JPH08508641A

JPH08508641A - ウイルスタンパク質による免疫応答刺激

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Publication number: JPH08508641A
Application number: JP6520753A
Authority: JP
Inventors: エーテル，クリスチヤン; フオン・ホエゲン，ポール; シールマクセル，ボルカー
Original assignee: ブリテイツシユ・テクノロジー・グループ・リミテツド
Priority date: 1993-03-16
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 1996-09-17
Also published as: AU6247794A; WO1994021798A1; ATE208421T1; KR960701208A; EP0689596B1; CA2158461A1; DE69428984T2; ZA941853B; AU675703B2; DE69428984D1; EP0689596A1

Abstract

(57)【要約】ヒトの細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の抗原特異的刺激増強用薬剤を製造するための、いずれの場合にも天然パラミクソウイルスを含まない、パラミクソウイルス、特にニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質、そのＴ細胞刺激増強ペプチド又は前記タンパク質若しくはペプチドをコードするＤＮＡの使用。本発明はさらに、ＨＮタンパク質若しくはペプチド又はそれをコードするＤＮＡによって感染させた抗原提示細胞からなるワクチンを含む。

Description

【発明の詳細な説明】ウイルスタンパク質による免疫応答刺激発明の背景１．発明の分野本発明は免疫学の分野にあり、一つの特定の形態の免疫応答を刺激する、即ち、抗原特異的細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）応答を増大させるための、好ましくはウイルスｃＤＮＡから発現した特定のウイルスタンパク質の使用に関する。２．関連技術の説明病原性抗原に対する細胞性免疫応答には幾つかの段階がある。最初の段階で、病原体はマクロファージに取り込まれる。マクロファージは抗原を小さなフラグメントに処理してＴ細胞に提示する。そのようなマクロファージは抗原提示細胞（ＡＰＣ）として知られている。この段階でＴ細胞は、該抗原を主要組織適合性複合体抗原の介在により異物として認識する。リンパ球であるＴ細胞は、マクロファージが産生したインターロイキン−１に支援されて機能特化性Ｔ細胞の産生を刺激する。これらのＴ細胞には、ＣＤ４⁺で表される表現型を有するヘルパーＴ細胞が含まれる。ヘルパー細胞は、インターロイキン−２の助けを借りて、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても知られているキラーＴ細胞の産生を刺激する。キラーＴ細胞はＣＤ８⁺で表される表現型を有している。ＣＴＬは抗原特異的である。ＣＴＬは、外来抗原を認識すると、溶解反応により該抗原を含む細胞を殺す。人体が有する生得のフィードバック機構により、人体に侵入した特定の外来抗原との戦いに役立つ機能性ＣＴＬの数が増大する。しかし、療法においては特定抗原に対する細胞性応答を増大させることが望ましい場合がある。 γ−インターフェロン〔M.M．Simonら，J．Immunol．136，2755-2762（1986）〕又はα／β−インターフェロン（L.K．Chenら，Eur．J．Immunol．16，767-77 0（1986）；P．von Hoegenら，Cellular Immunology 126，80-90（1990）〕のようなサイトカイン、又はニワトリのウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）〔P．von Haegen及びV.Schirrmacher，Annals N.Y．Acad．Sci．532，4 68-471（1988）；P．von Haegenら，J．Immunol．18，1159-1166（1988）〕に感染させた抗原含有細胞を用いてマウスを免疫感作して抗原提示細胞（ＡＰＣ）を修飾することにより、抗原特異的ＣＴＬ応答を増大させ得る。直腸結腸ガンにかかっている患者を該患者から採取してＮＤＶで処理したガン細胞を用いて治療することが、W．Liebrich ら，Eur．J．Cancer 27，703-710（1991）及びP．Schlagら，Cancer Immunology and Immunotherapy，35，325-330（1992）により開示されている。