JPH08508264A - Ｖｉｉ因子の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 数段のクロマトグラフィー精製工程を介する精製の際のFVIIの活性化及び分解はその精製工程のうちの少なくとも一段階におけるZn⁺⁺の存在によりコントロールされる。

Description

【発明の詳細な説明】 VII因子の精製 技術分野 本発明はVII因子のコントロールされた活性化及び分解のための方法に関する 。 背景技術 凝固因子VII（FVII）は血液凝固の外因性経路において重要な役割を果たすビ タミンＫ依存性セリンプロテアーゼである。それは約50,000の分子量を有する一 本鎖糖タンパク質（チモゲン）として肝臓の中で合成され、そしてそれが循環す る血液の中に分泌される。その活性化形態FVIIaにおいて、このプロテアーゼは セリンプロテアーゼ科の他の２種のビタミンＫ依存性凝固因子、IX因子（FIX） 及びＸ因子（FX）の活性化を触媒する。 次いで活性化FX（FXa）₁₀プロトロンビンをトロンビンへと変換せしめるであ ろう。次いでトロンビンはフィブリノーゲンを、血餅の主成分フィブリンへと変 換せしめるであろう。 VII因子はBroze and Majerus，J．Biol．Chem．255（4）（1980）1242−1247 及びHedner and Kisiel，J．Clin．Invest，71（1983）1836−1841に記載の方法 により血漿から精製され、そしてVIIa因子へと活性化される。 VIIa因子は組換DNA技術を介し、適当な培地の中でVII因子をエンコードするDN A配列でトランスフェクトされた哺乳細胞を培養し、生成タンパク質を単離し、 次いでこのタンパク質をVIIa因子へと活性化することによっても生産されうる（ ヨーロッパ特許出願第86 302855.1参照のこと）。 VIIa因子はVIII因子に対するインヒビターの生じた患者（Hedner，V．and Kis iel，W．J．Clin．Invest，71（1983）1836-1841）を処置するため、並びに血小 板障害、例えば血小板減少症、von Willebrand病及びその他の重度な組織障害に かかわる典型的なものの如くの出血障害に苦しむ患者の処置のために利用されう る（ヨーロッパ特許出願第86309197.1）。 血漿由来ウシタンパク質（Radcliffe & Nermerson，J．Biol．Chem．250（197 5）338−395）及びヒト組換タンパク質（Thimら、Biochemistry 27（1988）778 5−7793）の精製の際、FVIIはArg₁₅₂−Ile₁₅₃結合の加水分解により二本鎖形態 へと活性化される。FVIIa活性化はアニオン交換体（ジエチルアミノエチル又は トリメチルアミノエチル修飾ポリマーゲルマトリックス）上への収着により大い に高まる（A．H．Pedersenら、Biochemistry 28（1989），9331−9336）。どの ようにしてFVIIが活性化されるかのメカニズムは知られていない。活性化に加え て、FVIIa分子の画分は自己分解により主として290及び／又は315位において解 裂する（E．M．Nicolaisenら、FEBS LEtt．317（1993）245−249）。かかる分解 生成物は不活性分子であり、そしてVIIa因子調製品中でのその存在は低め比活性 の最終調製品を招くであろう。更に、分解生成物の量及び種類は生産バッチ間で 異なり、多彩な生物学活性VIIa因子含有量を有する調製品をもたらしめる。最終 調製品中の分解生成物の含有は患者の免疫系を誘発しうる。再投与は、ひどいケ ースにおいては致死的となりうるアレルギー反応をもたらしうる。患者はその後 の処置を困難又は無効にするVIIa因子に対する高力価抗体も作ることがある。 低含有分解生成物を有する精製FVIIa生成物を調製するため、精製行程及びそ の後の処理中での活性化コントロール及び分解を妨害 することが必須である。FVIIaと異なり、一本鎖形態FVIIは重鎮における解裂に 対して耐性又ははるかに解裂しにくい。従って、FVIIをその一本鎖形態で精製す ることが好都合でありうる。 