CZ253395A3

CZ253395A3 - Method of controlled activation and degradation of factor vii during purification process

Info

Publication number: CZ253395A3
Application number: CZ952533A
Authority: CZ
Inventors: Tony Jorgensen; Anders H Pedersen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-24
Publication date: 1996-01-17
Also published as: CA2159313A1; US5700914A; HUT72712A; FI954649L; TW278079B; AU6423994A; NO953883D0; ZA941956B; CN1121723A; EP0691984A1; FI954649A7; FI954649A0; AU677309B2; IL109164A0; CN1039231C; HU9502846D0; WO1994022905A1; DK38293D0; NO953883L; PL310887A1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu regulované aktivace a degradace faktoru VII během jeho čištění.

Dosavadní stav techniky

Koagulační faktor VII (FVII) je serinová proteasa závislá na vitaminu K, která hraje klíčovou roli ve vnější cestě srážení krve. Je syntetizován v játrech a sekretován do krve, kde obíhá jako jednořetězový glykoprotein (zymogen) s molekulovou hmotností kolem 50 000. Ve své aktivní formě, FVlIa, tato proteasa katalyzuje aktivaci dvou jiných koagulačních faktorů ze skupiny serinových proteas závislých na vitaminu K, faktoru IX (FIX) a faktoru X (FX).

Aktivovaný FX (FXa) pak převádí protrombin na trombin. Trombin pak převádí fibrinogen na fibrin, hlavní složku sraženiny.

t>

Faktor VII se může čistit z plasmy a aktivovat na faktor Víla způsoby popsanými Brožem a Majerusem: J. Biol, Chem. 255(4). 1242 (1980) a Hednerem a Kisielem: J. Clin. Invest. 7i, 1836 (1983).

Faktor Vila se může vyrábět technologií rekombinantní DNA kultivováním savčích buněk transfektovaných DNA sekvencí kódující faktor VII v příslušném mediu, isolováním připraveného proteinu a aktivováním tohoto proteinu na faktor VIIA (viz evropská patentová přihláška č. 86302855.1).

Faktor Víla se může používat pro léčení pacientů, kteří mají vyvinuté inhibitory na faktor VIII (Hedner U. a Kisiel W.:

J. Clin. Invest. 71. 1836 (1983) a pro léčení pacientů trpících poruchami krvácení, jako jsou poruchy krevních destiček včetně trombocytopenie, von Willebrandova choroba a další, typicky se vyskytující v případech se silnými poškozeními tkáně (evropská patentová přihláška č. 86309197.1).

Během čištění hovězího proteinu, pocházejícího z plasmy (Radcliffe a Nermerson: J. Biol. Chem. 250. 338 (1975) a lidského rekombinantního proteinu (Thim a spol.: Biochemistry 27, 7785 (1988), byl FVII aktivován na formu o dvou řetězcích hydrolýzou vazby Arg_l52-Ile₁₅₃. Aktivace FVII se velmi zvýší adsorpcí na anexech (diethylaminoethylovou skupinou nebo trimethylaminoethylovou skupinou modifikované oolymerní gelové matrice) (A.H.Pedersen a spol.: Biochemistry 28, 9331 (1989).). Mechanismům, kterým se aktivace FVII zvýší, není znám. Vedle aktivace se část molekul FVIIa autodegradací štěpí primárně v polohách 290 a/nebo 315 (E.M.Nicolaisen a spol.: FEBS Lett. 317, 245 (1993).). Tyto degradační produkty jsou neaktivní molekuly a jejich výskyt v prostředku faktoru Vila povede k nižší specifické aktivitě konečného prostředku. A dále, množství a povaha degradačních produktů se může měnit od jedné várky produktu k jiné, takže se získávají prostředky s proměnlivým obsahem biologicky aktivního faktoru Vila. Obsah degradačních produktů v konečném prostředku může spustit imunní systém pacienta. Další podání pak vede k alergickým reakcím, které mohou mít v horších případech smrtelný průběh. U pacientů se mohou také vyvinout vysoké titry protilátek proti faktoru Vila, což způsobuje, že následující léčení je obtížné nebo neúčinné.

