され得る。ＣＤＲグラフトによってモノクローナル抗体をヒト化する方法は、「再成形（ reshaping）」と呼ばれる（Riechmann等、1988［4］；Verhoeyen等、1988［13］）。典型的には、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト抗体の対応する領域に移植する（特異的抗原に結合するマウス抗体の領域はＣＤＲ（抗体重鎖中の３つと軽鎖中の３つ）であるので）。ＣＤＲの移植は、遺伝子工学により達成される。該遺伝子工学により、ＣＤＲＤＮＡ配列を、マウス重鎖及び軽鎖可変（Ｖ）領域遺伝子セグメントのクローニングによって決定し、次いで、部位特異的突然変異導入法によって対応するヒトＶ領域にトランスファーする。この方法の最後の段階で、所望のイソタイプ（通常、Ｃ_Hについてはガンマー１及びＣ_Lについてはカッパー）のヒト定常領域遺伝子セグメントを加え且つこれらのヒト化重鎖及び軽鎖遺伝子を、哺乳動物細胞内で同時発現させて可溶性のヒト化抗体を生成する。これらのＣＤＲのヒト抗体へのトランスファーは、この抗体に元のマウス抗体の抗原結合特性を与える。これらの６つのマウス抗体中のＣＤＲは、構造的に、Ｖ領域「フレームワーク」領域に載せられる。ＣＤＲグラフトがうまく行く理由は、マウス及びヒト抗体間でフレームワーク領域が非常に類似した３−Ｄ構造及びＣＤＲに対する類似の付着点を有し、ＣＤＲが交換可能だからである。それにもかかわらず、フレームワーク領域内のある種のアミノ酸は、ＣＤＲと相互作用して抗原結合アフィニティーに全体的に影響を与えると考えられる。ヒトＶ領域フレームワークの何らの修飾をも伴わない組換えヒト化抗体を生成するためのマウス抗体からのＣＤＲの直接トランスファーは、しばしば、結合アフィニティーの部分的な若しくは完全な喪失を生じる。 Riechmann等、1988［4］及びＷＯ８９／０７４５４［１４］において、ＣＤＲ領域のトランスファーは、単独では（Kabat等、1991［15］及びWu等、1970［16 ］により規定されたように）ＣＤＲグラフト生成物における満足すべき抗原結合活性を供給するのに十分でないことが見出された。Riechman等、1988［4］は、満足すべき抗原結合活性をを有するＣＤＲグラフト生成物を得るためにはヒト配列の２７位のセリン残基を対応するラットのフェニルアラニン残基に変換することが必要であることを見出した。重鎖の２７位のこの残基は、ＣＤＲ１に隣接する構造ループ内にある。重鎖の３０位にヒトセリンのマウスチロシンへの変化を付加的に含む更なる構造は、２７位に単独のセリンからフェニルアラニンへの変化を有するヒト化抗体上に有意の変化した結合活性を有しなかった。これらの結果は、ＣＤＲ領域の外側例えばＣＤＲ１に隣接するループ内のヒト配列の残基への変化が、一層複雑な抗原を認識するＣＤＲグラフト抗体に対する有効な抗原結合活性を得るために必要であり得ることを示している。たとえそうであっても、得られる最大ＣＤＲグラフト抗体の結合アフィニティーはやはり元のＭＡｂより有意に低かった。もっと最近、Queen等、1989［17］及びＷＯ９０／０７８６１［１８］は、マウスＭＡｂのＣＤＲ（抗Ｔａｃ）をヒト免疫グロブリンフレームワーク及び定常領域に結合することによってインターロイキン２レセプターに結合するヒト化抗体の調製物を記載している。彼らは、しばしば直接ＣＤＲトランスファーから生じる結合アフィニティーの喪失の問題に対する一つの解決を示した（ヒトＶ領域フレームワーク残基の何らの修飾をも伴わない）。彼らの解決は、２つの鍵となるステップを含んでいる。第１に、ヒトＶフレームワーク領域を、元のマウス抗体（この場合には、抗ＴａｃＭＡｂ）のＶ領域フレームワークに対する最適の蛋白質配列相同性についてコンピューター分析により選択する。第２ステップにおいて、マウスＣＤＲと相互作用しそうなフレームワークアミノ酸残基を可視化するためにマウスＶ領域の三次構造をコンピューターによって模擬し、次いで、これらのマウスアミノ酸残基を相同なヒトフレームワーク上にスーパーインポーズする。相同なヒトフレームワークを推定のマウス接触残基と共に用いる彼らのアプローチは、インターロイキン２レセプターに特異的な（Queen等、1989［17］）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）にも特異的な抗体（Co．等、1991［19］）に関して元のマウス抗体に対する類似の結合アフィニティーを有するヒト化抗体を生じた。しかしながら、マウス残基のヒトフレームワークへの再導入（抗インターロイキン２レセプター抗体については少なくとも９、２つの抗ＨＳＶ抗体の各々については少なくとも９及び７）は、ヒト化抗体におけるフレームワーク領域へのＨＡＭＡ応答の可能性を増大させ得る。Bruggemann等、1989［20］は、ヒトＶ領域フレームワークがマウスにおいて外来性として認識され、それ故に逆に、マウスの修飾ヒトフレームワークがヒトにおける免疫反応を起こすということをを示した。上記のＷＯ９０／０７８６１［１８］の２ステップのアプローチによって、Qu een等は、ヒト化免疫グロブリンをデザインするための４つの基準を概説した。第１の基準は、ヒトアクセプターとして、通常ヒト化すべき非ヒトドナー免疫グロブリンに相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用するか、又は多くのヒト抗体に由来するコンセンサスフレームワークを用いることである。第２の基準は、もしヒトアクセプター残基が普通でなく且つドナー残基がフレームワークの特異的残基においてヒト配列について典型的であるならば、アクセプターではなくてドナーアミノ酸を用いることである。第３の基準は、ＣＤＲに直接隣接する位置のアクセプターではなくてドナーフレームワークアミノ酸残基を用いることである。第４の基準は、アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Å以内の側鎖原子を有することが予想され且つ、抗原若しくはヒト化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用し得ることが予想されるフレームワーク位置のドナーアミノ酸残基を使用することである。基準２、３若しくは４を、基準１に加えて若しくは別に適用するか、又は各基準を単独で若しくは任意の組合せで適用することが勧められる。更に、ＷＯ９０／０７８６１［１８］は、単一のＣＤＲグラフトヒト化抗体の調製物、ＩＬ−２レセプターのｐ５５Ｔａｃ蛋白質に特異的なヒト化抗体を、これらのヒト化抗体をデザインする際に上記の４つのすべての条件の組合せを用いることにより詳述している。ヒト抗体ＥＵ（Kabat等、1991［15］を参照）の可変領域フレームワークがアクセプターとして用いられた。その結果生成したヒト化抗体において、ドナーＣＤＲはKabat等、1991［15］及びWu等、1970［16］により規定されたとおりであり、更に、マウスドナー残基がヒトアクセプター残基の代りに用いられた（可変領域フレームワークの重鎖の２７、３０、４８、６６、６７、８９、９１、９４、１０３、１０４、１０５及び１０７位及び軽鎖の４８、６０及び６３位にて）。得られたヒト化抗Ｔａｃ抗体は、３×１０⁹Ｍ^-1 のｐ５５に対するアフィニティー（マウスＭＡｂのアフィニティーの約１／３）を有することが報告された。幾つかの他のグループは、先ず相同なフレームワークを選択してからマウス残基を再導入するQueen等のアプローチは、元のマウス抗体に類似の結合アフィニティーを有するヒト化抗体を達成するためには必要でないらしいということを示した（Riechmann等、1988［4］；Tempest等、1991［5］；Verhoeyen等、1991［2 1］）。更に、これらのグループは、異なるアプローチを用いて、マウス残基のラジカル導入なしでＣＤＲグラフトのためにそれぞれＮＥＷＭ及びＲＥＩ重鎖及び軽鎖から導かれたＶ領域フレームワークを標準として利用することが可能であることを示した。しかしながら、元のマウスＭＡｂに類似の結合効率を有する抗体を生成するためにはどのマウス残基を導入すべきかを決定することは、大いに経験的であり且つ利用可能な従来技術によって教示されていないので、予想することは困難であり得る。ヒト化ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ抗体の場合には、２７位のセリン残基のフェニルアラニンでの置換は、単に、元のマウス抗体の結合効率に類似の結合効率を達成するために必要とされる置換であった（Riechmann等、198 8［4］；WO92/04381［22］）。イン・ビボでのレスピラトリーシンシチアルウイルス（ＲＳＶ）感染の阻止に対するＲＳＶに特異的なヒト化（再成形）抗体の場合に、ＣＤＲグラフトＮＥＷＭ重鎖中のＣＤＲ３に隣接する３残基のブロックの置換は、元のマウス抗体と等しい生物学的活性をを生成するために必要であった（Tempest等、1991［5］；WO92/04381［ 22］）。このマウスＣＤＲのみがヒトフレームワークにトランスファーされた再成形抗体は、ＲＳＶに対する弱い結合を示した。ヒト化抗体に基づくＮＥＷＭ及びＲＥＩを構築するためにTempest等、1991［5］のアプローチを用いることの有利さは、ＮＥＷＭ及びＲＥＩ可変領域の３次元構造がＸ線結晶学から公知であり、従って、ＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用を模擬することが出来ることである。この採用したアプローチにかかわらず、現在までに調製された初期ヒト化抗体の例は、それが、ヒト化抗体が導かれた元のマウスＭＡｂの特性、特に結合アフィニティー並びに他の望ましい特性を有するヒト化抗体を得るための直接的方法ではないことを示した。採用したＣＤＲグラフトへのアプローチにかかわらず、それは、しばしば、単にドナーＩｇからのＣＤＲをアクセプターのＩｇのフレームワーク領域にグラフトするためにも十分でない（例えば、Tempest等、1991［5 ］、Riechman等、1988［4］等（本明細書にて引用）を参照）。多くの場合に、それは、結合活性を得るためにアクセプター抗体のフレームワーク領域内の残基を変えるために臨界的であるらしい。しかしながら、かかるフレームワーク変化が必要であると認めたとしても、利用可能な従来技術に基づいて、所望の特異性の機能性のヒト化組換え抗体を得るためにはどのフレームワーク残基を変える必要があるか（変える必要がある場合）を予想することは不可能である。これまでの結果は、特異性及び／又はアフィニティーを保存するのに必要な変化が所定の抗体に対して殆どの部分についてユニークであり、異なる抗体のヒト化に基づいて予想することは出来ないことを示した。特に、本発明の教示に従って構築した組換えヒト化抗ＶＬＡ４抗体の活性に臨界的に重要なものとしてここに開示するフレームワーク中の残基のセットは、一般に、以前に他のヒト化抗体の活性に臨界的であるとして同定された残基と一致せず、従来技術に基づいて発見されなかった。Ｃ．ヒト化抗体の治療適用現在まで、ヒト化組換え抗体は、主として急性疾患状態の治療適用（Tempest 等、1991［5］）又は診断用イメージング（Verhoeyen等、1991［21］）のために開発されてきた。最近、臨床研究が、ＮＥＷＭ及びＲＥＩＶ領域フレームワークを有する少なくとも２つのヒト化抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ（Riechmann等、1988［4］）及びヒト化抗胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）（Verhoey en等、1991［21］）を用いて開始され、これらの研究は、初期に、これらの抗体に対する如何なる顕著な免疫反応も存在しないことを示した。ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨを用いる治療コースは、非ホジキンリンパ腫を有する２人の患者に対して緩解を与え、それ故、慢性疾患状態における効力を示した（Hale等、1988［23］）。更に、ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨの免疫原性の欠如が、これらの２人の患者の３０日及び４３日の日々の治療の後に示された。ヒト化抗体に対する十分な寛容がＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨを用いて認められたので、ヒト化抗体を用いる治療は、急性疾患の予防及び低死亡率の病気の治療に有望である。Ｄ．ＶＣＡＭ−ＶＬＡ４接着経路及びＶＬＡ４に対する抗体血管内皮細胞は、血管の裏打ちを構成し、通常、循環白血球には低いアフィニティーしか示さない（Harlan，1985［24］）。炎症部位におけるサイトカインの放出は（及び免疫反応に応答して）、それらの活性化を引き起こして、表面抗原の宿主の増大した発現を生じる（Collins等、1986［25］；Pober等、1986［26］；Bevi1acqua等、1987［27］；Leeuwenberg等、1989［28］）。これらは、接着蛋白質ＥＬＡＭ−１（好中球に結合する）（Bevilacqua等、1989［29］）、ＩＣＡＭ−１（すべての白血球と相互作用する）（Dustin等、1986［30］；Pober等、1986［26］；Boyd等、1988［31］；Dustin及びSpringer，1988［32］）及びＶＣＡＭ−１（リンパ球に結合する）（Osborn等、1989［33］）を含む。これらのサイトカイン誘導された接着分子は、血管外組織への白血球補充において重要な役割を演じるらしい。インテグリンは、広い細胞分布を有し且つ進化を通じて高度に保存されたアルファ−ベータヘテロ２量体構造を示す細胞−細胞外マトリックス及び細胞−細胞接着レセプターの群である（Hynes，1987［34］；Marcantonio及びHynes，1988 ［35］）。インテグリンは、３つの主要なサブグループに細分類されている；インテグリンのβ₂サブファミリー（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１及びｐ１５０，９５）は、殆どの免疫系内の細胞−細胞相互作用に関与する（Kishimoto等、1989［3 6］）が、他方、β₁及びβ₂インテグリンサブファミリーのメンバーは、優勢に、細胞の細胞外マトリックスへの付着を媒介する（Hynes，1987［34］；Ruoslah ti，1988［37］）。特に、β₁インテグリンファミリーは、ＶＬＡ蛋白質とも呼ばれるが、フィブロネクチン、コラーゲン及び／又はラミニンと特異的に相互作用する少なくとも６つのレセプターを含む（Hemler，1990［38］）。ＶＬＡファミリー内で、ＶＬＡ４は、殆どリンパ様細胞及び骨髄細胞に限られているので典型的ではなく（Hemler等、1987［39］）間接的証拠はそれが種々の細胞−細胞相互作用に関与し得ることを示唆した（Clayberger等、1987［40］；Takada等、 1989［41］；Holtzmann等、1989［42］；Bendarczyk及びMcIntyre，1990［43］）。更に、ＶＬＡ４は、ヒトプラズマフィブロネクチン（ＦＮ）のヘパリンＩＩ結合断片へのＴ及びＢリンパ球付着を媒介することが示された（Wayner19 89［44］）。ＶＣＡＭ−１は、ＩＣＡＭ−１と同様に、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである（Osborn等、1989［33］）。ＶＣＡＭ−１及びＶＬＡ４は、活性化内皮へのリンパ球の付着を与えるリガンドレセプター対であることが Elices等、1990［45］により示された。従って、ＶＬＡ４は、限定されたリガンドＶＣＡＭ−１及びＦＮによる細胞−細胞接着及び細胞−細胞外マトリックス接着機能の両方に関与するβ₁インテグリンレセプターの珍しい例に相当する。