JPH08508643A

JPH08508643A - プロテアーゼ変異体

Info

Publication number: JPH08508643A
Application number: JP6521563A
Authority: JP
Inventors: ラスムッセン，グレテ; ニールセン，エゴン; ハルキール，トーベン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-04-01
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 1996-09-17
Also published as: FI954647L; AU6424394A; US6087315A; ATE335813T1; KR100305140B1; BR9406565A; DE69434817T2; FI954647A0; EP0694065B1; FI119026B; DE69434817D1; EP0694065A1; DK39093D0; KR960701992A; WO1994023053A1

Abstract

(57)【要約】本発明はプロテアーゼ系によって引き起こされる失活に対し安定化プロテアーゼ変異体に関し、このプロテアーゼ変異体において天然チロシン残基が欠失しているか又は１又はそれ以上の位置で異なるアミノ酸残基で置換されている。本発明は又ペルオキシダーゼ系によって引き起こされる失活に対しプロテアーゼを安定化する方法並びに本発明のプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】プロテアーゼ変異体技術分野本発明は、ペルオキシダーゼ系によりもたらされる失活に対して安定化されたペルオキシダーゼ変異体に関し、このプロテアーゼ変異体において天然生産チロシン残基が欠失しているか又は１又はそれ以上の位置で異なるアミノ酸残基で置換されている。本発明はまた、ペルオキシダーゼ系によってもたらされる失活に対しプロテアーゼを安定化する方法および本発明のプロテアーゼ変異体を含んでなる洗剤組成物に関する。背景技術ペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7）は、過酸化水素を用い基質（電子又は水素供与体）の酸化を触媒する酵素である。そのような酵素は微生物、植物および動物起源から公知であり、例えばコプリナスシネレウス（Coprinus cinereus）由来のペルオキシダーゼ（例えばヨーロッパ特許出願179,486参照）。それらは典型的にはヘムタンパク質であり、すなわちそれらは補欠分子族としてヘムを含有する。過酸化水素又は過酸化水素前駆体と共にペルオキシダーゼの使用は、例えば製紙のためのパルプの漂白において、パルプ製造からの廃水処理において、洗剤における改良された漂白に対し、洗たく中の染料移動阻止に対しそしてリグニン改質、例えば特に板紙製造において提案されてきた。ペルオキシダーゼ活性を表わす酵素、過酸化水素源および過酸化水素増張剤を含んでなるペルオキシダーゼ系（又POD系とも称す）は、布帛を洗った時、布帛から浸出する着色された布帛からの余分の染料が、同じ洗液中に存在する他の布帛上に付着する（この現象は染料移動として一般に知られている）ことから防止する。このようなペルオキシダーゼ系を含んでなる洗剤組成物の洗液はWO 92／18687およびWO 92／18683に開示されている。そのようなペルオキシダーゼ系を洗剤組成物に適用する際の主な欠点は、洗剤組成物中に存在する酵素がペルオキシダーゼ系により強く影響され、これにより洗剤組成物の洗浄能力を妨げることである。発明の要約今や驚くべきことに見出された；すなわちタンパク分解酵素が、１つ又はそれ以上の天然チロシン残基の欠失又は異なるアミノ酸残基で置換することにより、ペルオキシダーゼ系によって引き起こされる失活に対して安定化される。従って本発明はプロテアーゼ変異体を提供し、この変異体において１つ又はそれ以上の天然チロシン残基が欠失しているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている。別の面において、本発明はプロテアーゼ系によって引き起こされる失活に対しプロテアーゼの安定化方法を提供し、この方法において、１つ又はそれ以上の天然チロシン残基が欠失しているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている。別の面において、本発明は本発明のプロテアーゼ変異体を含んでなる洗剤組成物に関する。更に別の面において、本発明は本発明のプロテアーゼ変異体を含んでなる洗剤用添加剤を提供する。図面の簡単な説明本発明を添付の図面を参照しつつ更に説明する。図１は例４に記載のPODの存在下、35℃でズブチリシン309およびズブチリシン309／V104Yの１分（黒）、５分（ハッチ）および10分（白）後の残留活性（％）を示す。発明の詳細な記載本発明は、ペルオキシダーゼ系によって引き起こされる失活に対し安定化された、新規なプロテアーゼ変異体を提供する。本発明に関連し、安定化プロテアーゼは、親酵素と比較した場合、ペルオキシダーゼ系により引き起こされる失活に対し改良された安定性を有する変異体又は突然変異プロテアーゼである。プロテアーゼ変異体又は突然変異プロテアーゼとは、親遺伝子のDNAヌクレオチド配列又はその誘導体の改変によって得られ得るプロテアーゼを意味する。酵素をコードするDNAヌクレオチドを適当な宿主生物中の適当なベクター中に挿入するとき、プロテアーゼ変異体又は突然変異プロテアーゼは発現されそして生産され得る。宿主生物体は、親遺伝子が由来する生物体と同一である必要はない。アミノ酸アミノ酸に対する略記号として、次の記号が用いられる：Ａ＝Ala＝アラニンＣ＝Cys＝システインＤ＝Asp＝アスパラギン酸Ｅ＝Glu＝グルタミン酸Ｆ＝Phe＝フェニルアラニンＧ＝Gly＝グリシンＨ＝His＝ヒスチジンＩ＝Ile＝イソロイシンＫ＝Lys＝リシンＬ＝Leu＝ロイシンＭ＝Met＝メチオニンＮ＝Asn＝アスパラギンＰ＝Pro＝プロリンＱ＝Gln＝グルタミンＲ＝Arg＝アルギニンＳ＝Ser＝セリンＴ＝Thr＝トレオニンＶ＝Val＝バリンＷ＝Trp＝トリプトファンＹ＝Tyr＝チロシンＢ＝Asx＝Asp（D）又はAsn（N）Ｚ＝Glx＝Glu（E）又はGln（Q）Ｘ＝任意アミノ酸 ★＝欠失又はアミノ酸不存在ペルオキシダーゼ活性本発明に関し、ペルオキシダーゼの酵素活性は「ペルオキシダーゼ単位」（PO DU）で表わされる。