抗原特異的ＣＴＬ応答を増大させる他の手段を見いだすことが望ましい。サイトカインは大量に投与しなければならず、それによって毒性問題が起る。全ＮＤＶに感染させると、ウイルスがヒヨコ卵内で増殖すること及び異なる成分のタンパク質が及ぼし得る作用を考慮すれば、安全性及び生殖性について困難が生じる。本発明の知識を用いればその関連性が明らかになる他の従来技術は、「発明の要旨」の項に記載する。３．発明の要旨本発明により、ヒトの抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激を増大させるための、いずれの場合においてもその天然パラミクソウイルスを含まず且つＨＮタンパク質に対するいかなる関連特異的抗体をも含まない、パラミクソウイルス、特に、ＮＤＶの血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質をコードするＤＮＡ又はＨＮタンパク質自体の新規な医学的な使用が提供される。ＨＮタンパク質から誘導され得且つ刺激増強作用を有するペプチド及び該ペプチドをコードするＤＮＡの同様な使用も本発明に含まれる。本発明は、ヨーロッパにおける上記目的用の薬剤を製造するための使用、及び米国における前記目的に有効な量のＤＮＡ又はタンパク質をヒト患者に投与することを含む前記刺激の増強法を含む、英国特許法要件に従う種々の方法で表現し得る。通常、ＨＮＤＮＡ又はＨＮタンパク質は、外来抗原に感染しているか又は既に該抗原を発現しており且つＨＮＤＮＡによって感染するか又はＨＮタンパク質と共にインキュベートされた細胞の形態で投与される。この文脈における「感染」という用語は、エレクトロポレーション又はしばしば「トランスフェクション」と称されるリン酸カルシウム沈降法のような方法並びに例えばレトロウイルス又はポックスウイルスにおけるようなＤＮＡ用のウイルスベクターを用いた感染を含む広義で用いられる。「その天然パラミクソウイルスを含まない」という用語は、単にＮＤＶ又は他のパラミクソウイルスの全粒子の使用を含まないように意図されていることを明確にするものである。第１の可能性は、罹患している患者から、細胞、例えば腫瘍細胞を取り出す。これらの細胞を、例えば照射により不活化し、ＨＮＤＮＡにより感染させるか又はＨＮタンパク質を担わせ、次いで患者に投与し返す。第２の可能性は、本発明をより一般的にはワクチンの投与に用いる。マクロファージ又は他のＡＰＣ、例えば任意のＨＬＡクラスＩ又はII発現細胞を患者から分離するか又は培養中で増殖させて患者のＭＨＣと適合させ、Ｔ細胞エピトープ担持ペプチド又は他の好適な抗原と共にインキュベートし、ＨＮＤＮＡにより感染させるか又はＨＮタンパク質を担わせる。従って本発明はさらにヒト患者の疾患との闘いに用いるのに好適なＴ細胞性免疫応答を増大させ得るワクチンを提供し、該ワクチンは、疾患に対して高い特異性を有する抗原を提示し且つパラミクソウイルスのＨＮタンパク質、そのＴ細胞刺激増強ペプチド又は前記タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡからなるＨＮタンパク質供給成分を含む患者に寛容な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、それによって、罹患細胞の細胞溶解反応に対して高い特異性を有する細胞障害性Ｔ細胞の生体内刺激がＨＮタンパク質供給成分によって増大する。一つの態様において、ＡＰＣは、治療を受ける患者又は適合するＭＨＣ型を有するドナー患者から既に分離されている不活化罹患細胞から得られる。従来技術についてのさらなる説明多くの可能な方法の中で、本発明はＮＤＶをベースとする方法を用いてさらに研究を進めることを選択した。ＮＤＶは、６個の遺伝子（３′−ＮＰ−Ｐ−Ｍ− Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５′）をコードする長さ約15kbの負極性の一本鎖ＲＮＡを有するニワトリのパラミクソウイルスである。ＮＤＶのＨＮは、ウイルスのエンベロープから突出し、血球凝集活性（ＨＡ）とノイラミニダーゼ活性（ＮＡ）〔N.S．M illarら，J．Gen．Virol．67，1917-1927（1986）〕とを有する74kD膜糖タンパク質である。ＨＮタンパク質は、ウイルスの宿主細胞受容体への結合の調節に重要な役割を果たす。しかしＨＮタンパク質は宿主の細胞性免疫応答のための主要標的としての役目は果たさず、宿主の細胞性免疫応答は、インフルエンザウイルスの場合に見られるように、ＮＰに向けられる可能性が最も高い。ノイラミニダーゼが免疫応答に関係しているという示唆がなされている。R.L．Simmons及びA．