ＶＣＡＭ１（ＩＮＣＡＭ−１１０としても知られる）は、最初、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ及びＩＬ−１）及びＬＰＳ（Rice等、1989［46］；Osborn等、19 89［33］）により内皮細胞上に誘導される接着分子として同定された。ＶＣＡＭ１は、インテグリンＶＬＡ４（α₄β₁）を示す細胞（Ｔ及びＢリンパ球、単核細胞及び好酸球を含むが、好中球は含まない）に結合するので、それは、これらの細胞の血流から感染及び炎症領域への補充に関与するものと考えられている（El ices等、1990［45］；Osborn，1990［33］）。ＶＣＡＭ／ＶＬＡ４接着経路は、多くの生理学的及び病原性プロセスを関連してきた。ＶＬＡ４は、通常、造血細胞系統に限れられているが、それはミエローマ細胞系統上で見出され、それ故、ＶＣＡＭ１はかかる腫瘍の転移に関与し得ることが示唆されている（Rice等、1989［46］）。イン・ビボにおいて、ＶＣＡＭ１は、ウサギモデル系において、初期アテローム性動脈硬化プラークを表している動脈内皮の領域に見出される（Cybulsky及び Gimbrone，1991［46］）。ＶＣＡＭは又、ヒトリンパ節の濾胞性樹状細胞においても見出される（Freedman等、1990［48］）。それは又、マウスの骨髄間質細胞上にも見出され（Miyake等、1991［49］）、従って、ＶＣＡＭ１は、Ｂ細胞発生において役割を果たしているらしい。イン・ビボでの内皮細胞上のＶＣＡＭ１の主要な形態は、ＶＣＡＭ−７Ｄとして言及されており、７つのＩｇ相同性ユニット若しくはドメインを有する；ドメイン４、５及び６は、アミノ酸配列において、それぞれ、ドメイン１、２及び３に類似し、遺伝子の進化の歴史における遺伝子間重複事象を示唆している（Osbo rn等、1989［33］；Polte等、1990［50］；Hession等、1991［51］；Osborn及び Benjamin，米国特許第０７／８２１，７１２号（１９９１年９月３０日出願）［５２］）。６ドメイン型（ここでは、ＶＣＡＭ−６Ｄとして言及する）は、４つのドメインが欠失する別のスプライシングによって生成される（Osborn等、1989 ［33］；Hession等、1991［51］；Cybulsky等、1991［47］；Osborn及びBenjami n，米国特許第０７／８２１，７１２号（１９９１年９月３０日出願）［５２］）。ＶＣＡＭ−６Ｄは、これらの別型の内で最初に配列決定されたが、後のイン・ビボでの研究は、ＶＣＡＭ−７Ｄ型がイン・ビボで優勢であることを示した。この別のスプライシングの生物学的意義は、未知であるが、Osborn及び Benjamin，米国特許第０７／８２１，７１２号（１９９１年９月３０日出願）［５２］により示されたように、ＶＣＡＭ−６Ｄは、ＶＬＡ４発現細胞に結合し、従って、明らかにイン・ビボで潜在的機能を有している。感染、炎症及び恐らくアテローム性動脈硬化におけるＶＣＡＭ１／ＶＬＡ４接着経路の見かけの関与は、分子レベルでの細胞−細胞接着の機構を理解するための徹底的研究の継続へと導き、且つ、研究者に、この接着経路における介入を病気特に炎症に対する治療として提案させた（Osborn等、1989［33］）。この経路における介入の１つの方法は、抗ＶＬＡ４抗体の利用を含み得る。ＶＣＡＭ１がＶＬＡ４に結合するのを阻止するモノクローナル抗体は公知である。例えば、抗ＶＬＡ４ＭＡｂＨＰ２／１及びＨＰ１／３は、ＶＬＡ４発現Ramo s細胞のヒト臍静脈細胞及びＶＣＡＭ１トランスフェクトしたＣＯＳ細胞への付着をブロックすることが示された（Elices等、1990［45］）。又、抗ＶＣＡＭ１抗体例えばモノクローナル抗体４Ｂ９（Carlos等、1990［53］）は、Ramos（Ｂ細胞様）、Jurkat（Ｔ細胞様）及びHL60（顆粒細胞様）細胞のＣＯＳ細胞（ＶＣＡＭ−６Ｄ及びＶＣＡＭ−７Ｄを発現するようにトランスフェクトしたもの）への接着を阻止することが示された（Hession等、1991［51］）。現在までに記載されたＶＬＡ４に対するモノクローナル抗体は、エピトープマッピング研究に基づいて幾つかのカテゴリーに入る（Pulido等、1991［54］）。重要なことには、エピトープ「Ｂ」に対する抗体の１つの特定のグループは、すべてのＶＬＡ４依存性接着機能の有効なブロッカーである（Pulido等、1991［54 ］）。かかるＶＬＡ４のエピトープＢに対するモノクローナル抗体（例えば、ＨＰ１／２ＭＡｂを含む）の調製は、Sanchez-Madrid等、1986［55］により記載されている。ＨＰ１／２の結合アフィニティーに匹敵するＶＬＡ４に対する類似の特異性及び高い結合アフィニティーを有する抗体は、アッセイ試薬、診断薬及び治療剤としてに有用なヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体の調製物に特に有望な候補であり得る。上記のように、炎症性白血球は、内皮細胞表面で発現される細胞接着分子によって炎症部位に補充される（該分子は白血球表面蛋白質若しくは蛋白質複合体に対するレセプターとして働く）。特に、好酸球は、最近、３つの別々の血管内皮への細胞接着経路に関与して、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、内皮細胞接着分子１（ＥＬＡＭ−１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）を発現する細胞に結合することが見出された（Weller等、1991［56］；Walsh等、1991［57 ］；Bochner等、1991 ［58］；及びDobrina等、1991［59］）。好酸球がＶＬＡ４を発現することは、それらを他の炎症細胞例えば好中球等から区別する（それらは、ＥＬＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１に結合するが、ＶＣＡＭ−１には結合しない）。ＶＬＡ４媒介の接着経路は、炎症を起こした肺組織への白血球の補充におけるＶＬＡ４の可能な役割を調べるために喘息モデルにおいて研究されてきた（Lobb ，米国特許第０７／８２１，７６８号（１９９２年１月１３日出願）［６０］）。抗ＶＬＡ４抗体の投与は、アレルギー性ヒツジにおいて、後期応答及び気道応答過剰の両者を阻止した。驚くべきことに、抗ＶＬＡ４の投与は、好中球及び好酸球が共にそれらを肺組織へ補充することの出来る別の接着経路を有するにもかかわらず、アレルゲンチャレンジの後４時間で肺の好中球及び好酸球の両者の数の減少へと導いた。やはり驚くべきことには、治療されたヒツジにおける応答過剰の阻止は、白血球（好中球及び好酸球を含む）の浸潤が有意に減少しなかったにもかかわらず、１週間継続して観察された。ＶＬＡ４媒介の接着モデルは又、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の霊長類モデルにおいても研究されている（Lobb，米国特許第０７／８３５，１３９号（１９９２年２月１２日出願）［６１］）。抗ＶＬＡ４抗体の投与は、そのモデル（ヒトの潰瘍性大腸炎に匹敵）において、驚くベき程有意に急性炎症を低減させた。更に最近、抗ＶＬＡ４抗体は、Papyannopoulou，米国特許第０７／８３５，１３９号（１９９２年２月１２日出願）［６２］に記載されたように、造血幹細胞を含むＣＤ３４⁺細胞の末梢化方法において利用された。こうして、ある種のエピトープ特異性及びある種の結合アフィニティーを有する抗ＶＬＡ４抗体は、喘息及びＩＢＤを含む種々の炎症状態において治療上有用であり得る。特に、かかる抗ＶＬＡ４抗体のヒト化組換えバージョンは、もしそれらを構築することが出来れば、ヒトに投与するために特に有用であり得る。かかるヒト化抗体は、所望の効能及び特異性を有し、同時に、抗体を無効にし及び／又は望ましくない副作用を起こす免疫応答を回避若しくは最小にする。発明の要約本発明は、組換え抗ＶＬＡ４抗体分子を構築する方法を提供する。特に、本発明による組換え抗体は、抗ＶＬＡ抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域から導いた抗原結合領域を含む。本発明は、第１ステップとしてＣＤＲグラフト若しくは「再成形」技術を用いるヒト化組換え抗体分子の構築のための方法を提供する。特に、本発明によるヒト化抗体は、ＶＬＡ４に対する特異性及び抗原結合部位を有する。ここに、この可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つ以上はドナーの非ヒト抗ＶＬＡ４抗体から導かれ、ドナー抗体の結合特異性を維持するためにアクセプター抗体重鎖及び／又は軽鎖可変フレームワーク領域の最小の変化を有するか又は有し得ない。好ましくは、これらのＣＤＲグラフト重鎖可変ドメインの抗原結合領域は、３１〜３５位（ＣＤＲ１）、５０〜６５位（ＣＤＲ２）及び９５〜１０２位（ＣＤＲ３）に対応するＣＤＲを含む。好ましくは、これらのＣＤＲグラフト軽鎖可変ドメインの抗原結合領域は、２４〜３４位（ＣＤＲ１）、５０〜５６位（ＣＤＲ２）及び８９〜９７位（ＣＤＲ３）に対応するＣＤＲを含む。これらの残基の指示は、Kabatの番号付け（Kabat等、1991［15］）に従って番号を付けた。従って、残基／位置指示は、配列表に示したアミノ酸残基の直線的番号付けと常に直接対応はしない。ここに開示するヒト化Ｖ_K配列の場合には、Kabatの番号付けは、実際に、配列表に示したアミノ酸残基の直線的番号付けに対応する。対照的に、ここに開示するヒト化Ｖ_H配列の場合には、Kabatの番号付けは、配列表に示したアミノ酸残基の直線的番号付けと対応しない（例えば、配列表に開示したヒト化Ｖ_H領域について、ＣＤＲ２＝５０〜６６、ＣＤＲ３＝９９〜１１０）。この発明は、更に、検出可能に標識された組換えのヒト化抗ＶＬＡ４抗体を提供する。この発明は、更に、本発明の組換えのヒト化抗ＶＬＡ４抗体を発現し得る組換えＤＮＡ分子を提供する。この発明は、更に、本発明の組換えのヒト化抗ＶＬＡ４抗体を産生し得る宿主細胞を提供する。この発明は、更に、本発明の組換えのヒト化抗ＶＬＡ４抗体に係る診断及び治療用途に関係する。この発明は、更に、ヒトを含む哺乳動物患者における特異的防御系の応答から生じた炎症を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に炎症を抑えるのに十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、該抗炎症剤が本発明の組換えのヒト化抗ＶＬＡ４抗体である、上記の方法を提供する。この発明は、更に、ヒトを含む哺乳動物患者における非特異的炎症を、組換えのヒト化抗ＶＬＡ４抗体を用いて治療するための方法を提供する。この発明は、更に、本発明の組換えのヒト化抗ＶＬＡ４抗体をマウスモノクローナル抗体ＨＰ１／２から導く上記の方法の具体例に関係する。発明の特定の具体例の詳細な説明モノクローナル抗体を生成するための技術は周知である。簡単に言えば、不滅細胞系統（典型的には、ミエローマ細胞）を、所定の抗原例えばＶＬＡ４を発現している全細胞で免疫化した哺乳動物からのリンパ球（典型的には、脾臓細胞）と融合させ、その結果生成したハイブリドーマ細胞の培養上清をその抗原に対する抗体についてスクリーニングする（Kohler等、1975［1］を参照されたい）。免疫化は、標準的手順を用いて達成することが出来る。単位投与量及び免疫化管理（regimen）は、免疫化すべき哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重等に依存する。典型的には、免疫化哺乳動物から採血し、各血液試料からの血清を、適当なスクリーニングアッセイを用いて特定の抗体についてアッセイする。例えば、抗ＶＬＡ４抗体を、¹²⁵Ｉ標識したＶＬＡ４発現細胞からの細胞溶解物の免疫沈降によって同定することが出来る（Sanchez-Madrid等、1986［55］及びHemler等、1987［39］）。抗ＶＬＡ４抗体は又、フローサイトメトリーにより、例えばＶＬＡ４を認識すると考えられる抗体と共にインキュベートしたRamos 細胞の蛍光染色を測定することによって同定することが出来る（Elices等、1990 ［45］を参照）。典型的には、ハイブリドーマ細胞の生成に用いるリンパ球を、免疫化した哺乳動物（その血清が抗ＶＬＡ４抗体の存在について陽性であることをかかるスクリーニングアッセイを用いて既に試験してある動物）から単離する。典型的には、不滅細胞系統（例えば、ミエローマ細胞系統）をリンパ球と同一の哺乳動物種から誘導する。好適な不滅細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のマウスミエローマ細胞系統である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞を、１５００分子量のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ１５００」）を用いてマウス脾臓細胞と融合する。次いで、融合の結果生成するハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択する。該培地は、未融合ミエローマ細胞及び非生産的に融合したミエローマ細胞を殺す（未融合脾臓細胞は、トランスフォームされていないので数日後に死ぬ）。所望の抗体を産生するハイブリドーマを、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出する。例えば、抗ＶＬＡ４抗体の産生用に調製したハイブリドーマを、組換えα₄ サブユニット発現細胞系統例えばトランスフェクトしたＫ−５６２細胞に結合する能力を有する分泌された抗体についてハイブリドーマ培養上清を試験することによってスクリーニングすることが出来る（例えば、Elices等、1990［45］を参照）。抗ＶＬＡ４抗体を生成するために、かかるスクリーニングアッセイで試験して陽性であったハイブリドーマ細胞を、栄養培地で、ハイブリドーマ細胞にモノクローナル抗体を培養培地中に分泌させるのに十分な条件及び期間で培養する。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術及び培養培地は周知である。調整したハイブリドーマ培養上清を集めて、更に適宜、抗ＶＬＡ４抗体を周知の方法によって精製することが出来る。或は、所望の抗体を、ハイブリドーマ細胞を非免疫化マウスの腹膜腔に注入することによって生成することが出来る。ハイブリドーマ細胞は、腹膜腔内で増殖して抗体を分泌し、それは腹水液として蓄積される。この抗体を、腹水液を腹膜腔から注射器で回収することによって採取することが出来る。幾つかの抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体が、以前に記載されている（例えば、 Sanchez-Madrid等、1986［55］；Hemler等、1987［39］；Pulido等、1991［54］を参照）。例えば、ＨＰ１／２は、かかるＶＬＡ４を認識するマウスモノクローナル抗体の一つである。ＶＬＡ４は、プラズマフィブロネクチン及びＶＣＡＭ− １に対する白血球レセプターとして働く。他のモノクローナル抗体例えばＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５及びＰ４Ｃ２は、やはりＶＬＡ４を認識することが記載されている。ここでは、重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインのＣＤＲがマウスＨＰ１／２配列から導かれた組換え抗体を構築して説明する。本発明による組換えヒト化抗体を構築するための好適な出発物質は、抗ＶＬＡ４抗体例えばＨＰ１／２（これは、ＶＬＡ４がＶＣＡＭ１及びフィブロネクチンの両者と相互作用するのをブロックする）等である。更に、特に、細胞凝集を引き起こさないＨＰ１／２等の抗体が好適である。幾つかの抗ＶＬＡ４ブロッキング抗体は、かかる凝集を引き起こすことが観察された。