過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7）は、２，２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホネート）（ABTS）の脱水素を触媒する。生じた帯緑青色を418nmで分光学的に監視する。１PODUは標準条件下（すなわち、pH 7.0；基質として過酸化水素；0.1Ｍホスフェート緩衝液；30℃のインキュベーション温度；インキュベーション時間３分、動力学的に測定）、毎分１μmolの水素の変換を触媒する酵素の量である。プロテアーゼ活性本発明に関し、ズブチリシンの酵素活性を発色性基質を用いて行った。これらの基質とプロテアーゼとのインキュベーションは、基質の開裂およびｐ−ニトロアニリン（これは分光光度的に検出される）の放出を生ぜしめる。基質Ｎ−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−ニトロアニリド（20mMのナトリウムホスフェート緩衝液中0.8mM、pH 8.5又はブリットン−ロビンソン緩衝液中0.8mM、pH 8.5 ）を用い、ズブチリシンを分析する。インキュベーションを25℃で行ない次いで４分間分光光度的に追跡する。プロテアーゼの濃度は、ｐ−ニトロアニリンの放出が全分析中線状であるように選ばれる。ペルオキシダーゼ系本発明に関し、ペルオキシダーゼ系はペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活性を示す化合物、過酸化水素源およびペルオキシダーゼ増強剤を含んでなる系である。そのようなペルオキシダーゼ系は染料移行阻止を得るために用いられそして例えば国際公開WO 92／18687およびWO 92／18683に記載されている。そのようなペルオキシダーゼ系において、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活性を示す化合物は、酵素分類E.C.1.11.1.7によって含まれる全てのペルオキシダーゼであるか、又はペルオキシダーゼ活性を示すそれから由来する全ての断片であるか、又はその合成もしくは半合成誘導体である（例えばポルフィリン環系又はマイクロペルオキシダーゼ、注例えば米国特許4,077,768、ヨーロッパ特許出願537,381、国際公開WO 91／05858およびWO 92／16634）。このようなペルオキシダーゼは微生物、植物および動物源から公知である。ペルオキシダーゼは植物（例えば西洋わさび、又は大豆ペルオキシダーゼ）又は微生物例えば菌類又は細菌によって生産可能である。幾つかの好ましい菌類には、亜門ジュテロマイコチナ、綱ハイポマイセテス、例えばフサリアム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、トリコデルマ（Tricoderma）、マイロセシウム（Myrothecium）、ベルティシラム（Verticillum）、アースロマイセス（Arthromyces）、カルダリオマイセス（Caldariomyces）、ウロクラジウム（Ulocladium ）、エベリシア（Embellisia）、クラドスポリウム（Cladosporium）又はドレスセラ（Dreschlera）、特にフサリアムオキシスポラム（Fusarium o xysporum ）（DSM 2672）、フミコラインソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマレシー（Trichoderma resii）、マイロセシウムベルルカナ（Myrot hecium verrucana ）（IFO 6113）、ベルチシラムアルボラタム（Verticillum alboatrum ）、ベルチシラムダリー（Verticillum dahlie）、アスロマイセスラモサス（Arthromyces ramosus）（FERM P-7754）、カリロマイセスフマゴ（Caldariomyces fumago）、ウロクラジウムカータラム（Ulocaldium chartar um ）、エベルシアアリー（Embellisia alli）又はドレスケラハロデス（Dre schlera halodes ）に属する菌株が含まれる。他の好ましい菌類には、亜門バシジオマイコチナ、綱パシジオマイセテス、例えばコプリナス（Coprinus）、ファネロケーテ（Phanerochaete）、コリオラス（Coriolus）又はトラメテス（Trame tes ）、特にコプリナスシネレウス（Coprinus cinereus）ｆ．ミクロスポラス（microsporus）（IFO 8371）、コプリナスマクロリザス（Coprinus macrorhi zus ）、ファネロケテクリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）（例えばNA-12）又はトラメテス（Trametes）（以前はポリポラス（Polyporusと呼ばれていた）、例えばＴ．ベルシカラー（versicolor）（例えばPR4 28-A）が含まれる。更に好ましい菌類には、亜門ザイゴマイコチナ、綱マイコラセエ、例えばリボプス（Rhizopus）又はムコール（Mucor）、特にムコールヒーマリス（Mucor h iemalis ）が含まれる。幾つかの好ましい細菌には、目アクチノマイセタレス、例えばストレプトマイセススフェロイデス（Streptomyces spheroides）（ATTC 23965）、ストレプトマイセスサーモビロラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）（IFO 1238 2）又はストレプトベルチシラムベルチシリウム（Streptoverticillum vertic illium ）ssp.ベルチシリウム（verticillium）の菌株が含まれる。他の好ましい細菌には、バシラスプミラス（Bacillus pumilus（ATCC 12905 ）、バシラスステアロサーモフィラス（Bacillusｓtearothermophilus）、ロドバクタースフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドモナスパルストリー（Rhodomonas palustri）、ストレプトコッカスラクチス（Streptoco ccus lactis ）、シーュドモナスプロシニア（Pseudomonas purrocinia）（ATC C 15958）又はシーュドモナスフルオレスセンス（Pseudomonas fluorescens）（NRRL B-11）が含まれる。更に好ましい細菌には、マイキソコッカス（Myxococcus）、例えばＭ．ビレスセンス（virescens）が含まれる。