Rios，Cancer，34，1541-1547（1974）は、同系のマウスにしっかり樹立された腫瘍は、試験管内でＶｉｂｒｉｏＣｈｏｌｅｒａｅノラミニダーゼ（ＶＣＮ）に暴露された生腫瘍細胞でチャレンジすると退行すると報告した。ノイラミニダーゼは細胞表面で作用して末端のシアル酸残基を除去させることが示唆された。しかし同著者らは、ＶＣＮの代わりにコンコナバリンＡを用いた場合、腫瘍に同様な作用を及ぼすことについて満足すべき説明を与えることができなかった。15年後、ＮＤＶＨＮ遺伝子を含むレトロウイルスを用いてトランスフェクトしたヒヨコ細胞がＮＤＶ及びインフルエンザウイルスによる感染に対して耐性を有することが見いだされた。これも、ノイラミニダーゼによる細胞受容体の破壊によるものであると推測された〔T.G．Morriso n及びL.W．McGinnes，Virology 171，10-17（1989）〕。しかし、該著者らは、免疫応答を高めるためのＨＮ遺伝子のより一般的な作用についてはなんら示唆しなかった。米国特許第５，１２４，１４８号明細書（United Cancer Research Institute への権利譲渡人であるCsatary及びMassey）は、ＡＩＤＳにかかっているヒトに、ＮＤＶ（Ｈ株）のような弱毒化ニワトリパラミクソウイルス1000単位を、少なくとも４週間の間一週間に１回筋肉内注射により投与して、該患者のＴ−４ヘルパー誘発性Ｔ細胞、白血球及び血小板の数を有意に増大させる方法を権利請求している。Ｔ細胞の活性を増大させることについては何ら言及されていない。該明細書はさらに、病原性リンパ腫ウイルスをＮＤＶと一緒に接種した場合に、該ウイルスに感染したマウスの生存を含む、ニワトリのパラミクソウイルスの他の免疫作用についても記載している。該明細書は、「精製されたＲＮＡのようなウイルス成分」に言及しながら、全弱毒化ウイルス製剤以外の他のウイルス形態も使用し得ると主張しているが、その詳細については記載していない。従って、ＮＤＶのＨＮ遺伝子が免疫応答を高めることについて何のヒントも与えていないし、ノイラミニダーゼが特定の細胞受容体を破壊し得るという上記の先の推測だけに基づいてそのように仮定するのは自明ではない。 R.E．Randall及びD.F．Young，J．Gen．Virol．69，2505-2516（1988）は、ＨＮタンパク質を含むＳｉｍｉａｎＶｉｒｕｓＳＶ５タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を合成し、これらの抗体を固形マトリックス（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎＡ株の懸濁液）に複合させて、該複合体をＳＶ５タンパク質の免疫精製に使用する方法を記載している。得られた固形マトリックス−抗体−ＳＶ５ＨＮ抗原（ＳＭＡＡ）複合体を用いてマウスを免疫感作した。該複合体は、体液性応答及び細胞性応答の両方を誘発した。細胞性応答を非複合ＳＶ５ＨＮから得られうる応答と比較することはしなかった。該論文は、この結果をＳＭＡＡ提示法に帰するものと解釈しているが、ＨＮタンパク質がそれ自体Ｔ細胞の刺激物質であり得ることは全く示唆していない。ＳＶ５ＨＮを該抗原に対して特異的な抗体との複合体として提示することはさして実用的ではない。何故ならば、それはそのような抗体の使用の安全性に関してさらに問題を提起することになり、従って本発明の範囲から除外する。図面の簡単な説明図１は、プラスミドｐＳＶＬ−ＨＮ．１（公知のプラスミドから容易に誘導される）の使用を容易にするために追加のＢａｍＨＩ制限部位を導入し、該プラスミドｐＳＶＬ−ＨＮ．１を発現プラスミドｐ３６／７のＢａｍＨＩ部位に挿入する方法を示している。図２は、ＮＤＶＨＮｃＤＮＡが挿入されたプラスミドであるプラスミドｐ３６／７−ＨＮ．２をより詳細に示している。図３Ａ〜図３Ｃは、ＮＤＶＨＮｃＤＮＡを用いてトランスフェクトしたマウスのＬｔｋ^-細胞におけるＨＮ発現及びノイラミニダーゼ活性の発現の測定結果を示している。図４は、エフェクター細胞（ペプチドで及びＮＤＶＨＮでプレインキュベートしたマウスのＬｔｋ^-細胞）及びペプチド細胞と共にプレインキュベートした標的マウスのＬｔｋ^-細胞の種々の異なる比率での非特異的細胞障害性作用と比較したペプチド特異的細胞障害性作用を示している。図５は、種々の特異的細胞を有するマウスに、ＮＤＶを用いてプレトランフフェクトしたか又はしていないこれらの細胞を接種したときの10⁶細胞当たりの溶菌単位の刺激指数を示している。好ましい実施態様の説明本発明は一つの態様において、ＨＮタンパク質をコードするウイルスｃＤＮＡの使用を必要とする。これは、単にゲノムＲＮＡをコビーするか、又は遺伝子コードが同一のアミノ酸配列をコードするように遺伝子コードの縮重の範囲内又はアミノ酸をわずかに改変させる変異内でわずかな変更を加えるだけでよく、それによってタンパク質の機能が不利に変ることはない。