従って、本発明の目的は、高純度の均質な生成物を供する目的を伴う、FVIIに とっての精製方法であって、その活性化及び分解が回避されているか、又は許容 できるほど低い程度に保持されている方法を提供することにあり、ここでの生成 物は高い比活性を有する均一、且つ均質な生成物を供するように更なる行程で高 収率においてFVIIaへと活性化されうる。 亜鉛イオンは組換FVIIaのアミド分解及びタンパク質分解を阻害することで知 られている（Pedersen，A．H．ら、Thrombosis and Haemostasis，65（1991）， 528−534）。驚くべきことに、亜鉛イオンの点火はクロマトグラフィーカラム材 料による精製の際にFVIIの自己活性化をコントロール及びFVII／FVIIaの分解を 妨げるのに利用できうることがこの度見い出せた。 発明の詳細 最も広い観点において、本発明はVII因子の溶液を数段階のクロマトグラフィ ー精製行程にかける精製中でのFVIIのコントロールされた活性化及び分解のため の方法に関し、これにおいてはZn⁺⁺がこれらの精製行程における少なくとも一段 階において存在している。 より狭い観点において、本発明はFVのコントロールされた活性化及び分解のた めの方法に関し、これにおいてはFVIIa溶液を何本かのアニオン交換及びイムノ アフィニティーカラムに載せる。 本発明の好適な態様において、FVII溶液をクロマトグラフィーカラムに、下記 の順で載せる：１）アニオン交換；２）イムノアフィニティー；３）アニオン交 換；４）アニオン交換カラム：ここでZn ⁺⁺ は少なくとも最初の２段階において存在している。 図面の簡単な説明 図１はZn⁺⁺濃度を変えたときのアニオン交換カラムの存在下でのFVIIの活性化 を示す。 図２は１又は複数の精製工程におけるバッファー中にZn⁺⁺を含む精製方法の際 のrFVIIからrFVIIaに至る活性化を示す。 表１に方法Ａ〜Ｅにとっての条件を、そして表２にその結果を示す。 図３は１又は複数の精製工程におけるバッファー中にZn⁺⁺を含む精製方法の際 のFVIIaの分解を示す。 表１に方法Ａ〜Ｅにとっての条件を、そして表２にその結果を示す。 本発明を説明する前に、本明細書の中で使用している一定の用語の定義を記載 することがその理解のうえで役立ちうる。FVII ：FVIIは血漿から単離された、又は組換DNA技術によって調製されたFVIIを 含む。それはまた、活性化に基づき、内因性ヒトFVIIaと同一又は実質的に同一 の血液凝固にとっての生物活性を有する個体間で存在、且つ認められるアレル変 異体並びにアミノ酸残基の置換及び／もしくは置換により修飾されたFVIIタンパ ク質を包括する。 上記の定義内における「FVII」は、グリコシル化の程度及び位置における変異 を伴う、並びに／又は特定の宿主細胞に依存する及び組換DNA技術により発現さ れるときの培養条件に依存するその他の後翻訳修飾を伴うFVIIタンパク質をも包 括する。FVIIa生物活性 ：FVIIa生物活性は外因性経路にわたる血液凝固の仲介を特徴とす る。 FVIIaはFXをFXaに活性化、それはプロトロンビンをトロンビンに変換せしめ、 これによりフィブリン血餅の形成を阻害する。コントロールされた活性化及び分解 ：この表現は、精製過程の際のFVIIの活性化 及び分解が意識的にコントロールされた一定のパラメーター（この場合、Zn⁺⁺の 存在）の変更に従っている工程を包括する。 Zn⁺⁺がないと、その精製工程パラメーターに活性化及び分解反応の同時発生に ついて調整しなければならない。Zn⁺⁺の存在下では、これらの反応をコントロー ルすることが可能となり、精製及び活性化を個別に最適化することが可能となる 。 詳細な説明 ヒトFVIIは好ましくは、ヨーロッパ特許出願第86302855.1に記載の通りにして トランスフェクト化哺乳動物ベビーハムスターの腎威（BHK）細胞において発現 させる。FVII及び細胞増殖剌激タンパク質を含む培養培地をクロマトグラフィー 精製の前に遠心及び濾過により細胞から分離させる。 精製のため、FVIIを種々のクロマトグラフィーマトリックス、例えばカチオン 交換体、アニオン交換体、イムノアフィニティーマトリックス、金属イオンキレ ート剤、色素−アフィニティーマトリックス、疎水性相互作用マトリックス、及 び固定化バイオ特異的リガンドを有するアフィニティーマトリックスに収着させ る。