Pro přípravu vyčištěného FVIIa produktu s nízkým obsahem degradačních produktů je podstatné kontrolovat aktivaci a zabraňovat degradaci během procesu čištění a během následného zpracování. Na rozdíl od FVIIa ve formě jediného řetězce je FVII resistentní nebo mnohem méně náchylný ke štěpení v těžkém řetězci. Může být tedy výhodné čistit FVII v jeho formě jediného řetězce.

Účelem tohoto vynálezu je tedy získat způsob čištění FVII, při kterém se lze vyhnout aktivaci a degradaci nebo při kterém l2e aktivaci a degradaci udržet na přijatelné nízké úrovni a získat tak homogenní produkt o vysoké čistotě, který pak lze v dalším stupni dále aktivovat na FVIIa ve vysokých výtěžcích. Získá se tak jendotný a homogenní produkt s vysokou specifickou aktivitou.

Je známo, že zinečnaté ionty inhibují amidolytickou a proteolytickou aktivitu rekombinantního FVIIa (Pedersen A.H. a spoi.: Thrombosis and Haemostasis 65, 528 (1991).). Překvapivě bylo nyní zjištěno, že přidání zinečnatých iontů lze použít ke kontrole autoaktivace FVII a k zabránění degradace FVII/FVIIa během čištění chromatografiemi na koloně.

Podstata vynálezu

Ve svém nejširším aspektu se tento vynález týká způsobu regulování aktivace a degradace FVII během čištění, při čemž se roztok faktoru VII podrobí četnýmchromatograf ickým čistícím. stupňům, při čemž Zn** jsou přítomny alespoň v jednom čistícím stupni.

V užším aspektu se tento vynález týká způsobu regulované aktivace a degradace FVII, při čemž se roztok FVII nanese na několik anexových a imunoafinitních kolon.

Ve výhodném uspořádání podle tohoto vynálezu se roztok FVII nanese na chromátografické kolony v následujícím pořadí: 1) anex, 2) imunoafitnitní kolona, 3) anex, 4) anex, při čemž Zn** jsou přítomny alespoň v prvních dvou stupních.

Obr.*l ilustruje aktivaci FVII v přítomnosti anexových kolon s různými koncentracemi Zn⁺*.

Obr. 2 ilustruje aktivaci rFVlI na rFVIIa během schémat čištění obsahujících v jednom nebo více čistících stupních Zn** v pufru.

Podmínky pro schéma A až E jsou uvedeny v tabulce I, výsledky jsou uvedeny v tabulce II.

Obr. 3 ilustruje degradaci FVIIa během schémat čištění obsahující Zn⁺* v pufru v jednom nebo více čistících stupních.

Podmínky pro schémata A až E jsou uvedeny v tabulce I, výsledky jsou uvedeny v tabulce II.

Před předložením vynálezu může být užitečné porozumět definicím některých pojmů, které se zde dále používají.

Pojem FVII zahrnuje FVII isolovaný z. plasmy nebo připravený technologií rekorabinantní DNA. Zahrnuje také allelové varianty, které mohou existovat a vyskytovat se od jednoho jednotlivce k druhému, a FVII proteiny modifikované delecemi a/nebo substitucemi zbytků aminokyselin, které po aktivaci mají stejnou nebo v podstatě stejnou biologickou aktivitu na srážení krve jako endogenní lidský FVIIa.

Pojem FVII podle shora uvedené definice zahrnuje také FVII proteiny s variacemi ve stupni a umístění glykosylace a/nebo jiných posttranslačních modifikací podle zvolených hostitelských buněk a podmínek kultivace, jestliže je exprimován technologií rekombinantní DNA.

Pojem biologická aktivita FVIIa se vyznačuje zprostředkováním srážení krve vnější cestou.

FVIIa aktivuje FX na FXa, který dále převádí protrombin na trombin a tím iniciuje tvorbu fibrinové sraženiny.

Pojem regulovaná aktivace a degradace zahrnuje proces aktivace a degradace FVII během Čištění podle zamýšlených regulovaných změn daného parametru (v tomto případě jde o pří5 tomnost Zn⁴‘).

V nepřítomnosti Žn** se parametry procesu čistění musí upravit podle současně probíhající aktivační a degradační reakce. V přítomnosti Zn** je možné regulovat tyto reakce nezávislým optimalizováním čištění a aktivace.