通常、全長のＤＮＡを用いる、即ち、全ＨＮ遺伝子をコードするように企図されるが、実験によって、より短くはあっても使用可能な長さの遺伝子を見いだすのが簡単であることは明らかである。ＨＮタンパク質又はその一部が、例えば選択された細胞、特に十分量のシアル酸を発現しない細胞に結合する細胞表面結合能を有するタンパク質に融合した融合タンパク質を合成することも可能である。例えば、ＨＮタンパク質又はその一部を哺乳類細胞の上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体に結合し得るＥＧＦタンパク質に融合させることも可能である。以下に本発明を主としてＮＤＶのＨＮタンパク質に関して説明するが、ＮＤＶのＨＮタンパク質と近い相同性ＨＮタンパク質を有する他のパラミクソウイルスが存在することが理解されよう。本発明は、そのようなタンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡの使用を含む。例としては、そのＨＮｃＤＮＡがN．Miuraら，FEBS188（１），112-116（1985）によりクローン化されたセンダイウイルス、及びヒトのパラミクソウイルス又はパラインフルエンザウイルスがある。特に本発明は、アミノ酸レベルで、より好ましくはタンパク質をコードするｃＤＮＡレベルで、少なくとも70％のＮＤＶＢｅａｕｄｅｔｔｅＣ株のＨＮタンパク質との相同性（恒等性）を有するＨＮタンパク質の使用を含む。この定義には、Ｈｉｔｃｈｉｎ、Ｕｌｓｔｅｒ２Ｃ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｉｔａｌｉｅｎなどのような実質的に全てのＮＤＶ株が含まれるのは勿論である。ウイルスの複製には、生体内でタンパク質の連続的な供給を得ることを確実にしなければならず、これは単にタンパク質自体を一緒に投与しても達成し得ないので、一般にタンパク質自体よりウイルスｃＤＮＡを使用するほうが有利である。免疫感作は、例えば、移植片／宿主拒絶反応を回避するために、患者自身の細胞、特に、マクロファージを含む細胞、又は当該抗原及びＨＮＤＮＡを含む患者に寛容な他の細胞を患者に静脈注射して接種することにより行うことが可能である。ＨＮＤＮＡを含むレトロウイルスベクターによってＨＮＤＮＡを導入するのが好ましい〔J．Priceら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84 156-160（1987）を参照されたい〕。あるいは、細胞を適切なプラスミドからのＤＮＡを用いてトランスフェクトする。このためには、好適なプロモーター、例えばメタロチオネインプロモーターの制御下にＤＮＡを真核細胞発現ベクターに挿入する。ベクターはさらに真核細胞に用いるための少なくとも一つの薬剤耐性標識をも含んでいるのが好ましい。次いで寛容性細胞をリン酸カルシウム沈降法によりＨＮＤＮＡを用いてトランスフェクトする。あるいは、ＨＮＤＮＡを身体の腫瘍又は他の感染領域に直接注射し得るアデノウイルスベクターに組み込むことが可能である〔B．Q uantinら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，2581-2584（1992）を参照されたい〕。本発明のワクチンは、任意の標準的な方法で調剤することが可能であり且つアジュバントを含んでいてよい。本発明はさらに、上記及び／又は実施例に記載のような、ＤＮＡによりＡＰＣを適切に感染させるか又は関連抗原と共にインキュベートすることによるワクチンの製造をも含む。ＨＮタンパク質又は該タンパク質を発現するＤＮＡの用量は、10〜100、好ましくは20〜60HU/10⁷ＡＰＣを提案する。この用量は、全ＮＤＶのフェースII試行で用いられた32HU/10⁷細胞の用量と一致する〔上記に引用したP．Schlagらの論文を参照されたい〕。本明細書に提示されている結果は、新規な発見、即ち、ＡＰＣ中のＨＮ遺伝子産物の発現が該産物の抗原提示能を増強させ得ることを示している。これは、ペプチド及び腫瘍抗原に対する二次応答のような弱い免疫応答に特に適切である。本発明は主としてガン抗原に関し、ガン抗原の中のいくつかは、免疫応答の刺激において抗原として弱い作用しか有していない。その一つの例としては、高転移性ＥＳｂリンパ腫によりマウスに産生するものと類似の腫瘍関連抗原がある。他の例は、P．Van der Bruggenら，Science 254，1643-1647（1991）により記載されているヒト黒色腫抗原である。非発ガン性タンパク質の点変異から発生する抗原の他の例は該論文から明らかであろう。非発ガン性抗原の中では、リステリア抗原及びウイルス抗原、特にＨＩＶ− １のgp120又は160が特に興味深いものである。本発明の他の使用は、ＡＰＣにペプチド及びＨＮＤＮＡを与え、次いで一つの特定の関連抗原を認識する免疫細胞を刺激するＡＰＣの能力について試験することにより、ペプチドを抗原として機能するその能力についてスクリーニングする場合である。