ＨＰ１／２ＭＡｂ（Sanchez-Madrid，1986［55］）は、極度に高い効力を有し、ＶＬＡ４のＶＣＡＭ１及びフィブロネクチンの両者との相互作用をブロックするが、細胞凝集を引き起こさず、且つ、ＶＬＡ４上のエピトープに対する特異性を有するので、ヒト化のための特に優れた候補である。初期の実験において、Ｖ_H及びＶ_KＤＮＡが、ＨＰ１／２産生ハイブリドーマ細胞系統から単離されてクローン化された。ヒト化のための可変ドメインフレームワーク及び定常ドメインを、初期には、ヒト抗体配列から導いた。重鎖及び軽鎖の両方にある３つのＣＤＲは、構造研究から抗原結合に関与することが示された残基からなる。理論的には、もし、マウスＨＰ１／２抗体のＣＤＲをヒトのフレームワークにグラフトしてＣＤＲグラフト可変ドメインを形成し、この可変ドメインをヒト定常ドメインに結合したならば、その結果生成するＣＤＲグラフト抗体は、本質的に、ヒトＶＬＡ４に結合するマウスＨＰ１／２の特異性を有するヒト抗体である。この抗体が高度に「ヒト」特性を有するならば、患者に投与した場合に、マウスＨＰ１／２より遥かに少ない免疫原性しか有しないことが期待される。しかしながら、ＣＤＲのみがヒトフレームワークにグラフトされたＣＤＲグラフトＨＰ１／２抗体の抗原結合について試験したところ、これは、ＶＬＡ４抗原に対する妥当なアフィニティーを有するＣＤＲグラフト抗体を産生しなかったことが示された。従って、ＣＤＲ及び臨界的フレームワーク残基の幾つかに隣接する更なる残基がヒトから対応するマウスＨＰ１／２残基へ置換されることが、マウスＨＰ１／２ＭＡｂの結合アフィニティーの１０〜１００％の範囲の結合アフィニティーを有する抗体を生成するために必要であることが決定された。経験的に、Ｖ_H及びＶ_Kのフレームワーク領域内の１つ以上の残基を変化させて、所望の特異性及び効力を有するが、ヒト化Ｖ_H及びＶ_K領域配列の本質的にヒトの性質を危うくすることのないように、ヒトフレームワーク内にそれ程多くの変化を有しない抗体を調製した。更に、ここに記載した組換え抗ＶＬＡ４抗体からＶＬＡ４結合性断片例えばＦ ab、Ｆab'、（Ｆab'）₂及びＦ（ｖ）断片を調製することが出来；重鎖モノマー若しくはダイマー；軽鎖モノマー若しくはダイマー；並びに一の重鎖と一の軽鎖とからなるダイマーも又、ここで企図される。かかる抗体断片は、化学的方法、例えば無傷の抗体をペプシン若しくはパパイン等のプロテアーゼで開裂させることにより、又は組換えＤＮＡ技術により、例えば切り詰めた重鎖及び／若しくは軽鎖遺伝子でトランスフォームした宿主細胞を用いることによって生成することが出来る。重鎖及び軽鎖モノマーは、同様に、無傷の抗体を還元剤例えばジチオスレイトール若しくはβ−メルカプトエタノールで処理するか又は所望の重鎖若しくは軽鎖又はその両方をコードするＤＮＡでトランスフォームした宿主細胞を用いることによって生成することが出来る。下記の実施例は、この発明のある好適具体例を更に説明することを意図するものであり、特性を制限することを意図するものではない。下記の実施例において、必要な制限酵素、プラスミッド並びにその他の試薬及び材料は、市販品から得ることが出来、クローニング、ライゲーション及び他の組換えＤＮＡ技術は、当業者に周知の手順によって達成することが出来る。実施例１マウス抗ＶＬＡ４可変領域をコードするＤＮＡ配列の単離Ａ．ＨＰ１／２重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの単離ＶＬＡ４に対する特異性を有するヒト化組換え抗体をデザインするためには、マウスＨＰ１／２重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列を決定することが第１に必要である。この配列は、Tempest等、1991［5］にて参照された方法によって細胞質ＲＮＡから合成された重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡから決定された。１．細胞及びＲＮＡの単離細胞質ＲＮＡ（〜２００μｇ）をFavaloro等、1980［63］の方法によって、１５０ｃｍ²フラスコ中の準コンフルエントのＨＰ１／２産生ハイブリドーマ細胞（約５×１０⁵対数期細胞）から調製した。これらの細胞をペレット化して上清を抗体の存在について、Inno-Liaマウスモノクローナル抗体イソタイピングキット（ベルギー、Antwerp，Innogenetics）を用いて固相ＥＬＩＳＡによってアッセイした（カッパー結合体及びラムダ結合体の両者を使用）。抗体をこの方法によってＩｇＧ１／κであることを確認した。２．ｃＤＮＡ合成ｃＤＮＡをＨＰ１／２ＲＮＡから、マウスＩｇＧ１ＣＨ₁又はマウスカッパー定常ドメインの５’末端に基づくプライマーから開始する、１μｌ／５０μｌ Pharmacia（英国、Milton Keynes）RNA Guard（商標）及び２５０マイクロモルのｄＮＴＰを含む逆転写酵素緩衝液中の約５μｇＲＮＡ及び２５ｐモルプライマーを用いる逆転写によって合成した。これらのプライマーＣＧ１ＦＯＲ及びＣＫ２ＦＯＲの配列をそれぞれSEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:2として示す。この混合物を７０℃まで加熱し、次いでゆっくり室温まで冷却する。次いで、１００単位／５０μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（LifeTechnologies，英国、Paisley在）を加え、反応を４２℃で１時間進行させた。３．Ｖ_H及びＶ_KｃＤＮＡの増幅マウスＭＡｂ可変領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、例えばアンカードＰＣＲ又は保存配列に基づくプライマー等の手順の変法を用いて達成することが出来る（Orlandi等、1989［64］を参照されたい）。Orlandi等、［64］，Huse 等、1989［65］並びにJones及びBendig，1991［66］は、幾つかの可変領域プライマーを記載している。しかしながら、我々は、かかるプライマーの多く特にＨＰ１／２誘導したＶ_K配列の軽鎖ＰＣＲに対するものを用いて成功していない。ＨＰ１／２ＩｇＶ_H及びＶ_KｃＤＮＡを、Saiki等、1988［67］及びOrlandl i等、1989［64］により記載されたＰＣＲによって増幅した。反応を、２．５単位／５０μｌのAmplitaq（商標）ポリメラーゼ（コネチカット、Norwalk在、Perkin El mer Cetus）を用いて、９４℃で３０秒の後の５５℃で３０秒及び７５℃で４５秒のサイクルを２５回行なった。最終サイクルの後に、７５℃で５分間インキュベートした。ｃＤＮＡ合成に用いたのと同じ３’オリゴヌクレオチドを、各Ｖ領域の５’末端の比較的保存された領域のコンセンサス配列に基づく適当な５’オリゴヌクレオチドと共に用いた。Ｖ_HｃＤＮＡを、プライマーＶＨ１ＢＡＣＫ［SEQ ID N0:3］及びＣＧ１ＦＯＲ［ SEQ ID NO:1］を用いて上首尾に増幅し、約４００ｂｐの増幅生成物を生成した。Ｖ_KｃＤＮＡを、プライマーＶＫ５ＢＡＣＫ［SEQ ID NO:4］及びＣＫ２ＦＯＲ［SEQ ID NO:2］を用いて上首尾に増幅し、約３８０ｂｐの増幅生成物を生成した。４．Ｖ_HＤＮＡのクローニング及び配列決定Ｖ_HＤＮＡの増幅用に用いたプライマーは、配列決定用ベクター中へのクローニングを容易にするＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含んでいる。一般的クローニング及びライゲーション技術は、Molecular Cloning，A Laborator y Manual 1982，［68］に記載されたものである。増幅したＤＮＡをＰｓｔＩで消化して内部ＰｓｔＩ部位をチェックし、内部ＰｓｔＩ部位を見出した。それ故、Ｖ_HＤＮＡをＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片及びＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてＭ１３ｍｐ１８及び１９中にクローン化した。２つの独立のｃＤＮＡ調製物からの生成したコレクションを、シーケナーゼ（商標）（United States Biochemi cals，米国、オハイオ、 Cleveland在）を用いて、ジデオキシ法（Sanger等、1977，［69］）によって配列決定した。約１００〜２５０ｂｐの範囲の配列を、２５クローンの各々から決定した。配列決定した４０００より多いヌクレオチドの内、３つのＰＣＲ誘導した過渡的突然変異が３つの分離したクローン中にあった。ＨＰ１／２Ｖ_HＤＮＡ配列及びその翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO :6に示す。最初の８アミノ酸が、ＰＣＲで用いられる５’プライマーによって指図されることは注意すべきである。コンピューター補助された比較は、ＨＰ１／２Ｖ_H［SEQ ID NO:5及び6］がファミリーＩＩＣのメンバーであることを示す（K abat等、1991［15］）。ＨＰ１／２Ｖ_H［SEQ ID NO:5及び6］とファミリーＩＩＣのコンセンサス配列との間の比較は、単に異常な残基がアミノ酸の８０、９８及び１２１位にあることを示した（Kabatの番号付けでは、７９、９４及び１２１位）。サブグループＩＩＣにおいてＴｙｒ８０が不変であるにもかかわらず、他の配列決定したマウスＶ_H領域は、この位置に他の芳香族アミノ酸を有する（但し、Ｔｒｐを有するものはない）。ヒト及びマウスのＶ_Hの大多数は、Kabatの位置９４にアルギニン残基を有する。ＨＰ１／２Ｖ_H中のＡｓｐ９４の存在は、極めて稀である（この位置で負に帯電した残基の報告例は１つしかない）。Kaba tの位置１１３のプロリンも又異常であるが、そのＣＤＲからの距離からして、ＣＤＲのコンホメーションにおいて重要であることはありそうもない。ＣＤＲ１を作っているアミノ酸は、３つの他の配列決定されたマウスＶ_H領域に見出された。しかしながら、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、ＨＰ１／２にユニークであり、如何なる他の報告されたマウスＶ_H中にも見出されない。５．Ｖ_KＤＮＡのクローニング及び配列決定Ｖ_KＤＮＡの増幅に用いたプライマーは、酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩに対する制限部位を含んでいる。プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ［SEQ ID NO:7］、ＶＫ５ＢＡＣＫ［SEQ IDNO:4］及びＶＫ７ＢＡＣＫ［SEQ ID NO:8］を用いて得たＰＣＲ生成物を精製してＭ１３中にクローン化した。信頼すべきカッパー配列は、ＶＫ５ＢＡＣＫ［SEQ ID NO:4］を用いてのみ得られた。約２００〜３５０ｂｐの領域の配列を、２つの独立のｃＤＮＡ調製物からの１０クローンの各々から、シーケナーゼ（商標）（United States Biochemica1s，米国、オハイオ、Clevel and在）を用いて、ジデオキシ法（Sanger等、1977，［69］）によって配列決定した。配列決定した２ｋｂより多くの内で、２つのクローンのみが、それぞれ、１つのＰＣＲ誘導された過渡的突然変異を含んでいた。ＨＰ１／２Ｖ_KＤＮＡ配列及びその翻訳された配列をそれぞれSEQ ID NO:9及び SEQ ID NO:10に示す。最初の４アミノ酸は５’ＰＣＲプライマーによって指図されたが、配列の残りはすべて部分的蛋白質配列データと一致する。ＨＰ１／２Ｖ_KＤＮＡ配列は、KabatのファミリーＶ（Kabat等、1991［15］）のメンバーであり、異常な残基は有しない。ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸残基はユニークである。ＣＤＲ２を作っているアミノ酸は、他のマウスＶ_Kにおいて報告されている。実施例２ＣＤＲグラフト抗ＶＬＡ４抗体のデザインＣＤＲグラフト抗ＶＬＡ４抗体をデザインするためには、マウスＨＰ１／２のどの残基が軽鎖及び重鎖のＣＤＲを含むのかを決定することが必要である。３つの超可変領域（一層変化の少ない可変フレームワーク配列の中にある）が軽鎖と重鎖の両方において見出されている（Wu及びkabat，1970［16］；Kabat等、1991［15］）。殆どの場合において、これらの超可変領域は、ＣＤＲに対応するが、それを超えて広がってもよい。マウスＨＰ１／２Ｖ_H及びＶ_K鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:10に示す。マウスＨＰ１／２のＣＤＲは、Kabat等、1991［15］により、他のＶ_H及びＶ_K配列との整列によって解明された。これらのマウスＨＰ１／２Ｖ_HのＣＤＲは、下記のように、同定され、ここに開示するヒト化Ｖ_H配列中で同定された残基に対応している：ＣＤＲ１ＡＡ₃₁〜ＡＡ₃₅ ＣＤＲ２ＡＡ₅₀〜ＡＡ₆₆ ＣＤＲ３ＡＡ₉₀〜ＡＡ₁₁₀ これらは、それぞれ、Kabatの番号付けにおけるＡＡ₃₁〜ＡＡ₃₅、ＡＡ₅₀〜ＡＡ₆ ₅ 及びＡＡ₉₅〜ＡＡ₁₀₂に対応している。マウスＨＰ１／２Ｖ_KのＣＤＲは、下記のように、同定され、ここに開示するヒト化Ｖ_K配列中で同定された残基に対応している：ＣＤＲ１ＡＡ₂₄〜ＡＡ₃₄ ＣＤＲ２ＡＡ₅₀〜ＡＡ₅₆ ＣＤＲ３ＡＡ₈₉〜ＡＡ₉₇ これらは、Kabatの番号付けにおける同じ番号のアミノ酸に対応している。従って、Ｖ_K（Ｖ_Hではない）の境界のみがKabatのＣＤＲ残基に対応した。ＨＰ１／２ＣＤＲを受容するために選択したヒトフレームワークは、重鎖及び軽鎖のそれぞれについてＮＥＷＭ及びＲＥＩであった。ＮＥＷＭ及びＲＥＩ配列は、Kabat 等、1991［15］に公開されている。ヒト化方法の初期ステージは、文献から予想され得る最小のフレームワーク変化の基礎的ＣＤＲグラフトを含み得る。例えば、Riechmann等、1988［4］において、ＭＡｂＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈは、元のマウス抗体の結合効率と類似の結合効率を有する抗体を得るために必要な唯一つのフレームワーク変化を有する直接ＣＤＲグラフトを用いて上首尾にヒト化された。このフレームワーク変化は、２７位のＳｅｒのＰｈｅでの置換であった。しかしながら、ＣＤＲグラフトによる同じヒト化ストラテジー及び他の特異性を有するヒト化抗体の調製のためにRiechmann等、1988［4］により発見された単一フレームワーク変化を用いることは、マウス抗体に匹敵するアフィニティーを有する抗体を生成しなかった。かかる場合において、ヒト化方法は、所望の特異性及び効力を達成するために、必然的に、更なる経験的変化を含む。かかる変化は、出発マウス抗体のユニーク構造及び配列に関係し得るが、他の異なる特異性及び配列の抗体に基づいて予想することは出来ない。例えば、SEQ ID NO:6に示したＨＰ１／２からのマウスＶ_Hアミノ酸配列の他の公知の配列と比較しての分析は、残基７９、９４及び１１３（Kabatの番号付け）が異常であることを示した。勿論、Ａｓｐ９４がＣＤＲコンホメーションにおいて重要であることはありそうなことである。配列決定した殆どのＶ_H領域は、この位置にアルギニンを有し、それは、ＣＤＲ３中の比較的保存されたＡｓｐ１０１と塩橋を形成することが出来る。ＭＥＷＭがＡｒｇ９４を有し、ＨＰ１／２のＶ_HＣＤＲ３がＡｓｐ１０１を有するので、通常は生じない塩橋が形成される可能性が残る。９４位の負に帯電した残基の存在は非常に異常であり、それ故、推定のヒト化Ｖ_H中にＡｓｐ９４を含むことが決定された。キメラ（マウスＶ／ヒトＩｇＧ１／κ）ＨＰ１／２抗体は、（i）その抗原結合能力が正確なＶ領域がクローン化されたことを示し、（ii）本発明により調製した種々のヒト化抗体のアッセイにおいて有用な対照として働き得るので有用であり得るが、ＣＤＲグラフト構築物の調製の初期ステージにおいて必要な中間体ではない。