特に有用なペルオキシダーゼの他の可能な源はサウンダーズB C等、Peroxidas e，ロンドンバッターワース1964，41-43頁に掲げられる。ペルオキシダーゼは、該ペルオキシダーゼをコードするDNA配列並びにペルオキシダーゼをコードするDNA配列の発現を許容せしめる機能をコードするDNA配列を有する組換DNAベクターで形質転換された宿主細胞を、ペルオキシダーゼの発現を許容する条件下培地中で培養し、次いで培地からペルオキシダーゼを回収することを含んでなる方法によって生産できるものであってもよい。特に組換え工学的に生産されたペルオキシダーゼは、コプリナス（Coprinus） sp．、特にWO 92／16634に従いＣ．マクロリザス（macrorhizus）又はＣ．シネレウス（cinereus）由来のペルオキシダーゼである。本発明に関し、ペルオキシダーゼ活性を示す化合物はチトクローム、ヘモグロビン又はペルオキシダーゼ酵素から由来したペルオキシダーゼ活性断片およびその合成もしくは半合成誘導体、例えば鉄ポルフィン、鉄ポルフィリンおよび鉄プタロシアニンおよびその誘導体を含んでなる。ペルオキシダーゼ系において、エンハンサーは酸化可能な基質、例えば国際公開WO 92／18683およびWO 92／18687および加藤Ｍおよび清水Ｓ，Plant Cell Phy siol．1985 26（7），1291-1301頁（特に表１参照）およびサウンダーズB C等、 Peroxidase，ロンドンバッターワース，1964，141頁以降に記載される如き、例えば金属イオン又はフェノール化合物例えば７−ヒドロキシクマリン（7HCm）、バニリン（VAN）およびｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート（pHBS）又はWO 93／00394に記載される２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン −６−スルホネート）（ABTS）であってよい。プロテアーゼ変異体ペルオキシダーゼ系によって引き起こされる失活に対し安定化された本発明のプロテアーゼ変異体は、ズブチリシン（例えばバシラスレンタス（Bacillus l entus ）プロテアーゼ、バシラスアミロリクェファシエンス（Bacillus amylol iquefaciens ）プロテアーゼおよびバシラスリケニホルミス（Bacillus lichen iformis）プロテアーゼ）、トリプシン様プロテアーゼ（例えばフサリウム（Fu sarium）プロテアーゼ、国際公開89／06270）および溶菌プロテアーゼ（例えばノカルディオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼ、国際公開WO 88／03947）を含んでなる。ズブチリシン本発明に関し、ズブチリシンはグラム陽性細菌又は菌類によって生産されるセリンプロテアーゼとして定義される。他の定義によれば、ズブチリシンがセリンプロテアーゼであり、ここにおいて触媒的トリアド中のアミノ酸残基の相対的順序はAsp-His-Ser（位置32,64および221、BPN′ナンバリング）である。好ましいズブチリシンは、バシラスレンタス（Bacillus lentus）プロテアーゼ、例えばズブチリシン309およびズブチリシン147、バシラスアミロリクェファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）プロテアーゼ、例えばズブチリシンBPN′およびバシラスリケニホルミス（Bacillus licheniformis）プロテアーゼ、例えばズブチリシンカルスベルクである。アミノ酸ナンバリング本発明に関し、ズブチリシン中のアミノ酸残基の特有のナンバリング（番号付け）が用いられる。ズブチリシンBPN′に沿った種々のズブチリシンのアミノ酸配列の整列によって、ズブチリシンBPN′中の類似のアミノ酸の位置の数に対するズブチリシン中のアミノ酸残基の位置に対しナンバーを指定することが可能である（「BPN′ナンバリング」、例えば国際公開WO 89／06279およびWO 91／0034 5参照）。本発明に従って生産されるか又は意図される種々のプロテアーゼ変異体の記載において、次の命名法が参照を容易にするため採用された：〔元のアミノ酸；位置；置換アミノ酸〕従って位置209においてチロシンをフェニルアラニンで置換することは、Y209F として示される。位置36のアスパラギン酸の欠失はＤ36^*として示されそしてそのような位置における挿入は、位置36においてアスパラギン酸の挿入に対して36Ｄとして示される。多重変異はプラス記号によって分離される、すなわち、Y167I＋Y209Fは位置16 7および209において、チロシンをイソロイシンおよびフェニルアラニンでそれぞれ置換することを意味する。もしも置換が例えばズブチリシン309において変異によりなされる場合、生成物は例えば「ズブチリシン309／Y209F」として示される。これに関して言及されるズブチリシンに関する全ての位置は、上記のBPN′ナンバリングが言及される。好ましい態様において、本発明のプロテアーゼ変異体は、次の位置：6，57，9 1，104，143，167，171，192，206，209，214，256，262，263、より好ましくは 104，167，171，192（BPN′ナンバリング）の１つ又はそれ以上において交換されているズブチリシンである。他の好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼ変異体はズブチリシン30 9、ズブチリシン147、ズブチリシンBPN′、又はズブチリシンカルスベルクである。プロテアーゼの安定化方法本発明は、ペルオキシダーゼ系により引き起こされる失活に対するタンパク分解酵素の安定化方法を提供し、この方法により１又はそれ以上の天然チロシン残基は欠失されるか又は異なるアミノ酸残基で置換される。組換え工学的に生産される酵素過去において、多数のプロセスが組換えDNA工学により、ポリペプチド又はタンパク質の生産に対し開発された。この目的に対し、Ｅ．コリー（coli）、バシラスズブチリス（Bacillus subtilis ）、サッカロマイセスセレビジエ（Sac charomyces cerevisiae ）および種々のアスペルギルス（Aspergillus）株、例えばＡ．オリゼ（oryzae）およびＡ．ニガー（niger）が最も用いられる。生合成的にポリペプチドの発現ポリペプチド又はタンパク質の生産が意図される生物体の形質転換において、 DNA配列を生物体に導入する。