以下の実施例により本発明を説明する。実施例１（ａ）真核細胞プラスミドベクターｐ３６／７−ＨＮ．２の構築Ｅ．ＣｏｌｉのプラスミドｐＵＣ１９上の全長ＮＤＶ（ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣ．株）ＨＮ遺伝子のクローンの構築については既に記載されている〔P．Chamb ersら，J．Gen．Viro1．69，2115-2122（1988）；European Patent EP-B 227 41 4（British Technology GroupLtd.）〕。全長ＨＮＮＤＶＤＮＡを含むプラスミド（ｐＵＣ１９）上のＥ．Ｃｏｌｉのこのクローンは、International Reco gnition of the Deposit of Micro-organisms for the Purposes of Patent Pro cedureに関するBudapest Treatyの規定の下に、1986年７月１日、受託番号NCIMB 12278の下に、Nationa l Collections of Industrial and Marine Bacteria（MCIMB），23 St．Machar Drive，Aberdeen AB2 IRY，Scotlandに寄託された。この寄託物は、EP-B 227 41 4号に関連してEuropean Patent Officeを介して既にアクセスすることが可能である。ウイルスのゲノムＲＮＡ由来のクローンは、ＨＮ遺伝子の上流にＮＤＶＦ遺伝子の３′領域を含んでいる。クローンの５′末端にはＳｐｈＩ部位〔EP-B 2 27 414号に記載の配列中の1610-1615位、又はN.S．Millarら，J.Gen．Virol 67 ，1917-1927（1986）では1-6位〕があり、該部位は、ＨＮ開始コドンの上流の30 4ヌクレオチドである。該クローンは、ＨＮコード配列の末端から下流の87ヌクレオチドであるＳｓｔＩ部位〔EP-B 227 414号では3733-3738位又はMillarら（1 986）では2124-2129位〕まで伸びている。このクローンの３′非コード配列及びＦコード配列は７個の追加潜在開始コドンを含んでいる。ＨＮ遺伝子を効率的に発現させるために、この上流配列をエキソヌクレアーゼ消化により除去した。プラスミドをそのユニークＳｐｈＩ３′クローン化部位でリニアライズし、リニアライズされたプラスミド25μlを、0.6MのＮａＣｌ、12mMのＣａＣｌ₂、12mMのＭｇＣｌ₂、0.2mMのＥＤＴＡ及び20mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.0）を含む緩衝液200μl中１単位のＢａｌ３１と共に37 ℃でインキュベ′した。アリコート（20μl）を30秒〜15分で除去し、各アリコートを200mMのＥＤＴＡ２μlに添加して反応を停止し、次いで65℃で５分間加熱して不活化した。消化されたＤＮＡの末端に、４種のｄＮＴＰ（各５μM）全ての存在下にＤＮＡポリメラーゼ１（１単位）のクレノウフラグメントを加えて修復した。加熱により不活化した後、切欠プラスミドをＳｓｔＩで切断した。各時点由来の欠失フラグメントを別々にＭ１３多重クローン化部位中のＳｍａＩ及びＳｓｔＩ部位でＭ１３ｍｐ１８に連鎖した。Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換した後、各時点由来の個々のプラークを分離し、それらを挿入配列した。３′ＳｐｈＩ部位からＨＮ遺伝子全体の点への一連の欠失を得た。ＨＮ翻訳開始部位の上流の101 ヌクレオチド点が欠失し、該点から上流の全ての潜在開始コドンが除去されたＭ１３組換え体（Ｍ１３−ＨＮ１０）を同定した。ＸｂａＩ（Ｍ１３多重クローン化部位中）及びＳｓｔＩ（ＨＮｃＤＮＡの５′末端）でＭ１３−ＨＮ１０からの挿入体を切り出し、4.9kbプラスミド発現ベクターｐＳＶＬ（Pharmacia）の多重クローン化部位中のＸｂａＩ及びＳａｃＩ（ＳｓｔＩ）部位にサブクローン化して、プラスミドｐＳＶＬ−ＨＮを得た。該プラスミドは図１に概略的に示されており、そのサイズは約6.7kbである。図１を参照すると、よりよい発現を得るために、ＨＮ配列のすぐ上流でプラスミドを切断するＸｂａＩでｐＳＶＬ−ＨＮプラスミドを消化した。ＸｂａＩ部位を充填し、ＢａｍＨＩ部位に転換させた。次いでＨＮ遺伝子の上流と下流を切断するＢａｍＨＩによりプラスミドからＨＮ遺伝子を切り出し、ＢａｍＨＩ切断プラスミドｐ３６／７に連鎖し、再環化させて、プラスミドｐ３６／７−ＨＮ．２を合成した。該プラスミドはＳＶ４０Ｅプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子（ｐＳＶ−ネオプラスミド由来）、メタロチオネイン（ＭＩ_II）プロモーター、ＨＮ遺伝子及びポリＡシグナルから構成されている。