Ｖ_Hについては、完全長のＨＰ１／２Ｖ_Hを含むＭ１３クローンを、それぞれＶ_H ドメインの５’及び３’末端にＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ部位を含むＶＨ１ＢＡＣＫ［SEQ ID NO:3］及びＶＨ１ＦＯＲ［SEQ ID NO:11］を用いて増幅した。増幅ＤＮＡをＢｓｔＥＩＩで切断し且つＰｓｔＩで部分的に切断し、完全長ＤＮＡを精製して、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩで切断してあるＭ１３ＶＨＰＣＲ１中にクローン化した（Orlandi等、1989［64］）。Ｖ_Kについては、完全長のＨＰ１／２Ｖ_Kを含むＭ１３クローンを、ＶＫ３ＢＡＣＫ［SEQ ID NO:12］及びＶＫ１ＦＯＲ［SEQID N0:13］を用いて増幅してＰｖｕＩＩ及びＢｇｌＩＩ部位をそれぞれＶ_Kドメインの５’及び３’末端に導入した。増幅したＤＮＡをＰｖｕＩＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、ＰｖｕＩＩ及びＢｃ１ＩＩで切断しておいたＭ１３ＶＫＰＣＲ１（Orlandi等、1989［64］）中にクローン化した。要するに、これらのマウスＶH及びＶ_K領域の増幅用に用いた５’プライマーは、発現ベクター中にクローニングするのに便利な制限部位を含んでいる。このＰＣＲに用いた３’プライマーは、定常領域からのものであった。可変領域の３’ 末端の制限部位を、クローン化マウス可変領域遺伝子内に、ＢｓｔＩＩ又はＢｇ１ＩＩ部位を重鎖及び軽鎖（カッパー）可変領域内にそれぞれ導入したＰＣＲプライマーを用いて導入した。更に、Ｖ_Hプライマーは、Ｐｒｏ１１３をＳｅｒに変えた。マウスＶ_H及びＶ_KＤＮＡを、ｇｐｔ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むベクター（例えばOrlandi等、［64］に記載されたｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｈｙｇ等）中にクローン化し、適当なヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ４若しくはκ定常領域を、例えばTakahashi等、1982［70］，Flanagan及びRabbitts，1982［71］，及びHie ter等、1980［72］により記載されたようにして、それぞれ加えた。これらのベクターでミエローマＹＢ２／０を同時トランスフェクトしてミコフェノール酸耐性クローンをキメラＩｇＧ／κ抗体の分泌についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。このＹＢ２／０細胞系統は、Kilmartin等、1982［73］により記載されたものであり、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）メリーランド、Ro ckville在）から入手することが出来る。ＥＬＩＳＡ陽性のクローンを広げ、培養培地からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。トランスフェクトした細胞から精製したキメラ抗体を、ＶＬＡ４抗体活性について実施例７に記載のようにしてアッセイしてマウスＨＰ１／２抗体と等しい効力であることが見出された。実施例３ＣＤＲ配列の移植及び選択したフレームワーク残基の突然変異誘発ＣＤＲのヒトフレームワーク中への移植を、Ｍ１３突然変異誘発ベクターを用いて実施した。実施例２で概説したＣＤＲ配列を受容するために選択したヒトフレームワークをＮＥＷＭ（Ｖ_H用）及びＲＥＩ（Ｖ_K用）から導いた（各々、Ｍ１３突然変異誘発ベクター中）。Ｖ_H及びＶ_Kについて用いるＭ１３突然変異誘発ベクターは、それぞれ、Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１及びＭ１３ＶＫＰＣＲ２であった。Ｍ１３ＶＫＰＣＲ２は、Orlandi等、1989［64］に記載されたように、Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１と同一である。但し、バリン（GTG）からグルタミン（GAA）への単一アミノ酸変化が、ＲＥＩＶ_Kコード配列のフレームワーク４にある。Orlandi等、 1989［64］により記載されたＭ１３ＶＨＰＣＲ１は、抗ハプテン（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチルカプロン酸）抗体から導かれたＣＤＲを有するＮＥＷＭフレームワーク配列であるＶ_H領域に対するコード配列を含むＭ１３である。これらの無関係のＶ_HＣＤＲを、下記のように、位置指定突然変異導入法によって、ＨＰ１／２Ｖ_Hから導いたＣＤＲで置換する。Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１によりコードされたＶ_H領域の配列（ＤＮＡ及びアミノ酸）をSEQ ID NO:14及び15 として示す。Ｍ１３ＶＫＰＣＲ２は、Orlandi等、［64］により記載されたＭ１３ＶＫＰＣＲ１と同様に、抗リゾチーム抗体から導いたＣＤＲを有するＮ末端修飾ＲＥＩフレームワーク配列であるＶ_K領域に対するコード鎖を含むＭ１３である。これらの無関係のＶ_KＣＤＲを、下記のように、位置指定突然変異導入法によって、ＨＰ１／２Ｖ_Kから導いたＣＤＲで置換する。Ｍ１３ＰＣＲ２によってコードされたＶ_K領域の配列（ＤＮＡ及びアミノ酸）を、SEQ ID NO:16及び17として示す。合成オリゴヌクレオチドを、それぞれＮＥＷＭ及びＲＥＩフレームワークから引き出された短い配列に隣接したＨＰ１／２誘導されたＶ_H及びＶ_KＣＤＲを含んで合成し、下記のように、オリゴヌクレオチド位置指定突然変異導入法によってヒトフレームワーク中にグラフトした。ヒトＶ_Hフレームワーク中へのＣＤＲグラフトのために、突然変異導入用オリゴヌクレオチド５９８［SEQ ID N0:18］、５９９［SEQ ID NO:19］及び６００［SEQ ID NO:20］を用いた。ヒトＶ_Kフレームワーク中へのＣＤＲグラフトのために、突然変異導入用オリゴヌクレオチドは、６０５［SEQ ID N0:21］、６０６［SEQ ID NO:22］及び６０７［SEQ ID NO:23 ］であった。５μｇのＶ_H又はＶ_K一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３中）に、２倍モル過剰の各３つのＶ_H若しくはＶ_Kリン酸化オリゴヌクレオチドを、Ｍ１３配列に基づく隣接プライマー、オリゴ１０［SEQ ID NO:24］（Ｖ_H用）及びオリゴ３８５［SEQ I D NO:25］（Ｖ_K用）と共に加えた。プライマーを、７０℃まで加熱し、３７℃までゆっくりと冷却することによってテンプレートにアニールさせた。このアニールしたＤＮＡを、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、２５０ μＭｄＮＴＰ中で、２．５単位のＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（United States Bi ochemicals）及び１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Life Technologies）を用いて伸長させ且つライゲーションさせた（５０μｌの反応容積で、１６℃にて、１〜２時間）。新たに伸長させた突然変異導入鎖を、１単位のVentＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）及び２５ｐモルのオリゴ１１［SEQ ID NO:26］若しくはオリゴ３９１［SEQ ID NO:27］（それぞれ、Ｖ_H若しくはＶ_K用）（１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％トリトンＸ−１００、２５μＭｄＮＴＰ中）（反応容積５０μｌ）を用い且つ、試料を９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；７５℃、９０秒の３０サイクルにかけることによって、優先的に増幅した。次いで、標準的ＰＣＲを、２５ｐモルのオリゴ１０［SEQ ID NO:24］（Ｖ_H用）又はオリゴ３８５［SEQ ID NO:25］（Ｖ_K用）を加えて、１０熱サイクルを行なうことによって実施した。生成物ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化してＭ１３ｍｐ１９中にクローン化した。一本鎖ＤＮＡを、個々のプラークから調製し、配列決定して３つの突然変異体を同定した。その結果生成したこのＤＮＡ配列を有するステージ１のＶ_H構築物及びその翻訳生成物を、それぞれ、SEQ ID NO:28及びSEQ ID NO:29として示す。このＣＤＲグラフトに加えて、ステージ１のＶ_H構築物は、フレームワーク変化を含んだ。ＣＤＲ１の直前で、配列の１ブロックをマウス残基Ｐｈｅ２７、Ａｓｎ２８、Ｉｌｅ２９及びＬｙｓ３０に変更した（SEQ ID NO:29のＡＡ₂₇〜ＡＡ₃₀をマウスＶ_H 配列［SEQ ID NO:6］のそれと比較されたい）。これは、ラットのＣＡＭＰＡＴＨ１−Ｈ抗体のヒト化（Riechmann等、1988［4］）において置換されたＰｈｅ− ２７を含んだが、次いで、マウス配列において見出される次の３残基を代用している。これらの４つの残基は、名目上はＣＤＲ１に含まれない（即ち、Kabatの意味において超可変ではない）が、構造的には、それらは、ＣＤＲ１ループの一部（即ち、構造的ループ残基）であり、従って、経験的には、ＣＤＲ１の一部として含まれる。更に、残基９４におけるＡｒｇからＡｓｐへの変更は、実施例２で論じた理論的根拠に基づいて行なった。ＣＤＲグラフトしたステージ１フレームワーク配列とＮＥＷＭフレームワークを比較する整列を表Ｉに示す。生成したこのＤＮＡ配列を有するＶＫ１（ＤＱＬ）構築物及びその翻訳生成物をそれぞれ SEQ ID NO:30及びSEQ ID NO:31に示す。ＣＤＲグラフトしたＶＫ１（ＤＱＬ）フレームワーク配列とＲＥＩフレームワークを比較する整列を表ＩＩに示す。ＣＤＲ置換したＶ_H（ステージ１）及びＶ_K（ＶＫ１）遺伝子をOrlandi等、198 9［64］による発現ベクター中にクローン化してｐＨｕＶＨＨｕＩｇＧ１、ｐＨｕＶＨＨｕＩｇＧ４及びｐＨｕＶＫＨｕＣＫと称するプラスミッドを生成した。ｐＨｕＶＨＨｕＩｇＧ１及びｐＨｕＶＨＨｕＩｇＧ４について、ステージ１Ｖ_H 遺伝子を、Ｉｇ重鎖プロモーター、適当なスプライス部位及び単一ペプチド配列と共に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩでの消化によって、Ｍ１３突然変異誘発ベクターから切り出し、Orlandi等［64］により記載されたｐＳｖｇｐｔ等の発現ベクター中にクローン化した（該ベクターは、マウスＩｇ重鎖エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、哺乳動物細胞中での選択のためのｇｐｔ遺伝子並びに大腸菌における複製及び選択のための遺伝子を含む）。次いで、Takahashi等、198 2［70］に記載されたヒトＩｇＧ１定常領域をＢａｍＨＩ断片として加えた。或は、Flanagan及びRabbitts，1982［71］により記載されたヒトＩｇＧ４構築物領域を加えた。ｐＨｕＶＫＨｕＣＫプラスミッドの、Orlandi等［64］に記載されたｐＳＶｈｙｇ等の発現ベクターを用いる構築は、本質的に、重鎖発現ベクターのそれと同じであった（但し、選択用のｇｐｔ遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）で置換し、Hieter，1980［72］に記載されたヒトカッパー鎖定常領域を加えた）。これらのベクターでラットミエローマＹＢ２／０を同時トランスフェクトし、ミコフェノール酸耐性クローンをヒトＩｇＧ／κ抗体の分泌についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＹＢ２／０細胞系統は、Kiｌmartin等、1982［73］により記載されたものであり、American Type Culture Collection （メリーランド、Rockville在、ATCC）から入手することが出来る。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを増大させて、抗体を培地からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。トランスフェクトした細胞を、実施例７に記載のようにして、抗ＶＬＡ４抗体活性についてアッセイする。実施例４ＣＤＲグラフト抗体の修飾上記の実施例２及び３に記載のような抗ＶＬＡ４抗体を生成するためのデザイン及び調製のステージの次に、更なる経験的修飾のステージを用いて上首尾にヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体を調製した。実施例３に記載のステージ１修飾は、我々の一次配列分析及び上首尾に抗体をヒト化する試みにおける経験に基づくものであった。ステージ２と称する次の修飾は、部分的に我々の３Ｄモデリングデータの分析に基づく経験的なものであった。Ｖ_H領域について、ステージ３と称する更なる修飾は、アフィニティーその他の抗体特性の任意の残存する欠点を修正するために経験的に為されたいわゆる「スキャニング」修飾であった。これらの幾つかのステージで為された修飾は、ヒト化抗ＶＬＡ４抗体のアフィニティーその他の所望の特性の最適化を目的とする種々のアミノ酸ブロックの経験的変更であった。種々のステージで為された修飾が何れも所望の特性を有する抗体を生じた訳ではない。１．更なる重鎖修飾ａ．ステージ２修飾Ｖ_Hフレームワーク内の更なる経験的変更を、コンピューターモデリングを利用して行ない、そのＤＮＡ配列を有するステージ２構築物及びその翻訳生成物を生成した（それぞれ、SEQ ID NO:32及びSEQ ID NO:33に示す）。ステージ１Ｖ_H 領域のコンピューターモデリングを用いて、我々は、ステージ２についてのフレームワーク内の単一変更（即ち、位置７５のＬｙｓ（Kabatの番号付け、即ちSEQ ID NO:33中の７６位）をＳｅｒで代用する）を為すことを決定した。この決定は、部分的に、Ｌｙｓ−７５がＣＤＲ１に位置してそのコンホメーションを変え得る可能性に基づくものであった。実施例３で記載したステージ１ＣＤＲグラフトＨｕＶＨを含むＭ１３ベクターを、２ステップＰＣＲ指示突然変異誘発のためのテンプレートとして用いた（Ho等、1989［74］により記載された重複／伸長法を使用）。第１ステップにおいて、２つの別々のＰＣＲをセットアップした。１つは、末端プライマーオリゴ１０［SEQ ID NO:24］及び所望の突然変異を含むプライマー６８４［SEQ ID N O:34］を用い、他は、反対の末端プライマーオリゴ１１［SEQ ID NO:26］及びプライマー６８３［SEQ ID NO:35］（これは、第１の突然変異誘発プライマーと相補的である）を用いた。このＰＣＲの最初の対の増幅生成物を、次いで、一緒に混合して、第２ＰＣＲステップを、末端プライマーオリゴ１０及び１１（それぞれ、SEQ ID NO:24及びSEQ ID NO:26）のみを用いて行なった。このＰＣＲの突然変異誘発した増幅生成物を、次いで、Ｍ１３ｍｐ１９中にクローン化して配列決定し、ＬｙｓからＳｅｒへの変化（ステージ２又は「Ｓ突然変異体」）を有する突然変異体を同定した。これは、ＨＰ１／２から導かれたヒト化重鎖における臨界的変化であることが判明した（実施例７参照）。しかしながら、本発明によるヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体の調製におけるこの臨界的変化は、他のヒト化抗体の調製において同様に臨界的である訳ではなかった。