配列は、転写／翻訳開始シグナルおよび転写／翻訳停止シグナルによりフランクされた対象の遺伝子のコード領域を含む。コード領域は３個の塩基対のユニット（コドンと呼ばれる）を含有し、これは転写される遺伝子の翻訳の際アミノ酸に翻訳され、これは再び構築され対象のポリペプチドを与える。ポリペプチドにおける変異の導入コドン領域内の１以上の特定のコドンを変化させそして宿主微生物にこれらの新しいコドン領域で形質転換すると、新しいポリペプチドが生産でき、これは元のポリペプチドとは１つ又はそれ以上のアミノ酸により異なる。そのような改変は、「特定部位の試験管内突然変異誘発」として一般に知られた技術を用いて導入できる。多くの方法が公にされている。初期の方法は、ゾラーアンドスミス、DNA1984 3（6）479-488により記載されそして単鎖Ｍ13バクテリオファージの使用を含む。PCR（ポリメラーゼ鎖反応）を用いる好ましい方法は、ネルソンアンドロング、Analytical Biochemistry，1989 180 147-151により記載される。それは、PCR反応においてプライマーの一つとして化学的に合成されたDNA オリゴヌクレオチドを用いることにより、所望の変異を有するPCRフラグメントの３工程発生を含むPCR−発生断片から、変異を有するDNA断片が制限酵素で開裂することにより単離できそして発現プラスミドに再挿入される。第三の突然変異誘発方法は、DNAコード領域における制限部位を利用する。突然変異誘発標的をフランクする部位でDNAを制限酵素により消化し、所望の変異を合成的に有する新しい断片を合成しそして制限部位間でこの新しい断片をクローン化することにより、変異体コード領域が構築できる。全ての方法はタンパク工学と呼ばれる分野における開発に一般に適用可能であり、このタンパク工学は新しいか又は改変された特徴を有するポリペプチドの開発を取扱う。形質転換および発現は、当業者に公知方法により、例えばヨーロッパ特許出願 305,216（この明細書はその番号を引用して本明細書に加えられる）に記載される如く行うことができる。本発明の安定化酵素を生産し得る微生物は、他の必須栄養源と共に同化性炭素および窒素を含有する普通培地内で通常の発酵方法により培養でき、培地は当業者の原理に従って構成される。安定化酵素の精製および回収は、自体公知方法に従って行うこともできる。プロテアーゼ遺伝子のクローン化タンパク分解酵素をコードする遺伝子は、当業者に周知の種々の方法によりあらゆるグラム陽性細菌又は菌類からクローニングされ得る。先ず、DNAのゲノム、および／又はcDNAライブラリーが、研究されるべきプロテアーゼを生産する生物体から染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構築されねばならない。次いで、もしもプロテアーゼのアミノ酸配列が知られている場合、相同のオリゴヌクレオチドプローブが合成され、識別されそして細菌DNAのゲノムライブラリーから又は菌類cDNAライブラリーからプロテアーゼーコードクローンを同定するために用いられる。択一的に、細菌又は菌類の他の菌株からのプロテアーゼに相同の配列を有するラベル化オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリッド形成および低い厳しさの洗浄条件を用い、プロテアーゼーコードクローンを同定するためのプローブとして使用できる。プロテアーゼ−生産クローンを同定する別の方法は、ゲノムDNAの断片を発現ベクター例えばプラスミドに挿入し、プロテアーゼ−陰性細菌を生成ゲノムDNA ライブラリーをで形質転換し、次いで形質転換された細菌を、脱脂乳の如き、プロテアーゼに対する基質を含有する寒天上に塗布することを含む。プロテアーゼ担持プラスミドを含有するこれらの細胞は、分泌されたタンパク分解酵素による脱脂乳の消化のため、澄明な寒天のハロー（halo）により囲まれるコロニーを生産するであろう。プロテアーゼ遺伝子における特定部位の変異誘発の発生一度、プロテアーゼ遺伝子をクローン化しそして変異誘発に対する望ましい部位が同定されると、変異が合成オリゴヌクレオチドを用い導入できる。これらのオリゴヌクレオチドは望ましい変異部位をフランクするヌクレオチド配列を含有し、変異ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成中に挿入される。好ましい方法において、プロテアーゼ遺伝子を橋かけするDNAの一本鎖ギャップを、プロテアーゼ遺伝子を有するベクター内で作り出す。次いで、望ましい変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖DNAの相同部分にアニールする。次いで残りのギャップをD NAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）により充てんし、次いで構築体をＴ４リガーゼを用いて連結する。この方法の特異的例は、〔モリナガ等、Biotechnology，1 984 2 646-639〕に記載されている。モリナガ等によれば、遺伝子内の断片を、制限エンドヌクレアーゼを用いて除く。今やギャップを有するベクター／遺伝子を変性し次いでギャップを有する代りに、ベクター／遺伝子に対合しこれはギャップ内に取りこまれている領域の外側の部位で他の制限エンドヌクレアーゼで切断される。それで遺伝子の一本鎖領域は変異オリゴヌクレオチドについてハイブリッド形成に利用でき、残りのギャップはDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片により充てんされ、挿入体をT4 DNAリガーゼで連結し、次いで１サイクルの複製後、望ましい変異を有する二本鎖プラスミドを生産する。モリナガ法は新しい制限部位を構築する追加の操作を省き、従って多重部位で変異の発生を促進する。米国特許4,760,025はカセットの少変異を行うことにより多重変異を有するオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかし、多様の変異はモリナガ法により一度で導入できる、何故なら種々の長さの大きさのオリゴヌクレオチドが導入できる。プロテアーゼ変異体の発現本発明によれば、前記方法又は当業者に公知の択一的方法により生産される変異プロテアーゼ遺伝子は発現ベクターを用い、酵素形で発現できる。発現ベクターは一般にクローニングベクターの定義内に含まれる、何故ならば発現ベクターは典型的クローニングベクターの成分、すなわち微生物のゲノムに独立して微生物内のベクターの自動複製を許容する要素および選択目的のための１以上の表現型マーカーを通常含む。