図２はこのプラスミドｐ３６／７−ＨＮ．２を拡大してより詳細に示している。（ｂ）ＮＤＶＨＮｃＤＮＡでトランスフェクトされたマウスの線維芽細胞がＨＡ及びＮＡを発現することの証明 S．Kitら，Exp．Cell．Res．37，291-312（1963）により記載されているマウスの線維芽細胞系Ｌｔｋ^-は、以下の実験に用いたマウスのＴ細胞による認識に適当な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する細胞を提供する。トランスフェクションに使用する24時間前に、Ｌｔｋ^-細胞を１皿当たり10⁶細胞の密度でまいた。M．Wiglerら，Cell 14，725-731（1978）によって記載されているように、プラスミドｐ３６／７−ＨＮ．２由来のＤＮＡ（20μg）のリン酸カルシウム沈降物を調製した。沈降したＤＮＡにＬｔｋ^-細胞を６時間暴露し、次いで15％グリセロールを含むハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）培地で３分間衝撃を与えた。24時間後、600μg/mlのＧ４１８を用いてトランスフェクトした細胞を選択した。２〜３週後、Ｇ４１８耐性コロニーを限界希釈法によりクローン化した。ＮＤＶＨＮｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした細胞をＥＤＴＡで処理して培養プレートから取り出し、２度洗浄し、ＮＤＶＨＮタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（８Ｃ１１）又は、対照として、ＮＤＶＦタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（１２Ｃ４）若しくはＰＢＳと共に４℃で20分間インキュベートした。モノクローナル抗体はどちらもD．Meulemans（Brussels）が親切にも提供してくれたものであった〔L．Longら，J．Virol．5 7 ，1198-1202（1986）を参照されたい〕。次いで細胞をＰＢＳ／２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で２度洗浄した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とマウスＩｇに対するヤギの抗体との結合体を50μlのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１／100に希釈したものを、４℃で30分かけて加えた。細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２度洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ蛍光分析器（ Becton Dickinson）により分析した。この分析においては、ＬＹＳＩＳ IIソフトウエアを用いて、10,000個の細胞から細胞１個当たりの相対蛍光強度を計算した。ノイラミニダーゼの検定には、新規な蛍光定量法を開発した。ノイラミニダーゼ発現Ｌｔｋ^-細胞を成長させた。ノイラミニダーゼ発現細胞をＰＢＳ中で１時間37℃でヒツジの赤血球（ＳＲＢＣ）（0.1％）と共に10⁷細胞/mlでコインキュベートした。ノイラミニダーゼは、ＳＲＢＣの表層上に存在するピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）に対する受容体を明らかにした（unmasked）。明らかにされた受容体を検出するために、細胞を２度洗浄し、ＦＩＴＣ標識ＰＮＡ（3.125mg/ml）と共に20分間室温でインキュベートした。２度洗浄した後、上記分析器で流動細胞計測法によりＳＲＢＣを分析した。前方及び側方散乱通門の組み合わせによりＬｔｋ^-細胞を分析から除外した。結果を図３に示す。ＨＮ発現（図３Ａ）とノイラミニダーゼ活性（図３Ｂ）との関係を示すために、図３ＡのＨＮ発現分析の結果を、実験グループ（抗ＨＮ）の平均蛍光と適切な対照の平均蛍光との比率で表した蛍光として図３Ｃに再提示する。対照は、（ａ）Ｌｔｋ^-ＮＤＶ（全ウイルス）についてＰＢＳ処理したもの、及び（ｂ）Ｌｔｋ^-ＮＤＶＨＮｃＤＮＡトランスフェクトグループに対する抗Ｆタンパク質抗体と共にインキュベートしたＬｔｋ^-細胞であった。両方のパラメーターの発現を、疑似感染Ｌｔｋ^-細胞（Ｌｔｋ−ネオＡ４）及び胚形式ヒヨコ卵の尿膜腔に増殖した株Ｕｌｓｔｅｒ２Ｃの全ＮＤＶI00血球凝集素単位（ＨＵ）／10⁷細胞で感染したＬｔｋ^-細胞（Ｌｔｋ^-ＮＤＶ）と比較した。血球計算分析して選択した３種のクローン、即ち、Ｌｔｋ^-−ＨＮ．