特に、上記と同じ合理的解釈及び分析を用いて、その場所における変化は、２種の異なる種の抗体のヒト化における有利な変化であることは見出されなかった。ＣＤＲグラフトしたステージ２フレームワーク配列の整列を、ＮＥＷＭ並びにステージ１配列と比較して、表Ｉに示す。ｂ．ステージ３修飾更なる経験的変更を、ステージ３構築物として作成した。ステージ３において、主として経験的理由のために、一連の５つの異なるアミノ酸のブロック変更を作成して効力を改善することを試みた。これらの構築物は、ＳＴＡＷ、ＫＡＩＴＡＳ、ＳＳＥ、ＫＲＳ及びＡＳと称する。すべては、ステージ２で変更した７５位のＳｅｒ（Kabatの番号付け）［SEQ ID NO:35の７６位］及び上記の他の変更を含む。これらの構築物の各々を、２ステップＰＣＲ指示突然変異誘発により、ステージ２のＳｅｒ突然変異体について上述したHo等、1989［74］の重複／発現法を用いて調製した。ＳＴＡＷについて、更なる変更は、７７位のＧｌｎからＴｈｒ、７８位のＰｈｅからＡｌａ及び７９位のＳｅｒからＴｒｐ（Kabatの番号付け）であった。これらの変更は、末端プライマーオリゴ１０［SEQ ID NO:24］及び１１［SEQ ID NO:26］を突然変異誘発プライマー７１３［SEQ ID NO:36］及び７１６［SEQ ID NO:37］と共に用いて達成した。ＳＴＡＷＶ_HＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:38及びSEQ ID NO:39に示す。更なる変更ＡｒｇからＬｙｓ（６６位）、ＶａｌからＡｌａ（６７位）、ＭｅｔからＩｌｅ（６９位）、ＬｅｕからＴｈｒ（７０位）及びＶａｌからＡｌａ（７１位）（Kabatの番号付け）を有するＫＡＩＴＡＳを、オリゴ１０［SEQ ID NO:2 4］及び１１［SEQ ID NO:26］をオリゴ７０６［SEQ ID NO:40］及び７０７［SEQ ID NO:41］と共にを用いて調製した。ＫＡＩＴＡＳＶ_HＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:42及びSEQ ID NO:43に示す。ＳＳＥは、更なる変更ＡｌａからＳｅｒ（８４位）及びＡｌａからＧｌｕ（８５位）（Kabatの番号付け）を有した（オリゴ１０及び１１をオリゴ７６８［SEQ ID NO:44］及び７６９［SEQ ID NO:45］と共にを用いて達成）。ＳＳＥＶ_HＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:46及びSEQ ID NO:47に示す。ＫＲＳは、更なる変更ＡｒｇからＬｙｓ（３８位）及びＰｒｏからＡｒｇ（４０位）（Ka batの番号付け）を有した（オリゴ１０［SEQ ID NO:24］及び１１［SEQ ID NO:2 6］並びにオリゴ７０４［SEQ ID NO:48］及び７０５［SEQ ID NO:49］の使用による）。ＫＲＳＶ_HＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ I D NO:50及びSEQ ID NO:51に示す。ＡＳは、オリゴ１０［SEQ ID NO:24］及び１１［SEQ ID NO:26］並びにオリゴ７４５［SEQ ID NO:52］及び７４６［SEQ ID N O:53］に由来する更なる変更ＶａｌからＡｌａを２４位（Kabatの番号付け）に有した。ＡＳＶ_HＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:54及びSEQ ID NO:55に示す。ＣＤＲグラフトしたステージ３フレームワーク配列の、ＮＥＷＭ、ステージ０（下記参照）、ステージ１及びステージ２配列との整列を表Ｉに示す。重要なことに、実施例７に示したように、ＳＴＡＷ及びＡＳヒト化抗体の効力は改善されたが、他方、ＫＡＩＴＡＳ及びＫＲＳヒト化抗体はより良い効力を有しなかった。これは、予想しえなかった。ｃ．逆（ステージ０）修飾ステージ１を生成するために作成した２８〜３０位（ＮＩＫ）及び９４位（Ｄ）の２ブロックの変更を、２８〜３０位（ＴＦＳ）、９４位（Ｒ）又は２７〜３０位（ＴＦＳ）と９４位（Ｒ）の両方において突然変異させてＮＥＷＭに戻した。これらの構築物は、それぞれ、ステージ０−Ａ、０−Ｂ及び０−Ｃと称した。これらの構築物の各々を、２ステップＰＣＲ指示突然変異誘発により、ステージ２のＳｅｒ突然変異体について上述したHo等、1989［74］の重複／伸長法を用いて調製した。ステージ０−Ａ及び０−Ｂは、ステージ１から生成し；ステージ０ −Ｃは、ステージ０−Ａから下記のようにして生成した。ステージ０−Ａについて、変更は、９４位のＡｓｐからＡｒｇであった。この変更は、末端プライマーオリゴ１０［SEQ ID NO:24］及び１１［SEQ ID NO:26］を突然変異誘発プライマー９１５［SEQ ID NO:56］及び９１７［SEQ ID NO:57］と共に用いて達成した。ステージ０−Ｂについて、変更は、２８〜３０位のＡｓｎ−Ｉｌｅ−ＬｙｓからＴｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒであった。これらの変更は、末端プライマー１０［SEQ ID NO:24］及び１１［SEQ ID NO:26］を突然変異誘発プライマー９１８［SEQ ID NO:58］及び９１９［SEQ ID NO:59］と共に用いることによって達成した。最後に、ステージ０−Ｃについては、変更は、ステージ０−Ａでの９４位のＡｓｐからＡｒｇへの変更に加えて、２８〜３０位のＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−からＴｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒであった。これらの変更は、ステージ０−Ｂ構築物について上述したのと同じ末端プライマー及び突然変異誘発プライマーを用いて達成した。２．軽鎖の修飾我々の経験において、ヒト化軽鎖は、一般に、僅かの修飾（それが必要である場合でも）しか必要としない。しかしながら、ヒト化抗ＶＬＡ４抗体の調製において、ＨＰ１／２の軽鎖は幾つかの経験的変更を必要とすることが明らかとなった。例えば、マウス軽鎖を有するステージ２構築物（Ｓｅｒ突然変異体）のヒト化重鎖は、マウスＨＰ１／２より約２．５倍効力が低かったが、他方、ヒト化軽鎖を有する同じヒト化重鎖は、約４倍効力が低かった。ステージ１ヒト化Ｖ_K構築物は、ＶＫ１（ＤＱＬ）と称し、そのＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:30及びSEQ ID NO:31に示す。ＤＱＬ突然変異は、Ｖ_K領域の初期クローニングにおいて用いたＰＣＲプライマーから生じた（実施例１参照）。別法をこの軽鎖に行なって、２つの突然変異体ＳＶＭＤＹ及びＤＱＭＤＹ（それぞれ、ＶＫ２及びＶＫ３）を生成した。ＳＶＭＤＹ突然変異体は、ＤＱＬ配列から、ＤＹ配列については、オリゴ１０［SEQ ID NO:24］及び１１［SEQ ID NO:26］を用いて、ＳＶＭ配列については、オリゴ６９７［SEQ ID NO:60］及び６９８［SEQ ID NO:61］を用いて調製した。ＶＫ２（ＳＶＭＤＹ）ＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:62及びSEQ ID NO:63に示す。ＤＱＭＤＹ配列は、末端プライマー１０［SEQ ID NO:24］及び１１［SEQ ID NO: 26］を突然変異誘発プライマー８０３［SEQ ID NO:64］及び８０４［SEQ ID NO:65］と共に用い、ＳＶＭＤＹ配列をテンプレートとして用いる２ステップＰＣＲ指示突然変異誘発によって、元のＲＥＩフレームワーク配列に戻した。ＶＫ３（ＤＱＭＤＹ）ＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:66及びSEQ ID NO:67に示す。アミノ末端における変更（ＳＶＭ対ＤＱＭ）は、無関係であり、マウス軽鎖のアミノ末端に関係する。他の２つの変更Ｄ及びＹを行なって効力を改善し、実際、実施例７に記載のように、そのようにした。ＣＤＲグラフトＤＱＬ（ＶＫ１）、ＳＶＭＤＹ（ＶＫ２）及びＤＱＭＤＹ（ＶＫ３）フレームワーク配列のＲＥＩ配列と比較した整列を表ＩＩに示す。ＡＳ突然変異体の重鎖を改善した軽鎖（ＳＶＭＤＹ）と結合させた場合、その結果生成するヒト化抗体は、表ＩＩＩに示すようにマウスＨＰ１／２と等しい効力であった。３．別のヒト化Ｖ_H及びＶ_K領域或は、ＨＰ１／２Ｖ_H領域［SEQ ID NO:5］に基づくヒト化Ｖ_H領域配列を調製することが出来る。かかる選択肢の一つは、Ｖ_H−ＰＤＬＮと称するものである。ＰＤＬＮＶ_HのＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:68及びSEQ ID NO:69に示す。更に、別のＨＰ１／２Ｖ_K領域［SEQ ID NO:9］に基づくヒト化Ｖ_K領域配列を調製することが出来る。かかる別のＶ_K配列の一つは、Ｖ_K−ＰＤＬＮと称するものであり、それとそれの翻訳アミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:70及びSEQ ID NO:71に示す。ヒト化Ｖ_H−ＰＤＬＮを、集合すると完全なヒト化可変領域にわたる１２オリゴヌクレオチドをライゲーションし、正確な配列を有する構築物についてスクリーニングすることによって調製した。そのプロトコールを下記に一層詳細に説明する。オリゴヌクレオチド３７０−１１９から３７０−１３０（それぞれ、SEQ ID N O:72からSEQ ID NO:83）（各２０ｐモル）を乾燥し、別々に、１ｍＭＡＴＰ及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ）を含む２０μｌの１ ×キナーゼ緩衝液に再懸濁した。キナーゼ反応混合物を、１時間３７℃でインキュベートした。反応を、７０℃で５分間インキュベートすることによって停止させた。キナーゼ処理したオリゴヌクレオチドを、互いに合わせて（全量２４０μｌ）、２６μｌの１０ｍＭＡＴＰ及び２μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ）を用いて互いにライゲーションし、その反応混合物を室温で６時間インキュベートした。このライゲーション反応混合物を、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、次いで、エタノール沈澱して７０％エタノールで５回洗った。乾燥して洗ったエタノール沈澱を、５０μｌの１× １５０ｍＭ制限酵素緩衝液（１０×１５０ｍＭ制限酵素緩衝液は、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ＭＮａＣｌ、１００ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍＭジチオスレイトールである）に再懸濁して、制限酵素ＢｓｔＥ２及びＰｓｔＩと共に１６時間３７℃でインキュベートした。消化生成物を、２％アガロースゲルを通して電気泳動し、３３０ｂｐに対応するバンドを切り出した。その断片をGENECLEAN II（登録商標）を用いて溶出し、溶出物をエタノール沈殿させた。このエタノール沈澱を２０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。次に、この３３０ｂｐ断片を、ベクターｐＬＣＢ７中にライゲーションした（該ベクターは、ライゲーション用にＰｓｔＩ及びＢｓｔＥ２で消化し、仔ウシアルカリホスファターゼで５’末端を脱リン酸化し、低融点アガロース（ＬＭＡ）ゲル上で分画し、そして、ｐＬＣＢ７／ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥ２ＬＭＡ断片を切り出すことにより調製したものである）。次いで、ｐＬＢＣ７ＬＭＡ断片をヒト化Ｖ_H領域をコードする３３０ｂｐオリゴヌクレオチド断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。このライゲーション混合物を用いて大腸菌ＪＡ２２１（Ｉｑ）をトランスフォームしてアンピシリン耐性にした。コロニーを成育させてミニプレップＤＮＡを調製した。組換えプラスミッドを、約４１３ｂｐのＮｏｔＩ／ＢｓｔＥ２断片の存在についてスクリーニングした。ＤＮＡ配列分析は、ベクターｐＭＤＲ１０２３を、デザインしたヒト化Ｖ_H−ＰＤＬＮ配列を有するとして同定した。ヒト化Ｖ_K−ＰＤＬＮを、集まると完全なヒト化Ｖ_K−ＰＤＬＮ可変領域にわたる１２オリゴヌクレオチドをライゲーションし、正確な配列を有する構築物についてスクリーニングすることによって調製した。そのプロトコールを、下記に一層詳細に説明する。オリゴヌクレオチド３７０−１３１から３７０−１４２（それぞれ、SEQ ID N O:84からSEQ ID NO:5）（各２０ｐモル）を乾燥し、別々に、１ｍＭＡＴＰ及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位／μｌ）を含む２０μｌの１×キナーゼ緩衝液に再懸濁した。このキナーゼ反応混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。反応を、７０℃で５分間インキュベートすることによって停止した。キナーゼ処理したオリゴヌクレオチドを、互いに合わせて（全量２４０μｌ）、２６μｌの１０ｍＭＡＴＰ及び２μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１０単位／ μｌ）を用いて互いにライゲーションし、そして反応混合物を室温で６時間インキュベートした。ライゲーション反応混合物を、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、次いで、エタノール沈殿して７０％エタノールで５回洗った。乾燥して洗ったエタノール沈澱を、４０μｌのＴＥに再懸濁し、次いで、２％アガロースゲルを通して電気泳動して、３８０ｂｐに対応するバンドを切り出した。その断片をGENECLEAN II（登録商標）を用いて溶出し、溶出物をエタノール沈殿させた。このエタノール沈澱を、２０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。次に、この３８０ｂｐ断片を、ベクターｐＮＮ０３中にライゲーションした（該ベクターは、ライゲーション用に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで線状化し、仔ウシアルカリホスファターゼで５’末端を脱リン酸化し、低融点アガロースゲル上で分画して、線状化ｐＮＮ０３に対応するバンド（２．７ｋｂ）を切り出すことにより調製したものである）。この線状化した脱リン酸化ｐＮＮ０３を、次いで、ヒト化Ｖ_K領域をコードする３８０ｂｐのオリゴヌクレオチド断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。このライゲーション混合物を用いて大腸菌ＪＡ２２１（Ｉｑ）をトランスフォームしてアンピシリン耐性にした。コロニーを成育させて、ミニプレップＤＮＡを調製した。組換えプラスミッドを、可変領域断片の存在についてスクリーニングした。ＤＮＡ配列分析は、ベクターｐＭＤＲ１０２５を、デザインしたヒト化Ｖ_K−ＰＤＬＮ配列を有するとして同定した。Ｖ_H−ＰＤＬＮを含む重鎖及びＶ_K−ＰＤＬＮを含む軽鎖を有する抗体を、実施例７に従って、効力についてアッセイしたところ、生成したヒト化抗体は、マウスＨＰ１／２抗体とほぼ等しい効力であった。実施例５組換え抗ＶＬＡ４抗体の発現実施例１〜４によって調製したＶ_H領域配列及びＶ_K領域配列の各々を、定常領域配列と共に、発現ベクター中にトランスファーし、それらのベクターで、好ましくは電気穿孔法によって、哺乳動物細胞をトランスフェクトする。