発現ベクターはプロモーターをコードする調節配列、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび所望によりレプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子を含む。発現されたタンパク質の分泌を許容するため、「シグナル配列」をコードするヌクレオチドは、遺伝子のコード配列の前に挿入され得る。調節配列の支配下の発現に対し、本発明に従って処理されるべき標的遺伝子は、適当な読み枠内の調節配列に機能的に連結されている。プラスミドベクター内に挿入されそして変異体プロテアーゼ遺伝子の翻訳を支援し得るプロモーター配列は、制限されないが原核β−ラクタマーゼプロモーター〔ビラカマロフ等、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1978 75 3727-37 31〕およびtacプロモーター〔デボー等、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1983 80 21-25〕を含む。更に、Scientific American，1980 242 74-94中の「Useful Proteins from recombinant bacteria」において参照できる。１つの態様に従い、Ｂ．ズブチリス（subtilis）は変異DNAを有する発現ベクターにより形質転換される。もしも発現が分泌微生物例えばＢ．ズブチリスにおいて行なわれるべき場合、シグナル配列は翻訳開始シグナルのあとに続きそして対象のDNA配列に先行するシグナル配列は、発現生成物を細胞壁に移送するように作用し、その細胞壁ではそれは分泌により生成物から開裂する。先に定義される如き語句「調節配列」は、それが存在する場合、シグナル配列を含むことが意図される。本発明の安定化酵素を生産し得る微生物は、他の必須の栄養源と共に同化性炭素および窒素を含有する普通培地中通常の発酵法により培養でき、培地は公知技術の原理に従って構成される。宿主細胞から分泌されるプロテアーゼ変異体は、遠心分離又は濾過により細胞を培地から分離することおよび塩例えば硫酸アンモニウムによる培地のタンパク質成分の沈殿、次いでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー手段を含む公知手段により培地から好都合に回収できる。ヌクレオチド配列、発現ベクターおよび微生物本発明は、本発明の安定化プロテアーゼ変異体をコードするDNAヌクレオチド配列に関する。安定化酵素変異体は、本発明の酵素をコードするDNAヌクレオチド配列を、適当な宿主生物体中適当なベクター内に挿入するとき発現されそして生産される。宿主生物体は親遺伝子が由来する生物体と必ずしも同一でない。本発明は発現ベクターおよび本発明の安定化プロテアーゼ変異体をコードする DNAヌクレオチドを含有する宿主生物体にも関する。洗剤組成物本発明によれば、プロテアーゼ変異体は典型的には洗剤組成物の成分となり得る。そのようなものとして、プロテアーゼ変異体は無粉塵粒質物、安定化液体又は保護された形で洗剤組成物中に含有できる。無粉塵性粒質物は、例えば米国特許4,106,991および米国特許4,661,452（双方ともノボノルディスクＡ／Ｓに付与）に開示される如く製造できそして所望により当業者に公知の方法で被覆できる。洗剤用酵素は造粒前又は造粒後に混合され得る。ろう状コーティング物質の例は、平均分子量1000〜20000を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）、16〜50の酸化エチレン単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；エトキシル化脂肪アルコール（このアルコールは12〜20個の炭素原子を含みそして15〜80の酸化エチレン単位が存在する）；脂肪酸；および脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術により適用に対し適当なフィルム形成コーティング物質の例は英国特許1483591に示される液体酵素調製品は、例えば確立された方法に従い、ポリオール例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化できる。他の酵素安定剤は当業者に公知である。保護された酵素は、ヨーロッパ特許公開238,216記載された方法に従って製造できる。本発明の洗剤組成物は、如何なる通常の形態であってよく、例えば粉末、顆粒又は液体である。液体洗剤は典型的には70％までの水および０〜30％の有機溶剤を有する、水性であってよく、又は非水性であってよい。洗剤組成物は、１以上の界面活性剤を含むことができ、これはアニオン、非イオン、カチオン、両性イオンであってよい。洗剤は通常０〜50％のアニオン界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（AS）、アルコキシエトキシスルフェート（AEOS又はAES）、第二級アルカンスルホネート（SAS）、 α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸又は石けんを含有するであろう。洗剤は又０−40％の非イオン界面活性剤例えばアルコールエトキシレート（AEO又はAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば国際公開92／ 06154に記載の如き）を含有できる。洗剤組成物は、追加的に１以上の他の酵素、例えばアミラーゼ、セルラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ又はオキシダーゼを含有できる。洗剤は、１〜65％の洗剤用ビルダー又は錯化剤例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸（NTA ）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTMP A）、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は加層シリケート（例えばヘキスト社からのSKS-6）を含有できる。洗剤はアンビルト、すなわち本質的に洗剤用ビルダーを含有しなくてもよい。洗剤は１以上のポリマーを含有できる。その例は、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリカルボキシレート例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。