のＡ２、Ａ３及びＡ４は、図３Ｂ及び図３Ｃに示されている相対活性から見られるように、ＨＮとＮＡの両方を発現した。クローンＬｔｋ^-−ＨＮ．Ａ２は、ＨＮ及びＮＡの最高の発現を示し、これは、全ＮＤＶ感染Ｌｔｋ^-細胞に見られる活性を超える程でさえある。他の２種のクローン（Ｌｔｋ^-−ＨＮ．Ａ３及びＬｔｋ^-−ＨＮ．Ａ４）は、弱くてはあっても有意な発現を示している。（ｃ）抗原（ペプチド）特異的抗原提示細胞の合成マウスのＬｔｋ−細胞をＥＤＴＡで処理して培養液から除去し、10μg/mlのインフルエンザヌクレオタンパク質ペプチド５０−６３（ＮＰ５０−６３）を含む10％ＦＣＳ（Gibco BRL）を含む培地ＲＰＭＩ（Gibco BRL）中に107細胞/mlで懸濁した。37℃で１時間インキュベートした後、細胞を新鮮な培地で２度洗浄した。（ｄ）ＮＤＶＨＮｃＤＮＡの発現がＣＴＬの抗原（ペプチド）特異的刺激を増強することの証明 50μlのフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中100μgのペプチドＮＰ５０−６３を用いてＣ３Ｈマウスを尾の基部で免疫感作した。10日後、10μg/mlのペプチドＮＰ５０−６３を含む培地中37℃で１時間プレインキュベートしたＬｔｋ^-細胞を用いて脾細胞を生体内で再刺激し、ＮＤＶＨＮｃＤＮＡを用いてトランスフェクトするか又は先に記載のように全ＮＤＶに感染させた。再刺激された脾細胞は、ＮＰ５０−６３ペプチドに特異的となった細胞障害性Ｔ細胞を含むＴ細胞を含んでいる。これらの細胞は「エフェクター細胞」と称されている。ＡＰＣについて上記（ｃ）項に記載したように、⁵¹Ｃｒ標識し、次いでプレインキュベートした、ペプチドＮＰ５０−６３を含むか又は含まないＬｔｋ^-「標的細胞」に対する標準４−ｈ⁵¹Ｃｒ放出検定でエフェクター細胞のペプチド特異的細胞障害性を測定した。エフェクター細胞と標的細胞との細胞数比は、例えば、50：１、25：１、12：１及び６：１といった種々の異なる比率を用いた。結果を図４に示す。該図には、種々の異なる実験における細胞溶解反応が示されている。３種のＨＮ発現Ｌｔｋ^-−ＨＮクローン全てがＬｔｋ^-及びＬｔｋ^-ネオ対照より強力なペプチド特異的ＣＴＬ活性の活性化を誘発した。Ｌｔｋ^-−ＨＮ．Ａ２では、増強度は全ＮＤＶ感染Ｌｔｋ−細胞とは見分けがつかない程であり、応答は厳密にペプチド依存性であった。異なるＬｔｋ^-−ＨＮクローンを比較することにより、ＨＮ発現レベルと特異的ＣＴＬ活性増強との相互関係が明らかになった（図３及び図４）。ＨＮトランスフェクト物質の蛍光強度と増大量のＮＤＶに感染させた細胞の蛍光強度との定量比較により、２種の弱染色クローンＬｔｋ^-−ＨＮ．Ａ３及びＬｔｋ^-−ＨＮ．Ａ４は、それぞれＮＤＶの90及び10 0血球凝集素単位（ＨＵ）／10⁷細胞による感染と同等であり、クローンＬｔｋ^- −ＨＮ．Ａ２の方は200（HU）／10⁷細胞と同等であることが明らかになった。従って、Ｌｔｋ^-−ＨＮクローンに発現したＨＮ量の範囲は、腫瘍特異的免疫応答における全ＮＤＶ感染の場合に見られる最適濃度の範囲内であった〔P．von Hoe genら，Invasion and Metastasis 9，117-133（1989）〕。ＣＴＬ刺激能についての機能性分析により、Ｌｔｋ^-−ＨＮ．Ａ２細胞は、より高いＨＮ発現及びＮＡ活性を示したものの、溶解作用においてはＮＤＶ感染Ｌｔｋ^-細胞〔100HU/ml ］と同等でしかないので、発現されたＨＮは、感染に用いた完全ウイルスより有効性がわずかに劣ることが明らかになった。ＨＮ発現に対して相対蛍光が二倍増強されているだけの他の２種のクローン（Ｌｔｋ^-−ＨＮ．Ａ３及びＬｔｋ^-−ＨＮ．Ａ４）は、ＣＴＬ活性の著しい増強を示し、これは、比較的低量の発現ＨＮでもＣＴＬの抗原特異的活性化を増大させるのに十分であったことを示している。実施例２ＣＴＬ活性の全般的な増強ＣＴＬの活性化に及ぼすＮＤＶの増強作用がインフルエンザＮＰペプチドの場合にのみ見られる特異的な現象でないことを証明するために、他の抗原特異的ＣＴＬ応答におけるＡＰＣのＮＤＶ感染作用を混合白血球細胞培養中で調べた。試験した異なる応答は、（Ａ）抗ＥＳｂ腫瘍抗原、（Ｂ）抗微量Ｈ抗原、（Ｃ）抗アロＭＨＣ抗原及び（Ｄ）抗インフルエンザＮＰ５０−６３ペプチドであった。これらの実験には全ウイルスを用いたが、ＨＮｃＤＮＡトランスフェクトＬｔｋ^-細胞を用いた実験も含まれており、全ウイルスを用いた場合と同様な結果を得た。従ってこの実施例は、ＨＮｃＤＮＡが上記の他の抗原特異的ＡＰＣに関して全ＮＤＶと同じように有効であるという可能性を示すと言ってよい。マウスは生体内で感作し、９日後にその脾細胞又は腫瘍細胞を除去した。以下の表に従って除去した細胞に５日間試験管内刺激を与えた。