これらの重鎖及び軽鎖配列は、別個のベクター上にコードされて細胞に同時トランスフェクトしてもよいし、或は、重鎖及び軽鎖配列を単一ベクターでコードしてトランスフェクトしてもよい。かかる単一ベクターは、３つの発現カセット（１つはＩｇ重鎖用、１つはＩｇ軽鎖用、そして１つは選択マーカーである）を含む。抗体の発現レベルを、トランスフェクション後、下記のように又は実施例７に記載のようにして測定する。Ｖ_H及びＶ_K領域配列を、実施例４に記載のようにして、種々のクローニングベクター及び発現ベクター中に挿入した。抗ＶＬＡ４Ｖ_H領域配列について、かかる配列［実施例１〜４に記載のもの］を含むプラスミッドをＰｓｔＩ及びＢｓｔＥ２で消化した。ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥ２での消化後のプラスミッドＤＮＡを脱リン酸化して２％アガロースゲルを通して電気泳動した。ライゲーシヨン用のバンドを切り出し、ＤＮＡを、GENECLEAN（商標）技術（カリフォルニア、LaJolla在、Bio 101 Inc．）を用いて溶出し、エタノール沈殿させ、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁した。次いで、１０μｌの再懸濁したＤＮＡを、ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥ２消化したＶ_H領域配列とのライゲーション用に用いた。このライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１（Ｉｑ）をトランスフォームしてアンピシリン耐性にした。大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１（Ｉｑ）細胞は、ＡＴＣＣに寄託してある（受託番号６８８４５）。組換え体コロニーを、Ｖ_H 挿入物の存在についてスクリーニングした。かかる断片を含むプラスミッドの幾つかを配列決定した。これらのＶ_H含有プラスミッドを、ｐＢＡＧ１８４（Ｖ_H −ＳＴＡＷ）、ｐＢＡＧ１８３（Ｖ_H−ＫＡＩＴＡＳ）、ｐＢＡＧ１８５（Ｖ_H− ＫＲＳ）、ｐＢＡＧ２０７（Ｖ_H−ＳＳＥ）及びｐＢＡＧ１９５（Ｖ_H−ＡＳ）と呼び、大腸菌Ｋ１２Ｊ２２１（Ｉｑ）にて、ＡＴＣＣに、受託番号、それぞれ、６９１１０、６９１０９、６９１１１、６９１１６及び６９１１３として寄託した。別のＶ_H−ＰＤＬＮ領域を含むプラスミッドは、ｐＭＤＲ１０２３と称した。Ｖ_K領域配列について、これらの配列をコードするＤＮＡを、ＰＣＲを利用して、クローニング及びトランスフォーメーションのために増幅した。増幅の前に、２０ｐモルの各Ｖ_K鎖プライマーを、従来のプロトコールに従って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと３７℃で６０分間インキュベートすることによってキナーゼ処理した。キナーゼ反応を、７０℃に１０分間加熱することにより停止させた。これらのＰＣＲ反応物は、それぞれ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液を含んだ（１０×ＰＣＲ緩衝液は、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、各２０ｐモルの適当なキナーゼ処理したプライマー、２０μｌのｃＤＮＡ、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（５単位／μｌ、Perkin Elmer-Cetus製）及び４９．５μｌのＨ₂Ｏである）。ＰＣＲ条件は、９４℃で１分間；４０℃（重鎖用ＰＣＲ）若しくは５５℃（軽鎖用ＰＣＲ）で２分間；及び７２℃で２分間のインキュベーションの３０サイクルであった。ＶＫ１−ＤＱＬについて、プライマーは、３７０−２４７［SEQ ID NO:96］及び３７０−２１０［SEQ ID NO:97］。ＶＫ２−ＳＶＭＤＹについて、プライマーは、３７０−２６９［SEQ ID NO:98］及び３７０−２１０［ SEQ ID NO:97］であった。ＶＫ３−ＤＱＭＤＹについて、プライマーは、３７０ −２６８［SEQ ID NO:99］及び３７０−２１０［SEQ ID NO:97］であった。これらの反応混合物を、２％アガロースゲルを通して電気泳動し、軽鎖可変領域の予想されるサイズ（〜３３０ｂｐ）に対応するバンドをＡｇｅＩ及びＢａｍＨＩを用いて切り出した。これらのバンド中のＤＮＡを、GENECLEAN（商標）技術（カリフォルニア、LaJolla在、Bio101 Inc．）を用いて溶出し、エタノール沈澱させて、続いて、各々を２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片（New England Biolabs，５単位／μｌ）（１μｌ）を、１×ライゲーション緩衝液（１０×ライゲーション緩衝液は、０．５Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＭｇＣｌ₂及び４０ｍＭＤＴＴ）及び０．１２５ｍＭの各ｄＸＴＰを含む２５μｌの反応物容積中の精製したＰＣＲ断片に加え、この反応物を室温で１５分間インキュベートした。反応を、７０℃に５分間インキュベートすることにより停止させ、次いで、氷上に貯蔵した。各ＰＣＲ反応からの断片を、ｐＮＮ０３等のプラスミッド又はｐＮＪ０３から誘導したプラスミッド例えばｐＬＣＢ７等にライゲーションする（これらは、前以てＥｃｏＲＶにより線状化し、脱リン酸化して低融点アガロースを通して分画しておく）。かかるｐＮＮ０３及びｐＬＣＢ７を含むプラスミッドは、同時係属中の及び同時譲渡された（Burkly等、米国特許第０７／９１６，０９８号（１９９２年７月２４日出願）［７５］）に記載されている。このライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１（Ｉｑ）をトランスフォームしてアンピシリン耐性にした。大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１（Ｉｑ）細胞は、American Type Culture Collectionに寄託されている（受託番号６８８４５）。組換え体コロニーを、Ｖ_K挿入物の存在についてスクリーニングした。かかる断片を含むプラスミッドの幾つかを配列決定した。これらのＶ_K含有プラスミッドをｐＢＡＧ１９０（ＶＫ１−ＤＱＬ）、ｐＢＡＧ１９８（ＶＫ２−ＳＶＭＤＹ）及びｐＢＡＧ１９７（ＶＫ３−ＤＱＭＤＹ）と呼び、大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１（Ｉｑ）細胞にて、それぞれ、受託番号６９１１２、６９１１５及び６９１１４としてＡＴＣＣに寄託した。別のＶ_K（ＰＤＬＮ）領域を含むプラスミッドは、ｐＭＤＲ１０２５と称した。一連の実験において、組換え抗ＶＬＡ４重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを電気穿孔法によるトランスフェクションに用い、次いで、細胞を４８時間培養する。４８時間の培養の後に、これらの細胞を、³⁵Ｓ−システインを用いて一晩放射性標識し、次いで、それらの細胞の抽出物及び調整した培地をプロテインＡ−セファロースと共にインキュベートすることによって免疫沈降させる。プロテインＡ−セファロースをＳＤＳ−ＰＡＧＥロード用緩衝液で洗い、結合した蛋白質を溶出する。これらの試料を、還元条件下の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析する。この方法において、軽鎖の発現は、重鎖と結合した結果としてのみ検出される。１０％ゲルで可視化したときの、重鎖及び軽鎖の予想サイズは、それぞれ、５０ｋＤ及び２５ｋＤである。実施例１〜４に記載のようにして調製した組換え抗ＶＬＡ４抗体分子は、種々の哺乳動物細胞系統において安定に発現されるので、組換え抗体遺伝子を、Ｉｇ遺伝子プロモーター及びエンハンサーの制御下で非分泌性ミエローマ若しくはハイブリドーマにて発現させ、或は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の非リンパ様細胞にて発現させることは可能である（ＤＨＦＲ選択を用いるベクター増幅と共に）。最近、Bebbington等、1992［76］は、グルタミンシンテターゼ遺伝子を増幅マーカーとして用いるミエローマ細胞からの組換え抗体の高レベル発現のための方法を記載した。このＧＳ発現系は、本発明の組換え抗ＶＬＡ４抗体分子の生成のために最も好適なものである。組換え抗体のＧＳ発現のための方法、ｈＣＭＶプロモーターを有するベクター及びｈＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子含有細胞系統（最も好ましくは、ＮＳＯ）に由来する５’ 非翻訳配列を有するベクター及び培地は、Bebbington等、1992［76］、ＷＯ８６／０５８０７［７７］、ＷＯ８７／０４４６２［７８］、ＷＯ８９／０１０３６［７９］及びＷＯ８９／１０４０４［８０］に詳細に記載されている。これらの刊行物の教示に従って、ＮＳＯ細胞を、ＶＨ−ＡＳ領域配列［SEQ ID NO:54］を有する重鎖配列及びＶＫ−ＳＶＭＤＹ配列［SEQ ID NO:66］を有する軽鎖配列と共にトランスフェクトして、マウスＨＰ１／２抗体に匹敵する高い効力を有するヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体を分泌する安定な細胞系統を得た。この細胞系統を、１９９２年１１月３日に、ＡＴＣＣに寄託して、受託番号ＣＲＬ１１１７５を付与された。このＡＳ／ＳＶＭＤＹヒト化抗体は、少なくとも、マウスのＨＰ１／２抗体と効力が等しいか、恐らくは一層高い効力を有する。実施例６アッセイ用調整培地からのＭＡｂの精製最大結合若しくは最大阻害の半分（half-maximal）の正確な値を得るためには、濃度既知の精製抗体のストック溶液が必要である。関心のある抗体を分泌する安定な細胞系統を作成して、ヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体を調整培地から慣用のプロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。精製した抗体の濃度を、それらの２８０ｎｍでの吸光度係数により評価した（これは、抗体について十分確立している）。ヒト化抗ＶＬＡ４抗体を産生する細胞系統をローラーボトル中で、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地にて生育させる。調整培地の２リットルバッチを各精製行程用に用いる。細胞を、ＲＣ−３Ｂ調製用遠心分離機（４Ｋ、３０分、Ｈ４０００ローター）での遠心分離によって培地から取り出し、上清を、先ず、０．４５μメンブレンを通して、次いで、０．２２μメンブレンを通して濾過する。この培地を、処理することが出来るまで４℃に貯蔵する。２リットルの調整培地を、S1Y30（YM30）Diafloカートリッジを取り付けたらせん式限外濾過ユニット（マサチューセッツ、Danvers，Cherry Hi ll Drive在、Amicon，Corp．）にて、２２０ｍｌまで濃縮する。濃縮物を、４００ｍｌのプロテインＡ結合緩衝液（３ＭＮａＣｌ、１．５Ｍグリシン、ｐＨ８．９）で希釈し、再び、２００ｍｌまで濃縮する。その濃縮物を、バッチ式で、混合物を攪拌するためのレイズド・スター・バーを用いて、０．５ｍｌのフアーストフロープロテインＡセファロース４（ニュージャージー、Piscataway，Centennial A venue 800在、Pharmacia Inc．）で処理する。一晩４℃でインキュベートした後、樹脂を遠心分離（５分間、５０ｇ）によって集めて２０容のプロテインＡ結合緩衝液で２回洗い（樹脂回収には遠心分離を使用）、そして、続く処理のためのカラムに移す。このカラムを、０．５ｍｌのプロテインＡ結合緩衝液で４回洗い、０．２５ｍｌのＰＢＳで２回洗い、そして、ＩｇＧをPierce IgG溶出緩衝液（イリノイ、Rockford在、Pierce Chemical Co.，Cat No．21004Y又は21009Y）を用いて溶出させる。１８０μｌの画分を集め、２０μｌの１ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で中和する。画分を、２８０ｎｍの吸光度及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。ゲルを、クーマシーブルーで染色する。ピーク画分をプールする。１００μｌ（１４ｍｌ／ｍｌ）を、１００μｌのＰＢＳで希釈して、ＰＢＳ中での Superose 6 FPLCカラム（ニュージャージー、Piscataway，Centennial Avenue 800在、 Pharmacia Inc．）でのゲル濾過にかける。このカラムでの処理は２０ｍｌ／時で行ない、１．５分の画分を集める。ピークのカラム画分をプールしてアリコートを採取し、ドライアイス上で凍結して−７０℃に保存する。最終生成物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルプロフィルを、還元条件及び非還元条件下で得る。幾つかの場合には、試料を非還元条件下で分析したときに、生成物の約１０％が無傷の抗体ではない。これらの場合の研究は、この生成物が重−軽鎖ダイマーであることを示している。これは、以前に、ＩｇＧ４抗体の問題として認められている。実施例７ヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体の相対的結合アフィニティーの決定本発明の組換え抗体を、実施例６に記載のようにして精製し、アッセイしてそれらのＶＬＡ４に対する特異性及び結合アフィニティー若しくは効力を決定する。特に、組換え抗ＶＬＡ４抗体の効力を、下記の２つの異なるアッセイを用いて、最大結合定数の半分（half-maximal binding constant）（精製抗体のｎｇ／ｍｌ又はμｇ／ｍｌとして報告）を計算することによって評価した。１．ＶＣＡＭ１へのＶＬＡ４依存性接着の阻止抗ＶＬＡ４抗体の臨界的機能は、ＶＣＡＭ１／ＶＬＡ４接着経路を阻止する能力により規定される。精製した組換えの可溶性ＶＣＡＭ１（ｒｓＶＣＡＭ１）はプラスチック上に固定化され得て、機能性接着分子であることが以前に示されている（Lobb等、1991a，［81］）。固定化ｒｓＶＣＡＭ１は、ＶＬＡ４発現細胞例えばヒトＢ細胞系統Ramos等に結合し、この結合は、ＶＣＡＭ１に対するＭＡｂ例えば４Ｂ９又はＶＬＡ４に対するＭＡｂ例えばＨＰ１／２によって阻止され得る。このアッセイは、任意のヒト化組換え抗体の効力を評価するための再現可能な方法を提供する。簡単に言えば、抗体溶液を希釈して、一連の抗体希釈物をRamos細胞と共にインキュベートし、次いで、それをｒｓＶＣＡＭ１被覆したプレートでインキュベートする。Ramos細胞は、により記載されたようにして蛍光標識し、結合を、下記のプロトコールに従って、９６ウェルクラスタープレートにて、蛍光により評価する。組換え可溶性ＶＣＡＭ１を調製し、本質的にLobb等、1991a［81］により記載されたようにして精製した。可溶性ＶＣＡＭを、０．０５ＭＮａＨＣＯ₃（１５ｍＭＮａＨＣＯ₃、３５ｍＭＮａ₂ＣＯ₃）ｐＨ９．２にて１０μｇ／ｍｌまで希釈する。次いで、５０μｌ／ウェルを、Linbro Titertekポリスチレン平底９６ウェルプレート（Flow Labsカタログ番号76-231-05）中に加える。このプレートを、一晩、４℃でインキュベートする。このインキュベーションの後に、ウェルの内容物を逆さにしてプレートにブロットすることによって取り出す。これらの空のウェルに、ＰＢＳ、０．０２％ＮａＮ₃中の１％ＢＳＡを、室温で１時間以上、ウェル当り１００μｌで加える。もしこのプレートを直ちに使用しないならば、それをブロックして１週間４℃で保存することが出来る。ＢＳＡを幾つかのウェルに加えて非特異的結合を評価する。