洗剤はH₂O₂源例えばパボレート又はポカーボネートを含んでなる漂白系を含有できこのH₂O₂源は過酸−形成漂白活性化剤例えば四酢酸エチレンジアミン（TAED ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）と組合せることができる。択一的に、漂白系は例えばアミド、イミド又はスルホンタイプのペルオキシ酸を含んでなる。本発明の洗剤組成物の酵素は、通常の安定剤、例えばポリオール例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体例えば芳香族ボレートエステルを用いて安定化でき、そして組成物は例えばWO 92／19709およびWO 92／19708に記載の如く調製される。洗剤は又、他の通常の洗剤用成分例えば粘土を含有する布帛柔軟剤、起泡増進剤、土壌抑制剤、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、抗土壌−再付着剤、染料、殺菌剤、螢光増白剤又は香料を含有できる。 pH（使用濃度で水性溶液中に測定された）は、通常中性又はアルカリ性、例えば７−11であろう。本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態は次のものが含まれる：１）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物として製剤化した洗剤組成物：２）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物として製剤化された洗剤組成物：３）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物として製剤化された洗剤組成物：４）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物として製剤化した洗剤組成物：５）次の成分を含んでなる水性液体組成物：６）以下の成分を含んでなる水性構築液体洗剤組成物：７）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物として製剤化された洗剤組成物：８）以下の成分を含んでなる粒質物として製剤化された洗剤組成物：９）以下の成分を含んでなる粒質物として製剤化された洗剤組成物： 10）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤組成物： 11）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤組成物： 12）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物として製剤化された洗剤組成物： 13）直鎖アルキルベンゼンスルホナート又はその一部が、アルキルスルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）により置換されている１）−12）に記載されているような洗剤配合物。 14）追加の成分として又は既に明記した漂白系の代替物として安定化もしくは封入された過酸を含有する１）−13）記載されているような洗剤配合物。 15）パボレートの含量がポカーボネートで置換されている、３），７），９）および12）に記載されているような洗剤配合物。 16）液体非イオン界面活性剤例えば直鎖アルコキシル化第一アルコール、ビルダー系（例えばホスフェート）、酵素およびアルカリを含んでなる、非水性洗剤液体として製剤化された洗剤組成物。洗剤は又アニオン界面活性剤および／又は漂白系を含んでなる。本発明のプロテアーゼ変異体は、洗剤中で好都合に用いられる濃度で配合できる。現在次のように考えられている；すなわち本発明の洗剤組成物において、プロテアーゼ変異体は洗液１ｌ当たり0.001−100mgのプロテアーゼ変異体に相当する量で添加され得る。以下の実施例は更に本発明を説明するが、それらはいかなる場合も請求の範囲で記載されているような本発明の範囲を制限するものではない。例１ペルオキシダーゼ系コプリナスシネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼ（CiP，ヨーロッパ特許出願179,486に従って得られる）、過酸化水素（H₂O₂）、ペルオキシダーゼ増強剤としてのｐ−ヒドロキシベンゼンスルホナート（pHBS）を含んでなる、染料移行阻止（DTI）のために用いられるペルオキシダーゼ（POD）を、硫酸ナトリウム緩衝液中でシミュレートした。〔pHBS〕：50μＭ、〔H₂O₂〕：200μＭ、〔CiP〕：２PODU／ml、20mMの硫酸ナトリウム、pH 8.5。ズブチリシン309（サビナーゼ（商標）、ノボノルディスクＡ／Ｓデンマークより供給）の活性を、35℃で20分間ペルオキシダーゼ系と共にインキュベーションした後調べた。サビナーゼ309の残留活性を、前記の如く基質Ｎ−スクシニル−Ala−Ala−Pro −Phe−ｐ−ニトロアニリドを用いて測定した。プロテアーゼの安定度を、40nM および400nMの濃度をそれぞれ用い分析的に評価した。両濃度に対し、ズブチリシン309の残留活性を未処理ズブチリシン309に関して 15％に評価した。従って、ズブチリシンはPOD系の存在下明らかに失活している。例２ズブチリシン309を、例１に記載したように〔¹⁴Ｃ〕−pHBSの存在下POD系と共にインキュベートした。POD処理後、ズブチリシン309を精製し次いで更にアミノ酸分析による調査および変性条件下ゲル濾過クロマトグラフィーに委ねる。POD処理ズブチリシン309の精製 POD系および400nM濃度のズブチリシン309を含有する２ｌのリン酸ナトリウム緩衝液を35℃で20分間インキュベートした。失活後、YM10膜（アミコン）を用いアミコンセル中で溶液を３mlに濃縮した。更に精製をゲル濾過カラム；スーパーデックス75（16／60）で行い0.1Ｍ酢酸アンモニウムで溶出した。POD処理ズブチリシン309の最大部分は、未処理ズブチリシン309よりもわずかに高い分子量を伴って溶出された。POD処理ズブチリシン309を濃縮し次いでアミコンセル中ミリ（ Milli）Ｑ水10容量を用いて洗浄した。アミノ酸分析アミノ酸分析を、製造者の指示に従いアプライドバイオシステム420Ａアミノ酸分析システムで行った。アミノ酸分析からの結果を下記の表１に示す。表の記載から明らかなように、 POD失活により著るしく影響を受ける唯一の検出可能なアミノ酸は、チロシン（T yr）である。〔¹⁴Ｃ〕−pHBSの存在下ズブチリシン309のPOD失活は、酵素の放射性標識化をもたらす。