刺激を受けた細胞をそのまま（対照）用いるか、又はＮＤＶの100 HU/10⁷細胞に感染させた後で用いたが、但し実験Ｄ２では、Ｌｔｋ^-細胞を上記のようにＨＮｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした。これらのエフェクター細胞の細胞障害性を４−ｈ⁵¹Ｃｒ放出検定で測定した。該検定において、特異的標的細胞はＥＳｂ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ＥＬ−４（Ｃ）及びペプチド担持Ｌｔｋ^-細胞（Ｄ）であった。ＥＳｂ細胞は、メチルコラントレン誘発リンパ腫細胞系Ｅｂ（Professor V．Schirrmacher，DKFZ ，Heidelberg）の自然高転移性変異体である。ＥＬ−４細胞はAmerican Type Cu lture Collection（ATCC）から「ＴＩＢ３９」として入手し得る。数値は、溶解単位（LU）/10⁶細胞に基づく「刺激指数」で表されている。１LUは標的細胞（５×10³）の30％溶解を引き起こすエフェクター細胞の数である。ＮＤＶ修飾をしていない刺激物質細胞のLUを刺激指数１とした。結果を図５に示す。同系のＥＳｂ腫瘍（Ａ）に対するＤＢＡ／２マウスの免疫応答において、試験管内で刺激物質細胞としてＥＳｂの代わりにＮＤＶ感染ＥＳｂ細胞を用いたときに、ＣＴＬ応答に11倍の増加が見られた。生体内での免疫感作により同様な増大が見られた（ＥＳｂの代わりにＮＤＶ感染ＥＳｂを用いた感作）。感作及び再刺激の両方にウイルス感染腫瘍細胞を用いると、２つの増強作用の間に相乗作用が見られ、それによって刺激指数に100倍を超える増大が観察された。微量Ｈ応答においては、ウイルス感染細胞を用いて感作しても何ら増強作用が見られず、これは、免疫応答が既に最適になっていたという事実による可能性がある。試験管内での最適ＣＴＬ応答も刺激物質細胞のＮＤＶ感染によって増強され得なかった（データは示さず）。従って、わずか10％の標準刺激物質細胞を用いるだけで、微量Ｈ（図５Ｂ）及びアロ抗原（図５Ｃ）に対するさらに強力な免疫応答が得られるように培養条件を制限した。そのような次善条件下において、刺激物質細胞のウイルス感染により、微量Ｈ及びアロ抗原応答におけるＣＴＬ応答に６倍の増大が観察された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者シールマクセル，ボルカードイツ連邦共和国、デー―69117・ハイデルベルク、ウンタレル・フアウレル・ペルツ・６

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトの細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の抗原特異的刺激を増強する薬剤を製造するための、いずれの場合においても天然パラミクソウイルス及びＨＮタンパク質に対するいかなる関連特異的抗体を含まない、パラミクソウイルスのＨＮタンパク質、そのＴ細胞刺激増強ペプチド又は前記タンパク質若しくはペプチドをコードするＤＮＡの使用。２．パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルスである請求項１に記載の使用。３．ＨＮタンパク質が、ニューカッスル病ウイルス株ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣのタンパク質と少なくとも70％のアミノ酸相同性を有する請求項１に記載の使用。４．ＨＮタンパク質をコードするＤＮＡが、ニューカッスル病ウイルス株ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣのＤＮＡと少なくとも70％の相同性を有する請求項１に記載の使用。５．抗原がガン抗原である請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。６．ガン抗原が腫瘍抗原である請求項５に記載の使用。７．Ｔ細胞性免疫応答を高め得るヒト患者の病気との闘いにおける使用に好適なワクチンであって、疾患に対して高特異性を有する抗原を提示し且つパラミクソウイルスのＨＮタンパク質、そのＴ細胞剌激増強ペプチド又は前記タンパク質若しくはペプチドをコードするＤＮＡからなるＨＮタンパク質供給成分を含み、いずれの場合においても天然パラミクソウイルス及びＨＮタンパク質に対するいかなる関連特異的抗体を含まない患者に寛容な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、それによって罹患細胞の溶解反応に対して高い特異性を有する細胞障害性Ｔ細胞の生体内刺激がＨＮタンパク質供給成分により増大するワクチン。８．ＡＰＣが、治療を受ける患者又は適合するＭＨＣ型を有するドナー患者から予め採取した不活化罹患細胞から得られる請求項７に記載のワクチン。