異なるマトリックスに収着するFVIIのメカニズムは異なり、それ故FVIIの活 性化に対するZn⁺⁺の効果は異ないうるが、しかしながら種々のタイプのクロマト グラフィーマトリックスに対する収着の際にいまだ有意義である。 亜鉛の塩は平衡化及び溶離に用いる１又は数種の溶離溶液及びバ ッファーに加えてよい。亜鉛の塩は任意の可溶性塩、例えば酢酸亜鉛、クエン酸 亜鉛、塩化亜鉛又は硫酸亜鉛であってよい。 Zn⁺⁺の濃度は10μＭ〜１mMであってよく、そして好ましくは約20μＭ〜約１mM 、より好ましくは約40μＭ〜約１mMであろう。 精製FVIIからFVIIaに至るその後の活性化はHedner and Kiesel（J．Clin．Inv est．71（1983），1836−1841）記載の通りにしてFXIIaを用いることにより、又 はトリプシン様特異性を有するプロテアーゼを用いることにより（Kiesel and F ujikawa，Behring Inst．Mitt．73（1983），29−42）達し得る。他方、FVIIは ボリマー巨大分子、例えばポリリジン、マトリックス構造体、置換化アガロース ゲル又は膜の存在下で活性化されうる。 実験の部 rFVIIの精製及びrFVIIaに至る活性化のための精製方法は下記の４通りの連続 クロマトグラフィー工程を介して行った：段階１アニオン交換；段階２イムノア フィニティークロマトグラフィー；段階３アニオン交換；段階４アニオン交換。 一連の精製方法の実験を行い、その一部は表１に概略した通り、１又は数段の クロマトグラフィー工程のバッファー全てに亜鉛塩の添加を含む。 実験条件は実施例を２〜４に示す。 対照実験（Ｅ）はZn（CH₃COOH）を加えないことを除き、実施例２の通りに行 った。 各段階の溶離液をFVIIの活性化の程度（％FVII）及びFVIIa分解生成物の含有 量についてアッセイした。FVIIの二本鎖FVIIa形態への変換は、クマジー・ブル ー染色及びレーザーデンシトメトリーによる定量と組合せた、還元条件下でのド デシル硫酸ナトリウム（SDS）における標準ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE ）により測定した。 FVIIa分解生成物の含有量は線形アセトニトリル勾配でのブチル結合型シリカ カラム上での逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）により定量した。 実施例に本質的に記載した通りにして行った実験由来の結果を表２に載せ、そ して図２及び図３に示す。図２から、亜鉛イオン（線分Ａ，Ｂ及びＣ）の存在下 では、イムノアフィニティー工程（工程２）及びアニオン交換工程（工程３及び ４）（線分Ａ及びＢ）の際、rFVII活性化は全く又はほとんど起こらないことが 明らかである。 これに反して、亜鉛イオン抜きでは、工程２（線分Ｅ）並びに工程３及び４（ 線分Ｂ，Ｃ及びＥ）において、かなりの活性化が起きた。 FVIIの活性化に阻害作用を及ぼす亜鉛イオンとFVII／FVIIaとの相互作用は不 可逆的性質であることも明らかである。その理由は、過剰EDTAとの錯体結合によ る亜鉛イオンの除去の後、FVIIはその後の精製工程の際に活性化されたからであ る（線分Ｂ及びＣ）。 段階１において、明らかに亜鉛イオン抜きでは活性化は起こらない。これはカ ラム上でのはるかに低いFVII濃度に原因しうる。 全ての実験において用いた段階１の溶離液は１％未満のFVIIaを含んでいた。 実施例１アニオン交換体に対する結合の際のFVIIの活性化の阻害 FVIIの活性化に及ぼすZn⁺⁺の作用を、精製FVIIをQ-Sepharose FFマトリックス に様々なZn⁺⁺濃度の存在下で収着させる実験において試験した。500μgのFVIIを 800μｌのバッファー（10mMのトリス 、50mMのNaCl、２mMのCaCl₂及び様々な濃度酢酸亜鉛）中の50μｌのQ-Sepharose FFと、1.5mlの試験管の中でインキュベートした。１hr及び２hr後、マトリック スを遠心により沈降させ、そして上清液を除去した。