Lidský FVII se s výhodou exprimuje v transfektovaných savčích buňkách ledvin křečka BHK (Baby Hamster Kidney), jak je popsáno v evropské patentové přihlášce č. 86302855.1. Kultivační medium obsahující FVII a proteiny stimulující růst buněk se před chromatografickým čištěním oddělí od těchto buněk odstřelováním a filtrací.

Pro čištění se FVII adsorbuje na různých typech chromatograf ických matric, jako jsou : katexy, anexy, imunoafitnitní matrice, cheláty kovů, matrice afinitní na barviva, matrice s hydrofobními interakcemi a afinitní matrice s iroobilizovanými bio-specifickými ligandy. Mechanismus, kterým se FVII adsorbuje na různé matrice, je různý, a tedy vliv Zn⁺⁺ na aktivaci FVII může být různý, ale stále ještě významný během adsorpce na různé typy chromatografických matric.

Zinečnatá sůl se může přidat k jednomu nebo více roztokům eluátu a pufrů používaných pro ekvilibraci a eluci. Zinečnatou solí může být jakákoliv rozpustná zinečnatá sůl, jako je octan zinečnatý, citran zinečnatý, chlorid 2inečnatý nebo,síran zinečnatý.

Koncentrace Zn*⁺ je mezi 10 μΜ a 1 mM, s výhodou mezi 20μΜ a lmM, výhodněji mezi 40μΜ a lmM.

Následné aktivace vyčištěného FVII na FVIIa se může dosáhnout použitím FXIIa, jak popsali Hedner a Kiesel (J. Clin. Invest. 71, 1836 (1983).) nebo jinými proteasami, které mají trypsinu podobnou specifičnost (Kiesel a. Fujikawa: Behring Inst. Mitt. 73., 29 (1983).). FVII se může aktivovat také v pří6 tomnosti polymemích makromolekul, jako je polylysin, struktur matric, substituovaného agarosového gelu nebo membrán.

Příklady provedeni vynálezu

Pokusná část

Schéma čištění pro čištění a aktivaci rFVXI na rFVIIa se provádí následujícími čtyřmi po sobě jdoucími chromatografickýrai stupni: stupeň 1 = anex, stupeň 2 = imunoafinitní chromatografie, stupeň 3 = anex, stupeň 4 ~ anex.

Experimentální čištění se provádí tak, že některá schémata obsahují přidání zinečnaté soli ke všem pufrům jednoho nebo více chromatografických stupňů, jak je to uvedeno v tabulce I.

‘ Í

Experimentální podmínky jsou popsány v příkladech 2 až 4.

Referenční pokus (E) byl prováděn jako v příkladu 2 až na to, Že nebyl přidán octan zinečnatý. .«

Tabulka I

schéma čištění	chromatografický stupeň
1	2	3	4
A	-	+	+	+
B	-	+	+	-
' C	-	+	-	-
E (ref.pok.)	—	—	—	—

+/- znamená přítomnost nebo nepřítomnost zinečnaté soli v pufru

Eluát každého stupně byl testován na stupeň FVII aktivace (% FVII) a na obsah FVIla degřadačních produktů. Konverse FVII na formu FVIIa se dvěma řetězci byla měřena standardní polyakrylamidovou elektroforesou (PAGE) v dodecylsulfátu sodném (SDS) za redukčních podmínek v kombinaci s obarvením Coomassie modří a kvantitativním vyhodnocením laserovou densitometrií.

Obsah degradačních produktů FVIIa byl kvantitativně vyhodnocen vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na obrácených fázích (RP-HPLC) na koloně oxidu křemičitého s navázanými butylovými skupinami v lineárním acetonitrilovém gradientu.

Výsledky z pokusů prováděných v podstatě tak, jak je to popsáno v příkladech, jsou uvedeny v tabulce II a dále na obr. 2 a 3. Z obr. 2 je zřejmé, Že v přítomnosti zinečnatých iontů (čáry A, B a C) během imunoafinitního stupně (stupeň 2) a anexových stupňů (stupeň 3 a 4) (čáry A a B) vůbec nedochází nebo dochází jen k velmi omezené aktivaci rFVII.

Naproti tomu dochází k rozsáhlé aktivaci ve stupni 2 (čára E) a ve stupni 3 a 4 (čáry B, C a E) v nepřítomnosti zinečnatých iontů.