この修正の共有結合性は２Ｍの尿素中で変性条件下ゲル濾過を通して示された。例３ペルオキシダーゼ系に対するズブチリシン309の安定化をいくつかの変異体（ここにおいて１又はそれ以上のチロシンが他のアミノ酸残基により置換されていた）を用いて調査した。ペルオキシダーゼ系を、ペルオキシダーゼ増強剤として７−ヒドロキシクマリン（7HCm）を用い、ブリトン−ロビンソン緩衝液中でシミュレートした：〔7HCm〕：10μＭ、〔H₂O₂〕：200μＭ、〔Cip〕：２PODU／ml、20mMブリトン −ロビンソン緩衝液（20mMの酢酸ナトリウム、20mMのホウ酸ナトリウムおよび20 mMのリン酸ナトリウム）、pH 8.5。種々の変異体を、80nMから120nMに変化する濃度でペルオキシダーゼ系と共にインキュベートした。35℃で10分間インキュベーションした後、変異体の残留活性を前記の如く、基質Ｎ−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−ニトロアニリドを用いて分析した。残留活性を未処理変異体に関して測定した。結果を下記の表２に示す。表の記載から明らかなように位置167,171および192 において置換体を含有する２つの変異体は、増強剤として7HCmを用いるペルオキシダーゼ系に対し著るしく安定化される。例４前記の幾つかのズブチリシンは、位置104にチロシン残基を有する。この位置におけるチロシンの重要性を、ズブチリシン309変異体V104Yを用いて調査した。ペルオキシダーゼ系を、ペルオキシダーゼ増強剤として７ヒドロキシクマリン（7HCm）を用いブリトン−ロビンソン緩衝液中でシミュレートした：〔7HCm〕：５μＭ、〔H₂O₂〕：200μＭ、〔CiP〕：２PODU／ml、20mMのブリトン−ロビンソン緩衝液（20mMの酢酸ナトリウム、20mMのホウ酸ナトリウムおよび 20mMのリン酸ナトリウム）、pH 8.5。プロテアーゼを80nMの濃度でプロテアーゼ系と共にインキュベートとした。35 ℃で１分、５分および10分間インキュベーション後、プロテアーゼの残留活性を、前記の如くＮ−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−ニトロアニリドを用い分析した。残留活性を未処理変異体に関して測定した。結果を図１に示す。位置104に追加のチロシンを導入後、ズブチリシン309変異体はPOD系に対してはるかにより感受的であるとなっていた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月５日【補正内容】請求の範囲１．ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活性を示す化合物、過酸化水素源およびペルオキシダーゼ増強剤を含んでなるペルオキシダーゼ系により引き起こされる失活に対するプロテアーゼ変異体の安定化方法であって、１又はそれ以上の天然チロシン残基を欠失するか又は異なるアミノ酸残基で置換することを特徴とする、前記方法。２．１又はそれ以上の天然チロシン残基を、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、グルタミン酸残基又はヒスチジン残基で置換することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。３．プロテアーゼ変異体が、バシラスレンタス（Bacillus lentus）プロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシン309変異体又はズブチリシン147変異体である、請求の範囲第１又は２項記載の方法。４．プロテアーゼ変異体が、バシラスアミロリクェファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens ）プロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンBPN′変異体である、請求の範囲第１又は２項記載の方法。５．プロテアーゼ変異体が、バシラスリケニホルミス（Bacillus lichenifo rmis ）プロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンカルスベルク変異体である、請求の範囲第１又は２項記載の方法。６．プロテアーゼ中の次の位置：6，57，91，104，143，167，171，192，206 ，209，214，256，262，263、好ましくは104，167，17 1，192（BPN′ナンバリング）のチロシン残基が１又はそれ以上の位置で欠失されているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている、請求の範囲第３〜５項のいずれか１項に記載の方法。７．ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活性を示す化合物、過酸化水素源およびペルオキシダーゼ増強剤を含んでなるペルオキシダーゼ系によって引き起こされる失活に対し、安定化されたプロテアーゼ変異体であって、１又はそれ以上の天然チロシン残基か欠失しているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている、前記プロテアーゼ変異体：但し次の変異 Y91F、 Y167E，F、 Y171E，V、 Y192E，F、 Y209F，L、 Y214F，T、 Y263F、の少なくとも１つを有するプロテアーゼ変異体および少なくとも１つのアミノ酸が次の如く： Y21X、 Y104X、 Y171X、 Y214X、 Y217X、置換されているバシラスアミロクェファシエンス（Bacillus amyloliquefacie ns ）ズブチリシン変異体を除外する（BPN′ナンバリング）。８．１又はそれ以上のチロシン残基が、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、グルタミン酸残基又はヒスチジン残基で置換されている、請求の範囲第７項記載のプロテアーゼ変異体。９．バシラスレンタス（Bacillus lentus）プロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシン309変異体又はズブチリシン147変異体である、請求の範囲第７又は８項記載のプロテアーゼ変異体。 10．バシラスリケニホルミス（Bacillus licheniformis）プロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンカルスベルク変異体である、請求の範囲第７又は８項記載のプロテアーゼ変異体。 