結合を定量するために、ＶＬＡ４提示細胞、好ましくはRamos細胞を、予備標識すべきである。これらの細胞を、放射性標識又は蛍光標識することが出来る。放射性標識するためには、細胞の予備標識を、一晩、³Ｈ−チミジン（０．５μ Ｃｉ／ｍｌ）を用いて行なうことが出来る。或は（そして、好ましくは）、これらの細胞を、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（化学名：２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５（及び−６）カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル、オレゴン、Eugene，Molecular Probes Inc.，カタログ番号B-1150）とプレインキュベートする。この方法のために、細胞を５×１０⁶／ｍｌに懸濁し、２ μＭＢＣＥＣＦ−ＡＭを加えて、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。何れかの方法の後に、これらの細胞を、ＲＰＭＩ、２％ＦＢＳ（ｐＨ７．４）で洗う。１％ＦＢＳを有するＲＰＭＩも使用することが出来る。結合研究のために、２〜４×１０⁶細胞／ｍｌ（ＲＰＭＩ、２％ＦＢＳ中）を再懸濁し、次いで、５０μｌの標識細胞をウェル当りに加える（室温で１０分間の結合）。１０分間のインキュベーションの後に、これらのウェルの内容物を逆さにすることにより取り出して、プレートをＲＰＭＩ、２％ＦＢＳで穏やかに１〜２回洗う。光学顕微鏡で調べた場合に、ＢＳＡブランクのウェルは、非常に僅かの結合細胞しか有しない。しっかりと付着していない細胞を除去するために簡単な逆さ回転を含むことが出来、これらのプレートを再び１〜２回洗うことが出来る。ＢＣＥＣＦ−ＡＭ法のために、１００μｌの１％ＮＰ４０を各ウェルに加えて細胞を可溶化し、次いで、プレートを、蛍光プレートスキャナー上で読む（放射性標識法を用いたならば、１００μｌの０．１％ＮａＯＨを各ウェルに加え、次いで、各ウェルの内容物を、カクテルを含むシンチレーションバイアルに移す）。５０μｌの容積の標識細胞をカウントして各ウェルに加えた全既知値を得る。次いで、５０μｌの標識細胞を、１００μｌの１％ＮＰ４０のみを含むウェル又は用いる方法に依存するシンチレーションバイアルに加える。抗体ブロッキング研究のために、１００μｌ／ウェルのマウスＨＰ１／２ＭＡｂ（抗ＶＬＡ４）を、典型的には、ＲＰＭＩ、２％ＦＢＳ中１０μｇ／ｍｌで、ｒｓＶＣＡＭ１被覆したプレートに加え、上記のように細胞結合の前に室温で３０分間インキュベートする。ＭＡｂＨＰ１／２（抗ＶＬＡ４）又はここに記載したようにして調製した任意の組換えヒト化抗ＶＬＡ４抗体は、細胞結合の前に、室温で３０分間、標識細胞とプレインキュベートしなければならない。プレインキュベートした抗体の濃度は変化するが、一般に、濃度は、約１μｇ／ｍｌの範囲にあった。これらの接着アッセイにおいて、マウスＨＰ１／２は、約４０ｎｇ／ｍｌにて Ramos細胞結合を完全に阻止し、約１５ｎｇ／ｍｌ（１０μＭ）で最大値の半分だけ阻止する。本発明により作成したヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体を用いる接着アッセイの、計算した半最大結合定数（half-maximal binding constant）により表した結果を、表ＩＩＩに示す。各値について実施した実験数（ｎ）は、組換えヒト化抗体について示してある。下記において検討するように、これらの結果は、一般に、ＦＡＣＳ結合アッセイで得られた結果に匹敵する。安定にトランスフェクトされたＹＢ２／０細胞系統から精製したＶＫ１（ＤＱＬ）軽鎖を有する組換えステージ０、ステージ１、ステージ２及びステージ３抗体の効力を、表ＩＩＩに示すように、接着アッセイにおいて測定した。その結果は、ステージ０−Ｂ及び０−Ｃヒト化抗体を用いては、１μｇ／ｍｌ（１０００ｎｇ／ｍｌ）までの濃度において阻止はないことを示した。改良したＶＫ２（ＳＶＭＤＹ）軽鎖を有する組換えステージ３抗体ＳＴＡＷ及びＡＳを用いた結果は、ＡＳ／ＳＶＭＤＹ抗体が少なくともマウスＨＰ１／２抗体と等しい効力を有するか恐らくは一層高い効力を有することを示した。あるステージ２及びステージ３構築物は、マウスＨＰ１／２抗体の効力の約２０〜１００％の効力を示した。２．ＦＡＣＳアッセイヒト化組換え抗体の細胞表面への結合を、蛍光標識抗体を用いて、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析によって直接評価することが出来る。これは、投与量応答測定の後の半最大結合情報をも提供する標準的技術である。これらのＦＡＣＳ法は、Lobb等、1991b［82］に記載されている。簡単に言えば、２５μｌの細胞（４×１０⁶／ｍｌＦＡＣＳ緩衝液、２％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ₃中）を氷上で、５μｌの５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ又はフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗体（ＦＡＣＳ緩衝液中）に加えて、氷上でＶ底ミクロタイターウェル中で３０分間インキュベートする。これらのウェルに、１２５ μｌのＦＡＣＳ緩衝液を加え、そのプレートを３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を振り落とす。各ウェルに、１２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液を加え、次いで、細胞を１２×７５ｍｍのFalconポリスチレンチューブに移して最終容積２５０μ ｌ（ＦＡＣＳ緩衝液中）に再懸濁する。この混合物を、Becton Dickinson FACSt arにて分析する。このＦＡＣＳアッセイの結果を、本発明により作成したヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体を用いて計算した半最大結合定数により表して、表ＩＩＩに示し、各値について実施した実験数（ｎ）をヒト化抗体について示した。表ＩＩＩは又、組合せた接着及びＦＡＣＳアッセイから計算した効力をも示す。マウスＨＰ１／２は、１５ｎｇ／ｍｌにて、Ramos細胞に対して半最大で結合する。ＡＳ／ＳＶＭＤＹヒト化抗体は、１２ｎｇ／ｍｌにて、Ramos細胞に対して半最大で結合する。従って、これらの２つのアッセイ（即ち、接着及びＦＡＣＳアッセイ）は、マウス抗体とヒト化ＡＳ／ＳＶＭＤＹ抗体について優れた相関を示す。寄託下記のプラスミッドを、大腸菌Ｋ１２Ｊ２２１（Ｉｑ）にて、ブダペスト条約の下、メリーランド（ＵＳＡ）Rockville在、American Type Culture Collect ion（ＡＴＣＣ）に、１９９２年１０月３０日に寄託した。これらの寄託物は、下記の通りである：プラスミッド受託番号 pBAG 184（V_H-STAW） 69110 pBAG 183（V_H-KAITAS） 69109 pBAG 185（V_H-KRS） 69111 pBAG 207（V_H-SSE） 69116 pBAG 195（V_H-AS） 69113 pBAG 190（VK1-DQL） 69112 pBAG 198（VK2-SVMDY） 69115 pBAG 197（VK3-DQMDY） 69114 更に、ヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体を産生するＮＳＯ細胞系統を、ブダペスト条約の下、メリーランド（ＵＳＡ）Rockville在、American Type Culture Colle ction（ＡＴＣＣ）に、１９９２年１１月３日に寄託した。この寄託物は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１１７５を付与された。配列下記は、Sequence Listingに示した配列の要約である： SEQ ID NO:1 ＣＧ１ＦＯＲプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:2 ＣＫ２ＦＯＲプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:3 ＶＨ１ＢＡＣＫプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:4 ＶＨ５ＢＡＣＫプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:5 ＨＰ１／２重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:6 ＨＰ１／２重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:7 ＶＨ１ＢＡＣＫプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:8 ＶＫ７ＢＡＣＫプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:9 ＨＰ１／２軽鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:10 ＨＰ１／２軽鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:11 ＶＨ１ＦＯＲプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:12 ＶＫ３ＢＡＣＫプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:13 ＶＫ１ＦＯＲプライマーのＤＮＡ配列 SEQ ID NO:14 Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１中のＶＨ挿入物のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:15 Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１中のＶＨ挿入物のアミノ酸配列 SEQ ID NO:16 Ｍ１３ＶＫＰＣＲ２中のＶＫ挿入物のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:17 Ｍ１３ＶＫＰＣＲ２中のＶＫ挿入物のアミノ酸配列 SEQ ID NO:18 オリゴ５９８のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:19 オリゴ５９９のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:20 オリゴ６００のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:21 オリゴ６０５のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:22 オリゴ６０６のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:23 オリゴ６０７のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:24 オリゴ１０のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:25 オリゴ３８５のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:26 オリゴ１１のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:27 オリゴ３９１のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:28 ステージ１重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:29 ステージ１重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:30 ＶＫ１（ＤＱＬ）軽鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:31 ＶＫ１（ＤＱＬ）軽鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:32 ステージ２重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:33 ステージ２重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:34 オリゴ６８４のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:35 オリゴ６８３のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:36 オリゴ７１３のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:37 オリゴ７１６のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:38 ＳＴＡＷ重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:39 ＳＴＡＷ重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:40 オリゴ７０６のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:41 オリゴ７０７のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:42 ＫＡＩＴＡＳ重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:43 ＫＡＩＴＡＳ重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:44 オリゴ７６８のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:45 オリゴ７６９のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:46 ＳＳＥ重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:47 ＳＳＥ重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:48 オリゴ７０４のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:49 オリゴ７０５のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:50 ＫＲＳ重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:51 ＫＲＳ重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:52 オリゴ７４５のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:53 オリゴ７４６のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:54 ＡＳ重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:55 ＡＳ重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:56 