800μｌのバッファー（10m Mのトリス、50mMのNaCl、25mMのCaCl₂、pH8.0）を加え、そして混合及び遠心後 、上清液のサンプルを抜き取り、そしてSDS−PAGEによりFVII／FVIIaについて分 析した。 結果（図１）は、Zn⁺⁺抜きでは、FVIIの55％が１hr以内にFVIIaに活性化され 、そして２hr後では90％より多い量が活性化されたことを示す。 10μＭのZn⁺⁺の存在下では、25％のみが１hr後に活性化され、そして73％のみ が２h後に活性化されていた。 約40μＭを超えるZn⁺⁺濃度の存在下では、２hr以内では活性化は起こらなかっ た。 この実験から、約10μＭ〜約10 μＭの濃度範囲のZn⁺⁺はアニオン交換性の存 在下でFVIIa活性化に対して阻害作用を有することが明らかであり、そしてZn⁺⁺ は10μＭ〜１mMの全域における全Zn⁺⁺濃度においてFVIIの活性に対して影響を及 ぼすことが考えられる。 Zn⁺⁺濃度を変えることにより、FVII活性化速度を一定にコントロールすること が可能であり、そして高Zn⁺⁺濃度においては、FVIIを活性化から、それ故分解か ら本質的に守ることが明らかである。 実施例２ rFVIIの精製及びrFVIIaに至る活性化は下記の４通りのクロマトグラフィー工 程を通じて実施した： 工程１： rFVII含有細胞培養培地を希釈により10mS／cm未満のイオン強度に調整し、そ してバッファーＡ（10mMのトリヒドロキシメチルアミ ノメタン〔トリス］；150mMのNaCl，pH８）で前平衡化したＱ−Sepharoseカラム に載せた。 同じバッファー中の175mMのNaClを伴う洗浄工程後、rFVIIをバファーＢ（10mM のトリス；150mMのNaCl；25mMのCaCl₂，pH８）により溶離させた。 工程２： 104mg／ｌのrFVIIを含む溶離溶液を次の最終組成： 10mMのトリス；１ＭのNaCl；25mMのCaCl₂；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5に調 整し、そして固定化抗−FVIIモノクローナル抗体を有するSepharose カラムに載 せた。 抗体カラムはバッファーＣ（10mMのトリス；100mMのNaCl；20mMのCaCl₂；70μ ＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5）で前平衡化しておいた。次いでカラムを10mMのトリ ス；２ＭのNaCl；20mMのCaCl₂ ；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5、次いでバッフ ァーＣで洗った。その後、rFVII／rFVIIaをバッファー（75mMのトリス；30mMの クエン酸三ナトリウム；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5）を適用することにより 溶離させた。 工程３： その溶離液を直ちに、バッファー（10mMのトリス；150mMのNaCl；70mMのZn（C H₃COO）₂，pH8.6）で前平衡化しておいたＱ−Sepharoseカラムに載せた。 このカラムを同じバッファーで洗い、そしてバッファーＡからバッファーＤ（ 10mMのトリス；500mMのNaCl；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH8.6）に至る線形勾配 で溶離させた。 工程４： rFVII／rFVIIaを含む画分を希釈により10mS／cm未満のイオン強度に調整し、 そして直ちに、バッファー（10mMのグリシルグリシン ；150mMのNaCl；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH8.6）で前平衡化しておいたＱ−Sep haroseカラムに載せた。 バッファー（10mMのグリシルグリシン；175mMのNaCl；70μＭのZn（CH₃COO）₂ ，pH8.6）及びバッファーＥ（10mMのグリシルグリシン；100mMのNaCl；70μＭの Zn（CH₃COO）₂，pH8.6）で洗浄後、rFVII／rFVIIaをバッファーＥからバッファ ー（10mMのグリシルグリシン；100mMのNaCl；15μＭのCaCl₂；70μＭのZn（CH₃C OO）₂，pH8.6）に至る線形勾配で溶離させた。