Je také zřejmé, že interakce zinečnatých iontů s FVII/ /FVIIa působící inhibiční efekt aktivace FVII, je reversibilní, neboť po odstranění zinečnatých iontů navázáním jako komplex s nadbytkem EDTA, se FVII během následujících stupňů čištění aktivuje (čáry B a C).

Ve stupni 1 v nepřítomnosti zinečnatých iontů zřetelně nedochází k žádné aktivaci. Může to být proto, že koncentrace FVII na koloně je mnohem nižší.

Eluát stupně 1, který byl používán ve všech pokusech, obsahoval méně než 1 % FVIIa.

Tabulka II - *

pokus	stupně čištění	Zn⁴*	% FVII % degradovaného FVIIa
(SDS-PAGE)	(RP-HPLC)
A+B	2	+	94	0
	3	+	92	0
A	4	+	89	<2
B	4	-	18	3,6
C	2	+	99	<2
	3	-	69	<2
	4	-	2	5,0
E	2	-	46	3,9
	3	-	19	4,6
	4	—	4	8,0

Příklad 1

Inhibice aktivace FVII během navázání na anex '

Vliv Zn⁺⁺ na aktivaci FVII byl testován v pokusu, v němž se vyčištěný FVII adsorbuje na matrici Q-sepharosy FF v přítomnosti různých koncnetrací Zn⁺*. 500 μς FVII se inkubuje s 50 μΐ Q-sepharosy FF V 800 μΐ pufru (lOmM Tris, 50mM NaCl, 2mM CaCl₂) s různými koncentracemi octanu zinečnatého v l,5ml zkumavkách. Po 1 h a po 2 h se odstřelováním usadí matrice á supernatant se odstraní. Přidá se 800 μΐ pufru (lOmM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, pH 8,0), směs se promíchá a po odstřeáování se odeberou a analyzují se SDS-PAGE na FVII/FVIIa vzorky supernatantu.

Výsledky (obr. 1) ukazují, že v nepřítomnosti Zn⁺⁺ se 55 % FVII aktivuje na FVIIa během lha více než 90 % se aktivuje po 2 hodinách.

V přítomnosti 10 μΜ Zn** se po 1 h aktivuje pouze 25 % a po 2 h pouze 73 %.

, V přítomnosti Zn** v koncentracích nad 40μΜ nebyla po 2 h pozorována žádná aktivace.

Z tohoto pokusu je zřejmé, že Zn** v koncetracích ΙΟμΜ až ΙΟΟμΜ má inhibiční účinek na aktivaci FVII v přítomnosti anexu. Je možné, že Zn** má vliv na aktivaci FVII při všech koncentracích Zn** v celém rozmezí od pod ΙΟμΜ do lmM.

Zdá se, že měněním koncentrace Zn** je možné regulovat rychlostní konstantu aktivace FVII a že vysoké koncentrace Zn** v podstatě chrání FVII před aktivací a tedy před degradací.

Příklad 2

Čištění a aktivace rFVII na rFVIIa byla prováděna následujícími čtyřmi chromatografickými stupni:

Stupeň 1:

Iontová síla kultivačního media obsahujícího rFVII se zředěním upraví pod 10 mS/cm. Toto medium se nanese na kolonu s Q-seoharosou předem ekvilibrovanou pufrem A: lOmM trihydroxymethýlaminomethan (Tris), 150mM NaCl, pH 8. Po stupni promývání 175mM NaCl ve stejném pufru se rFVII eluuje pufrem B: lOmM Tris, 150mM NaCl, 25mM CaCl_a, pH 8.

Stupeň 2:

Roztok eluátu obsahující 104 mg/1 rFVII byl upraven na konečné složení: lOmM Tris, 1M NaCl, 25mM CaCl_a, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5 a nanesen na kolonu se sepharosou s imobilizovanou anti-FVII monoklonální protilátkou. Kolona s protilátkou byla předem ekvilibrována pufrem C: lOmM Tris, lOOmM NaCl, 20mM CaCl_a, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5. Tato kolona se pak promývá lOmM Tris, 2M NaCl, 20mM CaCl_a, 70μΜ octanem zinečným, pH 7,5, následuje pufr C. Potom se eluuje rFVII/rFVIIá pufrem obsahují10 cím 75mM Tris, 30mM citran sodný, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5.