11．バシラスアミロリクェファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）プロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンBPN′変異体である、請求の範囲第７又は８項記載のプロテアーゼ変異体。 12．プロテアーゼ中の次の位置：6，57，91，143，167，171，192，206，209 ，214，256，262，263、好ましくは167，171，192（BPN′ナンバリング）のチロシン残基が１又はそれ以上の位置で欠失されているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている、請求の範囲第９〜15項のいずれか１項に記載のプロテアーゼ変異体。 13．請求の範囲第７〜12項のいずれか１項に記載のプロテアーゼ変異体を含んでなる、洗剤組成物。 14．更に１又はそれ以上の他の酵素、特にリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを好都合には洗剤中に配合されて含んでなる、請求の範囲第13項記載の洗剤組成物。 15．粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形態で提供される、請求の範囲第７〜12項のいずれか１項に記載のプロテアーゼ変異体を含んでなる、洗剤用添加剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/56 Ｃ１２Ｒ 1:10） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハルキール，トーベンデンマーク国，デーコー―1900 フレデリクスベルグセー，ボドロフスバイ，４アー．７

Claims

【特許請求の範囲】１．ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活性を示す化合物およびペルオキシダーゼ増強剤を含んでなるペルオキシダーゼ系によって引き起こされる失活に対し、安定化されたプロテアーゼ変異体であって、１又はそれ以上の天然チロシン残基が欠失しているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている、前記プロテアーゼ変異体。２．１又はそれ以上のチロシン残基が、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、グルタミン酸残基又はヒスチジン残基で置換されている、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ変異体。３．バシラスレンタスプロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシン309 変異体又はズブチリシン147変異体である、請求の範囲第１又は２項記載のプロテアーゼ変異体。４．バシラスリケニホルミスプロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンカルスベルク変異体である、請求の範囲第１又は２項記載のプロテアーゼ変異体。５．バシラスアミロリクェファシエンスプロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンBPN′変異体である、請求の範囲第１又は２項記載のプロテアーゼ変異体。６．プロテアーゼ中の次の位置：6，57，91，104，143，167，171，192，206 ，209，214，256，262，263、好ましくは104，167，171，192（BPN′ナンバリング）のチロシン残基が１又はそれ以上の位置で欠失されているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている、請求の範囲第３〜５項のいずれか１項に記載のプロテアーゼ変異体。７．ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活性を示す化合物、過酸化水素源およびペルオキシダーゼ増強剤を含んでなるペルオキシダーゼ系により引き起こされる失活に対するプロテアーゼ変異体の安定化方法であって、１又はそれ以上の天然チロシン残基を欠失するか又は異なるアミノ酸残基で置換することを特徴とする、前記方法。８．１又はそれ以上の天然チロシン残基を、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、グルタミン酸残基又はヒスチジン残基で置換することを特徴とする、請求の範囲第７項記載の方法。９．プロテアーゼ変異体が、バシラスレンタスブロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシン309変異体又はズブチリシン147変異体である、請求の範囲第７又は８項記載の方法。 10．プロテアーゼ変異体が、バシラスアミロリクェファシエンスプロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンBPN′変異体である、請求の範囲第７又は８項記載の方法。 11．プロテアーゼ変異体が、バシラスリケニホルミスプロテアーゼ変異体、好ましくはズブチリシンカルスベルク変異体である、請求の範囲第７又は８項記載の方法。 12．プロテアーゼ中の次の位置：6，57，91，104，143，167，171，192，206 ，209，214，256，262，263、好ましくは104，167，171，192（BPN′ナンバリング）のチロシン残基が１又はそれ以上の位置で欠失されているか又は異なるアミノ酸残基で置換されている、請求の範囲第９〜11項のいずれか１項に記載の方法。 13．請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載のプロテアーゼ変異体を含んでなる、洗剤組成物。 14．更に１又はそれ以上の他の酵素、特にリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを好都合には洗剤中に配合されて含んでなる、請求の範囲第13項記載の洗剤組成物。 15．粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形態で提供される、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載のプロテアーゼ変異体を含んでなる、洗剤用添加剤。