流速は１vol.／hrとした。 精製rFVIIa調製品は下記の特徴を有していた： rFVIIaの含有量：345mg／ml UV光度計により測定（OD280） 外来タンパク質の含有量：＜１％ RP−HPLCにより rFVIIの含有量：89％ SDS−PAGEにより rFVIIaの分解生成物の有量：＜２％ RP−HPLCにより 実施例３ rFVIIの精製及びrFVIIaに至る活性化は下記の４通りのクロマトグラフィー工 程を通じて実施した： 工程１： rFVII含有細胞培養培地を希釈により10mS／cm未満のイオン強度に調整し、そ してバッファーＡ（10mMのトリヒドロキシメチルアミノメタン〔トリス〕；150m MのNaCl，pH８）で前平衡化したＱ−Sepharoseカラムに載せた。 同じバッファー中の175mMのNaClを伴う洗浄工程後、rFVIIを10mMのトリス；15 0mMのNaCl；25mMのCaCl₂，pH８により溶離させた。 工程２： 104mg／ｌのrFVIIを含む溶離溶液を次の最終組成： 10mMのトリス；１ＭのNaCl；25mMのCaCl₂；70μＭのZn（CH₃COO）₂ ，pH7.5に調整し、そして固定化抗−FVIIモノクローナル抗体を有するSepharose カラムに載せた。 抗体カラムはバッファーＣ（10mMのトリス；100mMのNaCl；20mMのCaCl₂；70μ ＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5）で前平衡化しておいた。次いでカラムを10mMのトリ ス；２ＭのNaCl；20mMのCaCl₂ ；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5、次いでバッフ ァーＣで洗った。その後、rFVII／rFVIIaをバッファー（75mMのトリス；30mMの クエン酸三ナトリウム；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5）を適用することにより 溶離させた。 工程３： その溶離液を直ちに、バッファー（10mMのトリス；150mMのNaCl；70mMのZn（C H₃COO）₂，pH8.6）で前平衡化しておいたＱ−Sepharoseカラムに載せた。 このカラムを同じバッファーで洗い、そしてバッファーＡからバッファーＤ（ 10mMのトリス；500mMのNaCl；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH8.6）に至る線形勾配 で溶離させた。 工程４： rFVII／rFVIIaを含む画分を２mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）及び希釈 により10mS／cm未満のイオン強度に調整し、そして直ちに、バッファー（10mMの グリシルグリシン；150mMのNaCl，pH8.6）で前平衡化しておいたＱ−Sepharose カラムに載せた。 バッファー（10mMのグリシルグリシン；175mMのNaCl，pH8.6）及びバッファー Ｅ（10mMのグリシルグリシン；100mMのNaCl，pH8.6）で洗浄後、rFVII／rFVIIa をバッファーＥからバッファー（10mMのグリシルグリシン；100mMのNaCl；15μ ＭのCaCl₂，pH8.6）に至る線形勾配で溶離させた。流速は１vol.／hrとした。 精製rFVIIa調製品は下記の特徴を有していた： rFVIIaの含有量：492mg／ml UV光度計により測定（OD280） 外来タンパク質の含有量：＜１％ RP−HPLCにより rFVIIの含有量：18％ SDS−PAGEにより rFVIIa分解生成物の含有量：3.6％ RP−HPLCにより 実施例４ rFVIIの精製及びrFVIIaに至る活性化は下記の４通りのクロマトグラフィー工 程を通じて実施した： 工程１： rFVII含有細胞培養培地を希釈により10mS／cm未満のイオン強度に調整し、そ してバッファーＡ（10mMのトリヒドロキシメチルアミノメタン〔トリス〕；150m MのNaCl，pH８）で前平衡化したＱ−Sepharoseカラムに載せた。 