Stupeň 3:

Eluát se ihned nanese na kolonu s Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem: lOmM Tris, 150mM NaCl, 70μΜ octan zinečnatý, pH 8,6. Kolona se promývá stejným pufrem. rFVII/rFVIIa se eluuje lineárním gradientem od pufru A do pufru D: lOmM Tris, 500mM NaCl, 70μΜ octan 2inečnatý, pH 8,6.

Stupeň 4:

Frakce, která obsahuje rFVII/rFVIIa, se zředěním upraví tak, aby iontová síla byla pod 10 mS/cm a ihned se nanese na kolonu s Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem: lOmM glycylglycin, 150mM NaCl, 70μΜ octan zinečnatý, pH 8,6. Po promytí pufrem: lOmM glycylglycin, 175mM NaCl, 70μΜ octan zinečnatý, pH 8,6, a pufrem E: lOmM glycylglycin, lOOmM NaCl, 70μΜ octan zinečnatý, pH 8,6, se rFVII/rFVIIa eluuje lineárním gradientem od pufru E k pufru: lOmM glycylglycin, lOOmM NaCl, 15mM CaCl_s, 70μΜ octan zinečnatý, pH 8,6. Rychlost průtoku byla 1 objem/h.

Vyčištěný prostředek rFVHa měl následující vlastnosti: obsah rFVIIa: 345 mg/1 měřeno UF spektroskopií (OD 280),? obsah cizích proteinů: <1 % hmot. podle RP-HPLC, obsah rFVII: 89 % hmot. podle SDS PAGE a obsah degradačnich produktů rFVIIa: <2 % hmot. podle RP-HPLC.

Příklad 3

Čištění a aktivace rFVII na rFVIIa se provádí následující chromatograf ickými stupni:

Stupeň 1:

Iontová síla kultivačního media obsahujícího rFVII se zředěním upraví pod 10 mS/cm. Toto medium se nanese na kolonu s

Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem A: lOmM trihydroxymethyIaminomethan (Tris), 150mM NaCl, pH 8. Po stupni promýváni

175mM NaCl ve stejném pufru se rFVII eluuje pufrem B: lOmM

Tris, 150mM NaCl, 25mM CaCl₂, pH 8.

Stupeň 2:

Roztok eluátu obsahující 104 mg/1 rFVII byl upraven na konečné složeni: lOmM Tris, 1M NaCl, 25mM CaCl₂, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5, a nanesen na kolonu se sepharosou s imobilizovanou anti-FVII monoklonální protilátkou. Kolona s protilátkou byla předem ekvilibrována pufrem C: lOmM Tris, lOOmM NaCl, 20mM CaCl₂, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5. Tato kolona se pak promývá lOmM Tris, 2M NaCl, 20mM CaCl₂, 70μΜ octanem zinečným, pH 7,5, následuje pufr C. Potom se rFVII/rFVIIa eluuje pufrem obsahujícím 75mM Tris, 30mM citran sodný, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5.

Stupeň 3:

Eluát se ihned nanese na kolonu s Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem: lOmM Tris, 150mM NaCl, 70μΜ octan zinečnatý, pH 8,6. Kolona se promývá stejným pufrem. rFVII/rFVIIa se eluuje lineárním gradientem od pufru A do pufru D: lOmM Tris, 500mM NaCl, 70μΜ octan zinečnatý, pH 8,6.

Stupeň 4:

Frakce, která obsahuje rFVII/rFVIIa, se upraví tak, aby obsahovala 2mM ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA), zředěním se upraví tak, aby iontová síla byla pod 10 mS/cm a ihned se nanese na kolonu s Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem: lOmM glycylglycin, 150raM NaCl, pH 8,6. Po promytí pufrem: lOmM glycylglycin, 175mM NaCl, pH 8,6 a pufrem E: lOmM glycylglycin, lOOmM NaCl, pH 8,6, se rFVII/rFVIIa eluuje lineárním gradientem od pufru E k pufru: lOmM glycylglycin, lOOmM NaCl, 15mM CaCl₂, pH 8,6. Rychlost průtoku byla 1 objem/h.