オリゴ９１５のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:57 オリゴ９１７のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:58 オリゴ９１８のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:59 オリゴ９１９のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:60 オリゴ６９７のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:61 オリゴ６９８のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:62 ＶＫ２（ＳＶＭＤＹ）軽鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:63 ＶＫ２（ＳＶＭＤＹ）軽鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:64 オリゴ８０３のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:65 オリゴ８０４のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:66 ＶＫ３（ＤＱＭＤＹ）軽鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:67 ＶＫ３（ＤＱＭＤＹ）軽鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:68 ＰＤＬＮ重鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:69 ＰＤＬＮ重鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:70 ＰＤＬＮ軽鎖可変領域のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:71 ＰＤＬＮ軽鎖可変領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO:72 オリゴ３７０−１１９のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:73 オリゴ３７０−１２０のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:74 オリゴ３７０−１２１のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:75 オリゴ３７０−１２２のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:76 オリゴ３７０−１２３のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:77 オリゴ３７０−１２４のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:78 オリゴ３７０−１２５のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:79 オリゴ３７０−１２６のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:80 オリゴ３７０−１２７のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:81 オリゴ３７０−１２８のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:82 オリゴ３７０−１２９のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:83 オリゴ３７０−１３０のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:84 オリゴ３７０−１３１のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:85 オリゴ３７０−１３２のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:86 オリゴ３７０−１３３のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:87 オリゴ３７０−１３４のＤＮＡ配列 SEQ ID N0:88 オリゴ３７０−１３５のＤＮＡ配列 SEQ ID N0:89 オリゴ３７０−１３６のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:90 オリゴ３７０−１３７のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:91 オリゴ３７０−１３８のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:92 オリゴ３７０−１３９のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:93 オリゴ３７０−１４０のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:94 オリゴ３７０−１４１のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:95 オリゴ３７０−１４２のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:96 ＶＫ１−ＤＱＬプライマー３７０−２４７のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:97 ＶＫ１−ＤＱＬプライマー３７０−２１０のＤＮＡ配列 SEQ ID NO:98 ＶＫ２−ＳＶＭＤＹプライマー３７０−２６９のＤＮＡ配列 SEQ ID N0:99 ＶＫ３−ＳＶＭＤＹプライマー３７０−２６８のＤＮＡ配列我々は、上に、この発明の幾つかの具体例を説明してきたが、我々の基本的具体例を変形して、この発明の組成物及び方法を利用する他の具体例を与え得ることは明白である。それ故に、この発明の範囲は、上記の明細書中に規定され及び添付の請求の範囲により規定されるすべての別の具体例及び変法を含み且つ、この発明は説明のためにここに提供した特定の具体例に限定されるべきでないことは、認められるであろう。ここに列記した各文献は、そのまま、参考として本明細書中に援用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/78 8318−4Ｈ 16/18 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者カール，フランクジェイ. イギリス国エイビー23 ８エクスユー, アバディーンシャー，バルメディー，ザホールディングズ，バーチリー（番地なし) (72)発明者テンペスト，フィリップアール. イギリス国エイアール１６アールティー，アバディーン，ブライトンプレイス 63

Claims

【特許請求の範囲】１．ＶＬＡ４に対する特異性及び抗原結合部位を有するヒト化組換え抗体分子であって、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが非ヒト抗ＶＬＡ４抗体から導かれ且つ該抗体がマウスＨＰ１／２モノクローナル抗体の効力の約２０〜１００％の効力を有する、上記のヒト化組換え抗体分子。２．ＶＬＡ４に対する特異性及び抗原結合部位を有するヒト化組換え抗体分子であって、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが非ヒト抗ＶＬＡ４抗体から導かれ且つ該抗体が非ヒトＣＤＲを３１〜３５位（ＣＤＲ１）、５０〜６５位（ＣＤＲ２）及び９５〜１０２位（ＣＤＲ３）（Kabatの番号付け）に有するヒト化組換え重鎖を含む、上記のヒト化組換え抗体分子。３．ＶＬＡ４に対する特異性及び抗原結合部位を有するヒト化組換え抗体分子であって、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが非ヒト抗ＶＬＡ４抗体から導かれ且つ該抗体が非ヒト残基をフレームワークの２７〜３０位（ Kabatの番号付け）に有するヒト化組換え重鎖を含む、上記のヒト化組換え抗体分子。４．ＶＬＡ４に対する特異性及び抗原結合部位を有するヒト化組換え抗体分子であって、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが非ヒト抗ＶＬＡ４抗体から導かれ且つ該抗体が更なる非ヒト残基をフレームワークの７５位（Kabatの番号付け）に有するヒト化組換え重鎖を含む、上記のヒト化組換え抗体分子。５．ＶＬＡ４に対する特異性及び抗原結合部位を有するヒト化組換え抗体分子であって、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが非ヒト抗ＶＬＡ４抗体から導かれ且つ該抗体が更なる非ヒト残基をフレームワークの７７〜７９位又は６６〜６７及び６９〜７１位又は８４〜８５位又は３８及び４０位又は２４位に有するヒト化組換え重鎖を含む、上記のヒト化組換え抗体分子。６．非ヒトＣＤＲを２４〜３４位（ＣＤＲ１）、５０〜５６位（ＣＤＲ２）及び８９〜９７位（ＣＤＲ３）に含む、請求項１、２、３、４、５又は７に記載のヒト化組換え軽鎖。７．ＶＬＡ４に対する特異性及び抗原結合部位を有するヒト化組換え抗体分子であって、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが非ヒト抗ＶＬＡ４抗体から導かれ且つ該抗体が非ヒト残基をフレームワークの６０及び６７位に有するヒト化組換え軽鎖を含む、上記のヒト化組換え抗体分子。８．少なくとも１つの請求項２に記載の抗体重鎖及び少なくとも１つの請求項６に記載の抗体軽鎖を含む、ヒト化組換え抗体分子。９．非ヒトＣＤＲがＨＰ１／２マウスモノクローナル抗体に由来するものである、請求項６に記載のヒト化組換え抗体分子。１０．請求項２に記載の抗体重鎖をコードするＤＮＡ。１１．請求項６に記載の抗体軽鎖をコードするＤＮＡ。１２．請求項９に記載の抗体分子をコードするＤＮＡ。１３．請求項１０に記載のＤＮＡを含むベクター。１４．請求項１１に記載のＤＮＡを含むベクター。１５．請求項１２に記載のＤＮＡを含むベクター。１６．請求項２に記載の抗体重鎖をコードするＤＮＡを請求項６に記載の抗体軽鎖をコードするＤＮＡと機能的に組合せて含む発現ベクター。１７．請求項９に記載の抗体分子をコードするＤＮＡを含む発現ベクター。１８．請求項１３に記載のベクター及び請求項１４に記載のベクターでトランスフォームした宿主細胞。１９．請求項１５に記載のベクターでトランスフォームした宿主細胞。２０．次の工程を含む、請求項１〜７に記載のヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体の製造方法：（a）抗体重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを含む発現ベクターを生成し、ここに、可変ドメインのＣＤＲの少なくとも１つは非ヒト抗ＶＬＡ４抗体に由来し且つ抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来し、（b）相補的抗体軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを含む発現ベクターを生成し、ここに、可変ドメインのＣＤＲの少なくとも１つは非ヒト抗ＶＬＡ４抗体に由来し且つ抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来し、（c）宿主細胞を各ベクターでトランスフェクトし、そして、（d）トランスフェクトされた細胞系統を培養してヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子を生成する。２１．重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が同じベクターを含む、請求項２０に記載の方法。２２．請求項１に記載の抗体分子又はその断片を製薬上許容し得る希釈剤、賦形剤又はキャリアーと組合せて含む治療用組成物。２３．請求項１に記載の抗体分子又はその断片を検出可能に標識した形態で含む診断用組成物。２４．ヒト又は動物患者の治療において使用する医薬の製造のための、請求項１に記載の抗体の利用。２５．哺乳動物患者における特異的防御系の応答から生じる炎症の治療において使用する医薬の製造のための、請求項１に記載の抗体の利用。２６．Ｖ_H-ＳＴＡＷ（SEQ ID N0:39）、Ｖ_H-ＫＡＩＴＡＳ（SEQ ID NO:43）、Ｖ_H -ＳＳＥ（SEQ ID NO:47）、Ｖ_H-ＫＲＳ（SEQ ID NO:51）及びＶ_H-ＡＳ（SEQ ID NO:55）よりなる群から選択する可変重鎖領域を含むヒト化重鎖を、ＶＫ-ＤＱＬ（SEQ ID NO:31）、ＶＫ２-ＳＶＭＤＹ（SEQ ID NO:63）及びＶＫ３-ＤＱＭＤＹ（SEQ ID N0:67）よりなる群から選択する軽鎖可変領域を含むヒト化軽鎖と組合せて含む抗体の特徴を有するヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子。２７．請求項２６に記載のヒト化重鎖及びヒト化軽鎖をコードするＤＮＡ。２８．請求項２７に記載のＤＮＡを含むベクター。２９．請求項２６に記載の抗体分子をコードするＤＮＡを含む発現ベクター。３０．請求項２８に記載のベクターでトランスフォームした宿主細胞。３１．請求項２９に記載のベクターでトランスフォームした宿主細胞。３２．ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７５である、請求項３１に記載の宿主細胞。３３．Ｖ_H-ＡＳ（SEQ ID N0:55）の可変重鎖領域を含むヒト化重鎖を、ＶＫ２- ＳＶＭＤＹ（SEQ ID NO:63）の軽鎖可変領域を含むヒト化軽鎖と組合せて含む抗体の効力の約２０〜１００％の効力を有するヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子。３４．請求項２６又は３３に記載の抗体分子又はその断片を製薬上許容し得る希釈剤、賦形剤又はキャリアーと組合せて含む治療用組成物。３５．請求項２６又は３３に記載の抗体分子又はその断片を検出可能に標識した形態で含む診断用組成物。３６．ヒト又は動物患者の治療において使用する医薬の製造のための、請求項２６又は３３に記載の抗体の利用。３７．哺乳動物患者における特異的防御系の応答から生じる炎症の治療において使用する医薬の製造のための、請求項２６又は３３に記載の抗体の利用。３８．ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７５により産生される抗体であるか又はＡＴＣＣＣＲＬ１１１７５により産生される抗体の特性を有する抗体であるヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子。３９．ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７５により産生される抗体の効力の約２０〜１００％の効力を有するヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子。４０．マウスモノクローナル抗体ＨＰ１／２により産生される抗体の効力の約２０〜１００％の効力を有するヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体分子。