同じバッファー中の175mMのNaClを伴う洗浄工程後、rFVIIをバファーＢ（10mM のトリス；150mMのNaCl；25mMのNaCl₂，pH８）により溶離させた。 工程２： 104mg／ｌのrFVIIを含む溶離溶液を次の最終組成： 10mMのトリス；１ＭのNaCl；25mMのCaCl₂；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5に調 整し、そして固定化抗−FVIIモノクローナル抗体を有するSepharoseカラムに載 せた。 抗体カラムはバッファーＣ（10mMのトリス；100mMのNaCl；20mMのCaCl₂；70μ ＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5）で前平衡化しておいた。次いでカラムを10mMのトリ ス；２ＭのNaCl；20mMのCaCl₂ ；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5、次いでバッフ ァーＣで洗った。その後、rFVII／rFVIIaをバッファー（75mMのトリス；30mMの クエン酸三ナトリウム；70μＭのZn（CH₃COO）₂，pH7.5）を適用することにより 溶離させた。 工程３： その溶離液を直ちに、バッファー（10mMのトリス；150mMのNaCl，pH8.6）で前 平衡化しておいたＱ−Sepharose カラムに載せた。 このカラムを同じバッファーで洗い、そしてバッファーＡからバッファーＤ（ 10mMのトリス；500mMのNaCl，pH8.6）に至る線形勾配で溶離させた。 工程４： rFVII／rFVIIaを含む画分を希釈により10mS／cm未満のイオン強度に調整し、 そして直ちに、バッファー（10mMのグリシルグリシン；150mMのNaCl，pH8.6）で 前平衡化しておいたＱ−Sepharoseカラムに載せた。 バッファー（10mMのグリシルグリシン；175mMのNaCl，pH8.6）及びバッファー Ｅ（10mMのグリシルグリシン；100mMのNaCl，pH8.6）で洗浄後、rFVII／rFVIIa をバッファーＥからバッファー（10mMのグリシルグリシン；100mMのNaCl；15μ ＭのCaCl₂，pH8.6）に至る線形勾配で溶離させた。流速は１vol.／hrとした。 精製rFVIIa調製品は下記の特徴を有していた： rFVIIaの含有量：1.2mg／ml UV光度計により測定（OD280） 外来タンパク質の含有量：＜１％ RP−HPLCにより rFVIIの含有量：１％ SDS−PAGEにより rFVIIa分解生成物の含有量：6.7％ RP−HPLCにより

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/43 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/465

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．VII因子の溶液を数段のクロマトグラフィー工程にかける精製の際のVII因 子のコントロールされた活性化及び分解のための方法であって、Zn⁺⁺がその精製 工程の少なくとも一段階において存在している方法。 ２．VII因子の溶液を数本のアニオン交換及びイムノアフィニティークロマト グラフィーカラムに載せる、請求項１記載の方法。 ３．Zn⁺⁺が可溶性の亜鉛の塩の形態で存在している、請求項１〜３記載の方法 。 ４．Zn⁺⁺が約10μＭ〜約１mMの濃度で存在している、請求項１〜３記載の方法 。 ５．Zn⁺⁺が約20μＭ〜約１mMの濃度で存在している、請求項１〜４記載の方法 。 ６．Zn⁺⁺が約40ｐＭ〜約１mMの濃度で存在している、請求項４記載の方法。 ７．前記FVII溶液をクロマトグラフィーカラムに、下記の順番：１）アニオン 交換；２）イムノアフィニティー；３）アニオン交換；４）アニオン交換カラム で載せ、ここでZn⁺⁺は少なくとも２工程に存在している、請求項２記載の方法。