Vyčištěný prostředek rFVIIa měl následující vlastnosti: obsah rFVIIa: 492 mg/1 měřeno UF spektroskopií (OD 280), obsah cizích proteinů: <1 % hmot. podle RP-HPLC, obsah rFVII: 18 % hmot. podle SDS PAGE a obsah degradačních produktů rFVIIa: 3,6 % hmot. podle RP-HPLC.

Příklad 4

Čištění a aktivace rFVII na rFVIIa se provádí následujícími čtyřmi chromatografickými stupni.

Stupeň 1:

Iontová síla kultivačního media obsahujícího rFVII se zředěním upraví pod 10 mS/cm. Toto medium se nanese na kolonu s Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem A: lOmM trihydroxymethylaminomethan (Tris), 150mM NaCI, pH 8. Po stupni promývání 175mM NaCI ve stejném pufru se rFVII eluuje pufrem B: lOmM Tris, 150mM NaCI, 25mM CaCl₂, pH 8.

Stupeň 2:

Roztok eluátu obsahující 104 rag/1 rFVII byl upraven na konečné složení: lOmM Tris, IM NaCI, 25mM CaCl₂, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5, a nanesen na kolonu se sepharosou s imobilizovanou anti-FVH monoklonální protilátkou. Kolona s protilátkou byla předem ekvilibrována pufrem C: lOmM Tris, 100mM NaCI, 20mM CaCl_a, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5. Tato kolona se pak promývá lOmM Tris, 2M NaCI, 20mM CaCl_s, 70μΜ octanem zinečným, pH 7,5, následuje pufr C. Potom se rFVII/rFVIIa eluuje pufrem obsahujíjcím 75mM Tris, 30mM citran sodný, 70μΜ octan zinečnatý, pH 7,5.

Stupeň 3:

Eluát se upraví tak, aby obsahoval 2mM EDTA a ihned se nanese na kolonu s Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem: lOmM Tris, 150mM NaCI, pH 8,6. Kolona se promývá stejným pufrem. rFVII/rFVIIa se eluuje lineárním gradientem od pufru A do pufru D: lOmM Tris, 500mM NaCI, pH 8,6.

Stupeň 4:

Frakce, která obsahuje rFVII/rFVIIa, se zředěním upraví tak, aby iontová síla byla pod 10 mS/cm a ihned se nanese na kolonu s Q-sepharosou předem ekvilibrovanou pufrem: lOmM glycylglycin, 150mM NaCI, pH 8,6. Po promytí pufrem: lOmM glycylglycin, 175mM NaCI, pH 8,6, a pufrem E: lOmM glycylglycin, lOOmM NaCl, pH 8,6, se rFVII/rFVlla eluuje lineárním gradientem od pufru E k pufru: lOmM glycylglycin, lOOmM NaCl, 15mM CaCl₂, pH 8,6. Rychlost průtoku byla 1 objem/h.

Vyčištěný prostředek rFVIIa měl následující vlastnosti: obsah rFVIIa: 1,2 mg/1 měřeno UF spektroskopií (OD 280), obsah cizích proteinů: <1 % hmot. podle RP-HPLC, obsah rFVII: 1 % hmot. podle SDS PAGE a obsah degradačních produktů rFVIIa: 6,7 % hmot. podle RP-HPLC.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob regulované aktivace a degradace faktoru VII během čištění, vyznačující se tím, že roztok faktoru VII se podrobí několika chromatografickým čistícím stupňům, při čemž Zn” je přítomen alespoň v jednom z těchto čistících stupňů.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se • t í m, že roztok faktoru VII se nanese,na několik anexových nebo imunoafinitních chromatografických kolon.
3. Způsob podle nároku 1 až 2 , vyznačující se t í m, že Zn” je přítomen ve formě rozpustné zinečnaté soli.
4. Způsob podle nároku 1 až 3 , vyznačující se t í m, Že Zn” je přítomen v koncentraci od 10 μΜ do 1 mM,
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t í m, že Zn” je přítomen v koncentraci od 20 μΜ do 1 mM.
6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že Zn” je přítomen v koncentraci od 40 μΜ do 1 mM.
7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že roztok faktoru VII se nanese na chromatografické kolony v následujícím pořadí: a) anexová, b) imunoafinitní, 3) anexová, 4) anexová kolona a že Zn” je přítomen alespoň ve dvou stupních.